JPH1070998A

JPH1070998A - 改良された酵素基質

Info

Publication number: JPH1070998A
Application number: JP16569097A
Authority: JP
Inventors: Norio Hagi; 規男萩
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1996-06-24
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 1998-03-17
Anticipated expiration: 2017-06-23
Also published as: JP4120024B2

Abstract

(57)【要約】【課題】酵素活性測定や酵素免疫測定において使用され
る酵素基質として使用される４メチルウンベリフェロン
リン酸等のリン酸エステルを含む酵素基質であって、長
期間保存した場合の安定性が向上され、品質の劣化が防
止された酵素基質を提供する。【解決手段】クエン酸やコハク酸等の有機酸と４メチル
ウンベリフェロンリン酸等のリン酸エステルからなる酵
素基質等。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、改良された酵素基
質、改良された酵素基質の製造方法、更には改良された
酵素基質を含んでなる酵素活性測定用の試薬キット等に
関するものであり、例えば酵素免疫測定方法等に使用可
能な、安定性の向上した、優れた酵素基質等を提供する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、血清、尿等の生体試料中の微量蛋
白質等の含有量等は、抗体や抗原を利用した、いわゆる
サンドイッチ法、競合法等の酵素免疫測定を実施するこ
とで知ることが可能である。例えばサンドイッチ法と呼
ばれる方法においては、測定されるべき蛋白質等に対す
る固相化モノクローナル抗体（固相化抗体）と、測定さ
れるべき蛋白質等に対する、前記モノクローナル抗体と
は異なるモノクローナル抗体であって酵素と結合させた
抗体（標識抗体）を使用し、測定されるべき蛋白質等の
量に相関した（固相化抗体−蛋白質等−標識抗体）との
サンドイッチ複合体を形成させ、このようなサンドイツ
チ複合体を形成していない標識抗体を分離した後、サン
ドイッチ複合体中の酵素量をその活性を基に測定し、最
終的に測定されるべき蛋白質等の量を推定する。

【０００３】酵素反応に使用する酵素基質は、溶液とし
て又は凍結乾燥等した粉末状態で提供されることが多
い。実際に酵素反応を行うに際しては、該溶液を希釈又
は希釈することなしに、或いは該凍結乾燥粉末に水等を
加えて溶液としてから使用するが、提供された溶液や粉
末状態の酵素基質が劣化していた場合、再現性が悪化す
る等、酵素活性の測定結果に与える影響は大きい。従っ
て、酵素基質を製造し提供する側から言えば、より長時
間に渡って安定で酵素との反応性等が変化しない酵素基
質を提供することが必要である。

【０００４】以上に説明した酵素免疫測定では、酵素は
目的とする抗原等を測定するための標識として使用され
るが、このような場合以外にも、例えば体液中の酵素含
有量を、その酵素活性を測定することで知る方法も頻繁
に実施されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】例えば特開平２−１８
８５７８号公報には、酵素基質をアルカリ条件下におく
ことで安定化させることが記載されている。しかし、各
種酵素には活性発現に際して最適ｐＨが存在するため、
このようにアルカリ条件下で安定化された酵素基質をそ
のまま酵素活性の測定に使用すると、当該ｐＨが測定し
ようとする酵素の最適ｐＨと一致しない場合には酵素活
性自体が小さくなってしまい、測定精度が低下するとい
う課題を生じる。むろん、このようにアルカリ条件下で
安定化された酵素溶液のｐＨを酵素の最適ｐＨに調整す
ることも可能ではあるが、酵素活性測定に先立ってｐＨ
調整という工程が必要となる。

【０００６】また例えば米国特第５１４３８２５号公報
には、酵素基質溶液へＥＤＴＡやＥＧＴＡ等の金属キレ
ート剤を添加する、酵素溶液の安定化させる方法が記載
されている。この方法は、４メチルウンベリフェロンリ
ン酸又はその塩を非酵素的に分解してしまう金属イ才ン
を捕捉することでこれらを安定化するものである。この
方法においては、しかし、例えば免疫測定に頻繁に使用
されるアルカリ性フォオスファターゼ等、その活性の発
現にマグネシウムイオンや亜鉛イ才ンが必要とされる酵
素基質として４メチルウンベリフェロンリン酸又はその
塩を使用する場合、上記キレート剤によって前記イオン
も捕捉され、酵素活性が阻害される恐れがあるため、使
用に先立ってキレート剤を除去する等の操作が必要とな
る。

【０００７】なお、酵素基質を凍結乾燥等することによ
り、溶液として保存等する場合に比べて安定性を向上さ
せることが可能である。しかし、このような凍結乾燥処
理を行う場合であっても、更に長期間、更に安定的に酵
素基質の品質を保持し得る酵素基質を提供できれば、使
用者にとって便利である。即ち、凍結乾燥された酵素基
質は使用に先立って適当な溶液に溶解されるため、凍結
乾燥された基質であっても溶解後の保存安定性を良好に
できれば、大量の貯蔵液を調製し保存しておくことが可
能となるからである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、より安定な
酵素基質を提供すべく鋭意研究を行った結果、クエン酸
及び／又はコハク酸を共存させることにより、免疫測定
等の分野において標識物質として頻繁に使用されている
アルカリ性フォスファターゼ等の加水分解酵素の基質で
あるリン酸エステルを安定化し得ることを見出し、本発
明を完成するに至った。即ち本発明は、２０〜２５℃、
イオン強度が０．１の水溶液中での亜鉛に対するキレー
ト安定度定数（ｌｏｇＫ）が８〜１４である有機酸又は
その塩とリン酸エステルを含む酵素基質であり、かかる
酵素基質を含んでなる酵素活性測定用試薬セットや、か
かる酵素基質を含んでなる、酵素を標識物質として用い
る免疫測定用試薬セットである。

【０００９】また本発明は、２０〜２５℃、イオン強度
が０．１の水溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定
数（ｌｏｇＫ）が８〜１４である有機酸又はその塩を共
存させることを特徴とするリン酸エステルの安定化法で
あり、更には２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶
液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）
が８〜１４である有機酸又はその塩を添加する安定化さ
れたリン酸エステルの製造方法である。以下本発明を詳
細に説明する。

【００１０】２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶
液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）
が８〜１４である有機酸又はその塩は、４メチルウンベ
リフェロンリン酸又はその塩（以下単に４ＭＵＰとい
う）やパラニトロフェニルリン酸（以下単にＰＮＰＰと
いう）等のリン酸エステルを非酵素的に分解する金属イ
オン等を捕捉することにより、保存中にその品質等が劣
化するの抑制する。かかる条件下でのＥＤＴＡの安定度
定数（ｌｏｇＫ）は１６．５程度であり、ＥＤＴＡより
も弱い金属イオン捕捉力の有機酸又はその塩を用いるこ
とにより、４ＭＵＰ等のリン酸エステルを、活性発現の
ために金属イオンを必要とする酵素用の基質として使用
する場合であっても、これら活性発現に必要な金属イオ
ンが捕捉されてしまうという不都合がない。

【００１１】本発明において使用される好適な有機酸又
はその塩として、例えば、該定数が１１程度のクエン酸
やシュウ酸、１３程度のコハク酸、或いはこれらのナト
リウムやカリウムの塩（水和物を含む）を示すことがで
きる。クエン酸、シュウ酸、コハク酸等の有機酸、或い
はこれらの塩は、単独で、或いは２種以上を同時に使用
できる。

【００１２】前記有機酸又はその塩は、例えば４ＭＵＰ
等の長期保存に先だって添加することが好ましいが、他
にも種々時期に添加できる。例えば４ＭＵＰの原液の調
製直後やこれを凍結乾燥する場合における凍結乾燥処理
直前が特に好ましいが、酵素活性の測定に先だつ添加で
あれば前記本発明の効果が期待できる。

【００１３】４ＭＵＰやＰＮＰＰ等のリン酸エステルに
添加し、共存させる有機酸又はその塩の量については特
に制限されないが、総量で０．１〜１０００ｍＭが良
く、特に総量で１〜１００ｍＭが好ましい。

【００１４】後の実施例からも明らかではあるが、本発
明者の知見によれば、クエン酸やコハク酸が共存しても
酵素活性の測定に影響はなく、酵素と４ＭＵＰ或いは酵
素とＰＮＰＰ等の反応性は変化しない。従って、有機酸
又はその塩を添加して製造した４ＭＵＰやＰＮＰＰ等の
リン酸エステルを、例えば酵素免疫測定法等の酵素活性
測定用試薬キットの一構成試薬として使用することで、
安定化され、再現性の向上が期待できるという高品質の
試薬キットを提供することが可能である。

【００１５】

【発明の効果】本発明により、従来と比較して、より長
期間に渡って酵素基質を安定化することが可能である。
この結果、従来安定性を向上させるために凍結乾燥品と
して提供されていた４ＭＵＰやＰＮＰＰ等のリン酸エス
テルを、同等の安定性を保証しつつ溶液状態で提供する
ことも可能である。従って本発明によれば、凍結乾燥の
ような煩雑で各工程での制御が厳しい操作を省くことが
可能となり、溶液状態の４ＭＵＰやＰＮＰＰであっても
長期間安定的に保存することか可能とある。これによ
り、酵素基質溶液を必要時に必要量調製して使用しなく
とも再現性に支障をきたすことが無くなり、逐次基質を
調製するという不便さを解消することも可能である。む
ろん、本発明によって製造された４ＭＵＰやＰＮＰＰ等
のリン酸エステル溶液を凍結乾燥等することを排除する
ものではなく、本発明により提供される酵素基質を凍結
乾燥等した場合には、特に該乾燥物を溶解した後の安定
性を向上することができる。

【００１６】本発明は、酵素免疫測定法で頻繁に使用さ
れるアルカリ性フォスファターゼの酵素活性測定に多用
される４ＭＵＰやＰＮＰＰ等のリン酸エステルについて
顕著に安定性を向上できるため、酵素免疫測定の分野に
おける酵素基質の長期安定性向上のために有用である。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下に本発明を更に詳細に説明す
るために４ＭＰＵに関する実施例を記載するが、本発明
はこれら実施例に限定されるものではない。

【００１８】実施例１４ＭＵＰの加水分解速度に与え
るクエン酸及び／又はコハク酸（クエン酸及び／又はコ
ハク酸イオン）の効果（酵素基質の製造）２−アミノ−２一メチル−１−プロ
パノール（ナカライ化学（株）製）４４．４６ｇ及びア
ジ化ナトリウム（ナカライ化学（株）製）１ｇを容器に
秤りとり、これに精製水を加えて約９００ｍ１とした。
この溶液をｐＨメーターでモニターしながら濃塩酸を加
え、ｐＨ１０に調整した後、更に精製水を加え液量を１
リットルにした。

【００１９】以上のようにして調製した溶液に４−メチ
ルウンベリフェロンリン酸（米国ＪＢＬ社製、以下４Ｍ
ＵＰという）２５６．２ｍｇ加え、１ｍＭの４ＭＵＰ溶
液とした（以下この溶液をベース基質という）。

【００２０】ベース基質へマンガン溶液（ナカライ化学
（株）製）、亜鉛溶液（ナカライ化学（株）製）、カド
ミウム溶液（ナカライ化学（株）製）、アルミニウム溶
液（ナカライ化学（株）製）、鉄溶液（ナカライ化学
（株）製）、コバルト溶液（ナカライ化学（株）製）、
ニッケル溶液（ナカライ化学（株）製）、マグネシウム
溶液（ナカライ化学（株）製）又は鉛溶液（ナカライ化
学（株）製）を最終濃度が１００ｐｐｍとなるように添
加し、対照溶液とした。

【００２１】（基質の安定性の測定）前記のようにして
調製した溶液を４、２５、３５、４５℃の保温器へ入
れ、一定時間毎に取り出し、希釈液（０．１４Ｍリン酸
緩衝液、０．１ＭＥＤＴＡ（ナカライ化学（株）
製）、０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．１）にて１
０倍に希釈した後、蛍光分光光度計（日立Ｆ２０００
型、１ｃｍガラス角セル使用）にて測定した。蛍光分光
光度計による測定は、励起波長３６３ｎｍ（バンドパス
５ｎｍ）、蛍光波長４４７ｎｍ（バンドパス５ｎｍ）で
室温にて実施し、４ＭＵＰが加水分解されて生じる４Ｍ
Ｕ濃度測定のため既知濃度の４ＭＵ（希釈液（０．１４
Ｍリン酸緩衝液、０．１ＭＥＤＴＡ（ナカライ化学
（株）製、２ナトリウム・２水和物）、０．１％アジ化
ナトリウム、ｐＨ９．１）により希釈系列を作製した）
を測定したものとの相対蛍光強度の比較にて計算した。

【００２２】４５℃で保温した場合の結果を図１〜３に
示す。この結果から、ベース基質と比較して対照溶液、
特に鉄溶液を添加した対照溶液では４ＭＵの生成が早い
こと、即ち、即ちこれら金属イオンの共存により４ＭＵ
Ｐの安定性が失われる（加水分解される）されることが
分かる。また４、２５及び３５℃で保温した結果（不図
示）では、保温温度が低下するに従って生成４ＭＵ量は
低下し、前記金属イオン共存下での４ＭＵＰの非酵素的
分解は温度依存性であることも示された。

【００２３】実施例２４ＭＵＰの加水分解における鉄
イオン濃度の影響実施例１と同様にして調製したベース基質及びベース基
質に鉄溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度１、１
０又は１００ｐｐｍとなるように添加した対照溶液を実
施例１と同様に一定温度で一定時間保温した後、蛍光分
光光度計を用いて４ＭＵ濃度を測定した。

【００２４】結果を図４〜７に示す。これら図によれ
ば、鉄イオンの濃度に依存して４ＭＵの生成、即ち４Ｍ
ＵＰの非酵素的加水分解の度合いが増加することが分か
る。

【００２５】実施例３４ＭＵＰの加水分解におけるコ
ハク酸又はクエン酸の効果実施例１と同様にして調製したベース基質、ベース基質
に鉄溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度１又は１
０ｐｐｍとなるように添加した対照溶液、対照溶液に対
してコハク酸又はクエン酸を最終濃度が１０ｍＭとなる
ように添加した基質溶液（以下、コハク酸添加基質又は
クエン酸添加基質という）を実施例１と同様に一定温度
で一定時間保温した後、蛍光分光光度計を用いて４ＭＵ
濃度を測定した。

【００２６】４５℃で保温した場合の結果を図８に示
す。この結果から、ベース基質と比較して対照溶液では
４ＭＵの生成が増加するものの、クエン酸添加基質又は
コハク酸添加基質ではその増加が抑制されていることが
分かる。

【００２７】実施例４アルカリ性フォスファターゼの
酵素活性測定実施例１と同様にして調製したベース基質をもとに、ベ
ース基質に鉄溶液（ナカライ化学（株）製）を最終濃度
１ｐｐｍとなるように添加した対照溶液、対照溶液に対
してコハク酸、クエン酸又はＥＤＴＡを最終濃度が１０
ｍＭとなるように添加した基質溶液（以下、コハク酸添
加基質、クエン酸添加基質、ＥＤＴＡ添加基質という）
を調製した。

【００２８】各基質溶液１．５ｍｌに対し、市販のアル
カリ性フォスファターゼ（シグマ社製）の最終濃度が１
４ｇ／ｍｌとなるように調製した０．１％ウシ血清アル
ブミン（シグマ社製）を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を２０μｌ添加した後、実施例
１と同様にして４ＭＵ濃度を測定した。なお、本例の操
作は３７℃の温度条件下で実施した。

【００２９】結果を図９に示す。図９からは、ベース基
質、対照溶液、コハク酸添加基質及びクエン酸添加基質
については同様に４ＭＵ濃度が増加すること、即ち４Ｍ
Ｕを産生する酵素活性が阻害されていないことが分か
る。一方、ＥＤＴＡ添加基質では、酵素活性が阻害され
た結果４ＭＵの増加が抑制されていることが分かる。

【００３０】本例の結果と前記実施例１〜３の結果から
は、コハク酸等を添加することにより、酵素活性を阻害
することなく、４ＭＵＰ等を安定的に保存可能なことが
理解できる。

【００３１】実施例５ＴＳＨの酵素免疫測定（抗体固
定化固相ビーズの調製）ウォーターストランド法により得た平均直径１．４ｍ
ｍ、平均長さ１．５ｍｍのエチレン−酢酸ビニル共重合
体（ＥＶＡ）ペレット（東ソー（株）製）を特開平６２
−１９７４２５号公報に記載された方法に従って真球化
し、フェライト（東ソー（株）製）を熱融着させ、更に
グリシジルメタアクリレート（ＧＭＡ）でポリマーコー
ティングした。得られたポリマーコーティングビーズを
苛性ソーダ・メタノール溶液で処理して表面層のエポキ
シ基を開環させジオールにした。以上のようにして得ら
れたビーズに、以下に示すようにマウス抗ヒトＴＳＨ
（甲状腺刺激ホルモン）モノクローナル抗体（抗体１）
を固定化した。まずビーズ１０００００個に対し、特開
平６３−１５１６７号公報に記載された方法に従って５
００ｍｇのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤ
Ｉ：東京化成工業（株）製）を含む乾燥アセトン２５ｍ
ｌを窒素雰囲気下、室温下で３０分間激しく撹拌して活
性化処理を行った。この活性化されたビーズを洗浄後、
２．５ｍｇ／２０ｍｌのマウス抗ヒトＴＳＨモノクロー
ナル抗体を加え、室温にて４時間振とうして抗体を粒子
に結合させた。

【００３２】ビーズを洗浄後、１．０％の牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加
えブロッキング処理を行った。

【００３３】標識に用いる酵素としてウシ小腸由来のア
ルカリ性フォスファターゼを使用しこれを常法に従って
抗ヒトＴＳＨモノクローナル抗体（抗体２）と結合し
た。

【００３４】調製した抗体固定化ビーズを用いて、ヒト
ＴＳＨの酵素免疫測定を行なった。まず抗体固定化ビー
ズ１２個をプラスチック製カップに入れ、これに５０μ
ｌの標識抗体（抗体２）を加えたものを用意した。これ
を下部に磁石を有する測定装置（ＡＩＡ一１２００、東
ソー（株）製）にセットし、抗原溶液として、０又は４
８μＩＵ／ｍｌ濃度のＴＳＨ溶液１００μｌを添加して
酵素免疫反応を開始した。ＴＳＨの抗原抗体反応を進行
させるために３７℃にて４０分間、下部の磁石を約８３
ストローク／分にて振とうさせながらインキュベート
し、その後、反応容器を洗浄液にて洗浄した（Ｂ／Ｆ分
離）。

【００３５】洗浄終了後、実施例４で調製した各種の基
質溶液１００μｌを分注して酵素反応を実施した。反応
は、３７℃にて３、６、１０分間、下部の磁石を約８３
ストローク／分にて振とうさせながらインキュベートさ
せて実施した。酵素反応停止液である希釈液（０．１４
Ｍリン酸緩衝液、０．１ＭＥＤＴＡ、０．１％アジ化
ナトリウム、ｐＨ９．１）５００μｌを添加して酵素反
応を停止させた後、反応が停止された反応用液を実施例
１に示した希釈液にて希釈し、実施例１同様に蛍光量を
測定した。

【００３６】結果を図１０、１１に示す。これらの結果
からは、ベース基質、クエン酸添加基質及びコハク酸添
加基質ではほぼ同じ蛍光量（４ＭＵ量）が得られるこ
と、即ち（１）クエン酸及び／又はコハク酸の共存が酵
素活性を阻害しないこと、及び（２）及びクエン酸及び
／又はコハク酸の共存が免疫反応を阻害しないこと、が
分かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１の結果中、ベース基質とマンカ
ン、亜鉛、カドミウム溶液を含む対照溶液の結果につい
て示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸
は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸
はマンガンを含む対照溶液の、黒三角は亜鉛を含む対照
溶液の、黒四角はカドミウムを含む対照溶液の結果をそ
れぞれ示す。

【図２】図２は実施例１の結果中、ベース基質とアルミ
ニウム、鉄、コバルト溶液を含む対照溶液の結果につい
て示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸
は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸
はアルミニウムを含む対照溶液の、黒三角は鉄を含む対
照溶液の、黒四角はコバルトを含む対照溶液の結果をそ
れぞれ示す。

【図３】図３は実施例１の結果中、ベース基質とニッケ
ル、マグネシウム、鉛溶液を含む対照溶液の結果につい
て示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸
は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸
はニッケルを含む対照溶液の、黒三角はマグネシウムを
含む対照溶液の、黒四角は鉛を含む対照溶液の結果をそ
れぞれ示す。

【図４】図４は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を
含む対照溶液を４℃で保存した結果について示したもの
である。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間
（時間）を示し、自丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍ
の鉄を含む対照溶液の、黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含む
対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶液
の結果をそれぞれ示す。

【図５】図５は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を
含む対照溶液を２５℃で保存した結果について示したも
のである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間
（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍ
の鉄を含む対照溶液の、黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含む
対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶液
の結果をそれぞれ示す。

【図６】図６は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を
含む対照溶液を３５℃で保存した結果について示したも
のである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間
（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍ
の鉄を含む対照溶液の、４黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含
む対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶
液の結果をそれぞれ示す。

【図７】図７は実施例２の結果中、ベース基質又は鉄を
含む対照溶液を４５℃で保存した結果について示したも
のである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は保存時間
（時間）を示し、白丸はベース基質の、黒丸は１ｐｐｍ
の鉄を含む対照溶液の、黒三角は１０ｐｐｍの鉄を含む
対照溶液の、黒四角は１００ｐｐｍの鉄を含む対照溶液
の結果をそれぞれ示す。

【図８】図８は実施例３の結果中、４５℃で保存した結
果について示したものである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度
を、横軸は保存時間（時間）を示し、白丸はベース基質
の、自三角は鉄を含む対照溶液の、黒丸はコハク酸添加
基質の、黒三角はクエン酸添加基質の、黒四角はＥＤＴ
Ａ添加基質の結果をそれぞれ示す。

【図９】図９は実施例４の結果を示したものである。図
中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は酵素反応時間（秒）を
示し、白丸はベース基質の、黒四角は鉄を含む対照溶液
の、黒三角はコハク酸添加基質の、白三角はクエン酸添
加基質の、黒丸はＥＤＴＡ添加基質の結果をそれぞれ示
す。

【図１０】図１０は実施例５の結果中、０μＩＵ／ｍｌ
濃度のＴＳＨを測定した場合の結果について示したもの
である。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は酵素反応時
間（分）を示し、白丸はベース基質の、白三角は鉄を含
む対照溶液の、黒丸はコハク酸添加基質の、黒三角はク
エン酸添加基質の、黒四角はＥＤＴＡ添加基質の結果を
それぞれ示す。

【図１１】図１１は実施例５の結果中、５０μＩＵ／ｍ
ｌ濃度のＴＳＨを測定した場合の結果について示したも
のである。図中、縦軸は４ＭＵ濃度を、横軸は酵素反応
時間（分）を示し、白丸はベース基質の、白三角は鉄を
含む対照溶液の、黒丸はコハク酸添加基質の、黒三角は
クエン酸添加基質の、黒四角はＥＤＴＡ添加基質の結果
をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/543 ５５１Ｇ０１Ｎ 33/543 ５５１Ｓ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水溶
液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇＫ）
が８〜１４である有機酸又はその塩とリン酸エステルを
含む酵素基質。
【請求項２】前記有機酸又はその塩が、クエン酸及び／
又はコハク酸、或いはそれらの塩である請求項１の酵素
基質。
【請求項３】有機酸又はその塩の含有量が０．１〜１０
００ｍＭである請求項１又は２の酵素基質。
【請求項４】リン酸エステルが４メチルウンベリフェロ
ンリン酸又はその塩である請求項１の酵素基質。
【請求項５】リン酸エステルがパラニトロフェニルリン
酸又はその塩である請求項１の酵素基質。
【請求項６】アルカリ性フォスファターゼ用の基質であ
る請求項１に記載の酵素基質。
【請求項７】水溶液である請求項１〜６いずれかの項に
記載の酵素基質。
【請求項８】乾燥物である請求項１〜６いずれかの項に
記載の酵素基質。
【請求項９】請求項１〜８いずれかの項に記載の酵素基
質を含んでなる酵素活性測定用試薬セット。
【請求項１０】請求項１〜８いずれかの項に記載の酵素
基質を含んでなる、酵素を標識物質として用いる免疫測
定用試薬セット。
【請求項１１】２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水
溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇ
Ｋ）が８〜１４である有機酸又はその塩を共存させる、
リン酸エステルの安定化法。
【請求項１２】前記有機酸又はその塩がクエン酸及び／
又はコハク酸、或いはそれらの塩である請求項１１のリ
ン酸エステルの安定化法。
【請求項１３】０．１〜１０００ｍＭの有機酸又はその
塩を共存させる請求項１１又は１２の安定化法。
【請求項１４】リン酸エステルが４メチルウンベリフェ
ロンリン酸又はその塩である請求項１１の安定化法。
【請求項１５】リン酸エステルがパラニトロフェニルリ
ン酸又はその塩である請求項１１の安定化法。
【請求項１６】２０〜２５℃、イオン強度が０．１の水
溶液中での亜鉛に対するキレート安定度定数（ｌｏｇ
Ｋ）が８〜１４である有機酸又はその塩を添加する、安
定化されたリン酸エステルの製造方法。
【請求項１７】前記有機酸又はその塩がクエン酸及び／
又はコハク酸、或いはそれらの塩である請求項１６の安
定化されたリン酸エステルの製造方法。
【請求項１８】０．１〜１０００ｍＭの有機酸又はその
塩を添加する請求項１６又は１７の製造方法。
【請求項１９】リン酸エステルが４メチルウンベリフェ
ロンリン酸又はその塩である請求項１６の製造方法。
【請求項２０】リン酸エステルがパラニトロフェニルリ
ン酸又はその塩である請求項１６の製造方法。