JPH10509311A - 免疫原性化合物またはハプテンの免疫原性の改良方法、およびワクチン調製のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 宿主に投与する免疫原、抗原またはハプテンの免疫原性を投与のモードに係わらず増強する方法であって、上記抗原またはハプテンが支持体分子に共有結合して複合体を形成することを特徴とし、かつこの支持体分子が、哺乳動物血清アルブミンに特異的に結合し得るポリペプチドフラグメントであることを特徴とする方法。本発明は、上記方法により得られる産物の、医薬としての使用についても開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫原性化合物またはハプテンの免疫原性の改良方法、 およびワクチン調製のためのその使用 １才以下の離乳前幼児の急性呼吸器感染による入院の、最も普通の原因はＲＳ Ｖである。喉頭気管支炎、細気管支炎および肺炎にかかった幼児は入院治療を必 要とし、先天心臓病を示す離乳前幼児の死亡率は３７％を超える。気管支肺形成 異常症、腎性疾患および免疫欠損等の他の障害も、死亡率増加の原因になる重要 要因である。ＲＳＶ感染は老人の死亡原因でもある。 温帯諸国では、ＲＳＶの流行は１１月ないし４月の冬季に起こり、重症疾患の 最高発生率は生後２ないし６カ月の離乳前幼児達に見られる。ＲＳＶのＧ糖タン パク質の抗原性異形に準拠してＲＳＶの２つのタイプ、ＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ −Ｂ間には違いが認識される：サブグループＡおよびサブグループＢであり、こ れらは同時に広まる。１９８２年ないし１９９０年にフランスで行われた最近の 研究では、５年の期間に亙っての１つのサブグループの他のサブグループによる 交代が証明された。菌株Ａは菌株Ｂよりも一層重大な感染原因になることが多い 。 １９６０年代では、ホルモール不活性化ＲＳＶを用いた抗はしかワクチンに類 似する、在来型ワクチンの開発が試みられたが成功しなかった。ワクチン接種幼 児を防御する代わりに、このタイプのワクチンは上記天然ウイルス疾患を助長す る効果があった。 ヒトのＲＳＶは肺炎ウイルスに属し、パラミクソウイルス科の１員である。マ イナス極性を帯びたＲＮＡ鎖からなる上記ウイルスのゲノムは、非セグメントで あり、かつ異なる１０種のタンパク質をコードする：ＮＳ1、ＮＳ2、Ｎ、Ｐ、 Ｍ、ＳＨ（または１Ａ）、Ｇ、Ｆ、Ｍ2（または２２Ｋ）およびＬ。 開示された多くの実験によれば、防御に係わる主タンパクは：Ｆ、ＧおよびＮ であることが証明されている。前駆体Ｆoとして合成される融合糖タンパク質Ｆ はサブユニットＦ1（４８ｋＤａ）およびＦ2（２０ｋＤａ）の２つに開裂され、 これらはジスルフイド架橋により互いに結ばれている。このＦタンパク質はＲＳ Ｖ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂ（９１％相同）間に保存される。逆に、付着糖タンパク 質Ｇは１つのサブグループから他のサブグループへと大いに変わる。１３アミノ 酸（ａａ１６４からａａ１７６）の１領域のみが高度に保存され、かつシステイ ンの４つの残基（１７３、１７６、１８２および１８６）は各サブグループ中に 保持される。動物モデルでは、上記２つの糖タンパク質ＦおよびＧが、ＲＳＶの 免疫学において主要な役割を演ずることが判った。ＧおよびＦを指向するモノク ロナール抗体は上記ウイルスを ｉｎ ｖｉｔｒｏ で中和でき、かつ受動的に 投与されると、それらはコットンラットをＲＳＶ感染から防御する。 離乳前幼児におけるＲＳＶ由来の疾患悪化の場合の最近の処置方法は、ベンチ レーションにより提供される粘液吸引および呼吸支援による、呼吸道からのうっ 血除去である。抗ウイルス剤であるリバヴィリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）は、重 症の場合に有効であるように見える。しかし小児治療における使用については、 未だ明確にされていない。抗−ＲＳＶ免疫グロブリンを使用する受動免疫化は重 症ＲＳＶ感染の処置における別法の見本であり、不都合な副作用は観察されてい ない。それにも係わらず、このタイプの治療法は極めて高価につき、かつ大規模 に拡張するのは困難である。 ヒトＲＳＶ用のワクチン接種には異なったアプローチが取り入れられている： このワクチンは動物（げっ歯類および霊長類）のＲＳＶ感染は防御するが、肺の 病理を誘発するか、またはさもなればこのワクチンは免疫原性が不充分で防御を 提供しないかの何れかである［コノール（Ｃｏｎｎｏｒｓ）らのＶａｃｃｉｎｅ （１９９２）；１０：４７５−４８４］。 このような理由で本発明は、免疫原、特に抗原またはハプテンの免疫原性を改 良する方法に関するものであり、宿主に投与した場合、投与モードに係わらず、 上記免疫原またはハプテンが支持体分子に共有結合して複合体を形成することを 特徴とし、かつこの支持体分子が哺乳類の血清アルブミンに特異的に結合し得る ポリペプチドフラグメントであることを特徴とする方法に関する。 投与は特に経腸、非経口的または経口的に行なうことができる。 この免疫原と支持体分子との間の複合体の免疫原性は、他の免疫刺激剤が存在 しなくても免疫原単独の免疫原性に較べて改良されることが判った。 本発明の実施に特に適する複合体はストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ）のＧタンパク質から誘導されたポリペプチドとの抱合体を使用して得 られ、このタンパク質はニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）らにより、その特徴が描写さ れている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ（１９８８）；１：６９−７４］。 本発明は、上記支持体分子が配列番号７４で示されるアミノ酸配列を示す場合 、または上記配列番号７４との相同が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも ９０％の配列を示す場合の方法に関する。 この配列は、宿主中でのその発現を促進するリンキング配列に付着されてもよ い。 本発明によれば、配列番号７５または配列番号７８の１つを示す支持体分子、 ならびに上記配列との相同が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％で あるような支持体分子の使用も可能である。 このペプチド配列７８は次の特性を示す： 配列番号７８ 分子量：２６５２９ Gly:10(4.08%); Ala:30(12.24%); Ser:14(6.12%); Thr:16(6.53%); Val:20(8.16%); Leu 23(9.39%); Ile:12(4.90%); Pro: 4(1.63%); Cys: 0(0.00%); Met: 1(0.41%); His: 2(0.82%); Tyr: 9(3.67%); Asp:19(7.76%); Glu:19(8.16%); Lys 27(11.02%); Arg: 5(2.04%); Asn:16(6.94%); Gln: 8(3.27%); Phe: 7(2.86%); 上記支持体分子と免疫原性改良が所望される化合物との間の複合体は、組換え ＤＮＡ技術、特に免疫原またはハプテンをコードするＤＮＡを、この支持体をコ ードするＤＮＡ分子中に挿入または融合することにより生成させることができる 。 本発明の他の実施態様では、支持体分子と免疫原との間の共有結合は、当業者 には公知の手法を用いて化学的に行える。 本発明はまた、免疫原性を改良するための方法を実施させ得る遺伝子融合物に も関し、このものは免疫原またはハプテンをコードするＤＮＡを、支持体分子を コードするＤＮＡ分子中に挿入または融合して生成させるハイブリッドＤＮＡ分 子を含み、かつこれはプロモーターと共に融合されてなることを特徴とし；本発 明中にはまた、このような遺伝子を含有するベクターも包含され、上記ベクター の場合には特にその起源としてプラスミド、バクテリオフアージ、ウイルスおよ び／またはコスミドに由来するＤＮＡベクターを有することが可能である。 配列番号７６または７７を示すベクターは対応ポリペプチド同様に、本発明の 範疇に属する。これらのポリペプチドは次の特徴を示す： 配列ＩＤＮｏ：７６ 分子量：３８６８１ Gly:11(3.15%); Ala:31(8.88%); Ser:18(5.16%); Thr:37(10.60%); Val:25(7.16%); Leu:23(6.59%); Ile:15(4.30%); Pro:19(5.44%); Cys: 4(1.15%); Met: 2(0.57%); His: 4(1.15%); Tyr: 9(2.58%); Asp:22(6.30%); Glu:22(6.30%); Lys:48(13.75%); Arg: 7(2.01%); Asn:26(7.45%); Gln:13(3.72%); Phe:12(3.44%); Trp: 1(0.29%); 配列番号７７ 分子量：３９２８８ Gly:12(3.37%); Ala:31(8.71%); Ser:22(6.18%); Thr:37(10.39%); Val:26(7.30%); Leu:23(6.46%); Ile:15(4.21%); Pro:21(5.90%); Cys: 2(0.56%); Met: 2(0.56%); His: 4(1.12%); Tyr: 9(2.53%); Asp:23(6.46%); Glu:22(6.18%); Lys:48(13.48%); Arg: 7(1.97%); Asn:26(7.30%); Gln:13(3.65%); Phe:12(3.37%); Trp: 1(0.28); 免疫原と支持体分子間の複合体をコードするＤＮＡ分子は、宿主細胞のゲノム 中に組み入れ可能である。 その実施態様の一つでは、本発明の新規方法の中には、遺伝子操作により宿主 細胞中に上記複合体を生成させるための工程が包含される。 この宿主細胞は原核生物のタイプであってもよく、特にＥ．Ｃｏｌｉ、Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよ びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択されたものであってもよく、 また酵母であってもよい。 本発明の他の局面によれば、この宿主細胞は哺乳類由来のものである。 改良された免疫原性を有するこの複合体をコードするこの遺伝子融合物は、特 にウイルスベクターの仲介で宿主細胞中に導入される。 好ましく使用される免疫原はバクテリア、寄生虫およびウイルスから誘導され る。 この免疫原はハプテン：ペプチドまたは多糖類であってもよい。 この新規方法は病原体からの表面ポリペプチドの場合に特に好適である。この ポリペプチドが融合タンパク質の形態で発現される場合、組換ＤＮＡ技術を用い ることにより、融合タンパク質が宿主細胞膜表面に有利に発現され、定着し、か つ露出される。宿主細胞中で抗原合成を指図できるような核酸分子が採用される 。 それらは、当業者により適応されるはずのプロモーター配列、機能的に結合し た分泌シグナル配列および、膜定着領域をコードする配列を含んでいる。 この免疫原は特にＲＳＶ表面糖タンパク質：Ｆおよび／またはＧから誘導され 得る。 ＲＳＶサブグループＡまたはＢからのＧタンパック質のフラグメントを使用す ると、特に有利な結果が得られる。 ＲＳＶサブグループＡおよびサブグループＢのＧ糖タンパク質由来のタンパク 質は遺伝子的融合または化学的にＢＢに結合され得る。 したがって本発明は、ＲＳＶのＧタンパク質のアミノ酸１３０および２３０の 間に包含される配列、またはこのＧタンパク質の上記配列に少なくとも８０％相 同を示す配列を用いて得られる複合体に関する。 この配列はサブグループＡまたはＢに属するヒトまたはウシＲＳＶから得るこ とができる。 このＧタンパク質のアミノ酸１３０および２３０間に包含される配列は、その 免疫原活性および宿主系による発現を調節する目的で、各種タイプの修飾を施す ことができる。 本発明者は、特に重要なポリペプチド類としては： −位置１７３および／または１８６のＣｙｓアミノ酸が、ジスルフイド架橋を形 成しないアミノ酸特にセリンにより置換されているもの、および／または −位置１７６および１８２のアミノ酸が、ジスルフイド架橋以外の共有架橋を形 成し得るもの特にアスパラギン酸およびオルニチン、および／または −上記Ｇタンパク質の配列の位置１６３、１６５、１６８および／または１７０ に対応するフエニルアラニンアミノ酸類が極性アミノ酸特にセリンにより置換さ れたもの、および／または −アミノ酸番号１６２および１７０間に包含される配列が欠失しているもの； であることを証明している。 かくして、配列番号１ないし７３の１つ、または配列番号１ないし７３の１つ と少なくとも９０％の相同を有する配列を示すペプチドが本発明の実施に特に適 している。 この新規方法の実施に適する他の免疫原の中には、肝炎ウイルスＡ、Ｂおよび Ｃの表面タンパク質の誘導体、はしかウイルスの表面タンパク質、パラインフル エンザウイルス３の表面タンパク質、特にヘマググルチニン（ｈａｅｍａｇｇｌ ｕｔｉｎｉｎ）、ノイラミニダーゼＨＮおよび融合タンパク 質Ｆ等の表面糖タンパク質が包含される。 上記のような複合体をコードし、かつある種の特定宿主細胞中で標的にされる 発現を可能にする要素を含むＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド配列は、本発明の 範疇に包含される。それらはウイルスまたはプラスミドベクター中に組み込むこ とができる：このベクターは免疫原と支持体分子間との複合体をｉｎ ｓｉｔｅ で生成可能ならしめる目的で、特に医薬剤組成物として哺乳動物に投与される。 また本発明は免疫原（Ｐ）と上記支持体分子との間の融合遺伝子または複合体 の医薬としての使用に関する。上記遺伝子または複合体を、生理学的に許容され た賦形剤と共に含有する薬剤組成物もまた本発明の範疇に属する。それらはワク チンの調製に特に好適である。 免疫化は、このヌクレオチド配列自体の投与またはウイルスベクターの仲介を 通じての投与のいずれかにより得られる。宿主細胞特に不活性化バクテリアも使 用できる。最後に、化学結合により得られる複合体または融合タンパク質の形態 における複合体は抗体応答を誘発し、この応答はフロイントアジュバントに結合 するそれ自体上の（Ｐ）により誘発される応答に較べて遥かに強力である。 ＲＳＶに対するワクチンの範囲内で本発明者は、融合タンパク質ＢＢＧ２Ａ［ ここでＧ２ＡはＲＳＶ−Ａ（Ｇ ａａ１３０−ａａ２３０）のＧタンパク質の１ ０１アミノ酸フラグメント、配列番号１］の効能を証明した。げっ歯類の免疫に 用いると、ａｌｕｍ（水酸化アルミニウム）に結合したＢＢＧ２ＡおよびＢＢＧ ２ＡδＣはＲＳＶ−Ａ（長い菌株）の抗原投与に対して完全な防御を与える。 次に記載の実施例は本発明の説明目的のもので、本発明の制約を意図するもの ではない。 これらの実施例では、次の図面を参照する： 図１：ｐＶＡＢＢＧ２（Ａ）の構築。実施例１：遺伝子Ｇ２ＡおよびＧ２ＡδＣの発現ベクターｐＶＡＢＢ３０８中へ のクローニングおよびＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ ＣＯＬＩ中での融合タンパクＢ ＢＧ２ＡおよびＢＢＧ２δＣの生成 １）発現ベクターｐＶＡＢＢ３０８ Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＶＡＢＢ３０８（５．４ｋｂｐ）がトリプトフア ンオペロンプロモーター（Ｔｒｐ）を含み、次いでＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ［Ｎｙｇｒｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ（１９８８）；１：６９−７ ４］のＧタンパク質由来のヒトアルブミン−結合領域ＢＢをコードする遺伝子、 および多重クローニング部位ｍｐ８（この中に各種の異種遺伝子が挿入され得る ）が続く（図１参照）。プラスミドｐＶＡＢＢ３０８はアンピシリン抵抗遺伝子 （ＡＭＰ）、テトラサイクリン抵抗遺伝子（Ｔｅｔ）およびＥ．ｃｏｌｉ複製起 点を含む。この遺伝子の発現はＩＡＡ．（インドールアクリル酸）を、指数増殖 期間にＥ．ｃｏｌｉ培地中に添加して誘発される。 ２）遺伝子Ｇ２ＡおよびＧ２ＡδＣのＰＶＡＢＢ３０８へのクローニング ２．１．ＢＢＧ２Ａ ＲＳＶ−ＡＧ（１３０−２３０）をコードするこの遺伝子は、固相で合成遺伝 子を集合する方法により得られ［スタール（Ｓｔａｈｌ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ（１９９２）：１４：４２４−４３４］、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を用いて発現ベクターｐＶＡＢＢ中にクーロン化した。生成ベク ターをｐＶＡＢＢＧ２Ａ（５７９１ｂｐ）と呼称する。この融合生成物ＢＢＧ２ Ａは、ベクターｐＶＡＢＢＧ２Ａを用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉのサイト ゾルから２つの形態で精製される。 −溶性形態のＢＢＧ２Ａ（ゾル）、細胞壊変および遠心分離に続いて溶性タンパ ク質含有上澄みをアフイニテイーカラム上に直接充填する。 生成物は溶離後に酸性ｐＨで回収する。 −酸化性媒体中での復元後に得られる不溶形態のＢＢＧ２Ａ（不溶性）、カオト ロピック剤（グアニジンＨＣｌ）（３１、９３）中に溶解されている上記封入体 は、次いでアフイニテイー精製工程にかける。 ２．２．ＢＢＧ２ＡδＣ 上記２つのシステイン残基（１７３および１８６）をセリン（Ｓｅｒ）により 置換する。遺伝子が集合されたら、その（ＴＧＣ）トリプレットによりコードさ れる２Ｃｙｓ残基を取り囲むオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの１つが変化 している他の１つのオリゴヌクレオチドにより極めて簡単に置換される：Ｓｅｒ をコードする（ＴＣＣ）。本発明者らはＣｙｓ残基（１７６および１８２）によ り形成され、かつ防御に必須なジスルフイド架橋を専ら保持する目的で、この変 形では１つのジスルフイド架橋を意図的に修飾することを我々は望んだ［トルー デル（Ｔｒｕｄｅｌ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）；１８５：７４９−７ ５７］。 我々は、このＢＢアフイニテイーテールとＧ２Ａの間またはＢＢとＧ２ＡδＣ の間にＭｅｔ残基を導入した：ＢＢ−Ｍｅｔ−Ｇ２ＡおよびＢＢ−Ｍｅｔ−Ｇ２ ＡδＣであり、これにより臭化シアン（ＣＮＢｒ）を用いてこの融合生成物を化 学的に開裂し得るようになし；この混合物をＨＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフイ ニテイーカラムを通過させる。開裂ペプチドＧ２Ａ（Ｇ２ＡδＣ）は結合せず、 したがって溶離液中に回収され、次いで逆相ＨＰＬＣにより精製する。 ３）融合タンパク質の醗酵および精製 ＴＳＢ（トリプシンソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）、Ｄ ｉｆｃｏ）２５０ｍＬを、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）およ びテトラサイクリン（８μ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）と共に含むエルレンマイヤーフ ラスコを、プラスミドｐＶＡＢＢＧ２ＡおよびｐＶＡＢＢＧ２ＡδＣそれぞれを 用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８菌株で接種する。このフラスコ を震盪しながらＴ°＝３２℃で１６時間保温する。この培養物２００ｍＬを醗酵 槽（ＣＨＥＭＡＰ ＣＦ３０００、ＡＬＦＡ ＬＡＶＡＬ）中に接種する。この 醗酵器中には培養基２Ｌが含まれている。この培養基は（ｇ／Ｌ）単位でグリセ ロール５；硫酸アンモニウム２．６；リン酸二水素カリウム３；リン酸一水素二 カリウム２；クエン酸ナトリウム０．５；酵母抽出物１；アンピシリン０．１； テトラサイクリン０．００８；チアミン０．０７；硫酸マグネシウム１；および 微量元素溶液／１の１ｍＬおよびビタミン溶液／１の０．６５ｍＬを含む。醗酵 期間中にモニターするパラメーターはｐＨ、震盪、温度、酸素添加速度および炭 素源（グリセロールまたはグルコース）の供給である。このｐＨは７．３に維持 する。温度は３２℃に保つ。溶解酸素の圧力濃度（ｔｅｎｓｉｏｎ ｓｉｇｎａ ｌ）を３０％に維持するために定状速度でグリセロールを供給して成長を制御す る。培養物の濁度（５８０ｎｍで測定）が８０の値に達したら（培養約２７時間 後）、最終濃度が２５ｍｇ／Ｌになるようにインドールアクリル酸（ＩＡＡ）を 添加してタンパク質の生産を誘発する。誘導後３時間で遠心分離により細胞を収 穫する。得られるバイオマス収率は１５０ｇ／Ｌ（培養物）のオーダーである。 湿潤バイオマスのフラクション３０ｇをＴＳＴ溶液７０ｍＬ（５０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁する。これらの細胞を超音波（ Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ ７２４０１、Ｓｏｎｉｃｓ ＆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）に より壊変する。細胞溶解物を遠心分離後、上澄みを濾過（１．２μｍ）し、ＴＳ Ｔの５００ｍＬ中に希釈する。溶性形態で得られたこの融合タンパク質をアフイ ニテイーカラムＨＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ヒト血清アルブミン）上でスター ル（Ｓｔａｈｌ）らにより記載されたプロトコールに従って精製する［Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９）；１２４： ４３−５２］。 遠心分離後、不溶性分離物を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８． ５；５ｍＭ ＭｇＣＬ₂）を用いて１回洗浄する。洗浄後、このペレットを７Ｍ グアニジン・ＨＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭの ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の３０ｍＬ中に溶解し、次いでこの混合物を３７ ℃で２時間保温する。この溶解タンパク質を復元緩衝液［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ（ｐＨ８．５）；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ］中に添加する。グアニジンＨＣｌ濃度を、溶解化融合タンパク添加前に復元緩 衝液中の最終濃度０．５Ｍになるように調節する。この混合物を緩やかに撹拌し ながら室温で１６時間保温する。遠心分離後、上澄み中の溶性融合生産物をＨＳ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で精製する。精製融合タンパク質をＭＩＮＩ ＰＲＯＴＥＩＮ ＩＩ ＳＹＳＴＥＭ（ＢＩＯＲＡＤ）装置を用いて減圧条件下 、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）上で分析する。このタンパク質はＣｏｏｍａ ｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ブルーＲ２５０を用いて肉視できる。実施例２：ＢＢポリペプチドのキヤリアー効果およびＢＢＧ２ＡδＣの免疫原性 １．免疫化プロトコール Ｃ57Ｂ1／６マウス（バッチ当り５）に１０μｇ当量のＧ２ＡδＣの皮下注射 ２回をＤo上（完全アジュバント）およびＤ14上（不完全アジュバント）のフロ イントアジュバントの存在下で投与した。Ｄ21上で、この血清をＧ２ＡδＣ特異 性抗体の生産の場合についてＥＬＩＳＡにより個々に試験した。この抗体力価は 、免疫化に先立つこの動物血清の吸光度の２倍を与える血清希釈度の逆数として 決定する。示した結果は、バッチのそれぞれの場合に得られた抗−Ｇ２ＡδＣ抗 体の算術平均である。 結果の表 ２．結果 上記表は、Ｇ２ＡδＣがフロイントアジュバントの存在下でさえも弱い免疫原 であることを示す。このＢＢタンパク質は、Ｇ２ＡδＣに添加された際、その抗 −Ｇ２ＡδＣ抗体力価は僅か１ｌｏｇだけ増加するだけなので、劣ったアジュバ ント能力を有する。一方、Ｇ２ＡδＣへのＢＢの融合は抗−Ｇ２ＡδＣ抗体生産 が約３ｌｏｇだけで増加する。したがって、ＢＢはＧ２ＡδＣに対する優れたキ ヤリアータンパク質であり、この融合タンパク質ＢＢＧ２ＡδＣは極めて免疫原 性があると結論できる。実施例３： 融合タンパク質ＢＢＧ２ＡおよびＢＢＧ２ＡδＣにより誘発される 、げっ歯類における防御の研究 ａ）研究プロトコール この免疫化実験では、ＲＳＶ感染の場合の動物モデルである雌ＢＡＬＢ／ｃマ ウスおよびコットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）（ＩＦＦＡ −ＣＲＥＤＯ）を用いた。 上記動物群には２０％水酸化アルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）₃］（ｖ／ｖ）中の ＲＳＶ−Ａ候補的ワクチンの２００μｇ、２０μｇ、２μｇまたは０．２μｇの １、２または３用量を２週間間隔で投与する。このマウスは腹腔内（ｉ．ｐ．） 経由で免疫化し、一方でコットンラットは筋肉内注射（ｉ．ｍ．）により免疫化 する。対照グループは２０％水酸化アルミニウム（ｖ／ｖ）中のＲＳＶ−Ａまた はＰＢＳ−Ａ（Ｃａ²⁺またはＭｇ²⁺なしのＰＢＳ）の１０⁵ＴＣＩＤ₅₀を投与す る。 最後の免疫化後３ないし４週間で、これらの動物は約１０⁵ＴＣＩＤ₅₀ＲＳＶ −Ａを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）経由で抗原投与を受ける。彼らは心臓内血液穿 刺に続く５日後に死亡させる。彼らの肺中のウイルスの存在をトルーデル（Ｔｒ ｕｄｅｌ）らの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）；１８５；７４９−７５７ ］に従って決定する。 試験すべき異なった生成物はＢＢＧ２Ａ、ＢＢＧ２ＡδＣおよびＢＢ単独であ る。 ｂ）結果の表 ｃ）論議 上記の実験的防御結果を表３．１．および表３．２．に示す。各分子は少なく とも２回の独立実験で試験した。この結果は、採用した免疫化プロトコールには 無関係に、ＢＢＧ２ＡはＲＳＶ−Ａによる肺感染に対してげっ歯類を防御するこ とを明らかに立証している。我々の実験条件下では、ＢＢＧ２Ａの２００μｇの シングル注射、２μｇの２回注射、または０．２μｇのみの３回注射で感染に対 するマウスの防御には十分である（表３．２）。同一グループの第３番目の動物 中にウイルスが検出されたが、検出限界においてであった。これらの結果は、Ｂ ＢＧ２Ａが、免疫化対照動物におけるＲＳＶ−Ａのそれらに極めて類似で、かつ 文献記載のＲＳＶ−Ａサブユニット候補的ワクチンのそれらに極めて類似の将来 性と効能を示すことを暗示している。 またＢＢＧ２ＡδＣも、マウスにおいて肺感染に対して３４例中の３２動物を 防御するのに有効であった。２００μｇの２用量は０．２μｇの３回注射と同程 度に有効であることが判った。このように、数回の注射からなるこれらの免疫化 プロトコールでは、マウスにおける活性と効能はＢＢＧ２ＡδＣが、既に記載さ れたＲＳＶ−Ａサブユニット候補的ワクチンと同程度であることが判明した。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける体液性応答および細胞性応答の結果を表３．３に 示す。一般的にＥＬＩＳＡ法により得られる抗−ＲＳＶ−Ａ−特異性抗体類の平 均力価は候補的ワクチンの防御活性を反映するパラメーターの１つであると考え られる。ＰＳＶ−Ａにより免疫化したマウスの血清は終始一貫して高い抗−ＲＳ Ｖ−Ａ抗体力価を示した。このウイルスは、これらの動物の肺中には決して検出 されなかった。ＢＢＧ２Ａにより免疫化したマウスは、同様の高い抗−ＲＳＶ− Ａ平均抗体力価を示し、かつＲＳＶ−Ａの抗原投与に際して常に防御された。 ＢＢＧ２ＡδＣにより誘発された抗−ＲＳＶ−Ａ抗体の平均力価は上記分子に より得られる価よりも低かった。その上、この分子により免疫化された動物は僅 かに低い防御率を示した。ＢＢＧ２ＡδＣを用いて免疫化した、いくつかの動物 の血清は極めて低い抗−ＲＳＶ−Ａ特異抗体力価を示した（データは示さず）に も係わらず、これらの動物のいくらかはＲＳＶ−Ａの抗原投与に対して完全に防 御された。 上記防御研究は、抗−ＲＳＶ−Ａサブユニット候補的ワクチンの防御効能を示 している。ＢＢＧ２ＡおよびＢＢＧ２ＡδＣの２つの分子は、相同ウイルスでの 抗原投与間、ＲＳＶ−Ａ感染の場合の２種げっ歯類モデルにおいて極めて有効で あることが判った。実施例４：Ｇ２ＡδＣとの比較における、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＢＢＧ２ ＡδＣの免疫原性および防御効能 材料および方法： ＲＳＶ−Ａに関して血清ネガテイブであった４ＢＡＬＢ／ｃマウスの複数群を 、ＢＧＢ２ＡδＣおよびＧ２ＡδＣの５．１、０．５１および０．０５１ｎＭを 使用した２週間おきの２回腹膜腔内注射（ｉ．ｐ．）により免疫化した。後者分 子は臭化シアンを用いてＢＢＧ２ＡδＣを化学的に開裂して誘導できる。３マウ スからなる１群は２週間を隔てた２回のＰＢＳ緩衝液で免疫化して、ネガテイブ 対 照として使用した。すべての免疫化において、アルヒドロゲル［Ａｌ（ＯＨ）₃ ］（２０％ｖ／ｖ）（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ ＢｉｏＳｅｃｔｏｒ、Ｄｅｎｍａｒｋ ）をアジュバントとして用いた。Ｇ２ＡδＣに対するＥＬＩＳＡ力価決定の目的 で最終疫化後２週間で血液穿刺を行った。このマウスは最終免疫化後３週間でＲ ＳＶ−Ａ（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀）の抗原投与を受けた。彼らは５日後に死亡し、抗 原投与後の抗−ＲＳＶ−Ａ抗体を滴定す目的で心臓穿刺に処し、かつ肺のＲＳＶ −Ａを滴定するために肺を摘出した。結果 ： 表４参照。 この抗−Ｇ２ＡδＣのＥＬＩＳＡ検定の結果は、いかなる用量（０．０５１− ５．１ｎＭ）でもＢＢＧ２ＡδＣはＧ２ＡδＣよりも常に一層高い免疫原性があ ることを示す。特に０．０５１ｎＭでは、ＢＢＧ２ＡδＣは抗−Ｇ２δＣ平均力 価ｌｏｇ₁₀ ３．２７を誘発するが、Ｇ２ＡδＣの同一濃度では検出可能な抗− Ｇ２ＡδＣ抗体を誘発しない。抗−ＲＳＶ−ＡのＥＬＩＳＡに関する限りは同じ ことが適用され；ＢＢＧ２ＡδＣの５．１または０．５１ｎＭを用いて免疫化し た４中４マウスは血清ポジテイブであり、その平均力価はそれぞれｌｏｇ₁₀ ２ ．６７および２．７８であった。しかしＧ２ＡδＣの５．１ｎＭで免疫化した４ 中２マウスは血清ポジテイブであり、１つは検出限界にあり、１つの平均力価は ｌｏｇ₁₀≦２．１９であった。Ｇ２Ａ６ＡＣの０．５１ｎＭまたは０．０５１ｎ Ｍを用いて免疫化したマウスは、抗−ＲＳＶ−Ａ抗体の証拠を示さなかった。 ＢＢＧ２ＡδＣの５．１または０．５１ｎＭで免疫化したすべてのマウスの肺 は、相同ウイルスでの抗原投与に対して防御された。その方法の検出限界でのみ ウイルスを示したＢＢＧ２ＡδＣの０．５１ｎＭで免疫化した１マウスを除いて は、上記動物のいずれにも肺ウイルスの存在は認められなかった。ＢＢＧ２Ａδ Ｃの０．０５１ｎＭによる免疫化に続いて、４中３マウスが防御され、この中の ２マウスは肺ウイルス存在の証拠はなかった。第４番目のマウスでは、ＰＢＳ− Ａを用いた対照免疫化の場合の平均力価に較べてｌｏｇ₁₀ １．１６のオーダー だけ肺ウイルスが減少した。 Ｇ２ＡδＣの５．１ｎＭで免疫化した４中３のマウスの肺はＲＳＶ−Ａの抗原 投与に対して防御された。第４番目のマウスの肺ウイルスは、ＰＢＳ−Ａ緩衝液 で免疫化した対照の平均力価に較べてｌｏｇ₁₀ １．７５のオーダーだけ減少し た。肺ウイルスが検出されなかつたのは防御マウス中の１例のみであった。ＰＢ Ｓ−Ａ緩衝剤で免疫化した対照との比較において、肺ウイルスの有意な減少を示 さなかった１例の非防御マウスを除いては、Ｇ２ＡδＣの０．５１ｎＭでの免疫 化後には同じ結果が観察される。Ｇ２ＡδＣの０．０５１ｎＭで免疫化したマウ スの低呼吸道は相同ウイルスの抗原投与に対して防御されなかった。結論 上記研究条件にしたがえば、ＲＳＶ−Ａの抗原投与に対する肺を防御する免疫 応答の誘発において、ＢＢＧ２ＡδＣはＧ２ＡδＣの効果の１０ないし１００倍 のオーダーであることを示す。 実施例５：ＲＳＶ−Ａの抗原投与に対する、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチ ン候補の防御効能 材料および方法 ： ３マウスからなる複数群を２週間を置いて次の生産物２０μｇを用いて２回免 疫化した： ＢＢＧ７Ａ、ＢＢＧ２００Ａ、ＢＢＧ１９８Ａ、ＢＢＧ１９６Ａ、ＢＢＧ１９ ４ＡおよＢＢＧ１９２Ａ。 対照として、６および４マウスからなる２群を２週間を置いて２回、それぞＰ ＢＳ−ＡおよびＲＳＶ−Ａ（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀）を用いて免疫化した。各免疫化 ではアッジュバントとしてアルヒドロゲル［Ａｌ（ＯＨ）₃］（２０％ｖ／ｖ） を用いた。ＲＳＶ−Ａに関する血清ネガテイブ性を確認する目的で最初の免疫化 に先立ってすべての上記動物を目からサンプリングした。いずれも血清ネガテイ ブであるか、またはＥＬＩＳＡ検定の検出限界における力価を有していた。第２ 免疫化後２週間で、抗原およびＲＳＶ−Ａに関してのそれらの血清変換を確認す るために、それらを目からサンプリングした。最終免疫化後３週間で、ＲＳＶ− Ａの１０⁵ＴＣＩＤ₅₀を用いてマウスを鼻腔経由で抗原投与した。抗原投与後５ 日目にマウスを死亡させた：それらを心臓穿刺し；低呼吸道におけるウイルスを 滴定する目的で肺を摘出した。抗原投与後の血清を、ウイルス抗原に対するＥＬ ＩＳＡ検定により試験した。 結果： 表５参照。 ＢＢＧ２００Ａ、ＢＢＧ１９８Ａ、ＢＢＧ１９６Ａ、ＢＢＧ１９４Ａ、ＢＢＧ １９２ＡおよＢＢＧ１９７Ａで免疫化したマウスは、肺中にウイルスの証拠なし にＲＳＶ−Ａの抗原投与に対して防御された。すべての生産物が、免疫抗原（ｌ ｏｇ₁₀ ５．７７−６．４１）およびＲＳＶ−Ａ（ｌｏｇ₁₀ ３．３８− ４．６６）に対して高い平均抗体力価を誘発した。 これらの結果は、ＲＳＶ−Ａで免疫化したマウスから得られる結果と一致する 。 結論： 上記分子は極めて免疫原性であり、ＲＳＶ−Ａの抗原投与に対してＢＡＬＢ／ ｃマウスの肺を防御し得る免疫応答を誘発する。したがってそれらはＲＳＶ−Ａ に対する、可能性のあるワクチン候補を構成する。実施例６：ＲＳＶ−Ａの抗原投与に対する、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＢＢ− Ｇ４Ａの防御効能 材料および方法 ： ３マウスからなる２群を２週間を置いて２回、ＢＢ−Ｇ４ＡまたはＴＴ−Ｇ４ Ａの２０μｇを用いて免疫化した。これらの分子は坦体タンパク質（ＢＢまたは ＴＴのいずれか）上にペプチドＧ４Ａ（残基１７２−１８７）を化学的に結合し て得られる。対照として、６および４マウスからなる２群を２週間の間隔を置い て２回、それぞれＰＢＳ−ＡおよびＲＳＶ−Ａ（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀）を用いて免 疫化した。各免疫化に際してアジュベントとしてアルヒドロゲル［Ａｌ（ＯＨ）₃ ］（２０％ｖ．ｖ）を用いた。ＲＶＳ−Ａに関しての血清陰性を確認する目的 で、最初の免疫化に先立って、上記すべての動物を目からサンプリングした。い ずれも血清ネガテイブであり、またはＥＬＩＳＡ検定の検出限界における力価を 示した。第２免疫化後２週間で、抗原およびＲＳＶ−Ａに関してのそれらの血清 転換を確認するために、それらを目からサンプリングした。最後の免疫化の３週 間後、ＲＳＶ−Ａの１０⁵ＴＣＩＤ₅₀を用いて鼻腔経由でこれらのマウスに抗原 投与した。抗原投与後５日目にマウスを死亡させ；それらを心臓穿刺し；低呼吸 道におけるウイルスを滴定するために肺を摘出した。抗原投与後の血清を、ウイ ルス抗原に対するＥＬＩＳＡ検定により試験した。結果： ペプチドＧ４ＡのＢＢへの結合により得られるタンパク質ＢＢ−Ｇ４Ａは肺ウ イルスの証拠なしに、上記マウスを防御した。ペプチドＧ４ＡのＴＴへの結合に より得られるタンパク質ＴＴ−Ｇ４Ａは、肺の防御に関してはＢＢ−４ＧＡより も効果が低く；この場合、３中２マウスが防御され、そのうち１例は肺ウイルス の証拠はなかった。非防御マウスにおけるウイルス数の減少はＰＢＳ−Ａで免疫 化した対照との比較でｌｏｇ₁₀ １．５２のオーダーであった。ＢＢ−Ｇ４Ａお よびＴＴ−Ｇ４Ａの場合の坦体対ペプチド比はそれぞれ〜１：７および〜１：２ １である。したがってこれらの結果はＢＢがＴＴよりも、Ｇ４Ａの場合の一層優 れた坦体であることを示す。 上記２生産物は、免疫抗原に対する高い抗体力価を導いた（抗−ＢＢ−Ｇ４Ａ および抗−ＴＴ−Ｇ４Ａ血清免疫後の場合、それぞれｌｏｇ₁₀ ５．７７および ６．７３）。対照的に、これらの候補的ワクチンで免疫化した動物は、極めて低 い抗−ＲＳＶ−Ａ力価（抗−ＢＢ−Ｇ４Ａおよび抗−ＴＴ−Ｇ４Ａ血清免疫後の 場合、それぞれｌｏｇ₁₀ ２．１１±０．２８および２．４３±０．４８）を有 した。結論 ： ＢＢ−Ｇ４Ａは、ＲＳＶ−Ａの抗原投与に対して肺ウイルスの証拠なしにマウ スを防御できる。したがって抗−ＲＳＶ−Ａワクチンとしての将来性が確認され る。この結果は同時に、ＢＢがＴＴの場合よりもＧ４Ａに対する一層良好な坦体 であることを示している。 実施例７：ＲＳＶ−Ｂ（菌株８／６０）の異種抗原投与に関する、腹膜腔経由の 、ＢＢＧ２Ａで免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスの肺の交差防御 材料おび方法 ： ２週間を置いた腹膜腔へのＢＢＧ２Ａの２０μｇの、２回また は３回注射により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。対照として、同様な操作 でマウスの他の１群をＰＢＳ−Ａにより免疫化した。各免疫化においてアルヒド ロゲル［（ＡＬ（ＯＨ）₃］をアジュバントとしてを用いた。ＲＳＶ−Ａに関す るそれらの血清ネガテビテイを確認するために最初の免疫化に先立って血液サン プリングを行った。最後の免疫化後３週間で、ＲＳＶ−Ａの１０⁵ＴＣＩＤ₅₀ま たはＲＳＶ−Ｂの１０⁵ＴＣＩＤ₅₀を用いて鼻腔経由でマウスに抗原投与した。 抗原投与後５日でこれらのマウスを死亡させた：それらを心臓穿刺し；低呼吸道 におけるウイルス滴定のために肺を摘出した。抗原投与後の血清を、ウイルス抗 原に対するＥＬＩＳＡ検定により試験した。 結果： 研究開始時には、すべての上記マウスはＲＳＶ−Ａの場合に血清ネガテイブで あった。２０μｇのＢＢＧ２Ａで免疫化した第１群の１１中の１１マウスはＲＳ Ｖ−Ａの抗原投与に対して防御された。第２群である１１中の１１マウスも、Ｒ ＳＶ−Ｂ（表７）の異種抗原投与に関して防備された。 結論： ＢＢＧ２Ａ抗原を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、ＲＳＶ−Ａに対して のみでなく、同時にＲＳＶ−Ｂの抗原投与に関しても防御が行われる。したがっ て抗原ＢＢＧ２Ａは、異種抗原投与に関しても交差防御を誘発する。 実施例８：ＢＢＧ２Ａによる免疫化に及ぼすプライミング効果ＢＢの研究 ＢＡＬＢ／ｃマウスをＢＢタンパク質に感作させ、次いでＢＢＧ２Ａの注射を 与える。これらの動物中に得られる抗−Ｇ２Ａ力価は、ＢＢＧ２Ａの２回の注射 を与えたマウス中に得られたものに匹敵する。 材料および方法 皮下注射により、次のようにＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｎ＝５／バッチ）を免疫化 する： 上記動物の血液をＤ7およびＤ21上に採取し、抗−Ｇ２Ａ ＩｇＭおよびＩｇ Ｇの血清力価をＥＬＩＳＡ検定により個々に決定した。 結果 要約すると、Ｄ7およびＤ21における抗−Ｇ２Ａ ＩｇＧ力価の表は次のよう である： バッチ２：ＢＢＧ２Ａの２回注射 ＢＢＧ２Ａの２０μｇの最初の注射後１週間では抗Ｇ２Ａ ＩｇＧは検出され ない。一方、ＢＢＧ２Ａの第２回目の注射後１週間では、約４ｌｏｇ10の抗−Ｇ ２Ａ ＩｇＧの強力な生産が認められる。バッチ３：注射Ｎｏ．１＝ＢＢ、注射Ｎｏ．２＝ＢＢＧ２Ａ ＢＢの１００μｇで上記マウスを感作後は、ＢＢＧ２Ａの２０μｇの１回注射 で抗−Ｇ２Ａ ＩｇＧ力価、４ｌｏｇ₁₀を誘発するのに十分である。これはＢＢ Ｇ２Ａの２０μｇの２回注射により得られる場合と類似の力価である。 結論： これらの結果は、ＢＢＧ２Ａによる一次免疫化の時点でＢＢが、Ｇ２Ａ−特異 性Ｂ細胞に必要な支援を提供するＴｈ記憶細胞の生産を誘発し、ＩｇＧタイプの 二次応答を生起することを示している。したがって、生来のＢ細胞が刺激されて 抗−Ｇ２Ａ抗体を生産することを証明している。 このようにしてＢＢは、Ｇ２Ａに対する抗体を生産するのに適当なＴ−細胞援 助を供給し；この観点では、このものはキャリアータンパク質として挙動する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/155 Ａ６１Ｋ 39/155 39/29 39/29 39/39 39/39 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ０７Ｋ 14/315 (72)発明者 ニグレン，ペール アイク スウェーデン国スカルプナック、ピロトガ タン、22 (72)発明者 スタール，ステファン スウェーデン国ストックホルム、トルファ グスベーゲン、８ (72)発明者 ウーレン，マティアス スウェーデン国ストックホルム、スブルン スガタン、７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 免疫原、抗原またはハプテンの免疫原性を改良する方法であって、宿主 に投与した場合、投与モードの如何に係わらず、上記免疫原またはハプテンが支 持体分子に共有結合して複合体を形成し、かつこの支持体分子が、哺乳動物の血 清アルブミンに特異的に結合し得るポリペプチドフラグメントであることを特徴 とする方法。 ２． ポリペプチドフラグメントが、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＧタンパ ク質から誘導されることを特徴とする、請求項１記載の方法。 ３． 支持分子体が、配列番号７４のアミノ酸配列、または上記配列番号７４ と少なくとも８０％相同の配列を示すことを特徴とする、請求項１および２の１ つに記載の方法。 ４． 共有結合が、組換えＤＮＡ技術により行われることを特徴とする、請求 項１ないし３の１つに記載の方法。 ５． 抗原またはハプテンをコードするＤＮＡを、支持体をコードするＤＮＡ 分子中に挿入または融合して複合体を生成させることを特徴とする、請求項４記 載の方法。 ６． 上記共有結合を化学的に行うことを特徴とする、請求項１ないし３の１ つに記載の方法。 ７． 遺伝子融合体を宿主細胞中に導入する工程を包含し、この遺伝子融合体 は抗原またはハプテンをコードするＤＮＡを、支持体分子をコードするＤＮＡ分 子中に挿入または融合して生成させたものであり、かつプロモーターと融合させ たハイブリッドＤＮＡ分子を含むことを特徴とする、請求項１ないし５の１つに 記載の方法。 ８． 遺伝子融合体が、プラスミド、バクテリオフアージ、ウイルスおよび／ またはコスミドから誘導されるＤＮＡベクターの媒介で導入されることを特徴と する、請求項７記載の方法。 ９． 遺伝子融合体が、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることを特徴とする 、請求項７および８の１つに記載の方法。 １０． 宿主細胞が原核細胞であることを特徴とする、請求項７ないし９の１ つに記載の方法。 １１． 宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉ ｌｌｕｓからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０記載の方法。 １２． 宿主細胞が酵母であることを特徴とする、請求項７ないし１０記載の 方法。 １３． 宿主細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項７ないし９ 記載の方法。 １４． ウイルスベクターが採用されることを特徴とする、請求項８および９ 項記載の方法。 １５． 融合分子を宿主細胞の膜において発現、定着および露出させることを 特徴とする、請求項７ないし１２の１つまたは１４項記載の方法。 １６． 免疫原が、バクテリア、寄生虫およびウイルスから誘導されることを 特徴とする、請求項１ないし１５のいずれか１項記載の方法。 １７． 免疫原が、ハプテン：ペプチドまたは多糖類であることを特徴とする 、請求項１ないし１６のいずれか１項記載の方法。 １８． 免疫原が、ＲＳＶ表面糖タンパク質：Ｆおよび／またはＧから誘導さ れることを特徴とする、請求項１７記載の方法。 １９． 免疫原が、ヒトＲＳＶサブグループＡもしくはＢのＧタンパク質のア ミノ酸１３０および２３０間（両数値を含む）に含まれる配列、またはＧタンパ ク質の上記配列と少なくとも８０％相同を含む配列からなることを特徴とする、 請求項１８記載の方法。 ２０． 免疫原が、ウシＲＳＶサブグループＡもしくはＢのＧタンパク質のア ミノ酸１３０および２３０間（両数値を含む）に含まれる配列、またはＧタンパ ク質の上記配列と少なくとも８０％相同を含む配列からなることを特徴とする、 請求項１８記載の方法。 ２１． 抗原またはハプテンが、配列番号１ないし配列番号７３の１つを示す ことを特徴とする、請求項１８記載の方法。 ２２． 免疫原が、肝ウイルスＡ、ＢおよびＣの表面タンパク質から誘導され ることを特徴とする、請求項１６および１７の１つに記載の方法。 ２３． 免疫原が、はしかウイルスの表面タンパク質であることを特徴とする 、請求項１６および１７の１つに記載の方法。 ２４． 免疫原が、パラインフルエンザウイルス３の表面タンパク質であるこ とを特徴とする、請求項１６および１７の１つに記載の方法。 ２５． 免疫原が、表面糖タンパク質、特にヘマグルチニン、ノイラミニダー ゼＨＮおよび融合タンパク質Ｆであることを特徴とする、請求項１６、１７およ び２４の１つに記載の方法。 ２６． タンパク質が、ＲＳＶサブグループＡおよびＢの糖タンパク質から誘 導され、かつ遺伝子的にＢＢと融合または化学的結合されてなることを特徴とす る、請求項１９ないし２１の１つに記載の方法。 ２７． 請求項１ないし２６の１つに記載の方法により得られる複合体。 ２８． 請求項２７記載の複合体をコードするヌクレオチド配列。 ２９． 特定宿主細胞中で標的されるべき複合体の発現を可能にする要素を含 むことを特徴とする、請求項２８に記載のヌクレオチド配列。 ３０． ＤＮＡ構築物およびＲＮＡ構築物からなる群から選択されることを特 徴とする、請求項２８および２９の１つに記載のヌクレオチド配列。 ３１． 請求項４、５または７ないし２５の１つに記載の方法の実施を可能に する遺伝子融合体であることを特徴とする、請求項２８記載の配列。 ３２． 請求項２８ないし３１の１つに記載のヌクレオチド配列を包含むこと を特徴とするベクター。 ３３． 請求項１ないし２６の１つに記載の方法、または請求項３２記載のＤ ＮＡベクターにより得られる、医薬としての生成物。 ３４． 複合体が請求項１ないし２６の１つに記載の方法により得られる場合 の免疫原と支持体との間の複合体の、または請求項２８ないし３１の１つに記載 のヌクレオチド配列の、ワクチン調製用のための使用。