JPH10510993A

JPH10510993A - ハロゲン化セファロスポリンの酵素的製造

Info

Publication number: JPH10510993A
Application number: JP8519946A
Authority: JP
Inventors: エル．ワン，ビング; シェン，ヨング−キアング; チェン，ユング−ピン
Original assignee: バイオピュアコーポレーション
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-19
Publication date: 1998-10-27
Also published as: WO1996019569A1; PE8597A1; AR002458A1; EP0822981A1; CO4700345A1; US5589354A; AU4524196A; US5854054A

Abstract

(57)【要約】セファロスポリンハロペルオキシダーゼ活性を示す酵素標品はラサイバクター属の微生物種から単離される。この酵素標品は一工程でセファレキシンをハロゲン化したセファロスポリン抗生物質へ変換することができる。特に、セファロスポリンハロペルオキシダーゼ酵素標品を供給するユニークな微生物はラサイバクター・ビオプレシスである。

Description

【発明の詳細な説明】ハロゲン化セファロスポリンの酵素的製造発明の背景セファクロル（７−〔フェニルグリシルアミド〕−３−クロロ−３−セフェム −４−カルボン酸）はセファロスポリン類の抗生物質である。この抗生物質の活性は化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）、赤痢菌種（Shigella sp.）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、アエロバクター・アエロゲネス（Aerobacter aerogenes）とサルモネラ・ヘイデルベルグ（Salmonella heide lberg）を含む細菌の範囲に対して有効である。この抗生物質は親化合物から有機合成技術により合成されてきた（例えば、米国特許第３，９２５，３７２号明細書と第４，０６４，３４３号明細書参照）。エステル化により４−カルボン酸塩を保護するために、一般の合成技術が、単一の塩素原子がその位置に結果的に共有結合するように３位を修飾し、それからカルボン酸塩からエステル保護基を除く一連の工程により行われる。この方法で、様々なセファロスポリン抗生物質が合成されてきた。セファロスポリン族の他の抗生物質はセファレキシン（７−〔フェニルグリシルアミド〕−３−メチル−３−セフェム−４−カルボン酸）である。この抗生物質化合物は、３位でのメチルから塩素への置換によりセファクロルと異なる。セファレキシンの合成はセファクロルの合成より容易に達成される。しかしながら、抗生物質としてのセファクロルの有用性はセファレキシンよりも勝っている。これらの理由のため、容易にセファレキシンをセファクロルに変換することが望ましい。有機合成のルートが利用できるが、これらの合成スキームに頼った場合、この変換を達するのに数工程が必要とされる。簡単な、一工程の過程がより望ましい。特定の微生物は幅広い種々の有機化合物をハロゲン化できるハロペルオキシダーゼを有する（フランセン（Franssen，M．C．R.）ら，Adv．Applied Mic robiol．37: 41-99(1992)）。現在、これらのハロペルオキシダーゼはペルオキシダーゼとしての商業上の実用性は無いように見える。しかしながら、それらのハロゲン化剤としての使用が求められている。ある化学製品の製造におけるクロロペルオキシダーゼや他のハロゲン化酵素の使用の楽観的な予測にもかかわらず、この目的のためのハロペルオキシダーゼの使用の可能性は実現化されないままである。これらの予測の実現に対する主な障害は、２、３例を挙げると、これらの酵素の作用の狭いｐＨ範囲、酵素の供給源に対して有毒な高濃度のＨ₂Ｏ₂の使用、そして、酵素生体触媒の短い半減期に見出される。ほとんどのハロペルオキシダーゼはハロゲン化物を酸化する過程で、付随して過酸化物を水に変換する。この過程に続いて、酵素付加反応が起きる。しかしながら、セファレキシンをセファクロルに変換するために、置換反応が必要である；特に、塩素のメチル基への置換。有機化合物をハロゲン化するだけでなく、同時に有機化合物の塩化物等のハロゲン化物をメチル基に置換もする酵素標品を持つことが望ましい。この置換反応をセファレキシン分子の適切な位置で行い、それにより、セファクロル等のハロゲン化生成物を製造する酵素を持つことが特に好ましい。発明の要約本発明はセファクロル等のハロゲン化セファロスポリンである抗生物質の製造に関する。本発明においては、出発原料のセファロスポリン、セファレキシンを適当な反応条件下でセファレキシンハロペルオキシダーゼと呼ばれる酵素標品とインキュベートした時に、この抗生物質の生産が起こる。この酵素標品は適当な微生物から得ることができる。セファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を有する酵素標品を含む本発明の特定の微生物は、ラサイバクター（Rathayibacte r）属のユニークな株であるラサイバクター・ビオプレシス（Rathayibacter bio puresis）である。本発明の方法においては、セファレキシンをセファレキシンハロペルオキシダーゼ酵素標品とインキュベートし、該酵素標品（該微生物由来）がセファレキシンをハロゲン化生成物に変換する。本発明の方法におけるセファレキシンハロペルオキシダーゼ酵素標品は微生物由来の粗抽出物の形態である。図面の簡単な説明図１は、ラサイバクター・ビオプレシス微生物の顕微鏡写真である。図２は、一群の物質をラサイバクター・ビオプレシスをホモジェナイザー処理して得た無細胞粗抽出物を負荷したＴｏｙｏ−ＰｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ陰イオン交換樹脂から得た時の蛋白質含有量、溶出液伝導度、及びセファレキシンクロロペルオキシダーゼ活性を図示したものである。図３は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術によるセファレキシンとセファクロルの分離を図示したものである。図３Ａは、生体触媒反応溶液からのアウトプットを表している；図３Ｂは、既知のセファレキシンとセファクロルの混合物を含む標準溶液を表している；そして、図３Ｃは、生体触媒反応と混合標準溶液の組み合わせを表している。発明の詳細な説明本発明はセファレキシンをセファクロル等のハロゲン化生成物に変換する酵素過程に関する。この過程において、セファレキシの３位のメチル基はハロゲンに置換される。ハロゲンはヨウ素（Ｉ）、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、又はフッ素（Ｆ）のいずれでもよい。好ましい態様は、ハロゲンがＣｌで、ハロゲン化生成物がセファクロルである。この酵素過程は、他方ではセファレキシン等の適当な出発原料からハロゲン化生成物を製造するために必要ないくつかの有機合成反応工程を省略する。酵素過程は水性環境で行うため、汚染有機溶媒の痕跡は、それが反応混合物から回収された時にハロゲン化生成物と共には残っていない。これらの有機溶媒の痕跡等の有機残留物はしばしば有機合成手段後に回収される生成物に伴っている。もしヒトにハロゲン化セファロスポリン抗生物質等の治療用生成物と共に投与するならば、これらの有機残留物は欲しない有害でさえある効果を有することが可能である。従って、全合成過程を水性環境で行うことは、それ自体比較となる有機合成手段を改良することである。本発明の酵素過程は、有機合成過程で通常必要とされる数工程ではなく、一工程でセファレキシンをハロゲン化生成物に変換する。ハロゲン化生成物の収量は、特定の出発原料からこの生成物を形成する過程において、数工程よりもむしろ一工程の使用により高められる。本発明の酵素過程は、必要とする特異性を有する酵素標品を含む微生物の構成酵素を用いることにより行われる。このセファレキシンをセファクロル等のハロゲン化生成物に変換する特異性を示すこれらの微生物由来の酵素標品をセファレキシンハロペルオキシダーゼと呼ぶ。この酵素標品は、セファレキシンからメチル基を除き、それをハロゲンラジカルで置換する望ましい反応において過酸化物を付随して使用する。本発明のセファレキシンハロペルオキシダーゼ酵素標品は、独立にまたは組み合わせて、セファレキシンをハロゲン化された生産物に変換する機能を果たす一つ以上の酵素を含む。セファレキシンハロペルオキシダーゼ酵素標品はＴｏｙｏ−ＰｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ陰イオン交換樹脂から、陰イオン交換樹脂にラサイバクタービオプレシス培養物の全ホモジネートを１５，０００×ｇ（４℃ ）で遠心分離して得られる上清が負荷された後、５リットルの０．１ＭＮａＣｌ（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）バッチ溶出を行い、ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液中、０．３ＭのＮａＣｌバッチ５リットルで溶出される物質の画分にあることを特徴とすることができる。本発明の工程で行ったとき、酵素標品は、宿主微生物の粗ホモジネートまたは宿主微生物からの抽出物であってもよい。酵素標品は溶液中で遊離しているか固体支持体に固定化されていることができる。後者の構造では、セファレキシンは水溶液か混合液に入れられ、この溶液あるいは混合液を固定化酵素標品を通過するように流してもよい。次いで、ハロゲン生産物を反応系から回収することができ、さらにセファレキシンを導入することができる。このような、あるいは似たような方法で、ハロゲン化生産物は酵素標品の再使用によりセファレキシンから継続的に生産されることができる。もし酵素標品が固体支持体にくっつかず、むしろ溶液中で遊離している場合、ハロゲン化生産物は当業者にとって公知であるクロマトグラフィーか結晶化手法のような適当な手段で回収することができる。セファレキシンからハロゲン化生産物を生産するための本発明の酵素法は、求められる酵素的変換が成し遂げられる適切な条件下で行われる。酵素反応はｐＨ３．５から７．０の間の酸性条件で行うことができ、好ましくはｐＨ５．５付近である。過酸化物、好ましくは過酸化水素が、反応液中もしくは混合液に入れられる。ハロゲン化カリウムが通常反応液中もしくは混合液中に入れられ、好ましくは５０ｍＭの濃度である。ハロゲン化ナトリウムが反応液中もしくは混合液中でハロゲン化カリウムの代わりに択一的に置き換えられることができる。ハロゲン化生産物がセファクロルであるとき、存在する塩は塩化カリウムまたは塩化ナトリウムのいずれかである。酵素反応は以下の反応成分の存在下で行うことができる。本発明の微生物はセファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を持つ単離することができる酵素標品を含むこれらの微生物である。これらの微生物はセファレキシンとインキュベートしたときハロゲン化生産物を生産する。好ましい微生物はラサイバクター属由来の細菌である。これらの微生物はグラム陽性で、好気性のコリネフォルム形態を持つ。特に好ましい微生物はラサイバクタービオプレシスである。このラサイバクタービオプレシス微生物は、従来知られていない株であり、その生理学的な性質の傾向（脂肪酸と細胞壁の糖組成；サッカライド、有機酸およびアミノ酸の利用；酸の生産、塩への耐性；等）は特有である。とりわけ、本微生物の細胞内の脂肪酸１６：０の量はラサイバクター属の他の種では存在しない。以下の実施例により本発明の主題を説明する。これらの実施例等により、本発明が限定されるものではなく、当業者の能力内で修正されるべきものであることはいうまでもない。実施例１．セファレキシンとインキュベート時にセファクロルを製造する特質を有する微生物の単離海洋蠕形動物ノトマスタス・ロバタス（Ｎｏｔｏｍａｓｔｕｓｌｏｂａｔｕｓ）の腸から微生物を得、培養した。酵素によりセファレキシンをセファクロルに変換する酵素標品を含むこのグループの特定の微生物を単離した。単離した微生物の本質的に純粋な培養物からも酵素によりセファレキシンをセファクロルに変換する酵素標品を得た。単離した微生物はラサイバクター（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ）属の細菌である。単離した細菌をラサイバクター・ビオプレシスと命名した。この単離した微生物の培養物を３１Ｄ−４として、ブダペスト条約の条件下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、アメリカ合衆国、メリーランド２０８５２、ロックビル、パークロン・ドライブ１２３０１に、１９９５年１２月１日に寄託番号ＡＴＣＣ５５７２８で寄託した。実施例２微生物ラサイバクタービオプレシスの分類学的および同定的特性実施例１のラサイバクタービオプレシスとして示される単離された微生物を同定し、分類学的に記述するために、以下の培地および試験手順を使用した：Ａ．炭素源として炭水化物または有機酸の利用を決定するため、単離された微生物を次の成分からなる培地中で生育させた：（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．１％ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１５％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１５％ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ０．０５％イーストエキストラクト０．０１％カザミノ酸０．０１％試験炭水化物または有機酸０．５％ｐＨ６．５ネガティブコントロールは、炭素源を除いた基本培地であった。ポジティブコントロールは、グルコースを添加した基本培地であった。炭素源として炭水化物または有機酸の利用を決定する手段は、本質的に次に見られるものと同じものであった：Ｍ．Ｄ．コリンズら（Ｍ．Ｄ．Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．，）”ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＳｐｅｃｉｅｓｏｆＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ”、１２７６−１２８４頁、Ｐ．Ｈ．Ａ．スネアスら（Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓｎｅａｔｈｅｔａｌ．）編、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ＴｈｅＷｉｌｌｉａｍｓ＆ＷｉｌｋｉｎｓＣｏ．、Ｂａｌｔiｍｏｒｅ（１９８６）。Ｂ．微生物を特定の炭素源の存在下で生育させたときに酸を生産するかどうかを決定するために、単離された微生物を次の成分からなる培地中で生育させた：（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．１％ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１５％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５％イーストエキストラクト０．０１％カザミノ酸０．０１％ブロモクレゾールパープル０．０００４％試験炭水化物または有機酸０．５％ｐＨ７．０指示色の顕著な変化があったときにポジティブな反応が生じた。微生物を特定の炭素源の存在下で生育したときの酸の生産を決定するための手段は、上記パートＡ．のコリンズら（ｔｈｅＣｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．）の参考文献に見られるものと本質的に同じものであった。Ｃ．単独の窒素源としてアミノ酸の利用を決定するため、単離された微生物を次の成分からなる培地中で生育した：グルコース１％ＮａＣｌ０．０５％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５％ビオチン１０ｍｇ／Ｌチアミン１ｍｇ／Ｌ試験アミノ酸０．１％ｐＨ７．０単独の窒素源としてアミノ酸の利用を決定するための手段は、次の文献中に見られるものと本質的に同じものであった：Ｈ．Ｉ．ズグルスカヤら（Ｈ．Ｉ．Ｚｇｕｒｓｋａｙａｅｔａｌ．）、”Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒｇｅｎ．ｎｏｖ．，ＩｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅＳｐｅｃｉｅｓＲａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒｒａｔｈａｙｉｃｏｍｂ．ｎｏｖ．，Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒｔｒｉｔｉｃｉｃｏｍｂ．ｎｏｖ．，Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒｉｒａｎｉｃｕｓｃｏｍｂ．ｎｏｖ．ａｎｄＳｉｘＳｔｒａｉｎｓｆｒｏｍＡｎｎｕａｌＧｒａｓｓｅｓ”、Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．Ｓｙｓｔeｍａｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４３（１）、１４３−１４９（１９９３）。Ｄ．塩化ナトリウムまたは亜テルル酸カリウムに対する微生物の耐性を決定するために、単離された微生物を次の成分からなる培地中で生育させた：グルコース１％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１５％ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．１％イーストエキストラクト０．０１％カザミノ酸０．０１％５％ＮａＣｌ、１０％ＮａＣｌ、０．０５％亜テルル酸カリウムを用いて試験をした。ｐＨ６．５塩化ナトリウムまたは亜テルル酸カリウムに対する微生物の耐性を決定するための手段は、上記パートＣ．のズグルスカヤらの参考文献に見られるものと本質的に同じものであった。Ｅ．ツイーン２０、４０または８５を加水分解する微生物の活性を決定するため、単離された微生物を次の成分からなる培地中で生育させた：（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．１％ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１５％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５％イーストエキストラクト０．０１％カザミノ酸０．０１％試験界面活性剤０．５％ｐＨ６．５ツイーン類を加水分解する微生物の活性を決定するための手段は、上記パートＣ．のズグルスカヤらの参考文献に見られるものと本質的に同じものであった。Ｆ．微生物がフォゲス−プロスカウエル反応（ｔｈｅＶｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒｒｅａｃｔｉｏｎ）を行なうことができるかどうかを決定するため、単離された微生物を次の成分からなる培地中で生育させた：グルコース０．５％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５％バクトペプトン０．５％ｐＨ７．０フォゲス―プロスカウエル反応薬を、１００ｍＬの４０％ＮａＯＨ中にクレアチン０．３ｇを溶解することによって調製した。微生物を培地中で２−４日間培養したのち、３−５ｍＬのサンプルを取り、１−２ｍＬの反応溶液に添加した。混合液をよく震盪した。ポジティブな結果は、ピンク色の出現によって示された。ネガティブな結果は、黄色によって示された。微生物がフォゲス―プロスカウエル反応を行なうことができるかどうかを決定するための手段は、次に見られるものと本質的に同じものであった：Ｂ．デイビスら（Ｂ．Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、７２頁、Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ（１９９０）。Ｇ．微生物がメチルレッド反応を行なうことができるかどうかを決定するため、単離された微生物をフォゲス―プロスカウエル反応で用いたものと同じ培地中で生育させた。２５０ｍＬの６０％アルコールにメチルレッドを１グラム溶解した。微生物を培地中で４日間培養したのち、数滴のメチルレッド反応溶液を添加した。ポジティブ反応は赤色によって示された。ネガティブな結果は色が変わらないことによって示された。微生物がメチルレッド反応を行なうことができるかどうかを決定するための手段は、上記パートＡ．のコリンズらの参考文献に見られるものと本質的に同じものであった。Ｈ．微生物における、硝酸塩還元、インドール生成、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解、ウレアーゼ、オキシダーゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ピラジンアミダーゼ、ピロリドニルアリールアミダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、α−グルコシダーゼおよびβ−アセチルーβ−グルコサミニダーゼの諸性質を決定するため、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製細菌決定キット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘＶｉｔｅｋ，Ｉｎｃ．，５９５ＡｎｇｌｕｍＤｒｉｖｅ，Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，ＭＯ６３０４２）を用いて単離された微生物に対して特有の反応を行なった。Ｉ．微生物がカタラーゼ活性を持つかどうかを決定するため、１滴の３％Ｈ₂Ｏ₂ を単離された微生物の培養物に添加した。泡が生じたときポジティブ反応がおこった。微生物がカタラーゼ活性を持つかどうかを決定するための手段は、上記パートＡ．のコリンズらの参考文献に見られるものと本質的に同じものであった。Ｊ．微生物の脂肪酸組成は、通常のガスクロマトグラフィー技術により決定した。約４０ｍｇのラサイバクタービオプレシス微生物および１ｍＬの鹸化反応薬（ＮａＯＨ４５ｇ、メタノール１５０ｍＬおよび蒸留水１５０ｍＬ）を、ねじ蓋試験管内に入れた。試験管は確実にテフロン系キャップで密封し、沸騰した水槽に５分間入れた。それから各試験管を、各回５−１０秒間で６回、激しくボルテックスした。試験管を冷却し、蓋を外して各試験管に２ｍＬのメチル化反応薬（保証６ＮＨＣｌ３２５ｍＬおよびメチルアルコール２７５ｍＬ）を添加した。試験管に再び蓋をし、１０分間８０℃で加熱した。試験管を再び冷却し、１．２５ｍＬの抽出試薬（ヘキサン２００ｍＬおよびｔｅｒｔ−ブチルエーテル２００ｍＬ）を各試験管に添加した。試験管を、傾斜回転器で約１０分間穏やかに上下動させた。試験管から蓋をとり、水相をピペットで回収し捨てた。約３ｍＬの洗浄試薬（蒸留水９００ｍＬ中にＮａＯＨ１０．８ｇ）を各試験管の有機相に添加した。試験管に再び蓋をし、さらに５分間上下動させた。約２／３の有機相を各試験管からＧＣバイアル内に次の分析のためピペットで移した。ガスクロマトグラフィー法は２５ｍ×０．２ｍｍのフェニルメチルシリコーン融合シリカキャピラリーカラムで、１７０℃から２７０℃まで１分毎に５℃づつ温度を上昇する温度プログラムを用いて行なった。Ｋ．微生物の形態学的特徴を走査型電子顕微鏡技術により決定した。単離された微生物の以下の特性が観察された：１）形態学的特性（図１参照）ａ）形および大きさ：丸いふちをもつ短桿状体３６９×１３５４ｎｍ±３１ｎｍｂ）運動性：小個体群運動極性のある１べん毛性のべん毛ｃ）胞子：無胞子形成ｄ）グラム染色：陽性ｅ）蛍光色素：陽性２）特別培地における生長特性ａ）トリプシン大豆寒天プレート培地（２８℃）ｉ）コロニー形成：接種後２４時間 ii）形：完全なふちをもつ規則的な円形 iii）表面：平滑、低凸面、光沢あり iv）色：黄色ｖ）臭い：あり、腐臭ｂ）グリセロール寒天培地（２８℃）ｉ）コロニー形成：接種後３６時間 ii）形：完全なふちをもつ規則的な円形 iii）表面：平滑、低凸面、光沢あり iv）色：黄色ｃ）グルコース栄養寒天培地（２８℃）ｉ）コロニー形成：接種後４８時間 ii）形：完全なふちをもつ規則的な円形 iii）表面：平滑、低凸面、光沢あり iv）色：明るい黄色ｄ）グルコース硝酸塩寒天培地（２８℃）ｉ）コロニー形成：接種後４８時間 ii）形：完全なふちをもつ規則的な円形 iii）表面：平滑、低凸面、光沢あり iv）色：明るい黄色３）物理的特性ａ）硝酸塩還元＋ｂ）メチルレッド試験＋ｃ）フォゲス―プロスカウエル反応 − ｄ）インドール生成ｅ）ゼラチン加水分解＋ｆ）デンプン加水分解 − ｇ）エスクリン加水分解＋ｈ）硝酸塩の利用＋ｉ）カタラーゼ活性＋ｊ）オキシダーゼ活性＋ｋ）ウレアーゼ活性 − ｌ）アルギニンジヒドロラーゼ活性 − ｍ）アルカリホスファターゼ活性 − ｎ）β−ガラクトシダーゼ活性＋ｏ）β−グルクロニダーゼ活性 − ｐ）α−グルコシダーゼ活性 − ｑ）β−アセチル−β−グルコサミニダーゼ活性 − ｒ）ピラジンアミダーゼ活性＋ｓ）ピロリドニルアリールアミダーゼ活性 − ｔ）好気性または嫌気性：好気性ｕ）炭水化物および有機酸の利用：キシロース＋アラビノース＋ラクトース＋マンニトール＋ソルビトール＋イヌリン − グルコース＋ガラクトース＋フルクトース＋マンノース＋マルトース＋シュークロース＋グリセロール＋ラムノース＋メリビオース − タガトース − クエン酸塩＋酒石酸塩 − セバシン酸塩 − リンゴ酸塩＋グルタル酸塩＋ｖ）特定の炭水化物および有機酸と生育したときの酸生成：キシロース − アラビノース＋（弱い）ラクトース − マンニトール − ソルビトール − グルコース＋ガラクトース＋フルクトース＋マンノース＋マルトース＋シュークロース＋グリセロール＋ラムノース＋クエン酸塩 − リンゴ酸塩 − グルタル酸塩 − ｗ）塩化ナトリウムまたは亜テルル酸カリウムに対する耐性：５％ＮａＣｌ − １０％ＮａＣｌ − ０．０３％亜テルル酸カリウム − ｘ）ツイーン２０、４０および８５の加水分解：ツイーン２０（０．５％）＋ツイーン４０（０．５％）＋ツイーン８５（０．５％）＋ｙ）窒素源としてのアミノ酸利用：メチオニン＋ＤＬ−バリン − グルタミン酸 − ＤＬ−オルニチン＋４）ガスクロマトグラフィーにより決定される細胞性脂肪酸組成：５）ラサイバクター種の異なる特性の比較：単離された微生物の特性を表２でラサイバクター属の他の微生物の特性と比較した。単離された微生物の特性は、以下の特徴によりラサイバクター属の他の種と異なる：（１）単離された微生物の脂肪酸構成特性は独特である。特に、１６：０細胞性脂肪酸のパーセントは同じ属の他の微生物の該脂肪酸のパーセントに比べて著しく高い。（２）単離された微生物の炭水化物利用特性は独特である。特に、Ｒ．イラニクス（Ｒ．ｉｒａｎｉｃｕｓ）がイヌリンを利用しないのに対し、単離された微生物はイヌリンを利用している。同様にＲ．トリティシ（Ｒ．Ｔｒｉｔｉｃｉ）もイヌリンを利用するが、Ｒ．トリティシは単離された微生物（およびＲ．イラニクス）が利用しないようなセバシン酸塩を利用する。（３）単離された微生物において特別な炭水化物の利用の結果としての酸生成の特性は独特である。特に、キシロースが代謝される際に、Ｒ．種を除く他のラサイバクター種が酸を生成しているのに対し、単離された微生物は酸を生成しない。他方、数種の他の炭水化物（例えば、グルコース、ガラクトース等）が代謝される際に、単離された微生物はそれらの炭水化物の代謝の結果として酸を生成するのに対し、Ｒ．種は、酸を生産しない。（４）単離された微生物のアミノ酸利用特性は独特である。特に、Ｒ．種を除く他のラサイバクター種がグルタミン酸を利用しているのに対し、単離された微生物はグルタミン酸を利用しない。他方、単離された微生物はＤＬ−オルニチンを利用するのに対し、Ｒ．種はＤＬ−オルニチンを利用しない。ラサイバクタービオプレシス微生物に関する１６：０細胞性脂肪酸組成の高いパーセント（１１．６４％）、独特の物理的特性（炭水化物およびアミノ酸利用形態ならびに酸生産）に基づいて、この微生物は、ラサイバクター属の独特の株であることが決定され、したがって、ラサイバクタービオプレシスと呼称するに値する。実施例３．ラサイバクター・ビオプレシス由来のセファレキシンクロロペルオキシダーゼを含む無細胞粗抽出物の調製実施例１の単離したラサイバクター・ビオプレシス微生物の接種物を、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．１％ＮａＣｌ０．２５％ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１５％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０５％Ｌ−リンゴ酸１．６％Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物０．２％滅菌前ｐＨ６．１０からなるシード培地に置いた。この接種物の大きさは１〜２％であった。シード培養物の発酵を１０リットルの発酵槽中で２８℃で２０時間行った。発酵ｐＨがｐＨ８．５０に達した場合、発酵ｐＨを３ＮＨＣｌでｐＨ８．５０に維持した。前記シード培地と同じ培地中で培養物の最終発酵を行った。この発酵を５５０リットルの発酵槽中で２８℃で２５時間行った。再び、発酵ｐＨがｐＨ８．５０に達した場合、発酵ｐＨを３ＮＨＣｌでｐＨ８．５０に維持した。５５０リットルの発酵槽中で製造した発酵ブロス由来の約１．３ｋｇ（湿重量）のラサイバクター・ビオプレシス微生物を遠心分離により集め、２６００ｍｌのｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に再懸濁し、セル３０ＣＤ（ＡＰＧａｕｌｉｎ，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ）ホモジェナイザーに１４，０００ｐｓｉで２回通した。この過程の間、アイスバスと熱交換機を用いて温度を４〜８℃にコントロールした。それから、生じた破壊細胞混合物をバッチモードを利用して１５，０００×ｇ（４℃）で１５分間遠心分離した（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）。この遠心分離手順をもう一度繰り返した。実施例４．セファレキシンクロロペルオキシダーゼ標品との反応によるセファレキシンのセファクロルへの変換セファレキシンを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、様々な反応条件下で実施例３のセファレキシンクロロペルオキシダーゼ標品の粗抽出物とインキュベートし、製造されたセファクロルの量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）技術により、同定反応時間で決定した。典型的な実験条件と結果を以下に示す。Ａ．酸性環境で行われるセファレキシンクロロペルオキシダーゼ反応の能力を評価するために、酵素反応を以下の条件下で行った：実施例３由来粗抽出物１ｍｌ０．５ＭＫＣｌ１００μｌ３％Ｈ₂Ｏ₂ １０μｌ１０ｍｇ／ｍｌセファレキシン５０μｌｐＨを１ＮＨＣｌを加えて調整し希望の酸性度を達成した。温度３７℃ ２つのｐＨ値で製造したセファクロルの量を表３に示す。Ｂ．セファクロルの製造時のセファレキシンクロロペルオキシダーゼ標品によるＨ₂Ｏ₂の利用を評価するために、酵素反応を以下の条件下で行った：実施例３由来粗抽出物１ｍｌ０．５ＭＫＣｌ１００μｌ１０ｍｇ／ｍｌセファレキシン５０μｌＨ₂Ｏ₂を指定した濃度で１０μｌの水に加えた。ｐＨ５．７様々なＨ₂Ｏ₂濃度で製造したセファクロルの量と温度を表４に示す。Ｃ．セファレキシンクロロペルオキシダーゼ標品によるセファクロルの製造時のＫＣｌ濃度の効果を評価するために、酵素反応を以下の条件下で行った：実施例３由来粗抽出物０．８ｍｌ０．１ＭＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｍｌ３％Ｈ₂Ｏ₂ １０μｌ１０ｍｇ／ｍｌセファレキシン５０μｌｐＨ５．３温度４２℃ 様々なＫＣｌ濃度での生産されたセファクロル量は表５に示される。これらの評価の結果は、酸性環境下、Ｈ₂Ｏ₂を使用下の酵素の機能が、ＫＣｌと３７℃以上の温度が好ましいということである。温度は少なくとも３７〜４２ ℃にできる。実施例５ラサイバクタービオプレシス由来のセファレキシンクロロペルオキシダーゼの部分精製実施例３の無細胞抽出物がｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化された陰イオン交換カラム（Ｔｏｙｏ−ＰｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ）に負荷された。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０かＤＥ−５２陰イオン交換樹脂を二者択一的に使用することができる。クロロペルオキシダーゼ酵素画分がｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液中０から３．０ＭまでのＮａＣｌのステップグラジェントを用いることにより、カラムから溶出された。それぞれのステップグラジェントバッチは約５リットルであり、集められた画分は、伝導度によりモニターした。ＳｕｐｅｒＱが使用されたとき、クロロペルオキシダーゼ画分は約０．３ＭＮａＣｌで、８−２７ｍＳ／ｃｍの伝導度の範囲で、カラムから溶出された。その画分の蛋白質量、クロロペルオキシダーゼ活性および伝導度を図２に示す。酵素活性のピークを含むバッチを、バーティス凍結乾燥機を用いた凍結乾燥によりさらに濃縮した。実施例６ラサイバクタービオプレシス由来のセファレキシンクロロペルオキシダーゼ標品の固定化実施例５の２０ｍｇの凍結乾燥された蛋白質を０．１ＭＮａＣｌを含むｐＨ５．５の５０ｍＭリン酸緩衝液１０ｍｌに溶解させた。この溶液を１ｇの乾燥ユーパジット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）Ｃ固定化支持体に加えた。溶液スラリーを室温で４８〜６５時間ゆるやかに震盪させた。残りの蛋白質溶液は濾過により支持体物質から除かれた。次いで、生じた固定化生体触媒は、新しい１０ｍｌの蒸留水の洗浄で５回洗浄した。洗浄された固定化生体触媒は１０℃未満の０．１ＭＮａＣｌを有するｐＨ５．５の５０ｍＭリン酸緩衝液中で保存した。実施例７固定化セファレキシンクロロペルオキシダーゼ標品を用いた反応によるセファレキシンからセファクロルへの変換実施例６の固定化セファレキシンクロロペルオキシダーゼ標品を、以下の条件下でセファレキシンからセファクロルを酵素的に生産するために使用した：実施例６の固定化生体触媒５ｇ（湿潤）０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０１０ｍｌ３ＭＮａＣｌ９μｌ１０ｍｇ／ｍｌセファレキシン４８６μｌ３％Ｈ₂Ｏ₂ ３３μｌ反応液を３５℃で２４時間緩やかに震盪しつつインキュベートした。２４時間後生産したセファクロルの量はイオン対ＨＰＬＣを用いて評価された。ＨＰＬＣカラムはノボパックガードカラムの付いたウオーターズノボパックであった。移動相は２０％ＭｅＣＮ、８ｍＭ水酸化テトラブチルアンモニウム、ｐＨ７．０であった。カラムは３０℃であり、移動相流速は１．５ｍｌ／分であった。生産物はフォトダイオードアレイ検出器で１９５−３００ｎｍ全域と２５８ｎｍの特異的検出波長で検出された。この固定化生体触媒の工程から得られるセファクロルの収率はセファレキシンの出発量に基づいて０．２％であった。これらの結果は、固定化酵素がセファレキシンをセファクロルに変換できることを示す。固定化酵素を用いるセファクロルを生産する好ましい条件は、１．４ｍＭセファレキシン出発物質があるとき、ｐＨ６．０、２．８ｍＭＨ₂Ｏ₂、２．８ｍＭＮａＣｌである。酵素反応は３５℃で２４時間行なわれる。セファレキシンクロロペルオキシダーゼが固定化されない場合、例えば酵素が溶液中で遊離している場合、別のセファレキシンからセファクロルへの反応が行われた。この反応は、２４時間継続することが可能であった。図３Ａは２４時間反応終了後の生体触媒反応液成分のＨＰＬＣ分離の図示である。図３Ｂと３Ｃはセファクロルとセファレキシンの混合標準溶液と、混合標準溶液と生体触媒反応生産物の混合物のそれぞれの図示である。混合標準は溶液中に等重量のセファクロルとセファレキシンを含んでいた。これらのグラフはセファクロルがセファレキシンとのセファレキシンクロロペルオキシダーゼ反応により生産され、セファクロル生産物は反応液中で容易に同定されることができることを示す。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された本発明の具体的な態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような均等物は請求の範囲の範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【手続補正書】１９９６年１２月３０日【提出日】【補正内容】請求の範囲１．セファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品を生産するラサイバクター属の単離された種。２．ラサイバクタービオプレシスからなる請求項１記載の単離された種。３．セファレキシンβ−ラクタム環系の３位がハロゲン化される請求項１記載の単離された種。４．ハロペルオキシダーゼ反応のハロゲンがヨウ素、臭素、塩素およびフッ素からなる群より選ばれる請求項３記載の単離された種。５．該セファレキシンハロペルオキシダーゼ活性の生産物がセファクロルである請求項４記載の単離された種。６．セファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品。７．該酵素標品がラサイバクター属の微生物種由来の抽出物中に含まれている請求項６記載の酵素標品。８．該微生物種が、ラサイバクタービオプレシスである請求項７記載の酵素標品。９．１種以上の酵素が、単独でまたは組み合わせてセファレキシンをセファクロルに変換する機能を有する請求項６記載の酵素標品。１０．０．３ＭＮａＣｌバッチでＴｏｙｏ−ＰｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ陰イオン交換樹脂から溶出される物質からなり、該Ｔｏｙｏ−ＰｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ陰イオン交換樹脂がラサイバクタービオプレシス培養物の全ホモジネートを１５，０００×ｇで遠心分離して得られる上清部分であらかじめ負荷されている、請求項９記載の酵素標品。１１．該ハロゲン化セファロスポリンが生産されるような適切な条件下で、ラサイバクター属の種から得られた蛋白質抽出物を用いてセファレキシンをインキュベーションすることからなり、該蛋白質抽出物がセファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品を含んでいる、ハロゲン化セファロスポリンの生産方法。１２．該適切な条件が、過酸化物の利用と水系（ａｑｕｅｏｕｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）で該方法を実施することを含む、請求項１1記載の生産方法。１３．該ハロゲン化セファロスポリンがセファクロルである請求項１１記載の生産方法。１４．該ラサイバクター属の種がラサイバクタービオプレシスである請求項１１記載の生産方法。１５．該蛋白質抽出物が固体支持体に固定化された請求項１１記載の生産方法。１６．セファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品を生産するラサイバクター属の種の本質的に純粋な培養物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チェン，ユング−ピンアメリカ合衆国サウスカロライナコロンビア，ケンバリー 6244

Claims

【特許請求の範囲】１．セファロスポリンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品を生産する単離された微生物。２．ラサイバクター属の種からなる請求項１記載の単離された微生物。３．ラサイバクタービオプレシスからなる請求項２記載の単離された微生物。４．セファロスポリンβ−ラクタム環系の３位がハロゲン化される請求項１記載の単離された微生物。５．ハロペルオキシダーゼ反応のハロゲンがヨウ素、臭素、塩素およびフッ素からなる群より選ばれる請求項４記載の単離された微生物。６．セファロスポリンがセファレキシンであり、該セファロスポリンハロペルオキシダーゼ活性の生産物がセファクロルである請求項５記載の単離された微生物。７．セファロスポリンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品。８．該酵素標品がラサイバクター属の微生物種由来の抽出物中に含まれている請求項７記載の酵素標品。９．該微生物種が、ラサイバクタービオプレシスである請求項８記載の酵素標品。１０．単独でまたは組み合わせてセファレキシンをセファクロルに変換する機能を有する１種以上の酵素からなる請求項７記載の酵素標品。１１．０．３ＭＮａＣｌバッチでＴｏｙｏ−ＰｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ陰イオン交換樹脂から溶出される物質からなり、該Ｔｏｙｏ−ＰｅａｒｌＳｕｐｅｒＱ陰イオン交換樹脂がラサイバクタービオプレシス培養物の全ホモジネートを１５，０００×ｇで遠心分離して得られる上清部分であらかじめ負荷されている、請求項１０記載の酵素標品。１２．該ハロゲン化セファロスポリンが生産されるような適切な条件下で、ラサイバクター属の種から得られた蛋白質抽出物を用いてセファレキシンをインキュベーションすることからなり、該蛋白質抽出物がセファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品を含んでいる、ハロゲン化セファロスポリンの生産方法。１３．該適切な条件が、過酸化物の利用と水系（ａｑｕｅｏｕｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）で該方法を実施することを含む、請求項１２記載の生産方法。１４．該ハロゲン化セファロスポリンがセファクロルである請求項１２記載の生産方法。１５．該ラサイバクター属の種がラサイバクタービオプレシスである請求項１２記載の生産方法。１６．該蛋白質抽出物が固体支持体に固定化された請求項１２記載の生産方法。１７．セファレキシンハロペルオキシダーゼ活性を持つ酵素標品を生産する本質的に純粋な微生物培養物。