JPH1075782A - 新規△９不飽和化酵素をコードする遺伝子及びその遺 伝子を含有する酵母 - Google Patents
新規△９不飽和化酵素をコードする遺伝子及びその遺 伝子を含有する酵母Info
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- JPH1075782A JPH1075782A JP27040596A JP27040596A JPH1075782A JP H1075782 A JPH1075782 A JP H1075782A JP 27040596 A JP27040596 A JP 27040596A JP 27040596 A JP27040596 A JP 27040596A JP H1075782 A JPH1075782 A JP H1075782A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 パルミチン酸よりステアリン酸に対して基質
特異性の高い△９脂肪酸不飽和化酵素をコードする新規
な遺伝子、該遺伝子を導入した形質転換体を提供するこ
と。 【解決手段】 ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａ
ｎｇｕｓｔａ）由来のパルミチン酸よりステアリン酸に
対して基質特異性の高い△９不飽和化酵素をコードする
遺伝子及びその遺伝子を含有する酵母。
特異性の高い△９脂肪酸不飽和化酵素をコードする新規
な遺伝子、該遺伝子を導入した形質転換体を提供するこ
と。 【解決手段】 ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａ
ｎｇｕｓｔａ）由来のパルミチン酸よりステアリン酸に
対して基質特異性の高い△９不飽和化酵素をコードする
遺伝子及びその遺伝子を含有する酵母。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、補酵素Ａ（Ｃｏ
Ａ）とエステル結合した飽和脂肪酸であるパルミチン酸
又はステアリン酸を不飽和脂肪酸であるパルミトレン酸
又はオレイン酸に変換する酵素、特に、酵母ピヒア（Ｐ
ｉｃｈｉａ）の△９不飽和化酵素をコードする遺伝子、
及び該遺伝子を含有する形質転換体に関する。
Ａ）とエステル結合した飽和脂肪酸であるパルミチン酸
又はステアリン酸を不飽和脂肪酸であるパルミトレン酸
又はオレイン酸に変換する酵素、特に、酵母ピヒア（Ｐ
ｉｃｈｉａ）の△９不飽和化酵素をコードする遺伝子、
及び該遺伝子を含有する形質転換体に関する。
【０００２】なお、本発明にいう△９不飽和化酵素と
は、△９脂肪酸不飽和化酵素を意味する。
は、△９脂肪酸不飽和化酵素を意味する。
【０００３】
【従来の技術】△９不飽和化酵素は補酵素Ａ（ＣｏＡ）
とエステル結合したパルミチン酸とステアリン酸に作用
して、炭素鎖の△９位に不飽和結合を導入し、それぞれ
パルミトレン酸若しくはオレイン酸へ変換する。
とエステル結合したパルミチン酸とステアリン酸に作用
して、炭素鎖の△９位に不飽和結合を導入し、それぞれ
パルミトレン酸若しくはオレイン酸へ変換する。
【０００４】多くの種類の酵母の不飽和脂肪酸生合成で
は、△９不飽和化酵素によって生成したオレイン酸に別
の△１２不飽和化酵素が作用してリノール酸に変換し、
次に△６または△１５不飽和化酵素がリノール酸をリノ
レン酸へ変換する。
は、△９不飽和化酵素によって生成したオレイン酸に別
の△１２不飽和化酵素が作用してリノール酸に変換し、
次に△６または△１５不飽和化酵素がリノール酸をリノ
レン酸へ変換する。
【０００５】しかし、パンや醸造等産業的に最も頻繁に
利用されている酵母サッカロマイセス・シェルビッシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）の細胞内の主な不飽和脂肪酸はパルミトレン酸とオ
レイン酸で、リノール酸等の不飽和結合数が２以上の脂
肪酸は非常に少ない。また、オレイン酸よりパルミトレ
ン酸の方が含量が多い（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６，５５−６０，１９
８７）。この理由としては、サッカロマイセス・シェル
ビッシェの△９不飽和化酵素がステアリン酸よりパルミ
チン酸への基質特異性が高いことが考えられる。
利用されている酵母サッカロマイセス・シェルビッシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）の細胞内の主な不飽和脂肪酸はパルミトレン酸とオ
レイン酸で、リノール酸等の不飽和結合数が２以上の脂
肪酸は非常に少ない。また、オレイン酸よりパルミトレ
ン酸の方が含量が多い（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６，５５−６０，１９
８７）。この理由としては、サッカロマイセス・シェル
ビッシェの△９不飽和化酵素がステアリン酸よりパルミ
チン酸への基質特異性が高いことが考えられる。
【０００６】生体膜の相転移温度は、膜を構成している
脂質の脂肪酸の不飽和結合に依存し、不飽和結合の多い
脂肪酸が多いほど低くなる。膜の相転移温度が低いと低
温においても生体膜の流動性が維持されて細胞は低温傷
害を受け難くなることがらん藻で報告されている（Ｎａ
ｔｕｒｅ，３４７，２００−２０３，１９９０）。
脂質の脂肪酸の不飽和結合に依存し、不飽和結合の多い
脂肪酸が多いほど低くなる。膜の相転移温度が低いと低
温においても生体膜の流動性が維持されて細胞は低温傷
害を受け難くなることがらん藻で報告されている（Ｎａ
ｔｕｒｅ，３４７，２００−２０３，１９９０）。
【０００７】通常のサッカロマイセス・シェルビッシエ
は冷凍耐性が低く、この原因の一つは細胞内の膜脂質の
脂肪酸の不飽和化度が低いためと考えられている（凍結
及び乾燥研究会会誌、２９，１６−２０，１９８３）。
一方、製パン業において作業工程の簡素化を目的として
導入している冷凍生地製パン法では、パン酵母の冷凍耐
性の低さが問題となっている。
は冷凍耐性が低く、この原因の一つは細胞内の膜脂質の
脂肪酸の不飽和化度が低いためと考えられている（凍結
及び乾燥研究会会誌、２９，１６−２０，１９８３）。
一方、製パン業において作業工程の簡素化を目的として
導入している冷凍生地製パン法では、パン酵母の冷凍耐
性の低さが問題となっている。
【０００８】そこで、サッカロマイセス・シェルビシェ
の冷凍耐性を向上させる方法としてリノール酸を生合成
できるような遺伝学的改変が最も直接的な手法と考えら
れる。しかし、例えば、植物アラビドプシス（Ａｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から単離された△
１２不飽和酵素遺伝子をサッカロマイセス・シェルビッ
シェに導入すれば、リノール酸を生合成できることが報
告されているが（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１
１，２２３−２２６，１９９６）、この遺伝子導入した
サッカロマイセス・シェルビッシェは、依然パルミトレ
ン酸含量が高く、膜の相転移温度の低下を望める改変は
達成されていない。
の冷凍耐性を向上させる方法としてリノール酸を生合成
できるような遺伝学的改変が最も直接的な手法と考えら
れる。しかし、例えば、植物アラビドプシス（Ａｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から単離された△
１２不飽和酵素遺伝子をサッカロマイセス・シェルビッ
シェに導入すれば、リノール酸を生合成できることが報
告されているが（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１
１，２２３−２２６，１９９６）、この遺伝子導入した
サッカロマイセス・シェルビッシェは、依然パルミトレ
ン酸含量が高く、膜の相転移温度の低下を望める改変は
達成されていない。
【０００９】これは、サッカロマイセス・シェルビッシ
ェの△９不飽和化酵素がステアリン酸よりもパルミチン
酸に基質特異性か高いために、導入した△１２不飽和化
酵素の基質となるオレイン酸が充分に存在しないためと
考えられる。
ェの△９不飽和化酵素がステアリン酸よりもパルミチン
酸に基質特異性か高いために、導入した△１２不飽和化
酵素の基質となるオレイン酸が充分に存在しないためと
考えられる。
【００１０】従って、この様に遺伝子を利用してパン酵
母の冷凍耐性を向上させるにはパルミチン酸よりオレイ
ン酸に基質特異性の高い△９不飽和化酵素を探してその
遺伝子を導入してリノール酸の前駆体であるオレイン酸
を増加させる方法が考えられる。
母の冷凍耐性を向上させるにはパルミチン酸よりオレイ
ン酸に基質特異性の高い△９不飽和化酵素を探してその
遺伝子を導入してリノール酸の前駆体であるオレイン酸
を増加させる方法が考えられる。
【００１１】こうしたアプローチをとろうとすれば、パ
ルミチン酸よりオレイン酸に対して基質特異性の高い不
飽和化酵素をコードする遺伝子を取得することが必要で
ある。
ルミチン酸よりオレイン酸に対して基質特異性の高い不
飽和化酵素をコードする遺伝子を取得することが必要で
ある。
【００１２】しかし、不飽和化酵素は反応に還元力を必
要とし、酵母では細胞内の小胞体膜に結合してチトクロ
ームｂ５等の電子伝達を行う酵素群と一緒に働くことに
よって脂肪酸に不飽和結合を導入する（Ａｒｃｈ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｙ．，１７５，２８４−２
９４，１９７６）。このことから、通常加水分解酵素等
を分離精製する際の手法で採られるような酵素を細胞か
ら分離し単一に精製した後、アミノ酸配列の知見から遺
伝子をクローン化すること困難である。
要とし、酵母では細胞内の小胞体膜に結合してチトクロ
ームｂ５等の電子伝達を行う酵素群と一緒に働くことに
よって脂肪酸に不飽和結合を導入する（Ａｒｃｈ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｙ．，１７５，２８４−２
９４，１９７６）。このことから、通常加水分解酵素等
を分離精製する際の手法で採られるような酵素を細胞か
ら分離し単一に精製した後、アミノ酸配列の知見から遺
伝子をクローン化すること困難である。
【００１３】従って、パルミチン酸よりステアリン酸に
基質特異性の高い△９不飽和化酵素の遺伝子を得るに
は、目的とする遺伝子を有すると考えられる生物を探索
し、その生物から何らかの手段で不飽和化酵素遺伝子を
単離し、更にそれを酵母に導入して、その形質転換体の
脂肪酸組成を分析し、目的とする特性を有する酵素の遺
伝子なのかを判定するといった煩雑な研究が必要とな
る。
基質特異性の高い△９不飽和化酵素の遺伝子を得るに
は、目的とする遺伝子を有すると考えられる生物を探索
し、その生物から何らかの手段で不飽和化酵素遺伝子を
単離し、更にそれを酵母に導入して、その形質転換体の
脂肪酸組成を分析し、目的とする特性を有する酵素の遺
伝子なのかを判定するといった煩雑な研究が必要とな
る。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】パルミチン酸よりステ
アリン酸に基質特異性の高い△９不飽和化酵素をコード
する新規な遺伝子、該遺伝子を導入した形質転換体を提
供すること。
アリン酸に基質特異性の高い△９不飽和化酵素をコード
する新規な遺伝子、該遺伝子を導入した形質転換体を提
供すること。
【００１５】
【課題を解決するための手段】我々は鋭意研究した結
果、パルミチン酸よりスレアリン酸に基質特異性の高い
△９不飽和化酵素遺伝子を有するであろう酵母ピヒア・
アングスタを見出し、その△９不飽和化酵素遺伝子を単
離して、種々遺伝子組換え酵母を作成することによって
酵素の特性を把握し、本発明に至った。
果、パルミチン酸よりスレアリン酸に基質特異性の高い
△９不飽和化酵素遺伝子を有するであろう酵母ピヒア・
アングスタを見出し、その△９不飽和化酵素遺伝子を単
離して、種々遺伝子組換え酵母を作成することによって
酵素の特性を把握し、本発明に至った。
【００１６】すなわち、本発明は、パルミチン酸よりス
テアリン酸に基質特異性が高い特性を有する、△９不飽
和化酵素をコードする遺伝子が、配列表の配列番号７に
記載の塩基配列のうち、塩基番号４９８〜１８５０で表
される塩基配列を含むことを特徴とする△９不飽和化酵
素をコードする遺伝子及びこの遺伝子を含有する形質転
換された酵母である。
テアリン酸に基質特異性が高い特性を有する、△９不飽
和化酵素をコードする遺伝子が、配列表の配列番号７に
記載の塩基配列のうち、塩基番号４９８〜１８５０で表
される塩基配列を含むことを特徴とする△９不飽和化酵
素をコードする遺伝子及びこの遺伝子を含有する形質転
換された酵母である。
【００１７】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】（１） 各種酵母の細胞内脂肪酸組成物の
分析 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＳＨ ９８６、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｂａｋｅｒ
ｓ’ｙｅａｓｔ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｉｔｏａｎａ
ＩＦＯ ０３８０、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ Ｉ
ＦＯ １４７５、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ ＩＦＯ １６５９、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
ＩＦＯ １２８９、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅ
ｙｉ ＩＦＯ １２８９、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓＩＦＯ １９８５株等
の各種酵母菌株を培養し、酵母の細胞内脂肪酸組成の分
析を行った。
分析 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＳＨ ９８６、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｂａｋｅｒ
ｓ’ｙｅａｓｔ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｉｔｏａｎａ
ＩＦＯ ０３８０、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ Ｉ
ＦＯ １４７５、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａ ＩＦＯ １６５９、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
ＩＦＯ １２８９、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅ
ｙｉ ＩＦＯ １２８９、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓＩＦＯ １９８５株等
の各種酵母菌株を培養し、酵母の細胞内脂肪酸組成の分
析を行った。
【００１９】その結果、ピヒア・アングスタＩＦＯ１４
７５が、（オレイン酸＋リノール酸＋リノレン酸）／パ
ルミトレン酸の比の値が最も高かったので、ピヒア・ア
ングスタＩＦＯ１４７５の不飽和化酵素遺伝子に着目
し、その利用を図ることにした。
７５が、（オレイン酸＋リノール酸＋リノレン酸）／パ
ルミトレン酸の比の値が最も高かったので、ピヒア・ア
ングスタＩＦＯ１４７５の不飽和化酵素遺伝子に着目
し、その利用を図ることにした。
【００２０】（２） ピヒア△９不飽和化酵素遺伝子断
片のクローニング ピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５の菌株を培養し、該
菌体からＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｈｅｒｅｆｏｒｄ，
Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８，１２６１，１９
７９）に従って染色体ＤＮＡを抽出して、該菌体の染色
体ＤＮＡを得た。得られた染色体ＤＮＡを鋳型にし、次
に述べるようなプライマーを組み合わせてＰＣＲを行う
ことにより、該染色体ＤＮＡの増幅を行い、その結果、
数種類のＤＮＡ断片の増幅が見られた。
片のクローニング ピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５の菌株を培養し、該
菌体からＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｈｅｒｅｆｏｒｄ，
Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８，１２６１，１９
７９）に従って染色体ＤＮＡを抽出して、該菌体の染色
体ＤＮＡを得た。得られた染色体ＤＮＡを鋳型にし、次
に述べるようなプライマーを組み合わせてＰＣＲを行う
ことにより、該染色体ＤＮＡの増幅を行い、その結果、
数種類のＤＮＡ断片の増幅が見られた。
【００２１】このＰＣＲ法で用いるプライマーとして
は、サッカロマイセス・シェルビッシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１
９９０）、ラット（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
１，１３２３０−１３２３５，１９８６）及びマウス
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１７２９１−１
７３００，１９８８）の△９不飽和化酵素遺伝子のＤＮ
Ａ配列から推定されるアミノ酸配列を比較し、相同性の
高い領域より調製したもの、すなわち、配列番号１〜５
に示すプライマーＰ１０、Ｐ１２、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ
３０等を使用した。
は、サッカロマイセス・シェルビッシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１
９９０）、ラット（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
１，１３２３０−１３２３５，１９８６）及びマウス
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１７２９１−１
７３００，１９８８）の△９不飽和化酵素遺伝子のＤＮ
Ａ配列から推定されるアミノ酸配列を比較し、相同性の
高い領域より調製したもの、すなわち、配列番号１〜５
に示すプライマーＰ１０、Ｐ１２、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ
３０等を使用した。
【００２２】また、同時にプライマーＰ１０とＰ３０を
用いてサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６よ
り調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、サ
ッカロマイセス・シェルビッシェの△９不飽和化酵素遺
伝子（Ｓ−ＯＬＥ１）の６５０ｂｐの断片（Ａ６３）を
増幅した。
用いてサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６よ
り調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、サ
ッカロマイセス・シェルビッシェの△９不飽和化酵素遺
伝子（Ｓ−ＯＬＥ１）の６５０ｂｐの断片（Ａ６３）を
増幅した。
【００２３】ピヒア染色体ＤＮＡよりＰＣＲで増幅した
ＤＮＡ断片にＳ−ＯＬＥ１と相同性を示すものがあるの
か調べるため、このＡ６３をプローブとしたサザンハイ
ブリダイゼーションを行った。その結果、プライマーＰ
１０とＰ２０及びＰ１２とＰ２１を用いたＰＣＲで増幅
した５５０ｂｐのＤＮＡ断片がプライマーと強い相同性
を示すことが分かった。
ＤＮＡ断片にＳ−ＯＬＥ１と相同性を示すものがあるの
か調べるため、このＡ６３をプローブとしたサザンハイ
ブリダイゼーションを行った。その結果、プライマーＰ
１０とＰ２０及びＰ１２とＰ２１を用いたＰＣＲで増幅
した５５０ｂｐのＤＮＡ断片がプライマーと強い相同性
を示すことが分かった。
【００２４】そこで、Ｐ１２とＰ２１で増幅したＤＮＡ
断片（Ｆ２１）を抽出・精製し、制限酵素、例えば、Ｂ
ａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、得られたＤＮＡ断
片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）等のベクターを制限酵素、例えば、Ｂａｍ
ＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断した部位へ連結し、該
ＤＮＡ断片を含むプラスミドを作成した。このプラスミ
ドを大腸菌に導入し、クローニングを行った。次いで、
クローニングしたＤＮＡ断片（Ｆ２１）の塩基配列を決
定した（配列番号６）。この配列から推定されるアミノ
酸配列をＳ−ＯＬＥ１の対応する領域と比較すると、５
３％の相同性であった。
断片（Ｆ２１）を抽出・精製し、制限酵素、例えば、Ｂ
ａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、得られたＤＮＡ断
片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）等のベクターを制限酵素、例えば、Ｂａｍ
ＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断した部位へ連結し、該
ＤＮＡ断片を含むプラスミドを作成した。このプラスミ
ドを大腸菌に導入し、クローニングを行った。次いで、
クローニングしたＤＮＡ断片（Ｆ２１）の塩基配列を決
定した（配列番号６）。この配列から推定されるアミノ
酸配列をＳ−ＯＬＥ１の対応する領域と比較すると、５
３％の相同性であった。
【００２５】（３） ピヒア・アングスタ完全長△９不
飽和化酵素遺伝子のクローニング （２）で調製したピヒア・アングスタ１ＦＯ１４７５の
染色体ＤＮＡを制限酵素、例えば、ＳａｃＩで切断し、
得られたＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫ
Ｓ−等のベクターを制限酵素、例えば、ＳａｃＩにより
切断した部位へ連結した後、大腸菌へ導入し、染色体Ｄ
ＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーに対し
て上記（２）で取得したＤＮＡ断片をプローブとしたコ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクロ
ーンを得た。
飽和化酵素遺伝子のクローニング （２）で調製したピヒア・アングスタ１ＦＯ１４７５の
染色体ＤＮＡを制限酵素、例えば、ＳａｃＩで切断し、
得られたＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫ
Ｓ−等のベクターを制限酵素、例えば、ＳａｃＩにより
切断した部位へ連結した後、大腸菌へ導入し、染色体Ｄ
ＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーに対し
て上記（２）で取得したＤＮＡ断片をプローブとしたコ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクロ
ーンを得た。
【００２６】このクローンには約３．３ｋｂｐのＳａｃ
ＩＤＮＡ断片がクローニングされており、ＳａｃＩ切断
部位から約２．２ｋｂｐまでの領域の塩基配列を決定し
た。配列番号７にその塩基配列と推定されるアミノ酸配
列をそれぞれ示す。
ＩＤＮＡ断片がクローニングされており、ＳａｃＩ切断
部位から約２．２ｋｂｐまでの領域の塩基配列を決定し
た。配列番号７にその塩基配列と推定されるアミノ酸配
列をそれぞれ示す。
【００２７】この塩基配列の解析結果からクローニング
したＤＮＡ断片には、１，３５３ｂｐのタンパク質コー
ド領域（ＯＲＦ）があり、４５１アミノ酸からなる４
９．６ｋＤａのタンパク質をコードしていると考えられ
た。塩基配列から推定されるアミノ酸配列をＳ−ＯＬＥ
１の推定アミノ酸配列と比較すると相同性は６２％であ
った。このことから約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片には、
ピヒアの△９不飽和化酵素遺伝子Ｐ−ＯＬＥ１がクロー
ニングされていると判断した。
したＤＮＡ断片には、１，３５３ｂｐのタンパク質コー
ド領域（ＯＲＦ）があり、４５１アミノ酸からなる４
９．６ｋＤａのタンパク質をコードしていると考えられ
た。塩基配列から推定されるアミノ酸配列をＳ−ＯＬＥ
１の推定アミノ酸配列と比較すると相同性は６２％であ
った。このことから約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片には、
ピヒアの△９不飽和化酵素遺伝子Ｐ−ＯＬＥ１がクロー
ニングされていると判断した。
【００２８】また、ストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつパルミチン酸よりステアリン酸に基質
特異性が高い△９不飽和化酵素をコードする遺伝子も本
発明に含まれる。なお、ストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするとは、実施例（２）に示されるサザン
ハイブリダイゼーションの処理条件よりも強い条件によ
りＰ−ＯＬＥ１をハイブリダイズすることを指す。具体
的には、実施例２におけるハイブリ溶液の塩濃度は、５
ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．０２％Ｓ
ＤＳ、０．５％スキムミルク溶液、１００μｇ／ｍｌサ
ケ変性ＤＮＡから成るが、この組成よりもハイブリ溶液
の構成成分の濃度が高いか、ハイブリダイゼーション温
度が５５℃以上か、膜洗浄溶液が０．１％ＳＤＳ、０．
２ＸＳＳＣの組成より高い濃度の溶液であるか、膜洗浄
温度が５０℃以上の場合をいう。
リダイズし、かつパルミチン酸よりステアリン酸に基質
特異性が高い△９不飽和化酵素をコードする遺伝子も本
発明に含まれる。なお、ストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするとは、実施例（２）に示されるサザン
ハイブリダイゼーションの処理条件よりも強い条件によ
りＰ−ＯＬＥ１をハイブリダイズすることを指す。具体
的には、実施例２におけるハイブリ溶液の塩濃度は、５
ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．０２％Ｓ
ＤＳ、０．５％スキムミルク溶液、１００μｇ／ｍｌサ
ケ変性ＤＮＡから成るが、この組成よりもハイブリ溶液
の構成成分の濃度が高いか、ハイブリダイゼーション温
度が５５℃以上か、膜洗浄溶液が０．１％ＳＤＳ、０．
２ＸＳＳＣの組成より高い濃度の溶液であるか、膜洗浄
温度が５０℃以上の場合をいう。
【００２９】ところで、このようにして決定されたＤＮ
Ａ断片の塩基配列及びそれより推定されるアミノ酸配列
は、配列表の配列番号７に示すものが挙げられるが、か
かるＤＮＡ断片がコードするポリペプチドが、パルミチ
ン酸よりステアリン酸に基質特異性が高いという△９不
飽和化活性を損なわない範囲で、一部のアミノ酸又は核
酸を除去、置換或いは付加する等の改変を行ったものも
本発明に含まれる。
Ａ断片の塩基配列及びそれより推定されるアミノ酸配列
は、配列表の配列番号７に示すものが挙げられるが、か
かるＤＮＡ断片がコードするポリペプチドが、パルミチ
ン酸よりステアリン酸に基質特異性が高いという△９不
飽和化活性を損なわない範囲で、一部のアミノ酸又は核
酸を除去、置換或いは付加する等の改変を行ったものも
本発明に含まれる。
【００３０】（４） Ｐ−ＯＬＥ１酵母発現組換えベク
ターの構築 一般的に外来遺伝子を酵母中で発現させるのに用いるベ
クターとしては、酵母と大腸菌内で自立複製可能なＹＣ
ｐ型ベクター、例えばｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐ
ＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、
ｐＲＳ３１６（ＡＴＣＣｐＲＳ３１６）（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ，１２２，１９−２７，１９８９）、ＹＥｐベクタ
ーｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐ５２０（Ａ
ｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．，３０，，，５１５−５２０，１９８９）や、大腸
菌中では自立複製可能だが酵母中では自立複製しない組
み込み型ベクターＹＩｐ型ベクター、例えばｐＲＳ４０
３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６（ＳＴ
ＲＡＴＡＧＥＮＥ）が挙げられる。これら用いてＰ−Ｏ
ＬＥ１を酵母中で発現させるには、遺伝子発現用のプロ
モーターが挿入されているベクターの場合は外来遺伝子
挿入部位にＰ−ＯＬＥ１を制限酵素を用いて接続すれば
Ｐ−ＯＬＥ１酵母発現組換えベクターが作成できる。ま
た、発現用プロモーター無いベクターの場合はＰ−ＯＬ
Ｅ１の５’上流のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を
ベクターに挿入すればＰ−ＯＬＥ１酵母発現組換えベク
ターが作成できる。
ターの構築 一般的に外来遺伝子を酵母中で発現させるのに用いるベ
クターとしては、酵母と大腸菌内で自立複製可能なＹＣ
ｐ型ベクター、例えばｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐ
ＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、
ｐＲＳ３１６（ＡＴＣＣｐＲＳ３１６）（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ，１２２，１９−２７，１９８９）、ＹＥｐベクタ
ーｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐ５２０（Ａ
ｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．，３０，，，５１５−５２０，１９８９）や、大腸
菌中では自立複製可能だが酵母中では自立複製しない組
み込み型ベクターＹＩｐ型ベクター、例えばｐＲＳ４０
３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６（ＳＴ
ＲＡＴＡＧＥＮＥ）が挙げられる。これら用いてＰ−Ｏ
ＬＥ１を酵母中で発現させるには、遺伝子発現用のプロ
モーターが挿入されているベクターの場合は外来遺伝子
挿入部位にＰ−ＯＬＥ１を制限酵素を用いて接続すれば
Ｐ−ＯＬＥ１酵母発現組換えベクターが作成できる。ま
た、発現用プロモーター無いベクターの場合はＰ−ＯＬ
Ｅ１の５’上流のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を
ベクターに挿入すればＰ−ＯＬＥ１酵母発現組換えベク
ターが作成できる。
【００３１】そこで、（３）で得た組換えベクターより
制限酵素を用いて３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出
し、ＹＣｐ型ベクターｐＲＳ３１６のクローニング部位
へ連結して、組換えベクターを作成した。この組換えベ
クターを大腸菌ＪＭ１０９へ導入し、この大腸菌を形質
転換した。次に、得られた形質転換体を培養後、組換え
ベクターを抽出、精製し、制限酵素、例えば、ＳａｃＩ
で切断して電気泳動を行い、ｐＲＳ３１６に３．３ｋｂ
ｐの断片が導入された組換えベクターｐ１３１１（図
１）を保持する形質転換された大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１
３１１）を選別した。
制限酵素を用いて３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出
し、ＹＣｐ型ベクターｐＲＳ３１６のクローニング部位
へ連結して、組換えベクターを作成した。この組換えベ
クターを大腸菌ＪＭ１０９へ導入し、この大腸菌を形質
転換した。次に、得られた形質転換体を培養後、組換え
ベクターを抽出、精製し、制限酵素、例えば、ＳａｃＩ
で切断して電気泳動を行い、ｐＲＳ３１６に３．３ｋｂ
ｐの断片が導入された組換えベクターｐ１３１１（図
１）を保持する形質転換された大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１
３１１）を選別した。
【００３２】更に、Ｐ−ＯＬＥ１の翻訳開始点上流１１
塩基目からのＤＮＡ配列より、また、終止コドン下流３
７塩基からのＤＮＡ配列より、それぞれプライマーを合
成し、このプライマーを使用してピヒアＩＦＯ１４７５
の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、Ｐ−ＯＬＥ
１の構造遺伝子部分である１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を
増幅した。次いで、増幅したＤＮＡ断片をＹＥｐ型ベク
ターｐ５２０のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｏｒｏｇｅｎａｓｅ
（ＧＡＰ）プロモーターの下流に連結して、組換えベク
ターを作成した。この組換えベクターを大腸菌ＪＭ１０
９へ導入し、形質転換された大腸菌を得た。そして、こ
の形質転換体を培養後、組換えベクターを抽出し、これ
を制限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、
ｐ５２０に１．４ｋｂｐの切断が導入された組換えベク
ターｐ１２１９（図２）を保持した形質転換された大腸
菌ＪＭ１０９（ｐ１２１９）を選別した。
塩基目からのＤＮＡ配列より、また、終止コドン下流３
７塩基からのＤＮＡ配列より、それぞれプライマーを合
成し、このプライマーを使用してピヒアＩＦＯ１４７５
の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、Ｐ−ＯＬＥ
１の構造遺伝子部分である１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を
増幅した。次いで、増幅したＤＮＡ断片をＹＥｐ型ベク
ターｐ５２０のｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｏｒｏｇｅｎａｓｅ
（ＧＡＰ）プロモーターの下流に連結して、組換えベク
ターを作成した。この組換えベクターを大腸菌ＪＭ１０
９へ導入し、形質転換された大腸菌を得た。そして、こ
の形質転換体を培養後、組換えベクターを抽出し、これ
を制限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、
ｐ５２０に１．４ｋｂｐの切断が導入された組換えベク
ターｐ１２１９（図２）を保持した形質転換された大腸
菌ＪＭ１０９（ｐ１２１９）を選別した。
【００３３】また、対照として、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１９９０で報
告されているＳ−ＯＬＥ１のＤＮＡ配列を参考にしてＳ
−ＯＬＥ１の翻訳開始点から上流１０塩基目からの配列
より、また、終止コドンからの配列より、それぞれ、プ
ライマーを合成し、このプライマーを使用してサッカロ
マイセス・シェルビッシェＳ２８８Ｃ（ＭＡＴａ ｍａ
ｌ ｍｅｌ ｇａｌ）（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ保存、米国）（「Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｃｏ
ｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ」Ｃ．Ｓ．Ｈ）の
染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、１．８ｋｂｐ
の増幅したＤＮＡ断片を得た。そして、このＤＮＡ断片
をｐ５２０のＧＡＰプロモーターの下流に連結して、組
換えベクターを作成した。次いで、この組換えベクター
を大腸菌ＪＭ１０９へ導入し、形質転換された大腸菌を
得た。そして、この形質転換体を培養後、組換えベクタ
ーを抽出し、これをＳａｌＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動を行い、ｐ５２０に１．８ｋｂｐ（７）Ｓ−Ｏ
ＬＥ１が挿入された組換えベクターｐ１３２１（図３）
を保持する形質転換された大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１３２
１）を選別した。
ｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１９９０で報
告されているＳ−ＯＬＥ１のＤＮＡ配列を参考にしてＳ
−ＯＬＥ１の翻訳開始点から上流１０塩基目からの配列
より、また、終止コドンからの配列より、それぞれ、プ
ライマーを合成し、このプライマーを使用してサッカロ
マイセス・シェルビッシェＳ２８８Ｃ（ＭＡＴａ ｍａ
ｌ ｍｅｌ ｇａｌ）（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ保存、米国）（「Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｃｏ
ｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ」Ｃ．Ｓ．Ｈ）の
染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、１．８ｋｂｐ
の増幅したＤＮＡ断片を得た。そして、このＤＮＡ断片
をｐ５２０のＧＡＰプロモーターの下流に連結して、組
換えベクターを作成した。次いで、この組換えベクター
を大腸菌ＪＭ１０９へ導入し、形質転換された大腸菌を
得た。そして、この形質転換体を培養後、組換えベクタ
ーを抽出し、これをＳａｌＩで切断後、アガロースゲル
電気泳動を行い、ｐ５２０に１．８ｋｂｐ（７）Ｓ−Ｏ
ＬＥ１が挿入された組換えベクターｐ１３２１（図３）
を保持する形質転換された大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１３２
１）を選別した。
【００３４】（５）Ｐ−ＯＬＥ１導入形質転換酵母の作
成と脂肪酸組成 ｐ５２０と（４）で作成したｐ１２１９とｐ１３２１を
それぞれ酢酸リチウム法によってサッカロマイセス・シ
ェルビッシェＳＨ９８６に導入し、得られた形質転換体
を合成選択寒天培地に塗布して、形質転換体サッカロマ
イセス・シェルビッシェＳＨ９８６（ｐ５２０）、サッ
カロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６（ｐ１２１
９）とサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６
（ｐ１３２１）を選別し、取得した。
成と脂肪酸組成 ｐ５２０と（４）で作成したｐ１２１９とｐ１３２１を
それぞれ酢酸リチウム法によってサッカロマイセス・シ
ェルビッシェＳＨ９８６に導入し、得られた形質転換体
を合成選択寒天培地に塗布して、形質転換体サッカロマ
イセス・シェルビッシェＳＨ９８６（ｐ５２０）、サッ
カロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６（ｐ１２１
９）とサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６
（ｐ１３２１）を選別し、取得した。
【００３５】これら３種類の形質転換体を培養後、遠心
分離によって菌体を集め、（１）と同様にそれぞれの細
胞の脂肪酸組成を調べた。その結果を表２に示す。
分離によって菌体を集め、（１）と同様にそれぞれの細
胞の脂肪酸組成を調べた。その結果を表２に示す。
【００３６】３種類の形質転換酵母の脂肪酸組成は大き
な差がなく、この結果からでは、Ｐ−ＯＬＥ１の基質特
異性に関する機能が明確にできなかったので、次のよう
な実験を行った。
な差がなく、この結果からでは、Ｐ−ＯＬＥ１の基質特
異性に関する機能が明確にできなかったので、次のよう
な実験を行った。
【００３７】まず、ＯＬＥ１が欠失しているため培地中
にオレイン酸等の不飽和脂肪酸を加えなければ増殖でき
ない、Ｓ−ＯＬＥ１変異株で形質転換体の選択マーカー
を有するサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４
８（ＭＡＴａ ｏｌｅｌ ｈｉｓｌ−２９ ｌｅｕ２−
３，１１２ｔｒｐｌ ｕｒａ３−５２）（大阪大学・工
学部・応用生物工学科・生物情報工学研究室保存）を作
成した。
にオレイン酸等の不飽和脂肪酸を加えなければ増殖でき
ない、Ｓ−ＯＬＥ１変異株で形質転換体の選択マーカー
を有するサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４
８（ＭＡＴａ ｏｌｅｌ ｈｉｓｌ−２９ ｌｅｕ２−
３，１１２ｔｒｐｌ ｕｒａ３−５２）（大阪大学・工
学部・応用生物工学科・生物情報工学研究室保存）を作
成した。
【００３８】このサッカロマイセス・シェルビッシェＳ
Ｈ４３４８にｐ１３１１、ｐ１２１９及びｐ１３２１を
酢酸リチウム法によってそれぞれ導入し、ｐ１３１１の
形質転換体はウラシルを、ｐ１２１９とｐ１３２１の形
質転換体はトリプトファンを含まないオレイン酸添加合
成選択寒天培地に塗布して、形質転換体サッカロマイセ
ス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１３１１）、サッ
カロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１２１
９）とサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８
（ｐ１３２１）を選別し、取得した。
Ｈ４３４８にｐ１３１１、ｐ１２１９及びｐ１３２１を
酢酸リチウム法によってそれぞれ導入し、ｐ１３１１の
形質転換体はウラシルを、ｐ１２１９とｐ１３２１の形
質転換体はトリプトファンを含まないオレイン酸添加合
成選択寒天培地に塗布して、形質転換体サッカロマイセ
ス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１３１１）、サッ
カロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１２１
９）とサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８
（ｐ１３２１）を選別し、取得した。
【００３９】次に、それぞれの形質転換体をオレイン酸
を含まない合成選択寒天培地に塗布し増殖を調べた。そ
の結果、３種類の形質転換体はオレイン酸を含まない培
地で増殖しコロニーを形成した。
を含まない合成選択寒天培地に塗布し増殖を調べた。そ
の結果、３種類の形質転換体はオレイン酸を含まない培
地で増殖しコロニーを形成した。
【００４０】このことにより、クローニングしたＰ−Ｏ
ＬＥ１は、△９不飽和化酵素遺伝子を相補すること、Ｇ
ＡＰプロモーターとターミネーターで転写を制御できる
こと及びＰ−ＯＬＥ１のプロモーターがサッカロマイセ
ス・シェルビッシェ中で機能することが分かった。
ＬＥ１は、△９不飽和化酵素遺伝子を相補すること、Ｇ
ＡＰプロモーターとターミネーターで転写を制御できる
こと及びＰ−ＯＬＥ１のプロモーターがサッカロマイセ
ス・シェルビッシェ中で機能することが分かった。
【００４１】次に、これら３種類の形質転換体を７２時
間培養後、遠心分離によって菌体を集め、（１）と同様
にそれぞれの細胞の脂肪酸組成を調べた（表３）。
間培養後、遠心分離によって菌体を集め、（１）と同様
にそれぞれの細胞の脂肪酸組成を調べた（表３）。
【００４２】脂肪酸組成から計算されるオレイン酸／パ
ルミトレン酸の値は、Ｐ−ＯＬＥ１を導入したＳＨ４３
４８（ｐ１２１９）とＳＨ４３４８（ｐ１３１１）は、
ＳＨ４３４８（ｐ１３２１）に比べ有意に高いことが分
かった。
ルミトレン酸の値は、Ｐ−ＯＬＥ１を導入したＳＨ４３
４８（ｐ１２１９）とＳＨ４３４８（ｐ１３１１）は、
ＳＨ４３４８（ｐ１３２１）に比べ有意に高いことが分
かった。
【００４３】このことにより、Ｐ−ＯＬＥ１がコードす
る翻訳産物である△９不飽和化酵素は、パルミチン酸よ
りステアリン酸に対して基質特異性が高いことが判明し
た。
る翻訳産物である△９不飽和化酵素は、パルミチン酸よ
りステアリン酸に対して基質特異性が高いことが判明し
た。
【００４４】また、サッカロマイセス・シェルビッシェ
が本来有する△９不飽和化酵素遺伝子Ｓ−ＯＬＥ１を変
異処理や遺伝子導入による相同組換え等によって破壊し
た後Ｐ−ＯＬＥ１を組み込めば、パルミトレン酸含有量
が低くオレイン酸含有量が高い酵母を作り出せることが
判明した。
が本来有する△９不飽和化酵素遺伝子Ｓ−ＯＬＥ１を変
異処理や遺伝子導入による相同組換え等によって破壊し
た後Ｐ−ＯＬＥ１を組み込めば、パルミトレン酸含有量
が低くオレイン酸含有量が高い酵母を作り出せることが
判明した。
【００４５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を実施
例により詳細に説明する。
例により詳細に説明する。
【００４６】
（１）各種酵母の細胞内脂肪酸組成の分析 １２１℃、２０分間加熱滅菌したＹＰＤ液体培地（酵母
エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース１％）１０
０ｍｌが入った５００ｍｌ容坂口フラスコにＹＰＤ寒天
培地スラントより酵母菌体を植菌し、３０℃、１２０ｒ
ｐｍで２４時間振とう培養した前培養液２ｍｌを同じ培
地に移植し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培
養後、遠心分離によって菌体を集めた。菌体は蒸留水で
洗浄後、湿菌体１ｇに対して１０％水酸化カリウム・メ
タノール溶液０．８ｍｌを加え８０℃で２時間ケン化し
た。その後、石油エーテル１ｍｌで洗浄後、６Ｎ塩酸
０．３ｍｌと石油エーテル３ｍｌを加えて脂肪酸を抽出
し、窒素ガスで石油エーテルを揮発させ、脂肪酸を乾固
した。これに３フッ化ホウ素メタノール溶液０．５ｍｌ
を加えて８０℃で３分間反応させてメチルエステル化し
た。この溶液に飽和食塩水２ｍｌ加えた後、ｎ−ヘキサ
ン１ｍｌを加えて脂肪酸メチルエステルを抽出した。脂
肪酸組成はヘキサン抽出液をガスクロマトグラフィーに
供し、検出されたピーク面積比から求めた。ガスクロマ
トグラフィーの条件は、ＰＰＧＳ２０％、Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｒｂＷＡＷ８０／１００を充填した２ｍのガラスカ
ラムを使用し、カラム温度２１０℃、インジェクタ温度
２４０℃、検出器温度２４０℃、窒素ガス流速４０ｍｌ
／分、検出Ｆ Ｉｌ）（Ｈ２５０ｋｇ／ｃｍ２、エアー
５０ｋｇ／ｃｍ２）とした。結果を表１に示す。
エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース１％）１０
０ｍｌが入った５００ｍｌ容坂口フラスコにＹＰＤ寒天
培地スラントより酵母菌体を植菌し、３０℃、１２０ｒ
ｐｍで２４時間振とう培養した前培養液２ｍｌを同じ培
地に移植し、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間振とう培
養後、遠心分離によって菌体を集めた。菌体は蒸留水で
洗浄後、湿菌体１ｇに対して１０％水酸化カリウム・メ
タノール溶液０．８ｍｌを加え８０℃で２時間ケン化し
た。その後、石油エーテル１ｍｌで洗浄後、６Ｎ塩酸
０．３ｍｌと石油エーテル３ｍｌを加えて脂肪酸を抽出
し、窒素ガスで石油エーテルを揮発させ、脂肪酸を乾固
した。これに３フッ化ホウ素メタノール溶液０．５ｍｌ
を加えて８０℃で３分間反応させてメチルエステル化し
た。この溶液に飽和食塩水２ｍｌ加えた後、ｎ−ヘキサ
ン１ｍｌを加えて脂肪酸メチルエステルを抽出した。脂
肪酸組成はヘキサン抽出液をガスクロマトグラフィーに
供し、検出されたピーク面積比から求めた。ガスクロマ
トグラフィーの条件は、ＰＰＧＳ２０％、Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｒｂＷＡＷ８０／１００を充填した２ｍのガラスカ
ラムを使用し、カラム温度２１０℃、インジェクタ温度
２４０℃、検出器温度２４０℃、窒素ガス流速４０ｍｌ
／分、検出Ｆ Ｉｌ）（Ｈ２５０ｋｇ／ｃｍ２、エアー
５０ｋｇ／ｃｍ２）とした。結果を表１に示す。
【００４７】 （オレイン酸＋リノール酸＋リノレン酸）／パルミトレ
ン酸の比が最も高いピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５
の不飽和化酵素遺伝子を単離することとした。
ン酸の比が最も高いピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５
の不飽和化酵素遺伝子を単離することとした。
【００４８】（２）ピヒア△９不飽和化酵素遺伝子断片
のクローニング サッカロマイセス・シェルビッシュ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１９９
０）、ラット（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１
３２３０−１３２３５，１９８６）及びマウス（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１７２９１−１７３０
０，１９８８）の△９不飽和化酵素遺伝子のＤＮＡ配列
から推定されるアミノ酸配列を比較し、遺伝子解析ソフ
トＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣ（ソフトウエア開発（株））
を用いて相同性の高い領液を検索し、相同性の高い領液
を再度ＤＮＡ配列に読み変えて、配列番号１〜５に示す
プライマーＰ１０、Ｐ１２、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ３０を
設計した。そして、この配列通りの１本鎖ＤＮＡをＤＮ
ＡシンセサイザーＭＯＤＥＬ３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＡＥ
Ｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて
合成した後、濃度１００μＭの水溶液を調製してプライ
マー溶液とした。
のクローニング サッカロマイセス・シェルビッシュ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１９９
０）、ラット（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１
３２３０−１３２３５，１９８６）及びマウス（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１７２９１−１７３０
０，１９８８）の△９不飽和化酵素遺伝子のＤＮＡ配列
から推定されるアミノ酸配列を比較し、遺伝子解析ソフ
トＧＥＮＥＴＹＸ ＭＡＣ（ソフトウエア開発（株））
を用いて相同性の高い領液を検索し、相同性の高い領液
を再度ＤＮＡ配列に読み変えて、配列番号１〜５に示す
プライマーＰ１０、Ｐ１２、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ３０を
設計した。そして、この配列通りの１本鎖ＤＮＡをＤＮ
ＡシンセサイザーＭＯＤＥＬ３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＡＥ
Ｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて
合成した後、濃度１００μＭの水溶液を調製してプライ
マー溶液とした。
【００４９】一方、ピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５
の染色体ＤＮＡの調製はＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｈｅｒｅ
ｆｏｒｄ．Ｌ．，ｅｔ，ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８，１２
６１，１９７９）に従って行った。すなわち、（１）の
条件で培養したピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５の湿
菌体約１ｇを０．８Ｍソルビトールと１．３ｍｇ／ｍｌ
Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔ（生化学工業（株））
を含む０．０４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
１ｍｌ中で３５℃で１時間処理してスフェロプラスト化
した後、５％ＳＤＳ、０．１ＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａ
Ｃｌを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
１ｍｌを加えて３７℃で１時間、６０℃で３０分処理
し、染色体ＤＮＡを抽出した。更に、これを水飽和フェ
ノール溶液で２回洗浄した後、エタノール沈殿によって
ＤＮＡを回収し１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス・
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して染色体ＤＮＡ溶液
を調製した。
の染色体ＤＮＡの調製はＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｈｅｒｅ
ｆｏｒｄ．Ｌ．，ｅｔ，ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８，１２
６１，１９７９）に従って行った。すなわち、（１）の
条件で培養したピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５の湿
菌体約１ｇを０．８Ｍソルビトールと１．３ｍｇ／ｍｌ
Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔ（生化学工業（株））
を含む０．０４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
１ｍｌ中で３５℃で１時間処理してスフェロプラスト化
した後、５％ＳＤＳ、０．１ＭＥＤＴＡ、０．２ＭＮａ
Ｃｌを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
１ｍｌを加えて３７℃で１時間、６０℃で３０分処理
し、染色体ＤＮＡを抽出した。更に、これを水飽和フェ
ノール溶液で２回洗浄した後、エタノール沈殿によって
ＤＮＡを回収し１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス・
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して染色体ＤＮＡ溶液
を調製した。
【００５０】そして、この染色体ＤＮＡを鋳型にして上
記プライマーを組み合わせたＰＣＲを行った。ＰＣＲ
は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ
ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（宝酒造（株））を用いた。反応液は、最終的
にプライマー２μＭ、ｄＡＴＰ０．２ｍＭ、ｄＴＴＰ
０．２ｍＭ、ｄＧＴＰ０．２ｍＭ、ｄＣＴＰ０．２ｍ
Ｍ、ＡｍｐｌｉＴａｑｌ）ＮＡポリメラーゼ２５Ｕ／ｍ
ｌ）染色体ＤＮＡ１０μｇ／ｍｌになるように混合し、
９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイク
ルとして３５サイクル反応させた。反応液１０μｌは
２．０％アガロースゲル電気泳動後、１０ｎｇ／ｍｌ臭
化エチジウム水溶液で染色し、増幅したＤＮＡ断片の検
出を行った。その結果、数種類のＤＮＡ断片の増幅が見
られた。
記プライマーを組み合わせたＰＣＲを行った。ＰＣＲ
は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ
ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（宝酒造（株））を用いた。反応液は、最終的
にプライマー２μＭ、ｄＡＴＰ０．２ｍＭ、ｄＴＴＰ
０．２ｍＭ、ｄＧＴＰ０．２ｍＭ、ｄＣＴＰ０．２ｍ
Ｍ、ＡｍｐｌｉＴａｑｌ）ＮＡポリメラーゼ２５Ｕ／ｍ
ｌ）染色体ＤＮＡ１０μｇ／ｍｌになるように混合し、
９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイク
ルとして３５サイクル反応させた。反応液１０μｌは
２．０％アガロースゲル電気泳動後、１０ｎｇ／ｍｌ臭
化エチジウム水溶液で染色し、増幅したＤＮＡ断片の検
出を行った。その結果、数種類のＤＮＡ断片の増幅が見
られた。
【００５１】また、同時にプライマーＰ１０とＰ３０を
用いてサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６よ
り調製した染色体ＤＮＡを鋳型として上記と同じ組成の
反応液で９４℃で１分、６５℃で２分、７２℃で３分を
１サイクルとして３５サイクル反応させたＰＣＲを行
い、Ｓ−ＯＬＥ１６５０ｂｐの断片（Ａ６３）を増幅し
た。
用いてサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ９８６よ
り調製した染色体ＤＮＡを鋳型として上記と同じ組成の
反応液で９４℃で１分、６５℃で２分、７２℃で３分を
１サイクルとして３５サイクル反応させたＰＣＲを行
い、Ｓ−ＯＬＥ１６５０ｂｐの断片（Ａ６３）を増幅し
た。
【００５２】ピヒア染色体ＤＮＡよりＰＣＲで増幅した
ＤＮＡ断片にＳ−ＯＬＥ１と相同性を示すものがあるの
か調べるため、このＡ６３をプローブにしたサザンハイ
ブリダイゼーションをＤＩＧ核酸ラベリング・検出キッ
ト（ＢｏｅｈｒｉｎｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ）を用いて行った。
ＤＮＡ断片にＳ−ＯＬＥ１と相同性を示すものがあるの
か調べるため、このＡ６３をプローブにしたサザンハイ
ブリダイゼーションをＤＩＧ核酸ラベリング・検出キッ
ト（ＢｏｅｈｒｉｎｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａ）を用いて行った。
【００５３】まず、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄ
ｅｄ」（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）に従ってピピア染色
体ＤＮＡのＰＣＲ反応液を電気泳動したアガロースゲル
からナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
にＤＮＡを転写し、紫外線を照射してプロットした。次
に、キットに含まれる試薬を用いたランダムプライマー
法によってジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰでＡ６３をラベ
ルし、約５０μｇ／ｍｌのプローブ液を調製した。そし
て、このプローブ液０．５μｌを含むハイブリ溶液（５
ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ，ｓ液、０．０２％Ｓ
ＤＳ、０．５％スキムミルク溶液、１００μｇ／ｍｌサ
ケ変性ＤＮＡ）２．５ｍｌ中にナイロン膜を入れて５５
℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。０．１
％ＳＤＳを０．２ＸＳＳＣ溶液を用いて５０℃で膜を３
回洗浄後、キットに含まれるジゴキシゲニン検出試薬を
用いてプローブと相同性を示すＤＮＡ断片の検出を行っ
た。
ｎｇ．Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄ
ｅｄ」（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）に従ってピピア染色
体ＤＮＡのＰＣＲ反応液を電気泳動したアガロースゲル
からナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
にＤＮＡを転写し、紫外線を照射してプロットした。次
に、キットに含まれる試薬を用いたランダムプライマー
法によってジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰでＡ６３をラベ
ルし、約５０μｇ／ｍｌのプローブ液を調製した。そし
て、このプローブ液０．５μｌを含むハイブリ溶液（５
ＸＳＳＣ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ，ｓ液、０．０２％Ｓ
ＤＳ、０．５％スキムミルク溶液、１００μｇ／ｍｌサ
ケ変性ＤＮＡ）２．５ｍｌ中にナイロン膜を入れて５５
℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。０．１
％ＳＤＳを０．２ＸＳＳＣ溶液を用いて５０℃で膜を３
回洗浄後、キットに含まれるジゴキシゲニン検出試薬を
用いてプローブと相同性を示すＤＮＡ断片の検出を行っ
た。
【００５４】その結果、プライマーＰ１０とＰ２０及び
Ｐ１２とＰ２１を用いたＰＣＲで増幅した５５０ｂｐの
ＤＮＡ断片がプライマーと強い相同性を示した。
Ｐ１２とＰ２１を用いたＰＣＲで増幅した５５０ｂｐの
ＤＮＡ断片がプライマーと強い相同性を示した。
【００５５】そこで、Ｐ１２とＰ２１で増幅したＤＮＡ
断片（Ｆ２１）を電気泳動ゲルよりプレップＡジーンＤ
ＮＡ精製キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて抽出・精製
し、このＤＮＡ１μｇに対して制限酵素ＢａｍＨＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩをそれぞれ１０Ｕ加え、ユニバーサル緩衝
液（宝酒造（株））中で３５℃で２時間作用させた後、
エタノール沈殿によって回収した。これをＢａｍＨＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へＤＮＡライ
ゲーションシキット（宝酒造（株））を用いてライゲー
ションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル
（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換
した。そして、ランダムに形質転換体２０個を選び、こ
れを２ＴＹ液体培地（１．６％バクトトリプトン、１．
０％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に植菌し、３５℃
で１６時間培養後、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎ
ｄ ｅｄ」（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）に従ってアルカリ
・ＳＤＳ法でプラスミドを抽出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩＳＫ＋にＦ２１が挿入されたプラスミドを保持
する形質転換大腸菌を選別した。
断片（Ｆ２１）を電気泳動ゲルよりプレップＡジーンＤ
ＮＡ精製キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて抽出・精製
し、このＤＮＡ１μｇに対して制限酵素ＢａｍＨＩとＨ
ｉｎｄＩＩＩをそれぞれ１０Ｕ加え、ユニバーサル緩衝
液（宝酒造（株））中で３５℃で２時間作用させた後、
エタノール沈殿によって回収した。これをＢａｍＨＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へＤＮＡライ
ゲーションシキット（宝酒造（株））を用いてライゲー
ションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセル
（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換
した。そして、ランダムに形質転換体２０個を選び、こ
れを２ＴＹ液体培地（１．６％バクトトリプトン、１．
０％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に植菌し、３５℃
で１６時間培養後、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎ
ｄ ｅｄ」（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）に従ってアルカリ
・ＳＤＳ法でプラスミドを抽出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＩＩＳＫ＋にＦ２１が挿入されたプラスミドを保持
する形質転換大腸菌を選別した。
【００５６】クローニングしたＤＮＡ断片の配列をＴａ
ｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃ
ｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたダイターミネーター
法によって解折した。すなわちＦ２１を挿入したｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋に対してＭ１３Ｆプライマ
ー（東洋紡（株））とＭ１３プライマーＲＶ（東洋紡
（株））を用いてそれぞれ蛍光ラベル反応を行い、ＤＮ
Ａシークエンサー３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定した。決定し
た塩基配列を配列番号６に示した。この配列から推定さ
れるアミノ酸配列をＳ−ＯＬＥ１の対応する領域と比較
したところ、５３％の相同性が見い出された。
ｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃ
ｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたダイターミネーター
法によって解折した。すなわちＦ２１を挿入したｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋に対してＭ１３Ｆプライマ
ー（東洋紡（株））とＭ１３プライマーＲＶ（東洋紡
（株））を用いてそれぞれ蛍光ラベル反応を行い、ＤＮ
Ａシークエンサー３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）で分析して塩基配列を決定した。決定し
た塩基配列を配列番号６に示した。この配列から推定さ
れるアミノ酸配列をＳ−ＯＬＥ１の対応する領域と比較
したところ、５３％の相同性が見い出された。
【００５７】（３）ピヒアの完全長△９不飽和化酵素遺
伝子のクローニング （２）で調製したピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５の
染色体ＤＮＡ１μｇに制限酵素ＳａｃＩ２０Ｕを作用さ
せて完全に切断した後、ＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｃ
ｓｃｒｉｐｔ１ＩＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いてラ
イゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９コンピテント
セル（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ導入
し、ライブラリーを作成した。
伝子のクローニング （２）で調製したピヒア・アングスタＩＦＯ１４７５の
染色体ＤＮＡ１μｇに制限酵素ＳａｃＩ２０Ｕを作用さ
せて完全に切断した後、ＳａｃＩで切断したｐＢｌｕｃ
ｓｃｒｉｐｔ１ＩＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いてラ
イゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９コンピテント
セル（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ導入
し、ライブラリーを作成した。
【００５８】このライブラリーからコロニーハイブリダ
イゼーションによりピヒアの完全長△９不飽和化酵素遺
伝子を含むＤＮＡ断片のクローニングを行った。
イゼーションによりピヒアの完全長△９不飽和化酵素遺
伝子を含むＤＮＡ断片のクローニングを行った。
【００５９】アンピシリン耐性でβガラクトシダーゼ活
性を示さない形質転換体のコロニー約１，０００個を
「Ｍｏｌｃｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ」（ＣＳＨ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ）に従ってナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０枚に転写し、紫外線を照射し
てＤＮＡをプロットした。次に、（２）と同様にして、
Ｆ２１のジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰでラベルを行い、
約５０μｇ／ｍｌのプローブ液を調製した。コロニー中
のＤＮＡをプロットしたナイロン膜１枚についてプロー
ブ液０．５μｌを含むハイブリ溶液２．５ｍｌを使用
し、５５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行い、
５０℃で膜を３回洗浄後、ジゴキシゲニン検出試薬を用
いてプローブと相同性を示すコロニーの検出を行った。
その結果、ポジティブクローンを得た。そこで、このク
ローンを２ＴＹ液体培地で培養後、プラスミドを抽出、
精製し、ＳａｃＩで切断後、０．７％アガロースゲル電
気泳動を行い、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片がクローニ
ングされていることを確認した。そこで、この約３．３
ｋｂｐのＤＮＡ断片のＳａｃＩ切断部位から約２．２ｋ
ｂｐまでの塩基配列を決定した。
性を示さない形質転換体のコロニー約１，０００個を
「Ｍｏｌｃｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ」（ＣＳＨ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ）に従ってナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０枚に転写し、紫外線を照射し
てＤＮＡをプロットした。次に、（２）と同様にして、
Ｆ２１のジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰでラベルを行い、
約５０μｇ／ｍｌのプローブ液を調製した。コロニー中
のＤＮＡをプロットしたナイロン膜１枚についてプロー
ブ液０．５μｌを含むハイブリ溶液２．５ｍｌを使用
し、５５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行い、
５０℃で膜を３回洗浄後、ジゴキシゲニン検出試薬を用
いてプローブと相同性を示すコロニーの検出を行った。
その結果、ポジティブクローンを得た。そこで、このク
ローンを２ＴＹ液体培地で培養後、プラスミドを抽出、
精製し、ＳａｃＩで切断後、０．７％アガロースゲル電
気泳動を行い、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片がクローニ
ングされていることを確認した。そこで、この約３．３
ｋｂｐのＤＮＡ断片のＳａｃＩ切断部位から約２．２ｋ
ｂｐまでの塩基配列を決定した。
【００６０】ＤＮＡ断片の配列の解析は、△ＴｔｈＤＮ
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐ
ＲＯＫｉｔ（東洋紡（株））を用いて行った。すなわ
ち、蛍光ラベルされたＭ１３Ｆプライマー（東洋紡
（株））とＭ１３プライマーＲＶ（東洋紡（株））を用
いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ−のマルチクロー
ニング部位の両端からそれぞれ伸長反応を行い、Ａｕｔ
ｏｍａｔｅｄ ＬａｓｅｒＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ａ．Ｌ．Ｆ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で塩
基配列を解折した。その結果、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ
断片の塩基配列と推定されるアミノ酸配列は配列番号７
に示す通りであった。
Ａ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐ
ＲＯＫｉｔ（東洋紡（株））を用いて行った。すなわ
ち、蛍光ラベルされたＭ１３Ｆプライマー（東洋紡
（株））とＭ１３プライマーＲＶ（東洋紡（株））を用
いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ−のマルチクロー
ニング部位の両端からそれぞれ伸長反応を行い、Ａｕｔ
ｏｍａｔｅｄ ＬａｓｅｒＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ａ．Ｌ．Ｆ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で塩
基配列を解折した。その結果、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ
断片の塩基配列と推定されるアミノ酸配列は配列番号７
に示す通りであった。
【００６１】塩基配列の解折結果からクローニングした
約３．３Ｋｂｐ（７）ＤＮＡ断片には１，３５３ｂｐの
ＯＲＦがあり、４５１アミノ酸配列からなる４９．６Ｋ
Ｄａのタンパク質をコードしており、Ｓ−ＯＬＥ１の推
定アミノ酸配列と比較すると相同性は６２％であった。
このことから、約３．３ｋｂｐ（７）ＤＮＡ断片には、
ピヒアの△９不飽和化酵素遺伝子Ｐ−ＯＬＥ１がクロー
ニングされていると判断した。
約３．３Ｋｂｐ（７）ＤＮＡ断片には１，３５３ｂｐの
ＯＲＦがあり、４５１アミノ酸配列からなる４９．６Ｋ
Ｄａのタンパク質をコードしており、Ｓ−ＯＬＥ１の推
定アミノ酸配列と比較すると相同性は６２％であった。
このことから、約３．３ｋｂｐ（７）ＤＮＡ断片には、
ピヒアの△９不飽和化酵素遺伝子Ｐ−ＯＬＥ１がクロー
ニングされていると判断した。
【００６２】（４）Ｐ−ＯＬＥ１酵母発現組換えベクタ
ーの構築 （３）で得たＰ−ＯＬＥ１が挿入されたプラスミド１μ
ｇをＳａｃＩ１０Ｕで切断し、０．７％アガロースゲル
電気泳動した後、ゲルより約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片
をプレップＡジーンＤＮＡ精製キット（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ）を用いて抽出・精製した。これをＳａｃＩで切断し
たベクターｐＲＳ３１６（ＡＴＣＣｐＲＳ３１６）（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，１２２，１９−２７，１９８９）へＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いてラ
イゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテン
トセル（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ形
質転換した。そして、ランダムの形質転換体２０個を選
び、２ＴＹ液体培地で培養後、導入された組換えベクタ
ーを抽出、精製し、ＳａｃＩで切断して電気泳動を行
い、ｐＲＳ３１６に３．３ｋｂｐの断片が導入された組
換えベクターｐ１３１１（図１）を保持する形質転換体
大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１３１１）を選別した。
ーの構築 （３）で得たＰ−ＯＬＥ１が挿入されたプラスミド１μ
ｇをＳａｃＩ１０Ｕで切断し、０．７％アガロースゲル
電気泳動した後、ゲルより約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片
をプレップＡジーンＤＮＡ精製キット（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ）を用いて抽出・精製した。これをＳａｃＩで切断し
たベクターｐＲＳ３１６（ＡＴＣＣｐＲＳ３１６）（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ，１２２，１９−２７，１９８９）へＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いてラ
イゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテン
トセル（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ形
質転換した。そして、ランダムの形質転換体２０個を選
び、２ＴＹ液体培地で培養後、導入された組換えベクタ
ーを抽出、精製し、ＳａｃＩで切断して電気泳動を行
い、ｐＲＳ３１６に３．３ｋｂｐの断片が導入された組
換えベクターｐ１３１１（図１）を保持する形質転換体
大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１３１１）を選別した。
【００６３】更に、Ｐ−ＯＬＥ１の翻訳開始点から上流
１１塩基目からのＤＮＡ配列よりプライマー５’−ＧＡ
ＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＡ−３’、
終止コドン下流３７からのＤＮＡ配列よりプライマー
５’−ＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＣＧＴＣＧＴＣ
Ｔ−３’をそれぞれ合成し、ピヒアＩＦＯ１４７５の染
色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、Ｐ−ＯＬＥ１の
構造遺伝子部分である１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅
した。そして、増幅した断片をＳａｃＩとＢｇｌＩＩで
切断し、これをＳａｃＩとＢａｍＨＩ切断したベクター
ｐ５２０（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．，３０，５１５−５２０，１９８９）へＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いてラ
イゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテン
トセル（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ形
質転換した。そして、ランダムに形質転換体２０個を選
び、２ＴＹ液体培地で培養後、プラスミドを抽出し、こ
れをＳａＩとＳａｃＩＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動を行い、ｐ５２０に１．４ｋｂｐの切断が導入され
た組換えベクターｐ１２１９（図２）を保持した形質転
換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１２１９）を選別した。
１１塩基目からのＤＮＡ配列よりプライマー５’−ＧＡ
ＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＡ−３’、
終止コドン下流３７からのＤＮＡ配列よりプライマー
５’−ＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＣＧＴＣＧＴＣ
Ｔ−３’をそれぞれ合成し、ピヒアＩＦＯ１４７５の染
色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、Ｐ−ＯＬＥ１の
構造遺伝子部分である１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅
した。そして、増幅した断片をＳａｃＩとＢｇｌＩＩで
切断し、これをＳａｃＩとＢａｍＨＩ切断したベクター
ｐ５２０（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．，３０，５１５−５２０，１９８９）へＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を用いてラ
イゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテン
トセル（宝酒造（株））を用いて大腸菌ＪＭ１０９へ形
質転換した。そして、ランダムに形質転換体２０個を選
び、２ＴＹ液体培地で培養後、プラスミドを抽出し、こ
れをＳａＩとＳａｃＩＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動を行い、ｐ５２０に１．４ｋｂｐの切断が導入され
た組換えベクターｐ１２１９（図２）を保持した形質転
換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１２１９）を選別した。
【００６４】また、対照としてＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１９９０で報
告されているＳ−ＯＬＥ１のＤＮＡ配列を参考にしてＳ
−ＯＬＥ１の翻訳開始点から上流１０塩基目からの配列
よりプライマー５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡ
ＧＡＴＧＣＣＡＡＣＴ−３’、終止コドンからの配列よ
りプライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＧＴＡ
ＡＴＧＴＧＡＴＧＣ−３’をそれぞれ合成し、サッカロ
マイセス・シェルビッシェＳ２８８Ｃ（ＭＡＴａｍａｌ
ｍｅｌ ｇａｌ）（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ
ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ保存、米国）（「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｃｏｕ
ｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ」Ｃ．Ｓ．Ｈ）
の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、増幅した
１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。そして、このＤＮＡ
をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断後、ＳａｌＩとＢａｍＨ
Ｉで切断したベクターｐ５２０へＤＮＡライゲーション
キットを用いてライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９コンピテントセル（宝酒造（株））を用いて大腸
菌ＪＭ１０９へ形質転換した。そして、ランダムに形質
転換体２０個を選び、２ＴＹ液体培地で培養後、プラス
ミドを抽出し、これをＳａｌＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動を行い、ｐ５２０に１．８ｋｂｐのＳ−ＯＬ
Ｅ１が挿入された組換えベクターｐ１３２１（図３）を
保持する形質転換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１３２１）を
選別した。
ｍ．，２６５，２０１４４−２０１４９，１９９０で報
告されているＳ−ＯＬＥ１のＤＮＡ配列を参考にしてＳ
−ＯＬＥ１の翻訳開始点から上流１０塩基目からの配列
よりプライマー５’−ＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡ
ＧＡＴＧＣＣＡＡＣＴ−３’、終止コドンからの配列よ
りプライマー５’−ＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＡＴＴＧＴＡ
ＡＴＧＴＧＡＴＧＣ−３’をそれぞれ合成し、サッカロ
マイセス・シェルビッシェＳ２８８Ｃ（ＭＡＴａｍａｌ
ｍｅｌ ｇａｌ）（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓ
ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ保存、米国）（「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｃｏｕ
ｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ」Ｃ．Ｓ．Ｈ）
の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行い、増幅した
１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。そして、このＤＮＡ
をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断後、ＳａｌＩとＢａｍＨ
Ｉで切断したベクターｐ５２０へＤＮＡライゲーション
キットを用いてライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９コンピテントセル（宝酒造（株））を用いて大腸
菌ＪＭ１０９へ形質転換した。そして、ランダムに形質
転換体２０個を選び、２ＴＹ液体培地で培養後、プラス
ミドを抽出し、これをＳａｌＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動を行い、ｐ５２０に１．８ｋｂｐのＳ−ＯＬ
Ｅ１が挿入された組換えベクターｐ１３２１（図３）を
保持する形質転換体大腸菌ＪＭ１０９（ｐ１３２１）を
選別した。
【００６５】（５）Ｐ−ＯＬＥ１導入形質転換酵母の作
成と脂肪酸組成 ｐ５２０と（４）で作成したｐ１２１９とｐ１３２１を
それぞれ酢酸リチウム法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ
ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ
ａｎｄ Ｔａｉｔ，１９８３）によってサッカロマイセ
ス・シェルビッシェＳＨ９８６（ＭＡＴａ ｕｒａ３−
５２ ｈｉｓ ｌｅｕ２−３，１１２ｔｒｐｌ ａｄｅ
２−１０１）に導入し、形質転換体は、合成選択寒天培
地（０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓ
ｅアミノ酸不含（ＤＩＦＣＯＬＡＢ．）、０．００２％
アデニン、０．００２％ウラシル、０．００２％Ｌ−ヒ
スチジン、０．００２％Ｌ−メチオニン、０．００３％
Ｌ−ロイシン、（０．００２％Ｌ−トリプトファン））
に塗布して形質転換体サッカロマイセス・シェルビッシ
ェＳＨ９８６（ｐ５２０）、サッカロマイセス・シェル
ビッシェＳＨ９８６（ｐ１２１９）とサッカロマイセス
・シェルビッシェＳＨ９８６（ｐ１３２１）を選別し、
取得した。
成と脂肪酸組成 ｐ５２０と（４）で作成したｐ１２１９とｐ１３２１を
それぞれ酢酸リチウム法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ
ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ
ａｎｄ Ｔａｉｔ，１９８３）によってサッカロマイセ
ス・シェルビッシェＳＨ９８６（ＭＡＴａ ｕｒａ３−
５２ ｈｉｓ ｌｅｕ２−３，１１２ｔｒｐｌ ａｄｅ
２−１０１）に導入し、形質転換体は、合成選択寒天培
地（０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓ
ｅアミノ酸不含（ＤＩＦＣＯＬＡＢ．）、０．００２％
アデニン、０．００２％ウラシル、０．００２％Ｌ−ヒ
スチジン、０．００２％Ｌ−メチオニン、０．００３％
Ｌ−ロイシン、（０．００２％Ｌ−トリプトファン））
に塗布して形質転換体サッカロマイセス・シェルビッシ
ェＳＨ９８６（ｐ５２０）、サッカロマイセス・シェル
ビッシェＳＨ９８６（ｐ１２１９）とサッカロマイセス
・シェルビッシェＳＨ９８６（ｐ１３２１）を選別し、
取得した。
【００６６】そして、これら３種類の形質転換体を滅菌
した合成選択液体培地１００ｍｌが入った５００ｍｌ容
坂口フラスコにスラントより植菌し、３０℃、１２０ｒ
ｐｍで２４時間振とう培養した前培養液２ｍｌを同じ培
地に移植し、更に３０℃、１２０ｒｍｐで７２時間振と
う培養後、遠心分離によって菌体を集めた。そして、
（１）と同様にそれぞれの細胞の脂肪酸組成を調べた。
結果を表２に示す。
した合成選択液体培地１００ｍｌが入った５００ｍｌ容
坂口フラスコにスラントより植菌し、３０℃、１２０ｒ
ｐｍで２４時間振とう培養した前培養液２ｍｌを同じ培
地に移植し、更に３０℃、１２０ｒｍｐで７２時間振と
う培養後、遠心分離によって菌体を集めた。そして、
（１）と同様にそれぞれの細胞の脂肪酸組成を調べた。
結果を表２に示す。
【００６７】 ３種類の形質転換酵母の脂肪酸組成は大きな差がなく、
この結果ではＰ−ＯＬＥ１の基質特異性に関する機能が
明確にできなかった。
この結果ではＰ−ＯＬＥ１の基質特異性に関する機能が
明確にできなかった。
【００６８】そこで、以下の実験を行った。
【００６９】まず、ＯＬＥ１が欠失しているため培地中
にオレイン酸等の不飽和脂肪酸を添加しなければ増殖で
きないサッカロマイセス・シェルビッシェＫＤ１１５
（ＭＡＴａｏｌｅｌ）（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ 保存、米国）（Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，９８，４１５−４２０，１９６９）を
入手し、これをサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ
２６７６（ＭＡＴａ ｈｉｓ１−２９ ｌｅｕ２−３，
１１２ｔｒｐ１ ｕｒａ３−５２）（大阪大学・工学部
・応用生物工学科・生物情報工学研究室保存）と交雑し
て、ＯＬＥ１変異と形質転換での選択マーカーを有する
サッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ＭＡ
Ｔａ ｏｌｅｌ ｈｉｓ１−２９ ｌｅｕ２−３，１１
２ｔｒｐ１ｕｒａ３−５２）（大阪大学・工学部・応用
生物工学科・生物情報工学研究室保存）を作成した。
にオレイン酸等の不飽和脂肪酸を添加しなければ増殖で
きないサッカロマイセス・シェルビッシェＫＤ１１５
（ＭＡＴａｏｌｅｌ）（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ 保存、米国）（Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，９８，４１５−４２０，１９６９）を
入手し、これをサッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ
２６７６（ＭＡＴａ ｈｉｓ１−２９ ｌｅｕ２−３，
１１２ｔｒｐ１ ｕｒａ３−５２）（大阪大学・工学部
・応用生物工学科・生物情報工学研究室保存）と交雑し
て、ＯＬＥ１変異と形質転換での選択マーカーを有する
サッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ＭＡ
Ｔａ ｏｌｅｌ ｈｉｓ１−２９ ｌｅｕ２−３，１１
２ｔｒｐ１ｕｒａ３−５２）（大阪大学・工学部・応用
生物工学科・生物情報工学研究室保存）を作成した。
【００７０】そして、このサッカロマイセス・シェルビ
ッシェＳＨ４３４８にｐ１３１１、ｐ１２１９及びｐ１
３２１を酢酸リチウム法によってそれぞれ導入し、ｐ１
３１１の形質転換体はウラシルを、ｐ１２１９とｐ１３
２１の形質転換体はトリプトファンを含まないオレイン
酸添加合成選択寒天培地に塗布して、形質転換体サッカ
ロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１３１
１）、サッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８
（ｐ１２１９）とサッカロマイセス・シェルビッシェＳ
Ｈ４３４８（ｐ１３２１）を選別し、取得した。
ッシェＳＨ４３４８にｐ１３１１、ｐ１２１９及びｐ１
３２１を酢酸リチウム法によってそれぞれ導入し、ｐ１
３１１の形質転換体はウラシルを、ｐ１２１９とｐ１３
２１の形質転換体はトリプトファンを含まないオレイン
酸添加合成選択寒天培地に塗布して、形質転換体サッカ
ロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１３１
１）、サッカロマイセス・シェルビッシェＳＨ４３４８
（ｐ１２１９）とサッカロマイセス・シェルビッシェＳ
Ｈ４３４８（ｐ１３２１）を選別し、取得した。
【００７１】上記の形質転換体サッカロマイセス・シェ
ルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１３１１）をＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＨ４３４８
（ｐ１３１１）と命名し（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１
５８１４）、また、同サッカロマイセス・シェルビッシ
ェＳＨ４３４８（ｐ１２１９）をＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＨ４３４８（ｐ１２
１９）））と命名し（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５８
１５）、それぞれ、工業技術院生命工学工業技術試験所
に平成８年８月３０日に寄託した。
ルビッシェＳＨ４３４８（ｐ１３１１）をＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＨ４３４８
（ｐ１３１１）と命名し（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１
５８１４）、また、同サッカロマイセス・シェルビッシ
ェＳＨ４３４８（ｐ１２１９）をＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＨ４３４８（ｐ１２
１９）））と命名し（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５８
１５）、それぞれ、工業技術院生命工学工業技術試験所
に平成８年８月３０日に寄託した。
【００７２】宿主であるサッカロマイセス・シェルビッ
シェＳＨ４３４８はＯＬＥ１が変異しているため培地中
にオレイン酸等の不飽和脂肪酸が存在しないと増殖でき
ない。そこで、それぞれの形質転換体をオレイン酸を含
まない合成選択寒天培地に塗布し増殖を調べた。その結
果、３種類の形質転換体はオレイン酸を含まない培地で
増殖しコロニーを形成した。
シェＳＨ４３４８はＯＬＥ１が変異しているため培地中
にオレイン酸等の不飽和脂肪酸が存在しないと増殖でき
ない。そこで、それぞれの形質転換体をオレイン酸を含
まない合成選択寒天培地に塗布し増殖を調べた。その結
果、３種類の形質転換体はオレイン酸を含まない培地で
増殖しコロニーを形成した。
【００７３】このことにより、クローン化したＰ−ＯＬ
Ｅ１は△９不飽和化酵素遺伝子を相補すること、ＧＡＰ
プロモーターとターミネーターで転写を制御できること
及びＰ−ＯＬＥ１のプロモーターがサッカロマイセス・
シェルビッシェ中で機能することが分かった。
Ｅ１は△９不飽和化酵素遺伝子を相補すること、ＧＡＰ
プロモーターとターミネーターで転写を制御できること
及びＰ−ＯＬＥ１のプロモーターがサッカロマイセス・
シェルビッシェ中で機能することが分かった。
【００７４】次に、これら３種類の形質転換体を滅菌し
た合成選択液体培地１００ｍｌが入った５００ｍｌ容坂
口フラスコにスラントより植菌し、３０℃、１２０ｒｐ
ｍで２４時間振とう培養した前培養液２ｍｌを同じ培地
に移植し、更に３０℃、１２０ｒｍｐで７２時間振とう
培養後、遠心分離によって菌体を集めた。そして、
（１）と同様にそれぞれの細胞の脂肪酸組成を調べた。
結果を表３に示す。
た合成選択液体培地１００ｍｌが入った５００ｍｌ容坂
口フラスコにスラントより植菌し、３０℃、１２０ｒｐ
ｍで２４時間振とう培養した前培養液２ｍｌを同じ培地
に移植し、更に３０℃、１２０ｒｍｐで７２時間振とう
培養後、遠心分離によって菌体を集めた。そして、
（１）と同様にそれぞれの細胞の脂肪酸組成を調べた。
結果を表３に示す。
【００７５】 脂肪酸組成から計算されるオレイン酸／パルミトレン酸
の値は、ＳＨ４３４８（ｐ１２１９）≧ＳＨ４３４８
（ｐ１３１１）＞ＳＨ４３４８（ｐ１３２１）となり、
Ｐ−ＯＬＥ１を導入したＳＨ４３４８（ｐ１２１９）と
ＳＨ４３４８（ｐ１３１１）は、ＳＨ４３４８（ｐ１３
２１）に比べて非常に高いことが分かった。
の値は、ＳＨ４３４８（ｐ１２１９）≧ＳＨ４３４８
（ｐ１３１１）＞ＳＨ４３４８（ｐ１３２１）となり、
Ｐ−ＯＬＥ１を導入したＳＨ４３４８（ｐ１２１９）と
ＳＨ４３４８（ｐ１３１１）は、ＳＨ４３４８（ｐ１３
２１）に比べて非常に高いことが分かった。
【００７６】このことにより、Ｐ−ＯＬＥ１の転写産物
である△９不飽和化酵素は、パルミチン酸よりステアリ
ン酸に対して基質特異性が高いことが判明した。
である△９不飽和化酵素は、パルミチン酸よりステアリ
ン酸に対して基質特異性が高いことが判明した。
【００７７】
【発明の効果】本発明のパルミチン酸よりステアリン酸
に対して基質特異性の高い△９不飽和化酵素をコードす
る新規な遺伝子を用いることにより、パルミチン酸より
ステアリン酸に対して基質特異性の高い形質転換された
酵母を得ることが可能となった。このことは、低温耐性
の高い酵母等の形質転換体の提供に資することになると
考えられるので、本発明は非常に価値がある。
に対して基質特異性の高い△９不飽和化酵素をコードす
る新規な遺伝子を用いることにより、パルミチン酸より
ステアリン酸に対して基質特異性の高い形質転換された
酵母を得ることが可能となった。このことは、低温耐性
の高い酵母等の形質転換体の提供に資することになると
考えられるので、本発明は非常に価値がある。
【００７８】
【００７９】配列番号：１ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：合成ＤＮＡ 配列
【００８０】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：合成ＤＮＡ 配列
【００８１】配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：合成ＤＮＡ 配列
【００８２】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 起源：合成ＤＮＡ
【００８３】配列番号：５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： ＤＮＡ 起源：合成ＤＮＡ 配列
【００８４】配列番号：６ 配列の長さ：５５４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕ
ｓｔａ） 株名：ＩＦＯ１４７５
ｓｔａ） 株名：ＩＦＯ１４７５
【００８５】配列番号：７ 配列の長さ：２２５１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕ
ｓｔａ） 株名：ＩＦＯ１４７５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４９８．．１８５０ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ＴＡＴＡ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：３５１．．３５５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：５’ＵＴＲ 存在位置：１．．４９７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：３’ＵＴＲ 存在位置：１８５１．．２２５１ 特徴を決定した方法：Ｅ
ｓｔａ） 株名：ＩＦＯ１４７５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４９８．．１８５０ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ＴＡＴＡ ｓｉｇｎａｌ 存在位置：３５１．．３５５ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：５’ＵＴＲ 存在位置：１．．４９７ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：３’ＵＴＲ 存在位置：１８５１．．２２５１ 特徴を決定した方法：Ｅ
【図１】組換えベクターｐ１３１１の制限酵素切断部位
を示す図である。
を示す図である。
【図２】組換えベクターｐ１２１９の制限酵素切断部位
を示す図である。
を示す図である。
【図３】組換えベクターｐ１３２１の制限酵素切断部位
を示す図である。
を示す図である。
Claims (12)
- 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからな
る遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩
基番号４９８〜１８５０で表される塩基配列からなるＤ
ＮＡ （ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつパルミチン酸より
ステアリン酸に基質特異性が高い△９不飽和化酵素をコ
ードする酵母由来の遺伝子。 - 【請求項２】 配列表の配列番号７に記載の塩基配列の
うち、塩基番号４９８〜１８５０で表される塩基配列か
らなるＤＮＡが、ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ
ａｎｇｕｓｔａ）由来のものである請求項１記載の遺伝
子。 - 【請求項３】 ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａ
ｎｇｕｓｔａ）が、ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ
ａｎｇｕｓｔａ）ＩＦＯ１４７５である請求項２記載
の遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１乃至請求項３のいずれか一つに
記載の遺伝子を含む組換えベクター。 - 【請求項５】 遺伝子が、ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃ
ｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）ＩＦＯ１４７５株の染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素ＳａｃＩで切断して得た３．３ｋｂｐの
ＤＮＡ断片である請求項４記載の組換えベクター。 - 【請求項６】 遺伝子が、ピヒア・アングスタ（Ｐｉｃ
ｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）ＩＦＯ１４７５株の△９不飽
和化酵素をコードする遺伝子部分である１．４ｋｂｐの
ＤＮＡ断片である請求項４記載の組換えベクター。 - 【請求項７】 請求項４乃至請求項６のいずれか一つに
記載の組換えベクターで形質転換された酵母。 - 【請求項８】 酵母が、サッカロマイセス・シェルビッ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）である請求項７記載の酵母。 - 【請求項９】 サッカロマイセス・シェルビッシェ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
が、サッカロマイセス・シェルビッシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の△９不飽和
化酵素をコードする遺伝子欠失変異株である請求項８記
載の酵母。 - 【請求項１０】 パルミチン酸よりステアリン酸に基質
特異性が高い特性を有する配列表の配列番号７で表され
るアミノ酸配列を含む△９不飽和化酵素。 - 【請求項１１】 請求項７乃至請求項９のいずれか一つ
に記載の酵母を培養して請求項１０記載の△９不飽和化
酵素を産生する方法。 - 【請求項１２】 形質転換された酵母が、サッカロマイ
セス・シェルビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の△９不飽和化酵素をコードす
る遺伝子欠失変異株の形質転換体である請求項７乃至請
求項９記載の酵母を培養してパルミトレイン酸よりオレ
イン酸を多く含む脂肪酸組成物を産生する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27040596A JPH1075782A (ja) | 1996-09-04 | 1996-09-04 | 新規△９不飽和化酵素をコードする遺伝子及びその遺 伝子を含有する酵母 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27040596A JPH1075782A (ja) | 1996-09-04 | 1996-09-04 | 新規△９不飽和化酵素をコードする遺伝子及びその遺 伝子を含有する酵母 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075782A true JPH1075782A (ja) | 1998-03-24 |
Family
ID=17485813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27040596A Pending JPH1075782A (ja) | 1996-09-04 | 1996-09-04 | 新規△９不飽和化酵素をコードする遺伝子及びその遺 伝子を含有する酵母 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1075782A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8722910B2 (en) | 2009-07-10 | 2014-05-13 | Evolva Ag | Diyne compositions |
-
1996
- 1996-09-04 JP JP27040596A patent/JPH1075782A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8722910B2 (en) | 2009-07-10 | 2014-05-13 | Evolva Ag | Diyne compositions |
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