JPH10508200A - 老化関連遺伝子を同定および制御するための方法ならびに試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 若年細胞と老化細胞の間のｍＲＮＡ発現レベルを比較することにより、老化関連遺伝子の同定が実施されうる。そのような遺伝子に対して相補なプローブは、老化細胞を検出して若年細胞と老化細胞を識別するために使用可能であり、そして老化関連遺伝子の発現レベルを変更しうる化合物を同定するためのスクリーニングに使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 老化関連遺伝子を同定および制御するための方法ならびに試薬 発明の背景 発明の分野 本発明は、分子生物学、老年学、ならびに医学薬理学および診断学に関する。関連技術 体細胞の複製能力が有限であること（Ｈａｙｆｌｉｃｋ、１９６５、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，３７：６１４−６３６、およびＨａｙｆｌｉｃｋ、１９７ ０、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔ．，５：２９１−３０３）およびこの進行が加齢およ び加齢関連疾病の主な原因要素であること（Ｇｏｌｄｓｔｅｒｉｎ、１９９０、 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１１２９−１１３３；Ｓｔａｎｕｌｉｓ−Ｐｒａｅｇ ｅｒ、１９８７、Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．，３８：１−４８；および Ｗａｌｔｏｎ、１９８２、Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．，１９：２１７− ２４４）は、実質的に証明されている。細胞が生体外および生体内において複製 老化を受けると、細胞は成長刺激に応答して分裂する能力を失うだけでなく、遺 伝子発現のパターンに明らかに有害な変化が現れる（Ｗｅｓｔ、１９９４、Ａｒ ｃｈ．Ｄｅｒｍ．，１３０：８７−９５）。 複製の老化を通じて、細胞は、細胞周期のＧ１期が伸長し、細胞時間の周期変 化がより長くなる。有糸分裂の活性から老化への進行が続くと、細胞は分裂信号 に応答できず、代わりにＧ１にとどまるようになる。若年細胞が細胞周期および 細胞分裂に再び入るように誘導されるそのようなときまで静止状態になりＧ０期 に入る事と、老化細胞が細胞周期に入れない事とは、若年細胞と老年細胞の間の 主な相違点である。老化細胞は、形態学的に変化し、大きさおよび体積が増す。 しかしながら、老化細胞は、生存可能であり、代謝が活性である。複製老化のそ の他の特徴は、細胞がその複製生活の終末に到達するために、遺伝子発現パター ンの変化がより劇的に起こることである。このような変化は、「老齢特異的」ま たは「老化特異的」遺伝子の発現の増加と共に、「若年特異的」遺伝子発現の減 少を反映している。本発明の目的では、若年休止細胞と老化細胞の間で差異的に 発現される生成物の任意の遺伝子が、「老化関連」の遺伝子である。このような 変化は、老化細胞の構造および機能に影響を及ぼすだけでなく、そのような変化 は、細胞外環境を変化させることによって、または異なるタンパク質を放出する あるいは細胞−細胞相互作用を変化させることを通してのパラ分泌様式で、周辺 細胞および組織マトリックスの生理に影響を及ぼす。 いくつかの老化特異的遺伝子は、科学文献に記載されている。皮膚の加齢は、 一つの例証となる。皮膚の加齢は、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕ ｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）（ＥＣＭ）タンパク質の構造および機能の変化を特徴と する。これらと同じ変化が、老化にまで成長した繊維芽細胞でまたはより老齢の 個体から誘導された細胞内のいずれかで行われた実験で多く認められた。より老 齢の個体から誘導された細胞は、フィブロネクチンｍＲＮＡのレベルが、胎児細 胞で発現するレベルと比較して、最大で４．４倍の大きさを示した。同様に、フ ィブロネクチンの合成は、老化にまで成長した細胞で増加する。晩期継代細胞で は、合成されるフィブロネクチンは、より若年の細胞で見られるそれとは、構造 的に異なる。このような変化は、フィブロネクチンｍＲＮＡのプロセッシングに よる加齢関連変化を反映している。機能上、これらの変化は、細胞の粘着、細胞 の拡散および接触形成を仲介する能力の減少を説明する。より若年の細胞とより 老齢の細胞を比較すると、フィブロネクチン格子は、余りよく構成されない傾向 にあるより老年の細胞の格子との相違を示す。Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｕら、１９ ９１、「ヒトの繊維芽細胞によって分泌される細胞加齢関連タンパク質」（Ｃｅ ｌｌｕｌａｒ ａｇｅｉｎｇ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｃｒｅ ｔｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ． ，２５６：１２７−３８；Ｋｕｍａｚａｋｉら、１９９３、「生体内でヒト血管 内皮細胞および皮膚の繊維芽細胞の細胞加齢を通してのフィブロネクチンの発現 強化」（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔ ｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２０５： ３９６−４０２；Ｈａｒａら、１９９３、「オリゴ（ｄＴ）₃₀−ラテックスおよ びＰＣＲを用いたＤＮＡ−ＤＮＡ（−）ｃＤＮＡクローニング：老化したヒトの 二倍体繊維芽細胞で過剰発現する細胞遺伝子の同定」（ＤＮＡ−ＤＮＡ ｓｕｂ ｔｒａｃｔｉｖｅ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ ）₃₀−Ｌａｔｅｘ ａｎｄ ＰＣＲ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ ｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅ ｄ ｉｎ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｄｉｐｌｏｉｄ ｆｕｂｒｏｂｌ ａｓｔｓ）、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：５８−６４；およびＭ ａｒｔｉｎら、１９９０、「生体外でのブタ皮膚繊維芽細胞の加齢を通してのフ ィブロネクチンおよびコラーゲン遺伝子の発現」（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ａ ｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉ ｎ ｖｉｔｒｏ ａｇｅｉｎｇ ｏｆ ｐｉｇ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓ ｔｓ）、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１９１：８−１３を参照のこと。 皮膚の加齢のその他の特徴は、繊維芽細胞のコラゲナーゼとしても知られてい る、間質コラゲナーゼの発現が、老化細胞ならびにより老齢の提供者より得られ た細胞で増加すると報告されていることである。コラゲナーゼｍＲＮＡが増加す るのみならず、酵素活性もまた増加する。このような結果は、転写レベルにある と考えられ、それ自身が老化する間にアップレギュレーションされると考えられ るインターロイキン−１（ＩＬ−１）によって部分的に仲介されるであろう。Ｓ ｏｔｔｉｌｅら、１９８９、「早期−および晩期−継代ヒト二倍体繊維芽細胞で のコラゲナーゼおよびコラゲンナーゼｍＲＮＡ生成の調節」（Ｒｅｇｕｌａｔｉ ｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｍＲ ＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅａｒｌｙ− ａｎｄ ｌａｔｅ−ｐａｓ ｓａｇｅ ｈｕｍａｎ ｄｉｐｌｏｉｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｊ．Ｃｅ ｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３８：２８１−２９０；Ｗｅｓｔら、１９８９、「 ヒト皮膚の繊維芽細胞の複製老化は、コラゲナーゼ活性の調節不全および過剰発 現と相互に関連する」（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｓｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｖｅｒｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｃｉｖｉｔｙ）、Ｅｘｐ ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１８４：１３８−１４７；Ｂｕｒｋｅら、１９９４、「 より老齢の提供者からの培養皮膚繊維芽細胞におけるヒト間質コラゲナーゼの転 写調節の変化」（Ａｌｔｅｒｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕ ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅ ｎａｓｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒ ｏｍ ｏｌｄｅｒ ｄｏｎｏｒｓ）、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２９： ３７−５３；およびＬａｆｙａｔｉｓら、１９９０、「コラーゲン遺伝子発現は 、その５’活性化剤タンパク質−１結合部位を通して、インターロイキン−１に よって刺激され、全トランス−レチノイン酸によって阻害される」（Ｉｎｔｅｒ ｌｅｕｋｉｎ−１ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ａｎｄ ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅ ｔｉｏｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｇｅ ｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔｓ ５’ ａｃｔｉｖａｔ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ． ４：９７３−９８０；を参照のこと。 さらに、ＰＡＩ−１の発現は、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で皮膚 加齢機能として調節されていると考えられるが、その機構は未だ明らかではない 。Ｓｈａｙら、１９９２、「無誘導の可逆的不滅細胞における老化マーカーの再 発現」（Ｒｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｍａｒｋｅ ｒｓ ｉｎ ｄｅｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉ ｚｅｄ ｃｅｌｌｓ）、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２７：４７７−４９ ２を参照のこと。ストメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）のｍＲＮＡおよびタ ンパク質は、老化細胞で過剰発現し［Ｍｉｌｌｉｓら、１９９２、「複製老化を 通してのメタロプロテイナーゼおよびＴＩＭＰ−１遺伝子の発現」（Ｍｅｔａｌ ｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ＴＩＭＰ−１ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）、 Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２７：４２５−４２８：およびＭｉｌｌｉｓ ら、１９９２、「加齢したヒト繊維芽細胞でのメタロプロテイナーゼの差異的発 現お よびメタロプロテイナーゼ遺伝子の組織インヒビター」（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ａ ｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉ ｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ａｇｅｄ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ） 、Ｅｘｐ．ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２０１：３７３−３７９を参照のこと］、これ はｔＰＡと同様である［Ｗｅｓｔ，１９９４、「皮膚加齢の細胞および分子生物 学」（Ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇ ｙ ｏｆ ｓｋｉｎ ａｇｉｎｇ）、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３０： ８７−９５を参照のこと］。ＴＩＭＰ−２のタンパク質およびｍＲＮＡのレベル は、早期および晩期のヒトの継代繊維芽細胞で研究され、老化を通してアップレ ギュレーションされることが分かっている。ＺｅｎｇおよびＭｉｌｌｉｓ、１９ ９４、「早期および晩期のヒト継代繊維芽細胞における７２ｋＤａのゼラチナー ゼおよびＴＩＭＰ−２の発現」（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ７２−ｋＤａ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ ａｎｄ ＴＩＭＰ−２ ｉｎ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｌ ａｔｅ ｐａｓｓａｇｅ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｅｘｐ．Ｃ ｅｌｌＲｅｓ．，２１３：１４８−１５５を参照のこと。 その他の様々な遺伝子が、老化細胞内で過剰発現することが分かっている。こ のような遺伝子のいくつかは、細胞増殖およびシグナル化に役割を果たしている と考えられ、そのような遺伝子の変化は、組織生理学の変化の重要な一因となる であろう。ストロメリシン、ＰＡＩ−２およびコラゲナーゼを含むいくつかのＥ ＣＭ遺伝子の転写に影響を与えることができるＩＬ−１が老化に従ってアップレ ギュレートされる。Ｋｕｍａｒら、１９９３、「加齢個体からの早期継代繊維芽 細胞におけるインターロイキン−１−αおよびβの発現」（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｉｋｉｎ−１−α ａｎｄ β ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐａｓｓａｇｅ ｆｉｂｒｏｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ａｇｉｎｇ ｉｎｄｉｖｉ ｄｕａｌｓ）、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２８：５０５−５１３；およ びＫｕｍａｒら、１９９２、「加齢したヒト繊維芽細胞によるインターロイキン −１誘発遺伝子の発現およびインターロイキン−１の生成」（Ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｂｙ ａ ｇｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４６８３−７；を参照のこと。ＩＦＮ−γは、老 化を通してダウンレギュレーションされる様々な遺伝子の発現を減少させるよう に働く。Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｕら、１９９１、同上；およびＥｌｅｆｔｈｅｒ ｉｏｕら、１９９３、「細胞の加齢およびインターフェロン−γによって抑制さ れる３つの繊維芽細胞分泌ポリペプチドの群」（Ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｒ ｅｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１８ ０：３０４−３１２を参照のこと。例えば、ＩＦＮ−γは、コラーゲンの発現を 減少させ、コラゲナーゼおよびフィブロネクチンの発現を増加させるように機能 する。 繊維芽細胞は、エラスチン発生の原因であり［Ｂｒａｖｅｒｍａｎ、１９８９ 、「加齢した皮膚での弾力性繊維および毛細血管の異常」（Ｅｌａｓｔｉｃ ｆ ｉｂｅｒ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｓｋｉｎ）、Ｃｌｉｎ．Ｇｅｒｉａｔ．Ｍｅｄ．，５：６ ９−９０を参照のこと］、年齢の増加した個体からの培養皮膚繊維芽細胞によっ て生産されたエラスチンを試験した結果、６０年の間に、エラスチン繊維の合成 および修復が明らかに減少する［Ｆａｚｉｏら、１９８８、「ヒトエラスチンｃ ＤＮＡの単離および特徴、ならびに培養皮膚繊維芽細胞でのエラスチン遺伝子発 現の年齢に関連する変化（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ ｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｌａｓｔｉｎ ｃＤＮＡｓ， ａｎｄ ａ ｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｌａｓｔｉｎ ｇ ｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｋｉｎ ｆｉｒｏ ｂｌａｓｔｓ）、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５８：２７０−７；およびＤａｌｚ ｉｅｌら、１９９１、「皮膚加齢の外観」（Ａｓｐｃｅｔｓ ｏｆ ｃｕｔａｎ ｅｏｕｓ ａｇｅｉｎｇ）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１６：３ １５−２３を参照のこと］。また、培養皮膚繊維芽細胞は、コラーゲン合成にお い て年齢に関連して減少し、老化にまで増殖した場合、または様々な年齢の人々か ら誘導した場合のいずれかで分解が増加する。Ｍａｙｓら、１９９０、「生体内 でのラット組織および生体外での繊維芽細胞におけるコラーゲン代謝の同様の年 齢関連変化」（Ｓｉｍｉｌａｒ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏ ｎｓ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｒａｔ ｔｉｓ ｓｕｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒ ｏ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１８：９５７；Ｆｕｒｔｈ、１ ９９１、「コラーゲン１型ｍＲＮＡの定常状態レベルは、老化した繊維芽細胞で は減少する」（Ｔｈｅ ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｙ ｐｅ １ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍＲＮＡ ａｒｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｓｅ ｎｅｓｃｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，４６： Ｂ１２２−４；およびＴａｋｅｄａら、１９９２、全く同一ではないが、同様の 、生体外および生体内でのヒト皮膚繊維芽細胞の加齢に伴う細胞外マトリックス 成分の発現の調節（Ｓｉｍｉｌａｒ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ，ｍ ｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌ ｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔ ｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆ ｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５３：４５０− ９を参照のこと。特に、コラーゲン１型、プロα１および３鎖、ならびに３型プ ロα１はすべて、ｍＲＮＡ（Ｈａｒａら、１９９３、上記を参照のこと）および タンパク質レベルの両方で老化に伴ってダウンレギュレーションする。Ｄｕｍａ ｓら、１９９４、「加齢した提供者からのヒト皮膚繊維芽細胞によるコラーゲン １および３型の生体外での生合成」（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｉ ａｎｄ III ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｂｙ ｈｕｍ ａｎｄ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｄｏｎｏｒｓ ｏ ｆ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ａｇｅ）、Ｍｅｃｈ．Ａｇｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ７３：１７９−１８７を参照のこと。同様の結果が、ブタからの培養繊維芽細胞 を用いた実験でも認められた（Ｍａｒｔｉｎら、１９９０）上記、を参照のこと ）。これらの研究では、コラーゲン３型が増加し、これに対してコラーゲン１型 は、 合成されるが急速に分解される。このように、コラーゲンの１型と３型の比率が 、変化する。これらの結果は、年齢関連変化が種特異的であるを示している。 ＥＣＭの維持に関わる少なくとも２つのタンパク質は、皮膚加齢でダウンレギ ュレーションされる：メタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害剤は 、増殖中に誘導されるオステオネクチン、構造的ＥＣＭタンパク質と同様に、ダ ウンレギュレーションされる（Ｗｅｓｔら、１９８９；およびＭｉｌｌｉｓら、 １９９２、上記、を参照のこと）。Ｒｅｅｄら、１９９４、「ＴＧＦ−β１は、 若年および加齢した提供者からの繊維芽細胞によって、コラーゲン１型およびＳ ＰＡＲＣの発現を誘導し、コラーゲンゲルの収縮を強化する」（ＴＧＦ−ｂｅｔ ａ １ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ １ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ＳＰＡＲＣ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｏｎ ｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌｓ，ｂｙ ｆｉｂｒｏｂｌ ａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ａｎｄ ａｇｅｄ ｄｏｎｏｒｓ）、Ｊ．Ｃ ｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５８：１６９−７９を参照のこと。早期継代クロー ン１（Ｅａｒｌｙ Ｐａｓｓａｇｅ Ｃｌｏｎｅ １）［ＥＰＣ１、Ｐｉｇｎｏ ｌｏら、１９９３、「老化したＷＩ−３８細胞は、Ｇ₀状態にはいる時点で若年 細胞で誘導される遺伝子、ＥＰＣ−１、を発現できない」（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ＷＩ−３８ ｃｅｌｌｓ ｆａｉｌ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ＥＰＣ−１，ａ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｐｏｎ ｅｎ ｔｒｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｇ₀ ｓｔａｔｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６８：８９４９−８９５７を参照のこと］は、色素上皮誘導因子（Ｐｉｇｍｅ ｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆａｃｔｏｒ）（ＰＥＤＦ）［ Ｓｔｅｅｌｅら、１９９３、「色素上皮誘導因子：セリンプロテアーゼインヒビ ター遺伝子族の一員としての好中球の活性および同定」（Ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐ ｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ：Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍｅ ｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏ ｒ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ，９０：１５２６−３０を参照のこと］と同一であり、老化細胞ではダウンレ ギュレ ーションされる成長因子の一例である。老化に伴ってダウンレギュレーションさ れるその他の遺伝子として、リボソームタンパク質、Ｌ７があげられる［Ｓｅｓ ｈａｄｒｉら、１９９３、「老化したヒト繊維芽細胞でダウンレギュレーション される転写物の同定。ヒトＬ７リボソームタンパク質遺伝子のクローニング、配 列分析および調節」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｃ ｒｉｐｔ ｔｈａｔ ｉｓ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｓｅｎｅｓ ｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅ ｎｃｅ ａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍ ａｎ Ｌ７ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１８４７４−８０を参照のこと］が、ｃ−ｆｏｓの誘発 もまた、老化に伴って抑制される。ＳｅｓｈａｄｒｉおよびＣａｍｐｉｓｉ、１ ９９０、「老化ヒト繊維芽細胞でのｃ−ｆｏｓ転写の抑制および遺伝子プログラ ムの変化」（Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃ−ｆｏｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｏｎ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎ ｓ ｅｎｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７，２０５−２０９、を参照のこと。 このように、個体がより老齢になるに従って、老化細胞は、加齢個体組織中に 存在する細胞の割合が増加する。老化細胞が示す遺伝子発現パターンの変化は、 明らかに年齢関連病理の一因となる。加齢個体の数が近い将来劇的に増加すると 予想されるので、加齢に対する健康管理の代価も同様に劇的に増加するであろう 。老化遺伝子発現の取り消し、部分的取り消しまたは調整は、複製による細胞の 老化が原因因子である疾病、疾病状態、および病状に効果的治療法を提供する。 当然の結果として、加齢および年齢関連疾病の基礎生物学、特に細胞老化およ び年齢関連疾病の進行の一因となる遺伝子発現の基礎的変化に関連する生物学、 に基づいた治療薬および治療養生法に関する必要性が大である。本発明は、細胞 を基本としたアッセイおよびスクリーンに用いられる老化細胞を培養するための 新規の方法；若年増殖細胞、若年静止細胞、および増殖しない老化細胞によって 発現される遺伝子を識別するための新規の方法；老化細胞から若年細胞を分離し 、老化表現型を逆戻りさせることによって年齢関連疾病またはその病状を治療ま た は軽減する化合物を同定するために用いることのできる、細胞老化を基本とした 高効率のスクリーニングを行うためにそれらの細胞を用いる新規の方法；および 年齢に関連するヒトの疾病を治療するための、ならびにそれらの方法に有用な化 合物および試薬を提供するための、新規の方法：を提供することによって、その 必要性を援助する。発明の要約 第一の態様において、本発明は、以下の（ａ）から（ｄ）の段階の方法を含む 、老化関連遺伝子および遺伝子生成物を同定および単離するための方法を提供す る：（ａ）老化細胞および若年静止細胞からｍＲＮＡを単離し；（ｂ）ポリメラ ーゼ鎖反応でそのｍＲＮＡを増幅させ、増幅された遺伝子配列を作りだし：（ｃ ）ゲル電気泳動によってその増幅遺伝子配列を分離し；さらに（ｄ）段階（ｃ） で分離された増幅遺伝子配列を分析して、老化遺伝子からの増幅遺伝子配列で認 められたものとは異なるレベルで存在する若年静止細胞および若年分裂細胞から の増幅遺伝子配列を検出する。この方法で、老化関連遺伝子を容易に同定し単離 することができる。例えば、老化関連遺伝子または遺伝子標識は、物理的にゲル から取り出し、直接、または適当な組換えＤＮＡベクター内にクローニングした 後のいずれかに配列決定することができる。 それ故、第二の態様において、本発明は、老化関連遺伝子の部分を含み、診断 方法の核酸プローブとして、核酸プライマーとして、また組み換えＤＮＡクロー ニングおよび／または発現ベクターの成分として有用である、有用な核酸を単離 された型で提供する。また、本発明は、老化関連遺伝子の遺伝子生成物をも包含 する。 第三の態様では、本発明は、培地中および生体内で老化細胞を検出し、また非 老化細胞から老化細胞を識別するための診断方法を提供する。これらの方法は、 （ａ）相補的核酸が互いにハイブリダイズするような条件下で、老化関連遺伝子 の配列を含む標識された核酸プローブと、細胞または組織内に存在するｍＲＮＡ を接触させ；（ｂ）特異的ハイブリダイゼーションが起こるかどうかを決定し； さらに（ｃ）ハイブリダイゼーションの発生と老化細胞および非老化細胞の存在 を関連づける：段階からなる。 これらの方法は、治療養生法および治療戦略と結びつけると特に有用である。 例えば、プローブ（例えば、老化関連遺伝子またはＲＮＡ転写物に相補的な核酸 または修飾核酸、または老化関連遺伝子生成物に対する抗体）を用いると、組織 サンプル内の老化（または若年）細胞を同定することができる。検出用プローブ （例えば、蛍光分子または他の分子の結合パートナーとして供される分子）を適 切に標識化することによって、組織内の老化（または若年）細胞を標識し、次い で、老化細胞から若年細胞を分離することができる。さらに、検出可能試薬（例 えば、磁気共鳴画像のための対照分子）を、抗体、または老化関連遺伝子生成物 に特異的なその他の物質に結合させることができ、老化細胞を特異的に標識する ことができる。このような、若年表現型または老化表現型のいずれかに富む細胞 の調製と共に、これに次いで、宿主に若年細胞を再導入するまたは宿主に再導入 するための老化細胞の処理を含む、多くの有用な方法を実行することができる。 関連する態様では、老化関連遺伝子の同定は、新しい治療機会を提供すること ができる。老化特異的（または老化関連）遺伝子生成物に特異的な毒性物質（ま たは「毒素」）を提供することができる。そのような毒素は、これらの老化特異 的または老化関連遺伝子生成物を発現している細胞を殺すことができる。毒素は 、老化関連遺伝子生成物によって活性化される（細胞に毒性になる）毒性物質の 形で提供することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼは、老化に特異的な 遺伝子生成物であることが知られており、その結果、β−ガラクトシダーゼによ る活性化を必要とする毒性基質（または「プレ毒素」）を調製して、活性化し毒 性にすることができる。そのような毒性基質は、生体内または生体外で老化細胞 を除去するために用いることができた。さらなる態様では、老化関連遺伝子生成 物に対する抗体を、毒素または毒性基質と連結させ、当業者に既知の方法に従っ て細胞に配達して、老化関連遺伝子生成物を発現している細胞を破壊することが できる。この態様では、当業者に既知の任意の活性化型（例えば、光、放射線、 等）を用いることができるので、抗体に連結した毒性基質を老化関連遺伝子によ って活性化することは、必要ではない。その他の態様では、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドを老化関連遺伝子の標的にすることができる。そのようなアンチセ ンス オリゴヌクレオチドは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、修飾された核酸、または それらの混合物を含むことができる。当業者らは、本発明の老化関連遺伝子およ び遺伝子生成物が、若年細胞あるいは老化細胞に対する標的または直接的治療薬 または診断薬に用いることのできる広範囲にそろったそのような試薬を提供する ことを、認識するであろう。 第四の態様において、本発明は、老化細胞で遺伝子発現を変化させることので きる化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ） 老化細胞を化合物と接触させ；（ｂ）その老化細胞内でのｍＲＮＡの発現パター ンを測定し；さらに（ｃ）老化細胞内で遺伝子発現を変化させることのできる化 合物と、老化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現の変化を相関させる：ことからなる、上 記の方法を提供する。また、本発明は、この方法によって同定された化合物およ び老化細胞での遺伝子発現を変化させるそのような化合物の使用を包含する。 本発明のこれらのおよびその他の態様を、以下により詳細に記載する。図面の簡単な説明 図面について、最初に簡単に説明する。 図１は、３例の差異強化表示オートラジオグラフを示す。プライマーの組み合 わせをゲルの上方に示す。ゲルのレーンは以下の通りである：（１）ＢＪ老齢細 胞、継代倍加レベル（Ｐａｓｓａｇｅ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）（ＰＤ Ｌ）９０．３、０．５％血清中で増殖；（２）ＢＪ若年細胞、ＰＤＬ４０、０． ５％血清中で増殖；（３）ＩＭＲ９０老齢、ＰＤＬ５４、０．５％血清中で増殖 ；（４）ＩＭＲ９０若年、ＰＤＬ２１．４、０．５％血清中で増殖；（５）ＩＭ Ｒ９０老齢、ＰＤＬ５３、１０％血清中で増殖；（６）ＩＭＲ９０若年、ＰＤＬ ２７．４、１０％血清中で増殖。 図２は、ＥＤＤで用いた５’プライマーの３’側８塩基の誤対合の頻度の分析 を示す：（ａ）３４の遺伝子で検出された誤対合の頻度；および（ｂ）一つの誤 対合を持つ配列での誤対合の位置の分布。 図３は、若年（Ｙ）および老化（Ｏ）繊維芽細胞のＥＤＤ分析において差別的 に表示されたバンドを示す。；負荷順序は、図１に示したゲルのそれと同一であ る。左の矢印は、差別的に表示されたバンドを示し、数字は高発現のレーン番号 を示す。既知遺伝子のフラグメントを含むバンドに対応する核酸配列を右に示す 。バンドの検出に用いられたプライマーのセットは、Ｃｏｌ１３ａｌ用に０２お よびＣ、ラミニンＡ用に１６およびＣ、ＡＬＤＨ−１用に１８およびＣ、ならび にＩＦＭγ用に０１およびＤであった。 図４は、若年および老化細胞からのＲＮＡのノーザンブロットを示す。４Ａは 、（４Ｂ）４Ｃおよび４Ｄの）ＲＮＡサンプルの負荷順序を示している；総量２ ０μｇのＲＮＡをそれぞれのレーンに負荷し、負荷は、同一ゲルの臭化エチジウ ム染色によって確認した。４Ｂの標的遺伝子に示したプローブは、若年および老 化細胞間で差別的に発現されることを以前（１９９５年９月以前）報告した。４ Ｃは、示差強化表示によって、差別的に発現することが同定された既知遺伝子の プローブを示し；また４Ｄは、示差強化表示によって、差別的に発現することが 同定された新規遺伝子のプローブを示す。望ましい実施態様の記述 第一の態様では、本発明は、以下の（ａ）から（ｄ）の段階の方法を含む、老 化関連遺伝子および遺伝子生成物を同定および単離するための方法を提供する： （ａ）老化細胞および若年静止細胞からｍＲＮＡを単離し；（ｂ）ポリメラーゼ 鎖反応でそのｍＲＮＡを増幅させて増幅遺伝子配列を作りだし；（ｃ）ゲル電気 泳動によってその増幅遺伝子配列を分離し；さらに（ｄ）段階（ｃ）で分離され た増幅遺伝子配列を分析して、老化遺伝子からの増幅遺伝子配列で認められたも のとは異なるレベルで存在する若年静止細胞および若年分裂細胞からの増幅され た遺伝子配列を検出する。この方法は、老化関連遺伝子を迅速に効果的に同定し 単離することを可能にする方法であるという点で、従来技術の方法とは異なる。 「老化関連遺伝子」とは、同一細胞型の老化細胞と非老化細胞で異なるレベルで 発現する遺伝子をさす。いくつかの場合には、老化関連遺伝子は老化細胞で発現 し、非老化細胞ではより低いレベルで発現するか全く発現しないかのいずれかで あり、そのような場合、遺伝子は「老齢特異的」遺伝子と呼ばれる。他の場合に は、老化関連遺伝子は、非老化細胞内で発現し、老化細胞内ではより低いレベル で発現するかまたは全く発現しないかのいずれかであり、このような場合、遺伝 子は「若年特異的」遺伝子と呼ばれる。 この方法の長所は、部分的には、異なる集団、即ち若年静止細胞と老化細胞、 のｍＲＮＡ集団を比較することによる。傷の治癒または組織の再生の間のような 、増殖活性を必要としない限り、生体内では、ほとんどの細胞が一般的には休止 状態にあるため、若年静止細胞と老化細胞とを比較することは、非常に興味深く 適切である。それ故、若年静止細胞と老化細胞とを比較することは、生体内での 最も正確な状態を反映し、この方法で同定される遺伝子は、組織内で差別的に発 現される見込みが高い。分裂活性を持つ細胞集団（典型的には、細胞を非集密状 態に保つために、高濃度血清および頻繁な継代を用いて、細胞を分裂状態に保つ 、例えば、繊維芽細胞では、約１０％の血清がこの目的には適当である）、これ とは対照的な静止細胞の集団（典型的には、低濃度血清および接触阻害、即ち集 密状態を用いて、細胞を静止状態に保つ、例えば、繊維芽細胞では、約０．５％ の血清がこの目的のためには適当である）について、増殖条件を修飾し選択でき ることを、当業者らは認識している。典型的には、胎児または胎児性細胞が、発 達調節遺伝子を検出しようとする場合に用いられる。 これらの細胞集団のそれぞれによって生成されるｍＲＮＡ集団を比較すると、 老化関連遺伝子を同定することができる。この方法のその他の実施態様では、さ らなら細胞集団を用いると、さらなる情報が提供される。このように、方法は、 典型的には、低血清（０．５％）中で培養した若年細胞のｍＲＮＡ集団を、低血 清中で培養した老齢細胞のそれと比較することからなるが、高血清中で培養した 若年細胞と高血清中で培養した老齢細胞を比較することを含むことによって、方 法を強化することができる。高血清中で頻繁に継代培養した若年細胞は分裂し、 分裂活性でなくてはならず、細胞周期を調節するタンパク質をコードする遺伝子 のような、成長特異的遺伝子のｍＲＮＡの検出を可能にする。高血清中で培養し た老齢細胞は、高血清あるいは低血清中で培養した若年細胞または低血清中で培 養した老齢細胞のｍＲＮＡ集団には見られない種のｍＲＮＡを生産することがで きる。その上、老化細胞は分裂しないので、若年分裂細胞のｍＲＮＡ集団と老化 細胞のそれとをさらに比較すると、結果として、老化関連遺伝子生成物としての 細胞周期および細胞分裂に関わる遺伝子生成物を同定することができる。比較と して若年静止（分裂しない）細胞によって発現するｍＲＮＡ集団を用いることに よって、老化関連遺伝子生成物としての細胞周期および細胞分裂遺伝子生成物を 間違いないものにすることができる。 この方法は、「示差増強表示」（”Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ”）または”ＥＤＤ”として既知であり、米国特許出願０ ８／２３５，１８０（１９９４年４月２９日提出，ここに参照として取り入れる ）にさらに完全に記載されている、ｍＲＮＡ調製方法論と結びつけて用いた場合 に、特に好都合である。名前が暗示するように、ＥＤＤは、「示差表示」（”Ｄ ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ”または”ＤＤ”として知られる方法 論を改良したものである。ＤＤ（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、１９９２、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１を参照のこと）は、与えられた細胞集団 のｍＲＮＡを表すＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を用いることを含む。ＰＣＲ に用いる２つのプライマーの内の一つは、ｍＲＮＡのポリＡ尾に相補的であり、 これに対して、もう一つのプライマー(５’プライマー)は、ｍＲＮＡ内の内部配 列と相補的であるはずの無作為に選択した配列を持つ。長さ１０塩基の５’−プ ライマーのアニーリング条件を選択して変性させると、その結果、末端のわずか ６から８塩基によって配列の相同性が決定される。２つのさらなるヌクレオチド によって固定された１２の異なるポリ−Ｔプライマーは、限定されてはいるがラ ンダムに選択した５’−プライマーと組み合わせて、別々に反応させる。 このような条件下では、アッセイは、標準的な配列決定用ゲルで解析する場合 、ＰＣＲ反応当たり典型的には１００−４００塩基対（ｂｐ）の大きさの範囲の ３０から５０から１００のバンドを表示する。このように、それぞれのｍＲＮＡ サンプルに対して十分な数のプライマーの組み合わせを適用すると、発現した遺 伝子（または内部のポリＡ域を含むｍＲＮＡ分子の内部フラグメント）からのｍ ＲＮＡの３’−末端を表すバンドのカタログ（それぞれのバンドを「ジーンタグ 」と呼ぶ）ができる。その後、異なるｍＲＮＡ集団の表示を比較し、差別的に表 示されたバンドを同定することができる。次いで、これらのバンドは、ゲルから 切り出し、配列決定および／またはクローン化することができ、その後、ＤＮＡ フ ラグメントは、以下の実施例に示すように、特定遺伝子のｃＤＮＡクローンを単 離するためのプローブとして用いることができる。 ＤＤは、原型のままで多くの研究室で用いられているが、この方法は、実験ご とに広範に変化しやすい傾向をを持つ（ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、１９９ ３、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：３２６９−３２７５；およびＢａｕ ｅｒら、１９９３、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：４２７４−４２８０ を参照のこと）。このような再現性の欠如は、多分ＰＣＲプロトコールの縮重に よるもので、決定的な多くの間違いを起こす（Ｓｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅ ｒ Ｒｅｓ．，５４，１３９−１１４４を参照のこと）。結果として、ＤＤは、 他のｍＲＮＡ集団で別に作り出したカタログと比較することのできる一つのｍＲ ＮＡ集団のカタログを堅実に作り出すことはできない。本発明の改良法、ＥＤＤ は、一般的に乏しいＤＤ技術の再現性を基に改良した。 ＤＤ技術の信頼性は、部分的にはプライマーの長さおよびプライマーの伸張を 導く温度に依存すると考えられる。ＥＤＤは、より長いプライマー、および数の 限定される低温でのプライマー伸張段階の後プライマーを伸張するためのより高 い温度を用いることに於いて、ＤＤとは本質的に異なる。「より長いプライマー 」とは、長さ１８ヌクレオチドより長い、好適には長さ１８と３０の間のプライ マーを指す。ＤＤでは、プライマーの伸張段階は全て、低温で行われる。ＥＤＤ での最初の少ない（２から６）プライマー伸張段階では、プライマーのアニーリ ングおよび伸張温度は低く、プライマーを容易に結合することができ、ｍＲＮＡ 配列と完全に相補的である必要はない。「低温」または「低厳密性」または「低 適合性」条件とは、プライマーアニーリング／伸張温度が約３７°Ｃから５０° Ｃであることを指す。このような低厳密性条件下では、プライマーの最も３’側 （６から８）のヌクレオチドのみがハイブリダイゼーションの特異性を決定する 。しかしながら、用いられたプライマーは、最初の２、３の低温周期で活性なハ イブリダイズ領域より非常に長く（２０から３０またはそれより多いヌクレオチ ド）、後期のプライマーのアニーリングおよび伸張の周期は、特異性をより高く するに好都合であり、結果として最初の数周期で形成されたプライマー伸張生成 物のみを複製するように、より高い温度で行われ、より再現性のある結果を導く 。「高 温」または「高厳密性」または「高適合性」とは、プライマーのアニーリング／ 伸張の温度が約５５°Ｃから７５°Ｃであることを指す。 ＥＤＤでの実験を数多く行った結果、プライマーアニーリングの詳細な分析を 可能にする十分なデータが得られた。主な疑問点は、特異性を決定するに当たっ て、任意のプライマーの３’末端に要求される塩基の数である。記載されたカタ ログ（以下を参照のこと）およびその他の実験より、既知の配列を持つ３４の遺 伝子が得られた。任意のプライマーのアニーリング部位は、プライマー配列を持 つ遺伝子配列とバンドの大きさを合わせることによって決定された。３’末端の ８塩基に対する相補性を測定した。プライマーの９−２１（３’−５’）塩基の 遺伝子配列とのマッチは、可変性が高く、プライマーの最初のアニーリングによ るものとは考えられなかった。図２は、３４の遺伝子に関しての３’末端８塩基 の誤対合の一覧である。誤対合は、最後の８塩基にも認められ、いくつかの場合 には、１つより多い誤対合が認められた。誤対合は、予想通り、プライマーの５ ’末端に向かうほどより頻繁に起こっている。全体では、図２のデータは、８つ の塩基の内の７つの塩基が対合することが、ＥＤＤにおける５’プライマーの典 型的行動であることを示唆している。 ＥＤＤを用いると、発現した遺伝子からのｍＲＮＡの３’末端から誘導した１ ００から４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを容易にクローン化し配列決定するこ とができる。同一のｍＲＮＡから複数のジーンタグを得ることができるが、典型 的には、全体で１００から３００の異なるプライマーの組み合わせが用いられ、 １，０００から１０、０００（典型的には４０００−８０００）の異なるジーン タグが作り出される。ジーンタグは、ゲル電気泳動またはその他の技術を用いて 容易に分離し、目に見えるようにすることができ、また差別的に発現されるジー ンタグを、容易に単離し、即ちゲルから切り出し、直接またはクローニングした 後に配列決定することができる。典型的には、配列の約５０％を（単離されたゲ ルのバンドから）直接決定することができるが、残ったバンドは、最初にクロー ニングしてから配列を決定しなくてはならない。 この方法で単離された（時には、ゲル内にジーンタグとして出現するバンドを 指す）差別的に発現するジーンタグのそれぞれは、典型的には、最初にノーザン 分析のプローブとして用いられ、ジーンタグの老化関連性を確立するであろう。 ＲＮＡサンプルを若年および老齢および分裂および静止細胞から調製し、次いで 標識されたジーンタグプローブで試験して、ジーンタグが若年細胞と老化細胞の 間で差別的に発現するｍＲＮＡからのものであることを証明する。次いで、本当 に若年細胞または老齢細胞に特異的なジーンタグは、病気および正常の組織また は器官の両方を含む、若年および老齢の提供者の組織または器官区分の使用位置 でのＲＮＡ分析に、プローブとして用い、若年細胞と老齢細胞を識別することが できる。そのような分析は、シュアサイト^TMII システムマニュアル（ｔｈｅ ＳｕｒｅＳｉｔｅ^TMII Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ）（Ｎｏｖａｇｅｎから商 品として入手できる）に記載された試薬および使用位置でのハイブリダイゼーシ ョンプロトコールを用いて、好都合に実行することができる。また、ジーンタグ は、ジーンタグを誘導した細胞型以外の型の細胞からのＲＮＡのノーザン分析に 、プローブとして用いることもできる。発現が加齢に関連して変化する新規遺伝 子をクローン化し、この分野で良く知られた方法論を用いてさらにその特徴を調 べることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第８章および 次章参照、第２版、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ、を参照のこと）。例えば、新規遺伝子のＤＮＡ配列は、標準の分子生物学の 技術を用いて存在する遺伝子を比較することによって分析することができ、さら に分析するとジーンタグを誘導するｍＲＮＡによってコードされる分子の機能を 確立することができる。抗体を新規遺伝子生成物に対して上昇させるとこの分析 が容易になり、老齢細胞から若年細胞を識別するための、またはその他の目的、 例えば上記のような薬剤の配達、のための抗体を基本にした方法を提供すること ができる。また、遺伝子生成物は、以下により詳しく記載するが、老化細胞を基 本とした薬剤スクリーニングに取り入れることもできる。 ＥＤＤ方法論は、そのような遺伝子から生成されるｍＲＮＡの定常状態レベル で差を示す遺伝子の検出を可能にする。定常状態のｍＲＮＡレベルは、転写レベ ルで、また転写後のレベルで調節することができる。また、老齢細胞は、定常状 態のｍＲＮＡレベルの変化によって、また、ｍＲＮＡの翻訳またはタンパク質構 造の変化によるタンパク質のレベルまたはタンパク質の活性の変化によって、若 年細胞と区別することができる。このように、遺伝子発現の調節は、様々な機構 によって起こる。転写レベルでは、ｍＲＮＡの生成は、増加するかまたは減少す るかのどちらかである。翻訳レベルまたは翻訳後の修飾による変化では、タンパ ク質の量を増加または減少に導くことができる。タンパク質活性を調節すること ができ、または、タンパク質の代謝速度を変化させることもできる。これらの機 構のそれぞれを順番に調節することもできる。本発明の方法は、結果として、数 多くの既知遺伝子および以前に報告されたことのない遺伝子ならびに遺伝子生成 物を同定し、その発現または量は、少なくとも部分的には加齢進行によって調節 される。 これらの遺伝子生成物は、繊維芽細胞での細胞の老化を試験するために始めら れた研究で同定された。培養した皮膚の繊維芽細胞は、部分的にはこの細胞の型 の細胞老化に日付を付ける広範な研究による、この研究での分析用に選択した（ 例えば、Ｈａｒｌｅｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ，３４５：４５８−４６０を 参照のこと）。ここでは培養した皮膚の繊維芽細胞を用いたが、本発明の方法で は、任意の細胞の型を用いることができることを、当業者らは認識しているであ ろう。潜在的に有用な細胞の尽きることのないリストとして；（ａ）アルツハイ マー病、パーキンソン病、ハンチントン病および卒中のようなそのような加齢関 連病に関わる、星状細胞、内皮細胞および繊維芽細胞を含む、中枢神経システム の細胞；（ｂ）皮膚萎縮症、エラスチン分解および皮膚のしわ、脂腺増生症、老 年性ほくろ、白髪および抜け毛、慢性皮膚潰瘍、および加齢に関連する創傷治癒 障害のような、外皮の加齢関連病に関わる、繊維芽細胞、脂腺細胞、メラニン細 胞、ケラチン細胞、ランゲルハンス細胞および毛包細胞を含む、外皮細胞；（ｃ ）軟骨細胞のような関節軟骨細胞；その老化は、変形性関節症の関節性軟骨、お よび変形性関節症に関わる、裂孔、滑液、連結組織繊維芽細胞を破壊する、破壊 タンパク質コラゲナーゼおよびストロメリシンの過剰発現を導く；（ｄ）骨粗鬆 症に関わる、骨芽細胞、軟骨細胞の祖先細胞、骨髄ストローマ繊維芽細胞および 骨祖先細胞のような、骨の細胞；（ｅ）加齢に関連する免疫システムの損傷に関 わる、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、ＮＫ 細胞およびそれらのそれぞれの先祖のような、免疫システムの細胞；（ｆ）アテ ローム性動脈硬化症、石灰化、血栓症および動脈瘤を含む血管システムの加齢関 連病に関わる、内皮細胞、平滑筋細胞、外膜繊維芽細胞を含む、血管システムの 細胞；（ｇ）視力喪失、即ち加齢に関連する黄斑の退化に関わる、網膜色素上皮 、水晶体上皮細胞、虹彩筋肉細胞（筋芽細胞）および血管内皮細胞のような、目 の細胞；（ｈ）筋肉ジストロフィーに関わる筋肉付随体細胞；および（ｉ）吸収 不良症候群に関わる、腸管上皮細胞のような腸の細胞：があげられる。 本発明の方法および試薬は、部分的には、加齢進行に固有の器官および組織の 構造的機能的変化が細胞老化を伴う遺伝子発現のパターンの変化に帰すると言う 認識から、生ずる。細胞加齢の研究は、細胞の寿命を調節する機構の真相を見抜 く。生体外での正常な二倍体繊維芽細胞の培養は、細胞老化および不滅化を研究 するためのモデルシステムとして、供される。ＨａｙｆｌｉｃｋおよびＭｏｏｒ ｈｅａｄは、１９６１に、継続継代では、ヒト二倍体繊維芽細胞は、特有な集団 倍加数で複製老化に到達することが、報告された。若年個体組織から誘導した体 細胞および培地中で増殖させた体細胞は、老化に達する迄に、最大で５０−１０ ０回分裂できる。さらに、細胞分裂回数の上限は、提供者の年齢と逆比例の関係 にある。このように、複製老化は、細胞周期から退いて絶頂に達した正常細胞、 および老化表現型の発現が示す、一連の遺伝的プログラムの変化であると考えら れる。 体年齢に伴って、皮膚での老化細胞の割合が増加する。そのような細胞の蓄積 は、年齢関連変化および病理の一因となる直接的・間接的の両面に影響を与える と考えられる。細胞が老化するに従って、遺伝子発現のパターンの変化が、機能 的変化を導く。次いで、このような変化は、細胞外環境を変化させることによっ て、または異なるタンパク質の遊離を通してのパラ分泌様式によって、周辺細胞 の生理機能に影響を与える。例えば、皮膚内に老化細胞が蓄積した結果、皮膚構 造および機能が累進的に減少する。 本方法は、老化細胞の蓄積に関連する問題を改善するために、数多くの応用に 用いることができる。例えば、本方法は、ヒトおよび他の動物の網膜内への加齢 に関連するリボフスチンの蓄積を処理するために用いることができる。リポフス チンの蓄積は、筋肉破壊とも相関する。最近、ＥｌｄｒｅｄおよびＬａｓｋｙ（ １９９３）は、加齢した年齢５２から９８歳の提供者の網膜から少なくとも一つ の成分を、レチンアルデヒドとエタノールアミンの間のシッフ塩基であるＮ−レ チニリデン−Ｎ−レチニルエタノールアミンとして、その特徴を調べた。エタノ ールアミンの起源は、ホスファチジルエタノールアミンに富むかん状体の外側区 分にあり、網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅ ｌｉｕｍ）（ＲＰＥ）によって貪食されると言う考えが、出された。リポフスチ ンの年齢に関連する蓄積に関して、加齢したＲＰＥでレチオンアルデヒドのレチ オン酸への転化が減少すると言う一つの学説がある。アルデヒドデヒドロゲナー ゼ−１（ＡＬＤＨ−１）の遺伝子は、若年静止細胞でアップレギュレートされる ので、老化関連遺伝子である。老化細胞はＭ１活性化表現型を示すので、この遺 伝子を、老化細胞内で誘発させることはできない。ＡＬＤＨ−１の活性の一つは 、レチンアルデヒドをレチオン酸に転化することである。細胞老化に伴って、Ａ ＬＤＨ−１のダウンレギュレーションは、レチオンアルデヒドの蓄積を増加させ 、それ故、エタノールアミンとのシッフ塩基の形成が増加してＮ−レチニリデン −Ｎ−レチニルエタノールアミンを形成する。加齢ＲＰＥ内でのリポフスチンの 形成におけるＡＬＤＨ−１減少の問題は、遺伝子治療によって、即ち、ＲＰＥ細 胞内に本質的にＡＬＤＨ−１を発現する組換え体を移入して、加齢細胞および組 織内に活性を復活させることによって解決することができ、その結果リポフスチ ンのレベルは減少する。また、ＡＬＤＨ−１活性は、ＡＬＤＨ−１活性を増加さ せることによってリポフスチンの蓄積を阻害する治療薬をスクリーニングするた めの標的とすることもできた。さらに、ＡＬＤＨ−１の遺伝子は、遺伝子治療に よって加齢細胞に加えることもできた。 この即席の方法は、さらに、ＡＩＤＳの治療に関連して用いられる。最近の研 究から、免疫システムの機能障害は、ＡＩＤＳ患者や、非常な高齢に認められる ように、老化細胞の蓄積より生ずる。老化細胞はアポプトシスに抵抗性であるこ とが証明されており、また、アポプトシスに抵抗性である加齢したマウス内には リンパ球数が増加していることが報告されている。このことは、加齢した細胞で はＦＡＳの発現が減少することとも相関する。ＦＡＳがトランスジェニックによ り加えられた場合、老齢の動物でさえ、正常の免疫機能が著しく回復する。同様 に、加齢したヒトおよびＡＩＤＳ患者に蓄積する老化細胞は、ＦＡＳレベルおよ び活性のダウンレギュレーションによってアポプトシスに抵抗性であると考えら れる。もしこれらの長期間生存した老化リンパ球が不適切な自己認識を持つか、 あるいは、増殖阻害シグナルを遊離して資源細胞の増殖を阻害するならば、その 後、それらの存在は有毒である。即席の方法は、そのような老化細胞を検出し、 それらの蓄積に関連する問題を処理するために用いることができた。例えば、老 化細胞は、ＦＡＳリガンドまたはＦＡＳレセプターを活性化する能力を持つ同様 の分子を投与することによって排除することができる。このことによって、これ らの細胞でのアポプトシスが刺激され、適切な位置でそれらを取り除き、より若 い細胞を循環プールに補給することを可能にする。そのような薬剤を投与すると 、老化細胞の割合を減少させ、また、自己免疫現象またはその他の免疫システム の機能障害を減少させることができた。レセプターまたはその他の手段によって 代謝を活性化する能力を持つ分子は、アポプトシスを誘発する薬剤に対する細胞 を基本にしたスクリーニングに老化Ｔリンパ球を加えることによって発見するこ とができた。 また、この発明の方法は、若年細胞から老化細胞を識別するための細胞の分類 を含む。本発明の方法を用いると、若年細胞（ほとんど分割を受けない細胞）を 、提供者の組織から単離し、使用する即ち同一の提供者に再導入するように調製 することができる。最大の複製能力を持つ細胞を単離し、次に、これらの細胞の 複製老化を遅らせる培地で増殖させることができる。老化を遅らせる一つの方法 は、「テロメアを長くする方法および試薬」（”Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ”）、Ｐ ＣＴ／ＵＳ９５／１３１３０、ＷＯ９５／１３３８３（ここに参照として取り入 れる）に考察されているように、テロメアを長くすることである。 上記の方法に特に適切な一つの細胞の型として、メラニン細胞、表皮に存在し ケラチン細胞内に含まれるメラノソームを作る樹状突起細胞があげられる。メラ ニン細胞は、ケラチン基底細胞とともに複製され、その他の体細胞の複製能力と 比べてその能力は有限であると考えられる。老化細胞は、匹敵する若年細胞より 多くのメラニンを生成する。複製の老化を通してメラニン細胞が損失することは 、加齢した皮膚に認められる色素沈着減少および乏しい日焼け応答を説明し、太 陽によるほくろ又は肝斑として知られる高い色素沈着斑は、メラニンを過剰発現 する老化細胞の斑を示すであろう。提供者からの老化メラニン細胞は、本方法を 用いて若年細胞から分離し、複製老化を遅らせる又は逆行させる試薬と共に培養 し、提供者に再導入することができる。代わりの方法として、老化細胞中でのみ 活性化される毒素前駆体を投与することもできる。 これらのおよびその池の多くの治療効果は、本発明によって実現させることが できる。本発明は、繊維芽細胞に関する以下の実施例によって具体的に説明され る。加齢した皮膚の構造および機能のこのような減少の原因となる又は一因とな るであろう、繊維芽細胞の老化関連遺伝子を同定するために、本方法を説明する 目的で、０．５％または１０％の血清を含む培地中で培養したＢＪ（包皮）およ びＩＭＲ９０（肺）の細胞を用いた。また、胎児の手の甲の組織から単離した繊 維芽細胞のような、皮膚から誘導した繊維芽細胞を用いることもできる。一連の ２０の異なる５’−プライマーおよび１２の異なる３’−プライマーが、ｍＲＮ Ａを増幅させるために用いられ、その結果、２４０の異なるプライマーのセット が用いられた。増幅に用いられるプライマーは、それらの配列およびα−数指定 と共に、表１に示す。 増幅は、４サイクルの変性（低温および複製忠実）増幅：それぞれのサイクル は、９４°Ｃで４５秒；４１°Ｃで６０秒；および７２°Ｃで６０秒からなる： ならびに１８サイクルの高温および複製忠実増幅：それぞれのサイクルは、９４ °Ｃで４５秒；６０°Ｃで４５秒：７２°Ｃで１２０秒からなる：を含む。増幅 された生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、目に見えるように し、さらに差別的に表示されたバンドにバンド番号をつけ、次いでゲルから削り 取り、配列決定するか、またはクローン化するかのいずれか、またはその両方を 行った。ＥＤＤゲルの例を図１に示し、差別的に表示されたバンドの例を図３に 示す。約１５０の若年および老齢に特異的な老化関連遺伝子のジーンタグが、こ の方法によって同定された。これらのジーンタグを、表２に要約する。 表２のバンド番号は、４つのアラビア数字の番号であり、最初２つのアラビア 数字は、バンドを生成するために用いた５’−プライマーを示し、３番目のアラ ビア数字は、バンドを生成するために用いた３’−プライマーを示す文字であり 、４番目のアラビア数字は、ゲル上の特定のレーンに差別的に表示されたバンド の番号に従って割り当てた。表２に年齢に関する番号は、バンドに該当するｍＲ ＮＡが見いだされる細胞および培地条件を、以下の決まりに従って、表している ：Ｏ１は、ＢＪ老化細胞（０．５％血清）であり；Ｏ２は、ＩＭＲ９０老化細胞 （０．５％血清）であり；Ｏ３は、ＩＭＲ９０老化細胞（１０％血清）であり； Ｙ１は、ＢＪ若年細胞（０．５％血清）であり；Ｙ２は、ＩＭＲ９０若年細胞（ ０．５％血清）であり；Ｙ３は、ＩＭＲ９０若年細胞（１０％血清）である。可 能である限り、ジーンバンクの指定位置を示したが、もしジーンバンク指定位置 が分からない場合で、ジーンタグからの配列情報は得られているがいかなるジー ンバンク位置とも適合しないことを示唆する場合には、「新規」（”Ｎｏｖｅｌ ”）と言う言葉を用い、配列情報さえ得られいないことを示唆する場合には、「 未知」（”Ｕｎｋｎｏｗｎ”）と言う言葉を用いた。 表２に証明されるように、繊維芽細胞のＥＤＤは、結果として、多くの異なる 老化に関連するジーンタグを同定した。ジーンタグの多くは、既知遺伝子からの ものであり、年齢で調節されることが知られている遺伝子と、年齢で調節されて いることが以前に走られていなかった遺伝子の両方が含まれていた。例えば、Ｉ ＦＮ−γは、以前は、年齢で調節されることが分かっていなかった。バンド番号 ００Ｃ２は、赤芽球−増強活性糖タンパク質およびコラゲナーゼ阻害剤としても 知られているＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｌｏ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）（メタロブロテアーゼの組織阻害剤）をコード し、また、老化細胞に高レベルで存在すると報告されているＴＩＭＰ２もコード していると考えられる（ＺｅｎｇおよびＭｉｌｌｉｓ、１９９４、Ｅｘｐ．Ｃｅ ｌｌ Ｒｅｓ．，２１３：１４８を参照のこと）、ジーンバンク位置ＨＵＭＴＩ ＭＰＲと相同な配列を持つｍＲＮＡに該当する。さらに、以前から老齢特異的遺 伝子生成物として報告されているＰＡＩ２およびｔＰＡのｍＲＮＡに特異的なジ ーンタグ、ならびに以前から若年特異的遺伝子生成物として報告されているコラ ーゲン１型および３型のポロコラーゲン鎖のジーンタグもまた、ＥＤＤによって 同定された。 多くの既知遺伝子が、様々な異なるプライマーセットによって検出され、同一 遺伝子が、異なるプライマーセットによって、表２で「新規」または「未知」の 名称に該当する遺伝子として検出されうると予想される。例えば、ジーンバンク 位置ＨＵＭＴＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化剤をコードし、ｔＰＡとしても 知られている）は、次のバンド番号：０１Ｃ１、０１Ｅ３、０１Ｆ１、０２Ｄ１ および０３Ｃ３：によって定義されるプライマーセットを用いて同定され；ジー ンバンク位置ＨＳＣＯＬ３Ａ１（ヒトのプロ−α１コラーゲン３型をコードする ）は、次のバンド番号：０１Ｅ４、０１Ｆ２／３、０２Ｃ２／３／４、０２Ｄ２ 、０２Ｅ４、０２Ｆ３／４、０２Ｈ２、０２Ｊ１、０２Ｋ１、０２Ｋ２、０４Ｃ ２、０４Ｄ２、０４Ｌ１、および１８Ｋ１（および０１Ｃ２もまた、この遺伝子 から誘導されるであろう）で定義されるプライマーを用いて同定され；また、ジ ーンバンク位置ＨＵＭＣＧ１ＰＡ１（ヒトのコラーゲン前駆体１型のブロ−αＩ 鎖）は、次のバンド番号：０２Ｃ１および０２Ｅ２：で定義されるプライマーセ ットを用いて同定された。 繊維芽細胞のＥＤＤを用いてジーンタグが同定されたその他の既知遺伝子には 、ＨＵＭＣ１Ａ２（ヒトのコラーゲン１型のプロ−α２鎖をコードする、バンド 番号００Ｋ１）；ＨＵＭＳＥＣＰ３（単球分泌タンパク質をコードし、バンド番 号０１Ｄ１、また、ヒトのγインターフェロン中の配列をも含む、バンド番号０ １Ｍ４、ヒトのＪＥ遺伝子をコードする）；ＨＵＭＢＧＲ１Ａ（ヒトのグルタメ ートレセプターをコードする、バンド番号０１Ｍ５）；ＭＩＴ１ＨＳ（ミトコン ドリアのＲＮＡをコードする、バンド番号０２Ａ２）；ＨＵＭＴＦＰＡ（ヒトの 組織因子をコードする、バンド番号０６Ｅ１）；ＨＵＭＩＧＦＢＰ５（ヒトのイ ンスリン様成長因子結合タンパク質５をコードする、バンド番号０７Ｊ１；ジー ンバンク位置ＨＵＭＩＧＦＢＰ５Ｘに該当するバンド番号１１Ｈ１）；ＨＵＭＳ ＧＰ３（ヒトの分泌型顆粒コアプロテオグリカンをコードし、また、ＨＳＨＰＣ Ｐ造血プロテオグリカンおよびＨＵＭＳＥＲＧセルグリシン遺伝子として知られ る、 バンド番号０８Ｅ３）；ＨＵＭＰＡＩ２Ｂ（ヒトＰＡＩ−２をコードする、バン ド番号１０Ｄ１）；ＨＵＭＣＩＬＡ（リポタンパク質関連凝固阻害剤をコードす る、また、このジーンタグは、ヒトＨｅｐＧ２ ３’−直示Ｍｂ０１ ｃＤＮＡ 、クローンｓ１４ｅ０１、よりのジーンバンク位置ＨＵＭ０Ｓ１４Ｅ０１の配列 をも含む、バンド番号１１Ｅ１）；ＨＵＭＨＥＲＧＣ（ヒトのヘレグリンβ２遺 伝子、ｐ１８５−ｅｒｂＢ２の特異的活性化剤（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２ ０５，１９９２を参照のこと）をコードする、バンド番号１６Ｆ２）、ＨＵＭＣ Ｄ４４Ｂ（ヒトの細胞粘着分子ＣＤ４４をコードする、バンド番号１６Ｆ３）； ＨＵＭＳＰＡＲＣ（ヒトのオステオネクチンをコードし、また、大静脈性内皮Ｒ ＮＡとしても同定される、バンド番号１７Ｍ１）；ＨＵＭＡＬＤＨＡ１（ヒトの アルデヒドデヒドロゲナーゼ１をコードする、バンド番号１８Ｃ１）；ＨＵＭＫ ＣＳ（カルモジュリン結合タンパク質、タンパク質キナーゼＣ気質としても知ら れる、ヒトの８０Ｋ−Ｌタンパク質をコードする、バンド番号１８Ｍ３）；が含 まれる。 他のジーンタグは、未だ既知の遺伝子または機能と関連付けることのできない ジーンバンク内の既知の配列と相関させることができた。それ故、本発明は、第 一に、これらの遺伝子配列を含む合成オリゴヌクレオチドの有用性を提供する。 例えば、バンド番号０５Ｊ２は、ＥＳＴ０２７９７およびＥＳＴ００６７５と相 同な配列を共有する、発現配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）（ＥＳＴ）０６６３６からのジーンバンク位置Ｔ０８７４４に該当し、 また、ＧＯＳ２遺伝子および／またはアルコールデヒドロゲナーゼおよびヒトの スイリソルｍＲＮＡ（ＨＵＭＳＵＩＩＳＯ）にも該当し；バンド番号０７Ｅ１は 、ＩＢ５６８として既知のヒトｃＤＮＡクローンからのジーンバンク位置Ｔ０３ ５９８ ＩＢ５６８（６６６）に該当し；バンド番号０８Ｄ５および０８Ｆ１は 、チューブリンαと相同なｃＤＮＡクローン、ＥＳＴ００７１８からジーンバン ク位置Ｍ７８５７０に該当し；バンド番号０９Ｅ１は、ＥＳＴ０４２８８からジ ーンバンク位置Ｔ０６３９９、ヒトのｃＤＮＡクローンＨＦＢＤＳ９１、に該当 し；バンド番号１２Ｆ２は、ジーンバンク位置ＨＳＣＤＮ７に該当し、ｃＤＮＡ クローンは、アンドロゲン依存性および非依存性で前立腺カルシノーマ細胞型で 差 別的に発現するので、示差表示を用いて単離した；また、バンド番号１６Ｃ２お よび１６Ｌ２は、ヒトの配列タグＥＳＴ０７１３６、３’−末端クローンＨＩＢ ＥＲ１６、からジーンバンク位置Ｔ０９２４３に該当する。ＥＳＴＴ０９２４３ は、現在では、糖タンパク質４、ＨＵＭＭＦＡＰＡ、位置番号Ｌ３８４８６、に 関連するヒトのミクロフィブリルとして、ジーンバンクで同定されている。表２ に示すジーンタグ０５Ｃ４は、既知遺伝子マンガンスーパーオキシドジスムター ゼ（ＭｎＳＯＤ、Ｋｕｍａｒら、１９９３、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，２８ ：５０５−１３）として同定されている。 この方法を用いて同定されたその他のジーンタグは、既知遺伝子と相同である 。例えば、バンド番号００Ｄ３は、ＣＤ４４遺伝子と配列相同性であり；バンド 番号００Ｍ２は、ヒトのアロマターゼシトクロムＰ−４５０遺伝子とある程度の 相同性であり；バンド番号０３Ｍ３は、Ｇ（１−２）Ａ（１−３）に富む広がり を持ち、ヒトのペプシノゲン遺伝子（ＰＡＩ１遺伝子）およびいくつかのヒト配 列タグ（ＧＡ領域はいくつかの遺伝子内の繰り返しモチーフであると考えられる ）と配列相同性であり；また、バンド番号１６Ｃ１は、ヒトのラミニンＡ遺伝子 と配列相同性である。 表２で「未知」と同定したジーンタグに関しては、これらのジーンタグをクロ ーン化し、次いで、若年および老齢、分裂および静止状態の繊維芽細胞のＲＮＡ サンプルのノーザン分析のプローブとして用いると、ジーンタグが差別的に発現 されていることを証明できる。いったん確認されると、ジーンタグは配列を決定 され、その後、既知遺伝子であるかまたは以前には未知の遺伝子であったかを同 定される。いったん同定すると、老化関連遺伝子、それらの遺伝子に特異的なプ ローブ、それらの遺伝子の遺伝生成物、および、それらの遺伝子生成物に対する 抗体は、老化細胞を検出するためのマーカーとして、若年と老齢細胞を識別する および／または分離するためのマーカーとして、されに、スクリーニングおよび ／または治療目的のためのマーカーとして、用いることができる。スクリーニン グの目的のためには、もしその遺伝子生成物が病気の病理に関わるのもであれば 、またはその発現の変化が病気の病理に関わる遺伝子生成物の変化と類似してい るならば、老化遺伝子の遺伝子生成物は、治療介入のための有用な標的になるで あ ろう。処理能力の高いスクリーニング技術を用いると、化合物によって起きる遺 伝子発現レベルの変化を、定量することができる。活性化合物を用いると、遺伝 子発現と同格の修飾が起こるか否かまたはどのようなレベルで起こるか（即ち、 化合物は、老化関連遺伝子にどのように影響するか、全体的に、群で、または個 別的にか）、もし群で影響されるならば、個々の遺伝子はどの群に属するのか、 を決定することができる。そのようなスクリーニングに用いるために最初に選ば れる遺伝子のセットは、スクリーニング結果の蓄積に従って、一部変更（修正） することができる。 表３に、繊維芽細胞で行われたＥＤＤから集められたデータを要約する。 表２および３に記載した遺伝子および遺伝子生成物の大多数は、老化関連遺伝 子生成物としては、以前には同定されていなかった。遺伝子生成物の多くは、タ ンパク質を分泌し、加齢組織内で認められる細胞外マトリックスの変化と一致す る。このように、本発明は、組織または培地内の老化細胞同定するための新しい 方法および試薬を提供し、その方法は、一般的には、細胞がｍＲＮＡまたは他の ＲＮＡまたはタンパク質を含むことのできる老化関連遺伝子生成物を発現できる か否かを決定すること、および、細胞または組織の老化状態でのその遺伝子生成 物の存在を相関させること、からなる。 典型的には、そのような方法は、使用位置または細胞抽出物内のいずれかで、 細胞のｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを用 いて、実行することができるであろう。そのような方法の一つでは、老化関連遺 伝子に相関するｍＲＮＡに特異的なプローブが、膜またはろ紙上で免疫化される 。次いで、興味ある細胞は、遺伝子発現を誘導する条件下で培養され、フラッシ ュ凍結された。次いで、細胞は、標識したｍＲＮＡ前駆体の存在する中で溶解し 、そうすることによって、細胞を凍結した時に転写されている転写物内に標識が 取り込まれる。次いで、標識されたｍＲＮＡを細胞から集め、ろ紙上で免疫化し たプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションのパターンは、老 化関連遺伝子が細胞によって発現しているか否かを同定するであろう。当業者ら は、既知遺伝子によって生成する遺伝子またはｍＲＮＡの配列を提供する特定の 遺伝 子生成物に特異的なプローブを作成する方法を容易に理解する。 従って、既知の遺伝子の配列はここでは繰り返さないが、新規の老化関連遺伝 子に該当するジーンタグの配列を、表４に提供する。配列は、リボヌクレオチド の代わりにデオキシリボヌクレオチドを用いたが、ＥＤＤによって同定されたＲ ＮＡと同一であり、バンド番号によって同定され、５’−から３’−への方向で 示される（Ｎは、任意の塩基であり、その位置でのヌクレオチドの正体が分から ないことを示す）。 当業者らは、本発明に従って提供されるように、ジーンタグ配列または（上記 のプライマーを用いて生成することのできる）ジーンタグそれ自身が既知である または入手できるならば、本発明のジーンタグに該当する遺伝子の完全なコード 配列ならびに遺伝子の外因性プロモーターおよびその他の調節エレメントは、容 易に単離されうることを、認識するであろう。そのような遺伝子を、直接または 分子生物学の標準技術を用いて適当に修飾した後のいずれかで用いると、遺伝子 によってコードされたｍＲＮＡまたはタンパク質を発現するのみならず、老化関 連遺伝子の有害な発現を防ぐために用いることのできるアンチセンスオリゴヌク レオチドまたはリボザイムを発現させることができる。広範囲の様々な発現プラ スミドを用いると、本発明の有用な核酸を生成することができ、「プラスミド」 と言う言葉は、ここに用いられているように、宿細胞内に具体的な遺伝子情報を 運ぶために用いることのできる（ファージ、ウイルス、クロモソーム等からの） 核酸の任意の型を指す。 ジーンタグが差別的に発現されることを証明するために、既知および新規のプ ローブが調製され、ノーザンブロットで試験した。ノーザンおよびサザンブロッ ト分析は、標準的な方法に従って行われた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔ ｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒＣｌｏｎｉｎｇ；ａ Ｉａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒを参照のこと）。核酸を、装填したナイロン膜 に移し、次いで、ＵＶ ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を 用いて架橋した。新規のジーンタグのためのプローブは、その中にクローン化さ れた新規のジーンタグを合む適当なプラスミドを、ＨｉｎｄIIIでの制限消化し 、次いで低融点アガロースで挿入されたバンドを単離し、さらにその後無作為ヘ キサマー開始法（ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８３、Ａ ｎｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２：６−１３）を用いてＤＮＡを放射能標識する ことによって、調製された。プローブへのハイブリダイゼーションに次いで、ろ 紙ブロットを１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、６５°Ｃで３０分間、２回洗浄 した。次いで、ブロットは、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ ４２５Ｅ（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて露光し分析した。既知遺伝子のため のプローブは、メッセンジャーの５’コード領域に相補的であるように設計した おおよそ４０マーのオリゴのキナーゼ末端標識によって調製した。既知遺伝子よ うには、以下のプローブを用いた： 容易に配列を決定することのできたジーンタグは、ＥＤＤによって作りだれた データのさらなる分析のために用いられた。ノーザン分析のためのオリゴヌクレ オチドプローブは、表３に列挙した既知遺伝子の多くに相補的であるように設計 した。５つのプローブが、若年細胞および老化細胞で差別的に調節されるとして 以前から特徴付けられている遺伝子［ＰＡＩ−１（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９ ９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６１，５７１−９）、エラスチン（ Ｆａｚｉｏ，Ｍ．Ｊ．ら、１９８８、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５８：２７０− ７）、ＥＰＣ−１（Ｐｉｇｎｏｌｏら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６８：８９４９−８９５７）、コラゲナーゼ（Ｗｅｓｔら、１９８９、Ｅｘｐ ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，１８４：１３８−１４７）およびウロキナーゼ型プラスミ ノーゲン活性化剤（Ｓｈａｙら、１９９２、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ， ２７：４７７−４９２）；図４Ｂを参照のこと］用に、調製された。ＲＮＡは、 ０．５％または１０％のＦＢＳ中で増殖させた、若年および老化の両方のＩＭＲ ９０およびＢＪの繊維芽細胞から調製した。これらの８つのＲＮＡサンプルは、 ＥＤＤによって同定されたジーンタグの発現の広範囲の分析を可能にする。若年 細胞または老化細胞で発現が変化すると以前から特徴付けられている遺伝子のノ ーザン分析が、５つの遺伝子の全てについて行われ、報告されている差別的発現 が確認された（図４Ｂを参照のこと）。便宜上の理由から、図４Ａに示すために 、８つのＲＮＡサンプルをノーザン分析用に負荷した。ＥＤＤによって同定され た２１の既知遺伝子（ＥＳＴｓを含まない）の内、ノーザン分析から、図３から の４つの差別的に表示されたバンドを含む１２のジーンタグ（図４Ｃを参照のこ と）の差別的発現を確認したが、７つのジーンタグは、予想された差異を示さな かった（データには示していない）。もう一つのプローブのハイブリダイゼーシ ョンパターンは非特異的であり、また、あと一つの遺伝子（ミトコンドリアＲＮ Ａ）は、この分析では分析しなかった。 新規のジーンタグのクローニングを通して、同一と見なしうるような配列を生 成するバンドが、時として異なる挿入物を持つプラスミドを生じさせることが認 められた。そのような場合には、それぞれのバンドに対する様々なクローンが単 離され、開始配列を含むクローンを用いて、ノーザンブロットを厳密に調べた。 ３７の新規のジーンタグ（表３）の内、３１が、クローニングの後、回収された 。２つのジーンタグはＥＤＤで二重に同定され、２９の単一のジーンタグが残さ れ試験した。新規のジーンタグのためのプローブの特異的ハイブリダイゼーショ ン条件は、最初に、サザンブロット分析で試験した。ジーンタグは、メッセンジ ャーの翻訳されない３’末端、反復型配列に富む領域から最も頻繁に生成されて いる。サザン分析で特異的バンドを検出した２８のプローブの内、５つのプロー ブは、ノーザン分析ではシグナルが示されず（レーン当たりＲＮＡ総量２０μｇ を負荷した）、１２のプローブは、ＥＤＤでの所見を確認せず、また、１１のプ ローブのみ（図４Ｄを参照のこと）が、ＥＤＤでの最初の所見と一致した。この 分 析は、試験したジーンタグのおおよそ半分で、ＥＤＤでの最初の所見が確認され たことを、再度、示している。 即席法を用いて差別的に発現されることが示された新規遺伝子、およびノーザ ンブロットで検出されたｍＲＮＡのおおよそのサイズならびにジーンタグクロー ニングベクター内にクローン化した挿入物のサイズを、表５に示す。それぞれの ジーンタグに関する参照番号もまた示されている。 当業者らは、表に示されたｍＲＮＡサイズが概算でしかないことを認識してい るであろう。図４Ｄは、列挙したｍＲＮＡのサイズが得られたブロットと同様の ｍＲＮＡのノーザンブロットの例を示している。 これらの老化関連新規遺伝子に関して入手できる配列データを表６に示す；ま た、配列はＧｅｒｏｎの参照番号によって同定される。”ｃｏｎｔｉｇ”と言う 言葉は、その他の隣接しない配列をもまた手に入れることのできるジーンタグ配 列と同定される。配列は、５’−３’の方向で示している。Ｎは、任意の塩基で あり、その位置でのヌクレオチド本体が未知であることを示している。Ｍは、そ の位置でのヌクレオチドが、ＡまたはＣのいずれかであることを示している。Ｒ は、その位置のヌクレオチドが、ＡまたはＧのいずれかであることを示している 。Ｗは、その位置のヌクレオチドがＡまたはＴ／Ｕであることを示している。Ｙ は、その位置のヌクレオチドが、ＣまたはＴ／Ｕであることを示している。Ｋは 、その位置でのヌクレオチドがＧまたはＴ／Ｕであることを示している。 上に示した配列は、診断法の核酸プローブとして、核酸プライマーとして、組 換えＤＮＡクローニングおよび／または発現ベクタの成分として、遺伝子治療に 用いられ、ＲＮＡを細胞または組織内に直接生成させることができる。さらに、 いったんジーンタグの配列が分かると、本発明のジーンタグに該当する遺伝子の 完全なコード配列が単離されうることを、当業者らは認識しているであろう。こ のように、当業者らは、上記の配列情報を用いて、遺伝子のコード配列を単離す ることができ、また、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質を 発現させることができた。発現させたｍＲＮＡおよびそれに該当するタンパク質 の診断および治療への適用は、この技術分野で既知であり、本発明の実施に適用 することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム は、ｍＲＮＡを標的とするように設計することができ、また、抗体は、タンパク 質を標的とするように生成させることができる。そのようなアンチセンスオリボ ヌクレオチド、リボザイムおよび抗体は、老化関連遺伝子を検出するために、ま たは、上記のように、そのような遺伝子の有害な発現を妨げるために用いること ができる。 上記のように、表４に示した配列、または表６に示した配列、または本発明の 方法に従って同定したその他の老化関連遺伝子からの配列を含む、プローブおよ び／またはプライマーを診断法に用いると、組織またはその他のサンプル中の若 年細胞または老齢細胞の存在を検出することができる。ノーザンブロットによっ て若年または老化特異的であると同定されたいくつかのプローブは、使用位置で のヒト皮膚組織区分の分析に用いられた。これらのプローブは、組織内（生体内 ；使用位置）の老化細胞または若年細胞を同定するために用いることができる。 コラーゲン１α１、コラーゲン１α３、およびＭｎＳＯＤのためのプローブは、 商品として入手可能な使用位置でのハイブリダイゼーションプロトコール（Ｓｕ ｒｅＳｉｔｅ^TM II Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｏｖａｇｅｎ）に用いた 。予備的な結果として、コラーゲン１α１およびコラーゲン１α３のプローブは 、２人の若年提供者（＜１５才）のヒト皮膚区分の皮膚繊維芽細胞中のＲＮＡを 検出するが、ＭｎＳＯＤのプローブは、２人の老齢提供者（＞６９才）のヒトの 皮膚区分の皮膚繊維芽細胞中のＲＮＡを検出することを示している。これらの結 果は、若年特異的遺伝子は、若年提供者からの組織中の細胞を検出するが正常な 老齢提供者からのそれは検出せず、また、老化特異的遺伝子は、老齢提供者から の組織中の細胞を検出するが正常な若年提供者からのそれは検出しないと言う予 想を確認する。これらの見識は、繰り返し老化の皮膚繊維芽細胞が年齢と共に人 の皮膚に蓄積するという確信を支持する。 この使用位置でのデータは、本発明の核酸プライマーおよびプローブの価値を 、具体的に説明している。プライマーおよびプローブは、標的核酸と相補的なオ リゴヌクレオチドであり、それ故、標的核酸と結合するであろう。プライマーお よびプローブは、配列および長さが異なっても良いが、一次的分化因子は、機能 の一つであり：プライマーは、ＰＣＲ増幅に於いて、ＤＮＡ合成の開始に供され るが、プローブは、典型的には、標的核酸を結合することにのみ用いられる。プ ライマーまたはプローブの典型的な長さは、８から２０から３０またはそれより 多くのヌクレオチドの範囲であって良い。修飾した、合成の、および／または非 天然のヌクレオチドもまた、本発明のオリゴヌクレオチド内にその全体をまたは 部分的に用いることができる。また、プライマーおよびプローブを標識すると、 検 出（即ち、典型的には、放射性または蛍光分子がこの目的に用いられる）または 精製／分離（即ち、時としてビオチンまたはアビジンがこの目的に用いられる） を容易にすることもできる。 老化関連遺伝子からの配列を含むプライマー、プローブ、またはその他の核酸 の長さおよび／または予定の機能に一部依存するであろうが、本発明の発現プラ スミドは有用であろう。例えば、本発明のジーンタグまたは老化関連遺伝子に該 当するＲＮＡの組換え体の製造は、適当なプロモーター制御下で転写されるよう に配置したジーンタグのヌクレオチド配列を含む核酸からなる本発明の組換えＤ ＮＡ発現プラスミドを用いて行われる。そのようなプラスミドの宿主細胞は、原 核細胞または真核細胞のいずれであっても良く、発現プラスミド内への組み込み 用として選択されるプロモーターならびにその他の調節エレメントおよび選択マ ーカーは、生成に用いられる宿主細胞に依存するであろう。 本発明のジーンタグおよび該当する遺伝子から誘導されたプローブの一つの重 要な使用法は、老化細胞での遺伝子発現を変化させることのできる化合物を同定 するための化合物のスクリーニング方法：その方法は、（ａ）老化細胞を化合物 と接触させ；（ｂ）その老化細胞内でのｍＲＮＡ発現パターンを測定し；さらに （ｃ）老化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現の変化と、老化細胞で遺伝子発現を変化さ せることのできる化合物の同定とを相関させる；ことからなる：に関する。望ま しくは、ｍＲＮＡ発現パターンの測定は、２つまたはそれより多くの老化関連遺 伝子のｍＲＮＡ発現レベルの定量を含む。このように、このスクリーニング法は 、老化の結果として変化する遺伝子発現パターンを逆行、部分的に逆行、または 調整する能力を持つ化合物を同定する。また、本発明は、この方法によって同定 された化合物、および老化細胞の遺伝子発現を変化させるそれら化合物の使用法 をも包含する。また、そのようなスクリーニングは、若年特異的細胞を活性化す る、または細胞が老化状態に入ることを防ぐ、化合物をも同定することができる 。この方法において、本発明の新規オリゴヌクレオチドプローブは、試験化合物 が老化関連遺伝子の発現レベルを変化させることができるか否かの指示薬として 供される。 この方法で試験するに適した理想的化合物には、特異的老化関連遺伝子生成物 の発現に基づいた一次スクリーニングで同定された化合物が含まれる。一般的に は、スクリーニングの基本的方法は以下の通りである。老化細胞を９６穴のミク ロタイタープレート内で培養する。培養期間、即ち３日間培養の後、培地を取り 除き、一つあるいはそれより多くの老化マーカーについてアッセイし、「処理前 」の基準線を提供する。培地を、試験薬剤またはそのベヒクルを含む新鮮培地で 置き換える。細胞をさらなる期間、即ち培地中で２から４日またはそれより多く 、試験薬剤存在下で培養する。その後、細胞および／または培地を、老化マーカ ーについてアッセイする（「処理後」測定）。老化マーカーの標準サンプルを、 若年細胞の培地に存在させ、それらの効果を同様の様式で測定することもできる 。老化細胞に選択的に作用する化合物については、さらに、スクリーニングが行 われるであろう。 表２および科学文献に示されているように、数多くの既知遺伝子は老化関連遺 伝子である。例えば、β−ガラクトシダーゼの活性は、老化繊維芽細胞で上昇す る。Ｃｒｉｓｔｏｆａｌｏら、１９７５、Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．， ４：１９−２８；およびＤｉｍｒｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２（印刷中）を参照のこと。それ故、化合物が老化細胞 中のβ−ガラクトシダーゼ活性を阻害するか否かを決定する試験化合物の一次ス クリーニングを最初に行うことができる。このスクリーニングの一つの実施態様 では、繊維芽細胞を老化するまで増殖させ、９６穴プレートで平板培養し、試験 化合物と共に培養する。インキュベーション期間の終わりに、無色の基質を着色 反応生成物に切断する酵素の能力に基づいた比色アッセイを用いて酵素活性につ いて、細胞を分析する。このスクリーニングで活性化合物として同定された化合 物（以下の実施例１４参照のこと）は、その後、二次アッセイで試験して、活性 化合物は老化に特異的な酵素活性の増加を阻害し、酵素それ自体を完全には阻害 しないことを測定する。他の一次スクリーニングは、本発明の方法に従って同定 し、上記の表２で同定した老化関連遺伝子、または科学文献からの既知の老化関 連遺伝子を用いて、行うことができる。例えば、一次スクリーニングを行って、 コラーゲン活性、老化繊維芽細胞で上昇することが知られている酵素、のダウン レギュレーションを誘発する能力を持つ化合物を同定することができた。 これらのスクリーニングで活性な化合物は、次いで、本発明のスクリーニング 方法に従って試験し、化合物が、その他の老化関連の、具体的には老齢関連の遺 伝子の発現を阻害するか、または若年関連遺伝子の発現を活性化するか、または その両方であるかのいずれであるかを決定することができる。方法には、ノーザ ン分析を用い、ＥＤＤによって示されたように、老化で、発現が変化するまたは 豊富に示される遺伝子パネル上のリード化合物の効果について試験することがで きる。このスクリーニングの結果を基にして、どのような化合物が、老化で変化 し、また加齢関連病状の一因となる信じられている、そのような遺伝子の発現を 正常に戻すかを決定することができる。さらに、化合物が変化した発現パターン を逆行させるように作用する程度を測定することも可能であろう。遺伝子発現を 若年パターンへ完全に逆行すると、単一の共通の機構が含まれるを示唆するであ ろう。限定された遺伝子群を逆行させると、いくつかの機構が作用していること 、またそのそれぞれが異なる遺伝子バンクに影響を与えることが、示されるであ ろう。また、化合物は個々の遺伝子の活性を調整するように働き、共通の機構が 存在しないことも示唆されるであろう。この情報は、回り回って、一次スクリー ニング戦略に影響を与えるであろう。例えば、もし全ての活性化合物が、一組の 遺伝子、またはたった一つの個々の遺伝子、の発現変化を逆行させるようであれ ば、その後スクリーニングを拡張させ、そうすることによって、もし適当である ならば、推定される組のそれぞれの構成員を含むより数多くのマーカーを含むこ とができる。 上記のそれらのようなスクリーニングは、多くの異なる細胞型を基に行うこと ができる。例えば、様々な型の皮膚モデルは、そのようなスクリーニング法に有 用である。有用な皮膚モデルの例として、傷ついた皮膚モデル（Ｇｅｎｅｖｅｒ ｒａ，１９９３、Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２：２６６−２７３を参照のこ と）、繊維芽細胞を含むコラーゲンスポンジ上で増殖し分化するケラチン細胞（ Ｍａｒｕｇｕｃｈｉら、１９９４、Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ． ，９３：５３７−５４４を参照のこと）、コラーゲンマトリックスを持つ繊維芽 細胞およびケラチン細胞よりなる培養した皮膚代用品（Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉら 、１９９３、Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．，３１：３４０−３５１を参照の こ と）、再構築した架橋されていないコラーゲンまたはグルタルアルデヒド、アル ギン酸アルミニウムあるいは酢酸塩で化学的に架橋した再構築されたコラーゲン （Ｍｉｄｄｅｌｋｏｏｐら、１９９５、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．，２ ８０：４４７−４５３を参照のこと）、およびポリグラクチンメッシュ培養繊維 芽細胞皮膚代用品上で増殖させたヒトケラチン細胞（Ｈａｎｓｂｒｏｕｇｈら、 １９９３、Ｊ．Ｂｕｒｎ Ｃａｒｅ Ｒｅｈａｂｉｌ．，１４：４８５−４９４ を参照のこと）が、含まれる。 さらに、静止状態でアップレギュレートされた遺伝子であることがＥＤＤによ って認められたアルデヒドデヒドロゲアーゼ１（ＡＬＤＨ−１）遺伝子もまた、 スクリーニングに用いることができる。当業者らには，ＡＬＤＨ−１は１７βデ ヒドロゲナーゼ活性を持つと、信じられている。老化細胞でのこの遺伝子のダウ ンレギュレーションは、それ故、ステロイド代謝の変化（即ち、より活性なアン ドロゲン）を導く。前立腺、毛包、および毛脂腺中の細胞はアンドロゲンに応答 するので、このアンドロゲン活性を増加させると、良性の前立腺過形成、男性型 の脱毛、および皮脂腺増生症（年齢に関連することが知られている状態）を導く ことができた。遺伝子ＡＬＤＨ−１をスクリーニングに用いると、オキシダーゼ を阻害するが、酵素のレダクターゼ活性を阻害せず、その結果、酵素が細胞内に 存在するステロイドをより効果的に代謝できるようにする、薬剤を見つけだすこ とができる。 培養細胞をスクリーニングに用いるためには、数多くの技術的挑戦を受けるこ とが要求される。第一に、細胞はスクリーニング期間中、目に見える状態に保た なければならない。第二に、細胞の代謝は、アッセイ条件によって混乱してはな らない。第三に、特に複数日にわたるスクリーニングでは、無菌に保たれること がきわめて重要である。老齢老化ならびに若年静止および分裂細胞を作り出すで あろう培養条件は、注意深く選択されなければならず、老化のための以下の基準 を考慮に入れなければならない：（１）細胞は、典型的には、老化に到達すると きに細胞の増大および平板化を特徴とする形態学上の変化を示すであろう；（２ ）細胞は、細胞周期を逆行させることはできず、培養中の細胞数倍加時間によっ て測定した場合に、最低３週間の間増殖する能力を持つであろう；また、（３） 細 胞は、典型的には、２４時間より長い期間にわたって核内への標識されたＤＮＡ 前駆体の取り込みによって測定した場合、１％より低い核標識率を示すであろう （表１を参照のこと）。細胞が老化に到達した場合、それらの世代時間は増加す る。このことは、継代細胞間の間隔が常に変化しており、細胞密度を継続的にモ ニターすることによって測定されなければならないことを意味している。細胞複 製が終わる（複製老化）時間も測定されなければならない。 細胞を基本とするスクリーニングは、伝統的に仕事集約的であり、それ故、高 効率のスクリーニングには時として用いられない。しかしながら、本方法は、高 効率のスクリーニングを行うべきである。液体取り扱い操作は、ミクロラボ（Ｍ ｉｃｒｏｌａｂ）２０００^TMピペットステーション（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ ｓｔ ａｔｉｏｎ）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって行うこと ができる。スクリーニングに必要なその他の設備（例えば、インキュベーター、 プレート洗浄機、プレート読み取り機）は、自動機能化に適応させるか、または 自動化モジュールで購入するかのいずれかである。アッセイを通してのサンプル の移動は、長さ３ｍのトラック上に装備されたＸＰ^TMロボット（Ｚｙｍａｒｋ） によって行われるであろう。 これらのスクリーニングを通して、合成有機化合物、天然生成物、ペプチド、 およびオリゴヌクレオチドのライブラリーをそれらの能力について評価して、病 気の進行をもたらすまたは一因となる遺伝子の発現を調整することができる。具 体的には、老化を通してアップレギュレーションされる遺伝子をダウンレギュレ ーションするか、または逆に、老化を通してダウンレギュレーションされる遺伝 子の発現を増加させるであろう化合物を同定することが可能である。活性化合物 は、所望であれば、医療化学によって最適化することができる。最初に、最新の コンピューター装備の科学機器を用ると、高効率スクリーニングで活性であるこ とが見いだされた構造を代表する薬剤伝達物を明確に示すことができる。一端、 共通の薬剤伝達物が同定されたならば、化合物の組み合わせに焦点を合わせたラ イブラリーを設計して、構造と活性の関係を厳密に調べることができる。最後に 、医療用試験に適当な化合物を同定するためのリード構造を一つのセットとして 、有効性および効率性と言ったような、生物薬学的性質を改良することができる 。 このように、本発明は、老化関連遺伝子を同定するための新規の方法、老化細 胞および若年細胞を同定するための、組織中の若年細胞から老化細胞を識別する ための、方法および試薬、ならびに細胞の老化から結果として生じる病気および 状態を治療し、老化細胞を標的とする、化合物および治療法を提供する。以下の 実施例には、本発明を具体的に説明し、当業者らに対して本法の説明を提供する ために、本発明の具体的態様について記述している。 実施例１ 免疫組織化学的染色での細胞分裂率の定量 このアッセイは、ＤＮＡへ取り込まれた５−ブロモ２−デオキシウリジンを検 出することによって、細胞周期のＳ期での細胞区分の定量を可能にし、細胞がい つ老化するかを測定するために用いることができる。 Ａ． 調製および処理 １． 推定させる老化細胞を無菌のカバーガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｎｏ． １、１８ｍｍ四方）上で６０％の集密度にまで増殖させる。５−ブロモ−２’− デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で処理する一日前に細胞を回収する。ＢｒｄＵと 共にインキュベーションする直前まで細胞を洗浄してはならない；こうすること によって、この方法での取り込み期間中の細胞の増殖は遅らされるであろう。 ２． 最終濃度が増殖培地中の細胞に対して１０ｍＭになるように、Ｂｒｄ Ｕ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｂ−５００２）を加える。ＢｒｄＵは、添加段階の間、光か ら遮断するように保つ。限定された時間の期間（典型的には２から２４時間）、 細胞を暗がりで３７°Ｃにインキュベートする。ＰＢＳ中に溶解し、アッセイを 行う前に既に作っておいた光遮断（または光から遮断するホイルで覆った）チュ ーブ中にアリコートした１ｍＭ−ＢｒｄＵを保存しておかねばならない。 ３， ＢｒｄＵ処理後、漂白剤を含む不用の容器に培地を吸い込み、細胞を ＰＢＳで３回洗浄する。３回目の洗浄の後、それぞれの穴に３ｍｌのＰＢＳを加 える。 Ｂ． 固定化 １． プレートは、それぞれの穴当たり３ｍｌのＰＢＳを含み、氷上に保た ねばならない。３ｍｌの固定化溶液（氷冷したメタノール：無水酢酸 ３：１） をそれぞれの穴（氷上）加える。 ２． それぞれの穴から３ｍｌを取り除いて捨てる。それぞれの穴にさらに ３ｍｌの固定化溶液を加える。 ３． 段階２を２回またはそれより多く繰り返す。 ４． それぞれの穴から５ｍｌを取り除き、それぞれの穴に６ｍｌの固定化 溶液を加える。プレートを１５分間氷上に置いておき、この段階をもう一度繰り 返す。 ５． プレートからカバーグラスを取り除き、一晩または数時間空気乾燥さ せる。溶媒は完全に蒸発させなければならない。翌日染色するために、カバーグ ラスを、暗がりの中、覆いのある箱の中に保つ。カバーグラスを染色の前、一日 より長く保たなければならない場合には、カバーグラスは、Ｎ₂大気下、デシケ ーター中に凍結して保存する。 Ｃ． 免疫組織学的染色 １． ＤＮＡを変性させるために、固定化した細胞を３分間、０．０１Ｎ− ＮａＯＨで処理する。塩基で細胞を過剰処理してはならない；過剰処理すると、 細胞はカバーグラスから滑り落ちるであろう。 ２． ＰＢＳで塩基をｐＨ８．５に中和する。細胞をＰＢＳで二度洗浄し、 全ての塩基を取り除く。 ３． 細胞は、ＰＢＳ中の１．５％ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＃ Ｓ−２０００）（二次抗体を生成させた種からの血清を用いる）で、１５分間ブ ロックする。 ４． 細胞からウマ血清を取り除くために注意深く吸い出すか、またはカバ ーグラスを傾かせる。この時点でカバーグラスを洗浄してはならない。 ５． ＰＢＳ中の１％−ＢＳＡ、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０で１／５００ に希釈した４００ｍｌの抗ブロモウリジン モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＃Ｂ−２５３１、マウスで作成、ＩｇＧ）を加え、細胞を完全に覆う。光を遮断 した湿気のある部屋の中で、室温で２時間インキュベートする。 ６． 細胞をＰＢＳで３回リンスする。 ７． ４００ｍｌの二次的にビオチニル化したウマの抗マウスＩｇＧ（Ｖｅ ｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＃ＢＡ−２０００）を加え、室温で光のない湿気のある部 屋に３０分間おく。抗体は、１．５％ウマ血清／ＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌに希釈 しなくてはならない。 ８． 細胞をＰＢＳで３回洗浄する。 ９． 細胞を、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ−Ｎａｃｌ、ｐＨ８．５ 中の３０ｍｇ／ｍｌの蛍光アビジンＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ａｃｉｄｉｎ Ｄ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ Ａ−２００１）４００ｍｌと共に、光を遮断 した湿気のある部屋の中で室温で２０分間インキュベーションする。 １０． 細胞をＰＢＳで３回洗浄する。 １１． ２ｘ標準クエン酸塩（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａ ｔｅ）（ＳＳＣ）緩衝液中に、１ｍｇ／ｍｌ濃度の４’，６−ジアミジノ−２− フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ−９５４２）を加え、５分 間核染色する。標準クエン酸溶液は、最初に、以下の方法に従って、２０ｘＳＳ Ｃを作ることによって調製する：１７５．３ｇのＮａＣｌおよび８８．２ｇのク エン酸ナトリウムを８００ｍｌの水中に溶解し；１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７． ０に調整し；さらに、水で容量を１リットルに調整し；その後、９０ｍｌの蒸留 水に１０ｍｌの２０ｘＳＳＣを加えることによって、２０ｘＳＳＣを２ｘＳＳＣ に希釈する。ＤＡＰＩの保存溶液を調製し、蒸留水に溶解した１ｍｇ／ｍｌで、 光から遮断したチューブ中に保存しておくと便利である。 １２． ＤＡＰＩを吸い出し、細胞をＰＢＳで３回洗浄する。 １３． Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ^TM（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、＃Ｈ−１００ ０）の固定媒質を用いてスライド上にカバーグラスを固定し、ＦＩＴＣの急冷を 減少させる。個定媒質は完全には乾燥しないであろうため、固定化培地を過剰に 用いてはならない。透明なツメ光沢剤を用いてスライドをカバーグラスで密閉し 、５分間乾燥させる。 １４． 蛍光顕微鏡下でスライドを見る。 Ｄ． 分裂率の計算 分裂率は、与えられた領域内の、ＤＡＰＩ標識細胞数に対するＦＩＴＣ標識細 胞数の比率に等しい。 Ｅ． 老化したヒト二倍体繊維芽細胞を同定するためのアクリジン−オレンジ 染色 老化細胞を検出するためのもう一つの細胞染色法では、アクリジンオレンジ染 色が用いられる。アクリジンオレンジ（ＡＯ）は、単一のスペクトル性を持つ蛍 光染料である。この方法では、増殖中の細胞は、培養液に直接ＡＯ水溶液を加え 、細胞を３７°Ｃ（５％ＣＯ₂）でおおよそ３０分間インキュベートすることに よって染色される。次いで、４８８ｎｍ励起フィルター、５２０ロングパスバリ アーフィルター（”ＦＩＴＣフィルターセット”）を用いて、細胞を蛍光外顕微 鏡で見る。老化細胞から放射される蛍光は、複製可能な若年細胞のそれとは次の 点で異なる：（１）老化細胞では、細胞質内の全蛍光が増加し、長波長に向かっ て発光スペクトルがシフトし、また（２）老化細胞の核内では、より長い波長に 向かって発光スペクトルがシフトする。さらに、老化に伴うクロマチン組織内の 構造変化と一致して老化細胞の核内の蛍光パターンが変化する。このパターンは 老化細胞に特徴的である。この染色法は、使用位置での組織の分析に適用するこ とができる。 実施例２ 細胞培養およびＲＮＡ調製 標準的組織培養技術に従って、ヒトの繊維芽細胞を適当な密度に分裂させる。 細胞を、１０％子ウシ血清（ＢＣＳ）を加えたＤＭＥＭ培地中で増殖させる。Ｒ ＮＡを単離する前の最終分裂は、若年細胞では１から８、老化細胞では１から２ である。細胞を、分裂させ、１０％ＢＣＳを加えたＤＭＥＭ中に植え付けた後、 以下の二つのプロトコールに従う。 （１）分裂細胞が必要であれば、細胞は、１０％ＢＣＳを加えたＤＭＥＭ培地 中、２日間、３７°Ｃで増殖させる。その後、ＲＮＡを単離する（以下を参照の こと）。 （２）静止細胞が必要であれば、接種４ー８時間後、細胞が付着すると、１０ ％ＢＣＳを加えたＤＭＥＭ培地を吸い出す。培地を、０．５％ＢＣＳを加えたＤ ＭＥＭで置き換え、細胞を３７°Ｃで３日間増殖させる。培地を新しい０．５％ ＢＣＳ添加ＤＭＥＭ培地に置き換え、細胞を３７°Ｃでさらに２日間増殖させる 。 ＲＮＡの単離のために、細胞をＰＢＳで一度素早く洗浄し、その後、洗浄液を 完全に吸い出し、約１．５から２ｍｌのＧＩＴＣ溶液［２００ｍｌのＧＩＴＣ溶 液は、１．６７ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）に９４．５３ｇのグアニジ ンイソチオシアネートを加え、（０．２２μｍフィルターで）無菌にろ過したＤ ＥＰＣ水を２００ｍｌになるように加え、さらに発煙フード中で、１．６７ｍｌ のβ−メルカプトエタノールを加える］を１５ｃｍのプレートに加える。細胞を この溶液中に溶解する。全プレートを覆うために、プレートを前後に揺らし、数 分後に（粘液性の）溶解液を集め、ＣｓＣｌ₂遠心分離用に調製する。 実施例３ グアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）スピニングによるＲＮＡ単離 この方法を始める前に、ＲＮＡ＋ＧＩＴＣおよびＣｓＣｌが室温にあることを 確かめる。ＣｓＣｌ溶液は、９５．９７ｇのＣｓＣｌを０．８３ｍｌの３Ｍ酢酸 ナトリウム、ｐＨ６に加え、最終容量が１００ｍｌになるように水を加えること によって調製する。 １． Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ^TM１４ｘ８９ｍｍ ポリカルボネートチューブ （Ｂｅｃｋｍａｎ３４０５９）を用いる。 ２． チューブの底に４ｍｌの５．７Ｍ−ＣｓＣｌを加える。 ３． 穏やかに、界面をかき乱さないように、７ｍｌのグアニジンイソチオ シアネート＋ＲＮＡをこれらのチューブに加える。 ４． チューブの釣り合わせ、次いで、ＳＷ４１ローターの部分であるスイ ングバスケット内にチューブを置く。 ５． ３２Ｋで２０時間、２０°Ｃで回転させる。 ６． 回転後、上澄み液（ＲＮＡは、チューブの底でペレット状になる）を 吸い出す。 ７． チューブを逆さまに立てて、約３０分間それらの水気を切った後、チ ューブの底を切り離す。 ８． １８０μｌのジエチルピロカルバメートで処理した脱イオンＨ₂Ｏ（ ＤＥＰＣ−水）中にペレットを再懸濁する。 ９． その後、さらなる１８０μｌでチューブの底の二度目の洗浄を行う。 １０． これらの洗浄液（総量３６０μｌ）をプールし、それらに４０μｌの ３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６（フィルター滅菌した、ＤＥＰＣ−水で作成する）を 加える。 １１． 渦巻き攪拌し、１ｍｌの冷１００％エタノールを加え、攪拌し、−８ ０°Ｃに少なくろも３０分間置く。ＲＮＡを沈殿させるために、２．５倍容量の エタノールを用いる。 １２． １４Ｋ、４°Ｃで３０分間回転させる。注意してエタノールを吸い出 して除く。これは、後方の塩沈殿物を除くであろうため、チューブを蒸発させて はならない。 １３． ＤＥＰＣ−水に再懸濁する。容量は、ペレットの大きさを基にして決 定する。 １４． ０．Ｄ．（２６０）を測定する、例えば、１００μｌ中に１μｌを取 り、１００μｌの石英キュベットを用いる。 品質調製のためにＲＮＡを調べる場合、以下の方法を用いて、ゲル泳動させる ことができる。 １． １０μｌのＤＥＰＣ−水中で、１−２μｇのＲＮＡを、７０°Ｃに２ 分間加熱する。室温でインキュベートし、サンプルに、標準負荷染料を加える。 ２． ＤＥＰＣ−水で作成した１ｘＴＡＥバッファーで作製した１．２％ア ガロースゲルを泳動させる。 ３． 例えば、５”ｘ７”のゲルでは１５０ボルト、またはミニゲルでは７ ５ボルト、でゲルを泳動させる。 実施例４ 差異増強表示 Ａ． ｃＤＮＡ第一鎖の合成 アニーリング反応は、２．５ｍｌの２０μＭ ３’−プライマー（ｄＴ₁₂マー ） を含む総量１ｍｇのＲＮＡおよび９．５ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏを混合すること によって行われる。反応溶液は、７５°Ｃで１０分間加熱し、次いで、氷上で７ 分間冷却し、その後、回転させてチューブの底の混合物を集めた。 伸長反応は、チューブに５ｍｌの５Ｘ第一鎖合成緩衝液；１ｍｌのＲＮＡｓｉ ｎ（ＰｒｏｍｅｇａまたはＰｈａｒｍａｃｉａ）；２．５ｍｌの０．１Ｍ−ＤＴ Ｔ；２．５ｍｌの０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ；および１μｌの逆転写酵素（Ｓｕｐ ｅｒＳｃｒｉｐｔ^TMＩＩ ＲＴ，ＢＲＬ）を加えることによって行われる。得ら れた溶液を３７°Ｃで７０分間インキュベートする。次いで、溶液を加熱して、 混合物を９５°Ｃに１０分間インキュベートすることによって酵素を不活性化す る。反応混合物は、後の使用時まで−２０°Ｃで保存することができる。 Ｂ． ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅 反応混合物は、１ｍｌのｃＤＮＡ（３’プライマーは、ｃＤＮＡより流用する ）；２ｍｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭトリスｐＨ ８．３、２０ｍＭ ＭｇＣｌ）；１．５ｍｌの０．１ｍＭ ｄＮＴＰ；１．２５ ｍｌの２０ｍＭ ５’プライマー；１ｍｌの１−５倍希釈のα−³²Ｐ ｄＡＴＰ ；０．５ｍｌのＴａｑポリメラーゼ；および１２．７５ｍｌのＨ₂Ｏを用いて調 製する。約７０ｍｌの鉱油を反応混合液の頭部に層状に積み、簡単に遠心分離し て、チューブの底に反応混合物を集める。 ＰＣＲ機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｋｍｅｒ）は、以下のようにプログラムして：９ ４°Ｃで４５秒、４１°Ｃで６０秒、および７２°Ｃで６０秒を４サイクル；次 いで、９４°Ｃで４５秒、６０°Ｃで４５秒、および７２°Ｃで１２０秒を１８ サイクル：行う。チューブを簡単に遠心分離し、チューブの底に反応混合物を集 め、４°Ｃで保存することができる。 Ｃ． 差異表示ゲル分析 １． ２ｍｌの泳動用染料（ホルムアミド染料）と３ｍｌのＰＣＲ生成物を 混合する。 ２． サンプルを９０°Ｃに３分間加熱し、パルススピンさせ、０．６ｘＴ ＢＥ中で６％の配列決定用ゲル（Ｄを参照のこと）に負荷し、ゲルを２０００Ｖ （電流〜５０ｍＡ）で泳動する。 ３． 第二染料が底に到達するまでゲルを泳動する（これは、どのサイズの 範囲のバンドを比較したいかに依存して変えることができる）。 ４． ゲルを乾燥させ、ゲルが乾燥したならば、ゲルとフィルムを一緒に紐 でくくり、ゲルの角に三カ所の穴をあけ、フィルムに一晩晒す。 Ｄ． 配列決定用ゲル 配列決定用ゲルを調製するために、３６ｇの尿素を、１１．２５ｍｌの４０％ アクリルアミド／ビス溶液（１９：１）、および４．５ｍｌの１０ｘＴＢＥと混 合し、７５ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏを加え、成分を溶液内に入れる。次いで、Ｎ ａｌｇｅｎｅ１００ｍｌ使い捨てろ過器（ＣＮ）を通して混合液をろ過し、３３ ０ｍｌの１０％ペルオキソ二硫酸アンモニウムおよび３３ｍｌのＴｅｍｅｄを加 え、ゲルを即座に注ぎ込む。 実施例５ 示唆表示バンドの取り出し １． フィルムをゲルと共に並べる。 ２． １８ゲージの針で、バンドのそれぞれの端に、フィルムおよびゲルの と通して、穴をあける。 ３． バンドを示すゲル上のドットの間に線を引き、取り出す（このことは 、後の段階でサランラップを見ることを容易にする）。 ４． バンドをきれいな剃刀の刃で切り出し、バンドをきれいなピンセット で操作する（個々のバンドを回収する間に、両アイテムを水でリンスする）。 ５． ６つのバンドの全てに新しい剃刀の刃を用いる。 ６． バンドを１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ^TMチューブ内に置き、１ｍ ｌのＴＥ緩衝液を加える。１５分間浸す。 ７． 緩衝液を吸い出し、スライスしたゲルからサランラップおよび紙を分 離する。 ８． 次いで、（スライスしたゲル中の尿素を薄め出すために、）１ｍｌの ＴＥ緩衝液を戻して加え、再びすぐに吸い出す。 ９． ４０μｌのＴＥ緩衝液＋１００ｍＭ−ＮａＣｌを加える。 １０． ９５°Ｃ（沸騰した水浴）で１０分間加熱する。 １１． チューブを一晩室温に冷やす。 １２． １４Ｋでパルススピンさせ、ＰＣＲ増幅のために５μｌを取り出す。 １３． ５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液、２．５μｌの１ｍＭ ｄＮＴＰ、３μ １の２０μＭ５’−プライマー、３μｌの２０μＭ３’−プライマー、１μｌの Ｔａｑポリメラーゼを加え、ＤＥＰＣ−水で５０μｌにする。 １４． ＰＣＲを、（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ｍａｃｈｉｎｅで、）２５ サイクル行う：それぞれのサイクルは、９４°Ｃで４５秒；６０°Ｃで１分、お よび７２°Ｃで１分からなり、さらに７０°Ｃに１５分間インキュベートする。 実施例６ ＰＣＲ配列決定用差異表示バンド １． 液化するために、スライスゲルを９５°Ｃに加熱する。 ２． ３．５μｌを取り出し、適当な２０μＭの３’−プライマー、１．５ μｌを含む１．５ｍｌのチューブ内に入れる。 ３． ミクロタイター皿内の穴に５μｌのジデオキシヌクレオチド終止混合 物を加える。 ４． １０ｘ配列決定用緩衝液、³²Ｐ−α−ＡＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、 および水を含むカクテルを作る。 ５． ＰＣＲ増幅させたバンドおよびプライマーを含むチューブに、１８μ ｌのこの反応カクテルを加える。 ６． おおよそ２０秒間９５°Ｃに加熱し、すぐに、ミクロタイター皿内の 適当な終止混合物に、５μｌのこのカクテルを加える。 ７． ２０μｌの鉱油を上積する。 ８． ＰＣＲ機内のそれぞれの穴に一滴の鉱油を加え、その後ミクロタイタ ー皿を挿入する。 ９． ９５°Ｃで５分間液化させ、３０循環：それぞれは、９５°Ｃで３０ 秒、６０°Ｃで３０秒、および７２°Ｃで１分間からなる：行うように機械をプ ラグラムする。サンプルプローブが即座に十分に加熱されていることを確認する 。 １０． 終了時に５μｌの停止混合液を加える。 １１． ５分間９５°Ｃで液化することによってＰＣＲ機械中でサンプルを変 性させる。サンプルをすぐにゲルに負荷する。 実施例７ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋への差異表示バンドのクローニング Ａ． ＨｉｎｄIIIによるバンドの消化 クローンニングするために、４つの老齢または若年特異的バンドを選択する。 それぞれのバンドＤＮＡ溶液５μｌを消化し、その後、ＤＤゲルのスライスした アクリルアミドゲルからＰＣＲ増幅させる。反応混合物は：５μｌのバンドのＤ ＮＡ、５μｌの１０ｘ制限緩衝液Ｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）；３９μｌの脱イオンしたＨ₂Ｏ；および１μｌの制限酵素ＨｉｎｄIII（１０ Ｕ／μｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）：からなり、５０μｌの 反応総容量中、３７°Ｃで２−３時間反応させた。消化後、酵素は、７０°Ｃに ２０分間インキュベーションすることによって熱不活性化する。 Ｂ． クローニング用Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの調製 〜５０μｇのＨｉｎｄIII−消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）の保存溶液を、〜０．２５μｇ／ｍｌの濃度で調製すると有用であり、こ れを冷凍庫内で保存し、新鮮な子牛−腸のアルカリホスファターゼ−処理（ＣＩ Ｐｅｄ）ベクターを調製してから２−３週間毎にアリコートをストックとして用 いることができる。さらにＨｉｎｄIIIで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを調 製しなくてはならないならば、３０−５０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＨｉ ｎｄIIIで消化する。このＤＮＡは、全てを一つのチューブ内に置いてはならず 、むしろそれぞれが２０μｌの反応容量中に５μｇを含むように、数本のチュー ブを用いる。３７°Ｃで少なくとも３時間消化し、消化が完全であることを確実 にする。消化は完全でなくてはならず、さもなくば多すぎる青色コロニーが形質 転換後に現れるであろう。消化後、その消化が完全であることを確認するために 、それぞれの消化物１ｍｌを１％アガロースゲル上で泳動させる。消化が完全で ない（即ち、超コイルＤＮＡを示すさらなるバンドが見られる）ならば、全ての 消化物を 一つのチューブに集め、５−１０μｌのＨｉｎｄIII（それ以上の緩衝液を加え ずに）を加え、３７°Ｃに２−３時間インキュベーションする。ゲル上で２−４ μｌを調べ、消化が完全であることを再び確認する。 ２０μｌ(即ち−５μｇ)のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＨｉｎｄIII消化）を、 １μｌのＣＩＰ（１Ｕ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、３μｌの１０ｘＣＩＰ緩衝液 （Ｐｒｏｍｅｇａ）、６μｌの脱イオンＨ₂Ｏと共に、総量３０μｌで、３７° Ｃで１時間反応させることによって、新鮮なＣＩＰｅｄ ＨｉｎｄIII−消化ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋を２−３週間毎に調製する。最終濃度が５ｍＭに なるようにＥＤＴＡを加え（即ち、０．５μｌの０．３１Ｍ−ＥＤＴＡを加える ）、７０°Ｃに３０分間インキュベートし、次いで溶液を一端フェノール抽出す る。次いで、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および２容量の １００％ＥｔＯＨを加える。ドライアイス上に２０分間または−２０°Ｃに一晩 置く。１０分間遠心分離することにより、ミクロフュージ中でＤＮＡを遠心沈殿 させ、−２００μｌの７０％ＥｔＯＨ（氷冷）で洗浄する。さらに５分間、回転 させ、デシケーター内で、または高速真空遠心分離によってＤＮＡペレットを乾 燥させる。最終濃度が−０．２μｇ／ｍｌになるようにＤＮＡ（−５μｇ）を２ ５μｌの脱イオン水（ｄＨ₂Ｏ）に再懸濁する。１μｌのこの溶液を１％ゲル上 で調べ、ＤＮＡが高率で回収されていることを確かめる。連結反応当たり−１μ ｌを用いる。 Ｃ． ＨｉｎｄIII消化バンドのゲル精製、およびＨｉｎｄIIIで消化した ＣＩＰｅｄベクター内への凍結反応 バンドをＨｉｎｄIIIで消化し、酵素を熱で不活性化した後、消化反応物全体 を２％の低融点アガロースゲルに負荷する。ゲルの調製は、以下の方法に従って 行う。 ゲルボックスは８”ｘ１０”であり、３０の櫛状の穴を持ち、典型的には３０ ０ｍｌのゲル混合物が入る。 １． ２％のゲル用には、６ｇのシープラーク（ｓｅａｐｌａｑｕｅ）低融 点アガロースを３００ｍｌの１ＸＴＢＥ緩衝液に加える。１％ゲルとは、１ｇ／ １００ｍｌのゲルをさす。 ２． 溶液を、マイクロ波レベル７で約４分間加熱する。終了後、溶液を６ ５°Ｃの水浴中に置き、フラスコを扱いやすい温度に冷やす。 ３． ３μｌの５ｍｇ／ｍｌ−ＥｔＢｒをゲルに加え、振とうさせて混合し 、さらに１ｘＴＢＥの泳動緩衝液に４μｌを加える。 ４． 試験するサンプルの両端に、ＨａｅIII（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で消 化したΦＸ−１７４ ＲＦ ＤＮＡ、０．５μｌを負荷する。 ５． ゲルは、１００から１５０ボルトの間で、約１．５から２時間泳動す る。 負荷染料をサンプルに加える場合には、１μｌの染料を５μｌのサンプルに加 える。 １２３ｂｐのＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）２μｌをマーカーとして負荷する 。臭化エチジウムで染色した写真、およびＵＶ照射ゲルの写真を撮り、ゲル上の バンドのサイズがデータシート上に示されたサイズと合うことを確認する。カバ ーグラスを用いてバンドを切り出し、切り出したバンドをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ^TM チューブに入れる。バンドをゲルから取り出すために以下の操作を行う。 １． ３６５ｎｍＵＶライトボックスの表面をエタノールでふいて、きれい にする。 ２． ゲルをＵＶライトボックス上に置き、レンズの口径を８にセットし、 （シャッターを開けておく）時間をＢ（おおよそ２秒間シャッターボタンを押し 続ける）にしたカメラを手に持って、写真を撮る。 ３． 写真を調べて、バンドが正しいサイズであることを確かめる。 ４． カバーグラスを用いてバンドを切り出し、エタノールで殺菌消毒した スパテラで取り出す。 ５． バンドを標識した１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ^TMチューブに入れ 、ガラスのカバーグラスを捨て、さらにスパテラを再殺菌消毒する。 バンドを切り出す時にＵＶ露光に対して保護するために、顔の防護物、実験着 および手袋を身につけなくてはならない。 ２μｌのバンドＤＮＡ（加える前に６５°Ｃで１０分間おくことによってアガ ロースを溶解する）を、１μｌのＣＩＰｅｄ、ＨｉｎｄIII−消化Ｂｌｕｅｓｃ ｒ ｉｐｔ（−０．２μｇ／ｍｌ）、２μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、２μｌの１０ｘＰ ｈｏｒ−Ａｌｌ^TM緩衝液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１２μｌのｄＨ₂Ｏ、および １μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼと共に、総容量２０μｌで混合することによって連 結反応を始め、３７°Ｃで２−３時間インキュベートする。 Ｄ． サブクローニングしたＤＨ５α能力細胞の形質転換効率 能力細胞（ＤＨ５α細胞はＢＲＬから入手できる）を調製するために、以下の 操作を行う。 １． ３ｍｌの培地中で、一晩培養物を増殖させる。 ２． ５００ｍｌのＬＢ培地中に一晩培養物の全てを入れる。 ３． 光学密度が−０．４になる迄、培養物を増殖させる。 ４． 培養物の全てを２００ｍｌの使い捨て遠沈管（円錐形）に入れる。 ５． 細胞を２０００ｒｐｍ、４°Ｃで５分間、遠心分離する。 ６． 細胞ペレットを集め、１００ｍｌの冷５０ｍＭ ＣａＣｌ₂に再懸濁 する。 ７． 再懸濁した細胞を、氷上であらかじめ冷却した６本の５０ｍｌの円錐 形チューブにアリコートする。 ８． ２０００ｒｐｍ、４°Ｃで５分間、回転させる。 ９． 細胞を、２０ｍｌの冷５０ｍＭ ＣａＣｌ₂＋１５％グリセロール内 に、穏やかに再懸濁する。 １０． チューブ当たり１００μｌの再懸濁細胞（１形質転換に充分な量）を アリコートする。 １１． ドライアイス上でチューブをフラッシュ凍結する。 １２． フラッシュ凍結したチューブを−８０°Ｃで保存する。 形質転換を行うために、以下の操作を行う。 １． 能力細胞（ＤＨ５α）を−７０°Ｃの冷凍庫から取り出し、細胞を氷 上に置き、細胞を溶かす。 ２． 氷上のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ^TMチューブに入れ、冷やす。細胞が解けた ならば、２００μｌの能力細胞を冷やしたチューブのそれぞれに加える。チュー ブの数は、形質転換の数に該当する。用いない細胞は全て、ドライアイス／エタ ノールバス中で５分間再凍結させ、−７０°Ｃの冷凍庫に戻す。 ３． それぞれの連結反応物（２０μｌ）の全てを、２００μｌの細胞を含 むチューブのそれぞれに加える。穏やかに混合する。 ４． 対照として、形質転換効率を試験するために、ＢＲＬによって提供さ れる５μｌの０．１ｎｇ／μｌ（即ち０．５ｎｇ）の対照ｐＵＣ１９ＤＮＡもま た、５０μｌの能力細胞に加える。 ５． 細胞を氷上で３０分間インキュベートする。インキュベーションの１ ５分後、細胞を穏やかに混合する。 ６． 細胞を、３７°Ｃで１分間、熱処理する。この時、振とうしてはなら ない。 ７． 細胞を氷上に２分間置く。 ８． ８００μｌのＬＢ培地を加える。 ９． ２２５ｒｐｍで１時間、３７°Ｃで振とうし、アンピシリン耐性を発 現させる。 １０． その間に、適当な数のＬＢ−Ａｍｐプレートを冷保存から取りだし、 ２０μｌの５０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ＧＡＬおよび１００μｌの１００ｍＭ ＩＰＴ Ｇをそれぞれのプレート上に加えて広げる。 １１． インキュベーションの１時間後、ミクロ遠心間中の細胞（ｐＵＣ１９ 対照細胞を含むチューブを除く）を、１分間遠心分離することにより、ペレット 状にする。上澄み液をデカントにより除く。 １２． 細胞のペレットを１００μｌのＬＢに再懸濁する。 １３． Ｘ−ＧＡＬおよびＩＰＴＧを含むＬＢ−Ａｍｐプレート上に５０μｌ の懸濁液をそれぞれ塗布する。１ｍｌのｐＵＣ１９対照形質転換株１０μｌを塗 布する。 １４． プレートを一晩３７°Ｃにインキュベートする。 Ｅ． ＰＣＲによる挿入物の特徴付け １． 滅菌した爪楊枝で、白色コロニーをつつき取り、それと共にＰＢ−Ａ ａｍｐプレートに軽く触れ（決して筋を付けない）、いくつかの細胞をプレート 上に移す。 ２． 即座に、同じ爪楊枝を、２５μｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０． １ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ^TMチューブ内に浸す 。爪楊枝を振とうして、細胞を懸濁させ、その後、爪楊枝を捨てる。 ３． 新しい爪楊枝でＬＢ−Ａｐｍプレート上にパッチした細胞を筋状にの ばす。プレートを一晩３７°Ｃでインキュベートする。 ４． ブンゼンバーナー枠上の沸騰水の入ったビーカー内にそれを入れるこ とにより、５分間、緩衝液に懸濁した細胞を沸騰させる。 ５． ミクロ遠心管内で、１分間細胞片を回転させて落とす。 ６． ＰＣＲ反応を行うために、ミクロタイター皿の穴に、３μｌの上澄み 液を移す。 ７． ＰＣＲ反応用に、２０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物；２．７４μ ｌの万能プライマー（１ｍｇ／ｍｌ）；２．３３μｌの逆転プライマー（１．１ ｍｇ／ｍｌ）；１００μｌの１０ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；１０μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｍ ｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；およびｄＨ₂Ｏを１ｍｌにな るように（即ち８６４．９３μｌ）加えて：一緒にすることによって、マスター 混合物を調製する。 ８． ４７μｌのＰＣＲ用マスター混合物を、３μｌの沸騰させた細胞溶菌 液を含むミクロタイター皿のそれぞれの穴に加える。 ９． 混合して、鉱油で覆う。 １０． ミクロタイター皿をＰＣＲ機に入れ、最初に９５°Ｃに５分間インキ ュベートし、次に９４°Ｃに１０秒間；５４°Ｃに３０秒間；および７２°Ｃに ３０行間を３０サイクルさせることによって、ＰＣＲ反応を行う。 １１． ＰＣＲ反応物に負荷染料を加え、１２３ｂｐのＤＮＡマーカー（２μ ｌ）と共に、２％アガロースゲル上に負荷する。 １２． ゲルを試験し、バンドが予想されたサイズであることを確認する。 ２２０ｂｐのベクター配列が挿入配列に加えて増幅され、その結果ゲル上のバ ンドの予想サイズは、ＤＤのバンドサイズに２２０ｂｐを足したものに等しいこ とに注目のこと。適切なサイズの挿入物を含むらしいそのようなクローンは、そ の後、配列決定する。 Ｆ． 細菌コロニーのＰＣＲ配列決定 このプロトコールには、新鮮なコロニー（即ち１から２日齢のプレート）を用 いねばならない。 １． 形質転換株の挿入物の特徴を調べる方法にあるように、コロニーを滅 菌した爪楊枝でつつき、細胞を２５μｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に、再懸濁する。しかしながら、この時、細胞は、 形質転換プレートの筋を付けたコロニーを含むプレートからつつき取られ、最初 の形質転換プレートからではない。 ２． 細胞を５分間沸騰させ、氷上に置き、細胞デブリを１分間ミクロ遠心 分離で遠心沈殿させる。 ３． 配列決定を行うために、上澄み液１０μｌを新しいＥｐｐｅｎｄｏｒ ｔ^TMチューブに移す。 ４． 上澄み液１０μｌに、１μｌの１ｍＭ万能プライマー（１ｐｍｏｌ） ；４μｌの１０ｘ配列決定用緩衝液；１μｌ（１０ｍＣｉ）の［α-³²Ｐ］−ｄ ＡＴＰ；１μｌ（２Ｕ）のＴａｑポリメラーゼ、および３０μｌになるように（ 即ち１３μｌの）ｄＨ₂Ｏを加える。 ５． ３μｌの４つのｄｄＮＴＰ（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）のそれぞれの混合物を 、行われる配列決定反応の数に従って、ミクロタイター皿の穴に加える。 ６． ３μｌのｄｄＮＴＰを含む４本の終止チューブのそれぞれに、段階４ からの配列決定用反応混合物７μｌをアリコートする。混合し、一滴の鉱油を上 積みする。 ７． 以下の条件下、ＰＣＲ機内で反応を行う：９５°Ｃで５分間インキュ ベーションし、次いで、９５°Ｃで３０秒；６０°Ｃで３０秒；および７２°Ｃ で１分間を３０サイクルさせる。 ８． 反応が完全に行われたならば、それぞれの穴に５μｌの停止混合液を 加える。 ９． ＰＣＲ機中で、サンプルを９５°Ｃに５分間保つことにより熱変性さ せ、６％アクリルアミド配列決定用ゲル上に５−６μｌを負荷する。 １０． キシレンシアノール染料の先端がゲルの底部からおおよそ５ｃｍにな るまで、ゲルを泳動し、そうすることによって、ＨｉｎｄIIIサイトに該当する 配列は、ゲルの底部近くにくるであろう。 Ｇ． バンドのクローンからのＤＮＡ配列の分析 １． クローン内のＨｉｎｄIIIサイトの配列の位置を決定し、これにより 、挿入配列の始まり位置を決定する。ベクター配列の存在を確認する。 ２． 異なるコロニーをスキャニングして、その他のコロニーと対合してい ないかを見る。また、配列は、以前にアクリルアミドスライスから直接的に決定 した配列と対合しているかについて比較する。ミニ調製分析で以前に行った配列 決定と対合するクローンをつつく。 配列決定は小スケールでのプラスミド調製（「ミニ調製」”ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｓ”）からのプラスミドでできるので、この段階では、配列を詳細に読み記録す る必要はない。そのかわりに、差別的に発現されるべきクローンを決定するため に、比較の目的で配列をスキャニングする。 アクリルアミドスライスから直接決定された配列は、配列決定用プライマーと して、５’−差異表示プライマーを用いて得られた。それ故、これらの配列決定 は、バンドの５’末端より行われる。この方法でクローン化したバンドを、ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に、間接的に挿入する。それ故、万能プライマーから得ら れた配列の決定は、５’末端あるいは３’末端から始めることができる。Ｈｉｎ ｄIII部位のすぐ後に、（３’−末端のポリＡ尾に相補的な）長くのびたＴ残基 が存在するか否かによって、どちら側の末端から配列決定しているかを、識別す ることができる。Ｔの広がりは、遺伝子の３’−末端が読まれていることを示し 、これに対して、それがなかったら、遺伝子の５’−末端が読まれていることを 意味する。もし遺伝子の５’末端が読まれているならば、この配列は、ゲルから 得られた以前に誘導されてた配列と直接比較することができる。しかしながら、 もし３’末端が読まれている場合、配列は、ゲルより誘導した配列と比較するた めに、「逆転」させなければならない。クローンは、５’末端配列を得るために 、逆転プライマーで「もう一方の末端」から配列決定されねばならず、そうする ことによって、直接比較することができる。 配列情報がゲルより直接的に得られなかった（即ち、表２の「未知」のジーン タグ）場合には、示差表示バンドに該当する配列が最初は分からないことを除い て、上記の段階１および２を行う。この場合、配列が合うものを探して、ミニ調 製分析で最も頻繁に現れる配列をつつかなければならない。このことは、ミニ調 製の一つより多いバンドをつつき、ノーザン分析によって試験して差異表示バン ドを決定することを意味する。 Ｈ． アルカリ溶解ミニ調製法 この方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ、Ｆ ｒｉｔｓｃｈおよびｍａｎｉａｔｉｓ、１．２５−１．２８）第一巻に記載され た方法を応用している。 １． ５ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ（５ｍｌのＬＢ−Ａｍｐは、最終濃度が１００ μｇ／ｍｌになるように、５μｌの１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含まなくて はならない）中の興味あるプラスミドを含む細胞を一晩培養し、調製する。 ２． １．５ｍｌの培養液を新たなＥｐｐｅｎｄｏｒｆ^TMチューブに移し、 １分間、ミクロ遠心分離することにより、細胞をペレットにする。さらに１．５ ｍｌの培養液を同じチューブに移し、これらの細胞をペレットにし、そうするこ とによって、チューブは併せて３ｍｌの培養液からのペレットを含む。 ３． 簡単に渦巻き攪拌させて、１００μｌの溶液１．にペレットを再懸濁 する。 ４． ２００μｌの１％ＳＤＳ、０．２Ｍ ＮａＯＨを加える、この溶液は 、２０％ＳＤＳおよび１０Ｍ ＮａＯＨの保存溶液より、（使用直前に）新たに 調製しなければならない。逆さまにして穏やかに攪拌し、細胞を再懸濁する。氷 上に５分間置く。 ５． １５０μｌの溶液３．を加える。逆さまにして穏やかに攪拌し、氷上 で５分間インキュベーとする。 ６． 溶液を、ミクロ遠心分離で、２−４分間、遠心分離する。 ７． 上澄み液を新しいチューブに移し、ペレットを捨てる。チューブにフ ェノール／クロロホルム（４００μｌ）を加えて、２０秒間手で振とうし、次い でチューブを２分間遠心分離して、上澄み液をフェノール／クロロホルムで抽出 する。最上部（水）層を新しいチューブに移す。 ８． １ｍｌの１００％エタノールを溶液に加え、混合する。 ９． ミクロ遠沈で１０分間遠心分離することによって、ＤＮＡをペレット 状にする。 １０． 上澄み液を取り除く。ペレットに２００μｌの７０％エタノールを加 えてペレットを洗い、ミクロ遠沈で２分間遠心分離する。 １１． 上澄み液を真空吸引で除き、ＥｔＯＨを全て取り除くことを確かにす る。 １２． ペレットを５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解する。 １３． １μｌのＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼの存在下（５００μｇ／ｍ ｌ−３ｍｇ／ｍｌの濃度が適当である）、ＨｉｎｄIIIで８μｌを消化する。 １４． ２％の低融点アガロースゲル上に、全消化物を泳動させ、（１２３ｂ ｐマーカーを用いて、）挿入物が適切なサイズであることを確認する。ゲルから バンドを切り出し、バンドをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ^TMチューブ内に入れる。次いで 、このバンドを用いて、ノーザンブロットをスクリーニングするためのプローブ を調製することができる。 実施例８ 既知遺伝子からのオリゴヌクレオチドプローブの作製 老化関連と推定される遺伝子またはジーンタグが同定された場合、上で考察し たように、ノーザン分析または使用位置でハイブリダイゼーションすることによ り、遺伝子またはジーンタグが老化関連であることを容易に確認することができ る。しかしながら、これらの両方法のために、プローブは、比較的特異的である ことが要求される。なぜなら、もし、プローブが、細胞のＲＮＡ集団にむしろ豊 富に存在する配列とハイブリダイズするならば、その集団中のＲＮＡへのプロー ブのハイブリダイゼーションを含む任意の方法の結果は、曖昧である。結果とし て、最初に、ノーザンブロットまたは使用位置でのハイブリダイゼーション実験 を行う前に、プローブ配列の特異性をチェックすることは、有用である。 老化関連と推定される遺伝子が既知である場合、既知配列から多様な合成オリ ゴヌクレオチドプローブを容易に調製することができる。典型的には、そのよう なプローブは、長さ２０−６０のヌクレオチドであり、特異性のためにはより長 いプローブが望ましい。そのようなプローブの特異性は、都合の良いことに、ゲ ノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションによって、分析することがで きる。もしプローブが数本のバンド（５より少なく、望ましくは３より少ないバ ンド）とハイブリダイズするのみであれば、そのプローブは、遺伝子が老化関連 であることの確認に、また、化合物が老化細胞内の老化関連遺伝子の発現レベル に影響するか否かを決定するためのスクリーニングに用いるに、充分特異的であ る。 既知遺伝子からオリゴヌクレオチドプローブを調製するために、キナーゼ反応 法により、プローブを放射能標識で標識すると好都合である。２０μｌのキナー ゼ反応を調製するために、６００ｎｇのオリゴヌクレオチド（１００ｎｇ／μｌ の４０マーのオリゴヌクレオチド溶液、６μｌ）を用い、次の成分：７μｌの水 ；２μｌの１０ｘＯｎｅ−ｐｈｏｒ−ａｌｌ^TM緩衝液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）； ２μｌのＰｈａｒｍａｃｉａ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ；および５μｌの γ−³²Ｐ−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）：を加える。反応混合物を３７° Ｃで３０分間インキュベートし、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓ−２００ Ｓｅｐｈａ ｃｒｙｌ^TMスピンカラム上で標識したプローブを精製する。 以下の実施例は、新規遺伝子のジーンタグからプローブを調整するための方法 について記載しており、また、実施例１０および１１は、プローブハイブリダイ ゼーションの特異性をチェックするために、サザン分析を行う方法について記載 している。 実施例９ ＥＤＤクローン化バンドよりのプローブの作製 老化関連と推定される遺伝子として新規の遺伝子のジーンタグを同定した場合 、プローブの設計に用いるために、ジーンタグ配列のみを最初に手に入れること ができる。ジーンタグ配列が特異性の高いプローブとして用いることができるか 否かを迅速に分析するために、プラスミドをＨｉｎｄIIIで消化し（プラスミド は、 実施例７記載の方法に従って調製する）、得られたフラグメントを（実施例７記 載の方法に従って）低融点アガロースゲルで分離し、さらにバンドを次に記載す る方法に従ってゲルから分離除去することによって、ジーンタグクローンから、 プローブを好都合に調製することができる（実施例７参照のこと）。 １． １０−１５μｌのゲルスライスを６５°Ｃで２分間融解させる。 ２． １０μｌの２０μＭ５’−プライマーおよび１０μｌの２０μＭ３’ −プライマーを、ゲルスライス溶液に加える。 ３． この溶液を１００°Ｃに１０分間加熱し、その後氷上で急速に冷却す る。 ４． 次いで、２μｌのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）；１．５μｌのクレノー 酵素；および、プライマーもｄＣＴＰも含まない、１０μｌの５ｘオリゴヌクレ オチド標識化緩衝液を加える。５ｘ標識化緩衝液は、２５０ｍＭトリス（ｐＨ８ ）；２５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂；５ｍＭのβ−メルカプトエタノール；２ｍＭのｄＡ ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ；１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．６）；および５μｌの α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加える。 ５． この溶液を３７°Ｃで３０分間インキュベートする。 ６． もしゲルスライスが個体状であれば、この溶液を簡単に加熱して、ゲ ルスライスを融解し、次いで、標識化したプローブを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓ −２００スピンカラムで精製する。 実施例１０ ゲノム消化、ゲル電気泳動、およびサザン分析のための転移 ノーザン分析または使用位置でのハイブリダイゼーションに用いるためのプロ ーブの特異性をチェックするために、プローブを制限酵素で消化したゲノムのＤ ＮＡとハイブリダイズさせることができる。ゲノムＤＮＡを調製するために、最 初にヒトのゲノムＤＮＡを任意の様々な標準法によって単離（または購入）し、 次いで、ＤＮＡを制限酵素で消化する。最良の結果を得るために、制限酵素消化 は、６塩基の配列を認識する様々な異なる制限酵素、即ち、ＨｉｎｄIII，Ｅｃ ｏＲＩ、およびＢａｍＨＩ、で行う。 制限消化条件は、１０μｇのヒトゲノムＤＮＡ、５０μｌの１０ｘ制限酵素緩 衝液、および５μｌの制限酵素を含む、全５００μｌの反応容量であり、反応は 、３７°Ｃで３０分間インキュベートすることにより行い、その時点でさらに５ μｌの酵素を加え、反応を６時間続ける。消化されたＤＮＡは、５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび１ｍｌの１００％冷エタノールを加えて沈殿させ、室温、 １４Ｋで１０分間遠心分離する。エタノールを吸引し、ＤＮＡペレットを２０分 間空気乾燥させるか、あるいは、ＤＮＡを急速真空遠心分離で１０分間乾燥させ る。４°Ｃで一晩インキュベーションすることによりＤＮＡを２０μｌの水に再 懸濁する（ペレットは、再懸濁するためにより多くの時間を必要とするであろう ）。 ０．８％のアガロースゲルを調製するために、２．４ｇのアガロースを３００ ｍｌの０．５ｘＴＢＥ緩衝液に加える。３μｌの負荷染料をそれぞれのサンプル に加え、０．８％アガロースゲルにサンプルを負荷する。ゲルは３５Ｖで６時間 泳動する。より低い電圧およびより長い泳動時間は、制限フラグメントバンドを 細くしまらせる。臭化エチジウムで染色した後、ゲルの写真を撮る。ゲルをブロ ットするために、ゲルは、０．６Ｍ ＮａＣｌおよび０．４Ｍ ＮａＯＨ内に、 １０分間、室温で浸す。運搬溶液は、浸液と同じである、ゲルをろ紙芯上にひっ くり返して置く。一枚のＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｈｕｅｌｌ膜を大きさに 合わせて切り、ゲル上に、粗い側を下にして置く。二枚のろ紙をこの膜の上に置 き、さらに一山のテリワイプ（ｔｅｒｒｉｗｉｐｅ）を上に置き、テリワイプが 沈むように重さをかけて加圧する。緩衝液容器をサランラップで覆い、一晩転移 を続けさせる。 転移後、膜を５ｘＳＳＣ緩衝液に５分間浸し；次いで、過剰の液体を除く。Ｓ ｔｒａｒａｌｉｎｋｅｒ^TMのライトボックス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に膜を ＤＮＡ側を上にして置き、１２００ｋＪ（自動架橋モード）で架橋する。平らに なったゲルをチェックし、ゲル内にＤＮＡが残されていないことを確認する。 実施例１１ サザンハイブリダイゼーションおよび洗浄条件 Ａ． ハイブリダイゼーション 次のプレハイブリダイゼーション溶液を用いて、６０°Ｃで２時間ブロットを プレハイブリダイズする：５ｘＳＳＣ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍより購入した２０ｘＳＳＣより）；１ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ［５０ｘは、５ ｇのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（タイプ４００、Ｐｈａｒｍａｓｉａ）を含む ］；５ｇのポリビニルピロリドン；５ｇのＢＳＡ（フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ ）；および水で５００ｍｌとし、この保存溶液は、４ｍｌのコーニングチューブ 内に配分して−２０°Ｃで保存しなくてはならない）；０．１％のＳＤＳ；０． ０５％のピロリン酸ナトリウム（５％の保存溶液から薄めて用いる）および１５ ０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精液。２時間プレハイブリダイゼーションインキ ュベーションの後、溶液を全て取り除き、プレハイブリダイゼーション溶液と同 じ溶液に１０％の硫酸デキストランを加えた、ハイブリダイゼーション溶液で置 き換える。プローブを数分間沸騰させ、氷上で簡単に急冷させ、次いで、ハイブ リダイゼーション溶液に浸すブロットにこの溶液を加える。ブロットを二重に袋 に入れ、ハイブリダイゼーションを６０°Ｃで一晩続行させる。 Ｂ． 洗浄条件 ハイブリダイゼーション後、プローブを集めて、１５ｍｌのコーニングチュー ブ内に室温で蓄えておく。５μｌのこのプローブ溶液を、シンチレーションカウ ンターで計数する。ブロットは、次の溶液中：３ｘＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ；お よび０．０５％ピロリン酸ナトリウム：で２回、室温でリンスする。あらかじめ ６０°Ｃに前加熱しておいたこの溶液で、６０°Ｃ、１５分間洗浄を４回行う。 Ｃ． 分析 サザンブロットをプローブし洗浄した後、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒ^TM分析 （Ｍｏｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）またはオートラジオグラフによっ て、プローブが膜上のどこにに結合している決定するために、ブロットを分析す る。ノーザン分析または使用位置でのハイブリダイゼーションに用いるに適当な 特異性を持つプローブは、プローブが数本（５より少なく、望ましくは３より少 ない）のバンドのみとハイブリダイズするハイブリダイゼーションパターンによ って同定される。 実施例１２ ノーザン分析のためのＲＮＡアガロースゲルの変性 ホルムアルデヒドゲルを作製する場合、常に、焼いたガラス器具、保護用の手 袋、およびＤＥＰＣ−水を用いる。ゲルを調製するために、１４０ｍｌのＤＥＰ Ｃ−Ｈ₂Ｏ（１０００ｍｌの脱イオン水に１ｍｌのＤＥＰＣを加えると、結果と して０．１％のＤＥＰＣ溶液が得られ、得られた溶液は、フード内で数時間攪拌 しながら加熱し、高圧滅菌する）に２ｇのアガロースを加え、得られた溶液は、 ５００ｍｌのフラスコ中で、おおよそ３分間沸騰させ、次いで、溶液を６０°Ｃ の水浴中に置き、平衡化させる。フード内に置いた焼けたエーレンマイヤーフラ スコ内のホルムアルデヒドに数グラムの混合ベッド樹脂（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を加 え、攪拌棒でおおよそ５分間混合し、次いで、３ＭＭの円形Ｗａｔｍａｎｎ^TM紙 で覆った漏斗を通してこの混合物を注ぐことによって樹脂をろ過で除くことによ って、６５ｍｌの３７％ホルムアルデヒドを脱イオンし、そうしたホルムアルデ ヒドは、その後容易に用いることができる。 次に、６０°Ｃにインキュベートしたアガロース／水溶液に４４ｍｌの５ｘ泳 動用緩衝液を加える。５ｘ泳動用緩衝液は：ｐＨをＮａＯＨまたは酢酸のいずれ かを用いて調製し、アルミホイルで覆った瓶の中に室温で保存される、０．５Ｍ の保存溶液から調製される、０．１ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７）；４０ｍＭ酢酸ナト リウム；および５ｍＭ ＥＤＴＡから構成される。次いで、４０ｍｌの３７％脱 イオン化したホルムアルデヒドを加え、溶液を良く攪拌し、さらにゲルをフード 内でそそぎ込む。フード内で、ゲルを、１５０ボルトで５分間、前泳動する；ゲ ルボックスを取り扱うときは常にグローブを着用する。 サンプルは、次のように調製する。負荷前に、２μｌの５ｘ泳動用緩衝液；３ ．５μｌの脱イオンしたホルムアルデヒド；および１０μｌのホルムアミドと混 合した、典型的には、レーン当たり２０μｇ（４．５μｌ）のＲＮＡを負荷する 。、この混合物を６５°Ｃで１５分間加熱し、次いで、簡単に遠心分離して、チ ューブの底に混合物を収集する。２μｌの１０ｘ負荷用緩衝液（５０％のグリセ ロール；１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８；０．２５％ブロモフェノールブルー；０． ２５％のキシレンシアノールＦＦ：からなる）をそれぞれのサンプルに加える。 λ− ＨｉｎｄIII標準は、レーン当たり１μｇのＤＮＡを用い、上述のように（変性 させる）同じ方法で調整する。サンプルをゲル上に負荷し、さらに、フード内で ゲルを８０ボルトで３から４時間泳動させる。ゲルの泳動を中途で止め、ゲルを 軽く振とうし、緩衝液を循環させ、新しい緩衝液を加える。ゲルが完成した後、 ゲルをＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏ中で三回洗浄し、それぞれの洗浄の最後１０分間で、ホ ルムアルデヒドのほとんどが除かれる。ゲルを、ゲル型トレー内でリンスする。 λ−ＨｉｎｄIIIレーンをその次のＲＮＡレーンと共に切り出し、臭化エチジ ウムで目に見えるように染色する。エチジウム染色を行うために、ゲルスライス はＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏで満たしたゲル型トレー内に入れ；数滴の５ｍｇ／ｍｌの臭 化エチジウムをトレーに加え；２０分間室温で染色し、ＤＥＰＣ−Ｈ₂Ｏで１０ 分間の洗浄を二回行い、一晩冷蔵庫内で水中に置き、完全に脱染し；さらに、ゲ ルを、目に見えるように、ライトボックス上、物差しの横に置く。口径を８にセ ットし、時間を０．２５秒にセットして、写真を撮る。ゲルの残部を取り、０． ４５μｍのポアサイズの正に荷電したナイロン膜、”Ｎｙｔｒａｎ＋Ｍａｘｉｍ ｕｍ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ”（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ） に、ゲルをブロットする。 次に、転移装置を組み立てる；膜は前もって湿潤させておく必要はない。膜を ゲル上に置き；次いで、２枚の３ＭＭワットマンろ紙を膜の最上部に置き、一山 のテリタオルをろ紙の上に置き、さらに、タオルの上に重い重石を置く。転移用 緩衝液は、２ＯｘＳＳＣであり、転移は一晩続けて行わなくてはならない。膜に 鉛筆またはボールペンで印を付け、膜を５ｘＳＳＣで数分間洗浄し、さらに、膜 をろ紙で軽くブロットする。ＲＮＡを膜と連結させるために、Ｓｔｒａｔａｌｉ ｎｋｅｒ^TM（自動連結様式、１２０ｍＪ／ｃｍ²）ライトボックスを用いる。膜 は、一枚のろ紙上に、ＲＮＡ側を上にして、光の下に置く。 実施例１３ ノーザンハイブリダイゼーションおよび洗浄条件 ５０％ホルムアミド；５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ；０．５％ＳＤＳ；５ｘＳＳ ＰＥまたはＳＳＣ；および１００μｇ／ｍｌのサケ精液ＤＮＡからなるハイブリ ダイゼーション用溶液を用いて、ブロットは、少なくとも３０分間、４２°Ｃで プレハイブリダイゼーションする。サケ精液ＤＮＡは、それをハイブリダイゼー ション用溶液に加える前に、沸騰させてそのＤＮＡを変性させる。ハイブリダイ ゼーション用溶液を再使用するならば、ブロットの溶液に加える前に、溶液を２ 分間沸騰させ、氷上で急速に冷却する。プローブ（ＤＤバンド）を沸騰させた後 、プローブをブロットに加え、ブロットとハイブリダイゼーション溶液を二重の バッグに入れ、さらに、ブロットを４２°Ｃに一晩インキュベートする。 ハイブリダイゼーション後、プローブを集め、（さらに再使用できる；室温で 保存する、）さらにブロットを、１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳからなる溶液 内、室温で二回リンスする。次いで、６５°Ｃで３０分間、二回行われる洗浄は 、同じ（新しくはない）洗浄溶液を用いて行われ、非特異的結合プローブを洗い 流し、特異的に結合したプローブのみを残す。 上記したように、ノーザン分析法は、ジーンタグまたはプローブが老化関連遺 伝子を特異的に同定することができることを確認するために用いることができる 。代わりに、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｂｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｍ ｅｄｉａｔｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（逆 転写酵素仲介ポリメラーゼ鎖反応）をこの目的のために用いることもできる。遺 伝子およびジーンタグが、組織培養中の細胞の老化関連遺伝子であることを確認 した後、若年および老齢の提供者からの組織を用いて、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｓｕｒ ｅｓｉｔｅ^TMIIシステムマニュアル、上記、に記載した方法のように、使用位置 でのハイブリダイゼーション法によって、生体内で、遺伝子が老化に関連するす ることを確認することができる。 プローブが、老化関連遺伝子に特異的であると同定されたことが一端確認され たならば、ノーザン分析法またはＲＴ−ＰＣＲを用いて、化合物が、老化細胞内 の老化関連遺伝子の発現パターンを逆転させる、部分的に逆転させるまたは緩和 することができるか否かを同定することができる。一端そのような化合物が同定 されたならば、処理した動物からの組織を使用位置でのハイブリダイゼーション 法で分析することによって、化合物が生体内で活性を持つか否かについて決定す ることができる。使用位置での方法はまた、生体内で老化関連遺伝子を同定する ことが確認された本発明の老化関連遺伝子プローブを用いて、組織内での老化細 胞または若年細胞を同定するために用いることができる。 実施例１４ β−ガラクトシダーゼスクリーニング Ａ． 一次スクリーニング 老化細胞を、ＤＭＥＭ培地＋１０％子牛血清（ＢＣＳ）を含む９６穴のプレー トに、１０，０００から２０，０００細胞／穴になるように種付けをする。２つ の望ましい実施態様では、老化したヒト胎児性肺繊維芽細胞（ＩＭＲ９０）は、 継代倍加レベル（Ｐａｓｓａｇｅ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）（ＰＤＬ） ５３で用いられ、またはヒト包皮から誘導した老化繊維芽細胞系（ＢＪ細胞）は 、ＰＤＬ９２で用いられる。適当な培地内の、他の老化細胞もまた、用いること ができる。６時間後、培地を取り除き、ＤＭＥＭ＋０．５％ＢＣＳで置き換える 。３日後、培地を新しい培地に置き換え、サンプルまたはそのベヒクルを加える 。望ましい実施態様では、ＤＭＳＯ（最終濃度１μＭ）内に溶解させた２μｌの サンプル、またはＤＭＳＯのみ２μｌを、２００μｌの培地に加える。その他の 容量、ベヒクル、および化合物濃度もまた用いることができる。その他の容量、 ベヒクル、および化合物の濃度もまた用いることができる。さらに、単一化合物 よりむしろ、化合物の混合物を細胞に加えることもできる。４日（またはその他 の適当なインキュベーション時間）の後、培地を再び取り除き、細胞を固定し染 色する。 細胞を固定化するために、培養液を除き、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で置き換 える。これ、およびその他の液体の全ての置き換えは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉ ｃｒｏｌａｂ ２０００^TMピペッティングステーション（ｐｉｐｅｔｉｎｇ ｓ ｔａｔｉｏｎ）を用いて行うことができる。その他のピペッティングステーショ ンまたは手動式ピペッティングもまた用いることができる。次いで、ＰＢＳを取 り除き、再び、ＰＢＳで置き換える。ＰＢＳを取り除き、新しく調製した固定化 溶液（０．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ）で置き換える。細胞をこの混合液 中で２分間、室温でインキュベートする。固定化溶液を取り除き、ＰＢＳに置き 換える。ＰＢＳを新しいＰＢＳと置き換え、細胞をさらに１０分間、室温でイン キュベートする。細胞を固定化するその他の方法もまた、用いることができる。 細胞を染色するために、１００μｌのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、濃度５０ｍｇ／ｍｌのジメチルホ ルムアミド、Ｐｒｏｍｅｇａ、ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、１０ｍｌの染色用緩 衝液（蒸留水中、４０ｍＭクエン酸／Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液ｐＨ６、５ｍＭヘキサ シアノ鉄（II）酸カリウム、５ｍＭヘキサシアノ鉄（III）酸カリウム、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、および２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）に加える。Ｘ−ｇａｌは、その他 の基質と共に、適当な緩衝液に溶解したβ−ガラクトシダーゼに置き換えること ができる。ＰＢＳを取り除き、充分容量の染色溶液（５０μｌが日常的に用いら れる）で置き換えて、細胞を覆う。ミクロタイタープレートは、湿らせた容器で 覆い、密閉し、インキュベーター内、３７°Ｃに一晩置く。プレートをピペッテ ィングステーションとインキュベーターの間への移動は、手動、またはロボット ［例えば、Ｚｙｍａｒｋ ＸＰ（ＴＭ）］のどちらかで行うことができる。 一晩インキュベーションした後、染色強度を、例えば、５４０ｎＭの波長のプ レートリーダー（Ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて、測定する。また、定量 化は、顕微鏡を用いて、または像分析システムの助けを借りて行うことができる 。試験化合物存在下での染色強度の減少は、老化表現型の逆向を示唆する。この 効果を作り出すサンプルを、二次アッセイで試験する。プレートは、密封して、 ４°Ｃで、無期限に保存することができる。 Ｂ． 二次スクリーニング 老化細胞で染色の減少が見られたサンプルは、次に、若年細胞で染色を減少さ せる能力について試験する。２つの望ましい実施態様では、若年ＩＭＲ９０細胞 を３５より低いＰＤＬで用いる、または、若年ＢＪ細胞を５５より低いＰＤＬで 用いる。他の若年細胞もまた、適当な培地中で、用いることができる。二次スク リーニングには、２つの修飾を加えるが、老化細胞を用いてスクリーニングした のと同じ方法を用いて行う。第一に、老化細胞と言うよりはむしろ若年細胞を用 いる。第二に、染色用緩衝液を、ｐＨ６よりむしろｐＨ４に調製する。老化細胞 ではβ−ガラクトシダーゼ染色が減少するが若年細胞では減少しないことが、老 化表現型の逆転現象と解釈される。 老化関連特異的遺伝子の発現を変化させる化合物のその他の高効率スクリーニ ングには、フィブロネクチン、コラーゲン１（α１および３）、およびエラスチ ンのスクリーニングが含まれる［Ａｈｍｅｄら、１９９２、「チオバルビツール 酸法を基本にしたグリコシル化コラーゲンの比色ミクロアッセイ」（”Ａ ｃｏ ｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｌｙｃａｔｅｄ ｃ ｏｌｌａｇｅｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｉｏｂａｂｉｔｕｒｉｃ ａ ｃｉｄ ｍｅｃｈｏｄ”）、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．，２ １２：１３３−１３９；ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＥｌｌｉｏｔ、１９９１、「可 溶性エラスチンのための染料結合アッセイ」（”Ａ ｄｙｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｌａｓｔｉｎ”）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９：３８８Ｓ；Ｃｌａｒｋら、１９９２、「ヒト繊維 芽細胞コラゲナーゼに対するモノクローナル抗体および全コラゲナーゼを測定す るための酵素結合イムノソルベントアッセイの設計」（”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ｅｎ ｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｍ ｅａｓｕｒｅ ｔｏｔａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ”）、Ｍａｒｏｔｉｘ、１ ２：４７５−４８０；Ｗａｌｓｈら、１９９２、「ミクロプレートリーダーによ るコラーゲンの定量」（”Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ−ｂａｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ”）、Ａｎａｌｙｔ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．，２０３：１８７−１９０；およびＳｃｕｔｔら、１９９２、「 コラーゲン合成のための半自動化９６穴プレートアッセイ」（”Ａ ｓｅｍｉａ ｕｔｏｍａｔｅｄ，９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ａｓｓｙ ｆｏｒ ｃｏｌｌ ａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”）、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０３ ：２９０−２９４を参照のこと］。本実施例に記載のβ−ガラクトシダーゼスク リーニングと同様に、化合物が、老化関連遺伝子の活性または発現レベル（例え ば、タンパク質レベルは、ゲル分析または抗体に基づく方法によって定量するこ とができる）を修飾することができるか否かを最初に決定し、次いで、望まし くは、既知の老化関連遺伝子から、本発明の方法によって老化関連と決定された 既知遺伝子から、および本発明によって提供された以前は未知であった遺伝子か らの老化遺伝子関連ジーンタグからのプローブと共に、ノーザン分析、ＴＲＴ− ＰＣＲ、または使用位置でのハイブリダイゼーションを用いて、その化合物が老 化関連遺伝子のパネルへの修飾効果を持つか否かを決定する。 実施例１５ 老化関連遺伝子発現のスクリーニング 本発明の方法に従って、既知および新規の老化関連遺伝子のｍＲＮＡレベルへ の化合物の影響を測定するために、高効率スクリーニングの場合と同じプロトコ ールを用いて、１０または１５ｃｍのプレートで、老化細胞を増殖させる。一つ のプレートは、試験化合物と共にインキュベートし、その他のプレートは、化合 物試験ベヒクルのみとインキュベートする。４から２０日のインキュベーション の後、細胞をＧＩＴＣ中で溶解させ（ＲＮＡ単離プロトコール、上記、を参照の こと）、ＲＮＡを調製する。ＲＮＡは、ノーザン分析、またはＲＴ−ＰＣＲのよ うな、その他の適当な方法によって、本発明の老化関連遺伝子プローブを用いて 、分析する。この分析で得られた結果は、老化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル を変化させる化合物の効率を示唆するであろう。少なくとも２、望ましくは、３ から５から１０から２０またはそれより多くの、老化関連遺伝子の発現レベルが 測定されるであろう。 このように、化合物が、ＥＤＤによって同定された、または科学文献に記載さ れている、若年−および老齢−に特異的な老化関連遺伝子の発現を変化させるか 否かについて、化合物を試験して決定する。化合物が、遺伝子発現を若年のパタ ーンに完全に反転させる効果を持つならば、この化合物は、細胞老化を導く一つ の共通の機構に強い影響を与える。反転される遺伝子のグループが限定されるこ とは、様々な機構が老化に影響を及ぼすこと、また、異なる機構が遺伝子の異な るパネルに影響を与えることを、示唆している。化合物はまた、個々の遺伝子の 活性を修飾するように働くこともでき、このことは、共通の機構が存在しないこ とを示唆している。 老化関連遺伝子の発現を変化させる化合物についてのその他のスクリーニング 法には、その発現が効率的にまた容易にモニターできるアルカリホスファターゼ 遺伝子のような、レポーター遺伝子からのコード配列の発現を位置付ける老化関 連遺伝子のプロモーターからなる遺伝子構築物を用いることが含まれる。そのよ うな構築物を用ると、胎児性繊維芽細胞のような非常に若年の細胞への安定な移 入剤を作り出すことができ、さらに、細胞は、最大でおよび老化を含む任意の段 階で用いて、レポーター遺伝子の発現をアップまたはダウン−レギュレーション する薬剤を同定することができた。 前述の実施例は、本発明の様々な態様、および本発明の方法を実施するための 方法について記載している。実施例は、本発明の多くの異なる実施態様の徹底的 な記載を提供するつもりではない。上に列挙した全ての文献および特許出願は、 それぞれの文献または特許出願で参照として取り入れることを具体的かつ個別的 に示唆したように、ここに参照として取り入れられる。それ故、前述の発明は、 具体的説明および理解を明快にする目的のための実施例として、詳細に記載した が、当業者らには、添付クレームの精神または範囲からはずれることなく、ある 変更および修飾をそれに付け加えることが、本発明の教えの見識の内にあること が、明らかであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年５月２４日 【補正内容】 ねばならない。３ｍｌの固定化溶液（氷冷したメタノール：無水酢酸 ３：１） をそれぞれの穴（氷上）加える。 ２． それぞれの穴から３ｍｌを取り除いて捨てる。それぞれの穴にさらに ３ｍｌの固定化溶液を加える。 ３． 段階２を２回またはそれより多く繰り返す。 ４． それぞれの穴から５ｍｌを取り除き、それぞれの穴に６ｍｌの固定化 溶液を加える。プレートを１５分間氷上に置いておき、この段階をもう一度繰り 返す。 ５． プレートからカバーグラスを取り除き、一晩または数時間空気乾燥さ せる。溶媒は完全に蒸発させなければならない。翌日染色するために、カバーグ ラスを、暗がりの中、覆いのある箱の中に保つ。カバーグラスを染色の前、一日 より長く保たなければならない場合には、カバーグラスは、Ｎ₂大気下、デシケ ーター中に凍結して保存する。 Ｃ． 免疫組織学的染色 １． ＤＮＡを変性させるために、固定化した細胞を３分間、０．０１Ｎ− ＮａＯＨで処理する。塩基で細胞を過剰処理してはならない；過剰処理すると、 細胞はカバーグラスから滑り落ちるであろう。 ２． ＰＢＳで塩基をｐＨ８．５に中和する。細胞をＰＢＳで二度洗浄し、 全ての塩基を取り除く。 ３． 細胞は、ＰＢＳ中の１．５％ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＃ Ｓ−２０００）（二次抗体を生成させた種からの血清を用いる）で、１５分間ブ ロックする。 ４． 細胞からウマ血清を取り除くために注意深く吸い出すか、またはカバ ーグラスを傾かせる。この時点でカバーグラスを洗浄してはならない。 ５． ＰＢＳ中の１％−ＢＳＡ、０．０５％−Ｔｗｅｅｎ２０で１／５００ に希釈した４００μｌの抗ブロモウリジン モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＃Ｂ−２５３１、マウスで作成、ＩｇＧ）を加え、細胞を完全に覆う。光を遮断 した湿気のある部屋の中で、室温で２時間インキュベートする。 ６． 細胞をＰＢＳで３回リンスする。 ７． ４００μｌの二次的にビオチニル化したウマの抗マウスＩｇＧ（Ｖｅ ｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＃ＢＡ−２０００）を加え、室温で光のない湿気のある部 屋に３０分間おく。抗体は、１．５％ウマ血清／ＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌに希釈 しなくてはならない。 ８． 細胞をＰＢＳで３回洗浄する。 ９． 細胞を、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ−Ｎａｃｌ、ｐＨ８．５ 中の３０ｍｇ／ｍｌの蛍光アビジンＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ａｃｉｄｉｎ Ｄ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ Ａ−２００１）４００μｌと共に、光を遮断 した湿気のある部屋の中で室温で２０分間インキュベーションする。 １０． 細胞をＰＢＳで３回洗浄する。 １１． ２ｘ標準クエン酸塩（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａ ｔｅ）（ＳＳＣ）緩衝液中に、１ｍｇ／ｍｌ濃度の４’，６−ジアミジノ−２− フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ−９５４２）を加え、５分 間核染色する。標準クエン酸溶液は、最初に、以下の方法に従って、２０ｘＳＳ Ｃを作ることによって調製する：１７５．３ｇのＮａＣｌおよび８８．２ｇのク エン酸ナトリウムを８００ｍｌの水中に溶解し；１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７． ０に調整し；さらに、水で容量を１リットルに調整し；その後、９０ｍｌの蒸留 水に１０ｍｌの２０ｘＳＳＣを加えることによって、２０ｘＳＳＣを２ｘＳＳＣ に希釈する。ＤＡＰＩの保存溶液を調製し、蒸留水に溶解した１ｍｇ／ｍｌで、 光から遮断したチューブ中に保存しておくと便利である。 １２． ＤＡＰＩを吸い出し、細胞をＰＢＳで３回洗浄する。 １３． Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ^TM（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、＃Ｈ−１００ ０）の固定媒質を用いてスライド上にカバーグラスを固定し、ＦＩＴＣの急冷を 減少させる。個定媒質は完全には乾燥しないであろうため、固定化培地を過剰に 用いてはならない。透明なツメ光沢剤を用いてスライドをカバーグラスで密閉し 、５分間乾燥させる。 １４． 蛍光顕微鏡下でスライドを見る。 Ｄ． 分裂率の計算 分裂率は、与えられた領域内の、ＤＡＰＩ標識細胞数に対するＦＩＴＣ標識細

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴィルポントウ，ブライアント アメリカ合衆国カリフォルニア州94070, サン・カーロス・グリーンブライアー・ロ ード 1371 (72)発明者 フェン，ジュンリ アメリカ合衆国カリフォルニア州94070, サン・カーロス，グリーンブライアー・ロ ード 1371 (72)発明者 ファンク，ウォルター アメリカ合衆国カリフォルニア州94587, ユニオン・シティ，メンドータ・ストリー ト 4858 (72)発明者 ウエスト，マイケル・ディー アメリカ合衆国カリフォルニア州94002, ベルモント，ウエイクフィールド・コート 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の工程： （ａ）老化細胞および若年休止細胞からｍＲＮＡを単離し、 （ｂ）別々の反応混合物中で老化細胞及び若年休止細胞からのｍＲＮＡを増幅 して増幅遺伝子産物を生成し、 （ｃ）大きさおよび／または電荷により各々の反応混合物中で増幅遺伝子配列 を分離し、そして （ｄ）工程（ｃ）において分離された増幅遺伝子配列を分析して、老化細胞か ら観察されたのとは異なるレベルで存在する若年休止細胞および若年分割細胞か らの増幅遺伝子配列を同定する ことからなる、同定及び単離方法。 ２．増幅がポリメラーゼチェイン反応により行われる、請求項１記載の方法。 ３．分離が電気泳動により行われる、請求項１記載の方法。 ４．増幅工程が、以下の工程： （ｉ）少なくとも４から１２までの異なるアリコートに各々の異なるｍＲＮＡ 調製物を分注して、各アリコートに逆転写酵素および５’-Ｔ_6-12Ｒ₁Ｒ₂-３’（ 式中、Ｒ₁はＡ，ＧまたはＣであり、そしてＲ₂はＡ，Ｇ，ＣまたはＴである）に より規定される３’末端を有するプライマーからなるプライマー群から選択され るプライマーを、逆転写酵素介在プライマー伸長合成が生じ得る条件にて添加し 、そして、 （ii）工程（ｉ）で調製されたアリコートをさらに４から１２の異なる反応容 器に分割し、そして各容器にＤＮＡポリメラーゼおよび上記群のプライマーとは 異なり１０から１４のランダム配列により規定される３’末端を各々有するプラ イマーからなるプライマー群から選択されるプライマーを、逆転写酵素介在プラ イマー伸長合成が生じ得る条件にて添加する ことからなる請求項１記載の方法。 ５．分析が、ゲルから増幅遺伝子配列を物理的に取り除き、そして直接または 組換えＤＮＡベクターへのクローニング後にそのヌクレオチド配列を決定するこ とからなる、請求項１記載の方法。 ６．プライマーが表１中のプライマーからなる群から選択される、請求項１記 載の方法。 ７．ＤＮＡポリメラーゼが高温安定性ＤＮＡポリメラーゼであって、工程（ii ）がさらに、少なくとも１０サイクルのプライマーアニーリング、伸長合成およ び変性のポリメラーゼチェイン反応によりプライマーを伸長合成し、上記サイク ルは第１セットの２から４サイクルの低温プライマーアニーリングおよび第２セ ットの少なくとも６から８サイクルの高温プライマーアニーリングからなり、そ して低温プライマーアニーリングが高温プライマーアニーリングよりも少なくと も１０℃低い温度で実施される、請求項６記載の方法。 ８．表４または表６中の核酸配列からの隣接配列と同一または相補な少なくと も１２の隣接ヌクレオチド配列からなる、精製されたオリゴヌクレオチドプロー ブ。 ９．以下の工程： （ａ）相補核酸が互いにハイブリダイズする条件下で、老化関連遺伝子配列を 有する標識核酸プローブを細胞または組織中に存在するｍＲＮＡと接触させ、 （ｂ）特異的ハイブリダイゼーションが生じるか否かを測定し、そして （ｃ）ハイブリダイゼーションの発生により老化細胞と非老化細胞を相関させ る ことからなる、老化細胞を検出して非老化細胞から老化細胞を指揮寝つするため の方法。 10．標識核酸プローブが表４または表６中の核酸配列からの隣接配列と同一ま たは相補な少なくとも１２の隣接ヌクレオチド配列からなる、請求項９記載の方 法。 11．ｍＲＮＡが組織切片中にあり、そして接触工程をインサイチュにおいて実 施する、請求項10記載の方法。 12．以下の工程： （ａ）老化細胞を化合物と接触させ、 （ｂ）２つ以上の老化関連遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定することによ り老化細胞中のｍＲＮＡ発現パターンを測定し、そして （ｃ）老化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現における変化と老化細胞中の遺伝子発現 を変更しうる化合物を相関させる ことからなる、老化細胞中の遺伝子発現を変更しうる化合物を同定するために化 合物をスクリーニングする方法。 13．老化関連遺伝子が表２中の遺伝子からなる群から選択される、請求項12記 載の方法。 14．工程（ａ）の前に、第１の老化関連遺伝子産物の活性または発現レベルを 変調しうる能力に関して化合物を試験して能力を有するか否かを測定することか らなる、請求項12記載の方法。 15．工程（ｂ）が、２より多く５より少ない老化関連遺伝子のｍＲＮＡの発現 レベルを測定することからなる、請求項12記載の方法。 16．工程（ｂ）が、５より多く10より少ない老化関連遺伝子のｍＲＮＡの発現 レベルを測定することからなる、請求項12記載の方法。 17．工程（ｂ）が、10より多く20より少ない老化関連遺伝子のｍＲＮＡの発現 レベルを測定することからなる、請求項12記載の方法。 18．第１の老化関連遺伝子がベーターガラクトシダーゼである、請求項12記載 の方法。 19．第１の老化関連遺伝子がコラゲナーゼである、請求項12記載の方法。 20．第１の老化関連遺伝子がＩＦＮガンマである、請求項12記載の方法。 21．以下の工程： （ａ）ドナーから細胞を単離し、 （ｂ）若年細胞から老化細胞を分離し、そして （ｃ）若年細胞をドナーに再度導入する ことからなる、ドナーからの細胞集団の増殖能力を広げる方法。 22．さらに、工程（ｂ）の後に、細胞の複製老化を遅延させる試薬の存在下で 若年細胞を増殖させることからなる、請求項21記載の方法。 23．老化関連遺伝子産物を発現する細胞を特異的に破壊する毒性物質を提供す る工程を含む、老化関連遺伝子産物を発現する細胞を破壊する方法． 24．毒性物質が毒性基質であり、そして毒性基質が老化関連遺伝子産物により 活性化される、請求項23記載の方法。 25．老化関連遺伝子産物に、毒性基質と結合した抗体を提供することから成る 、老化関連遺伝子産物発現細胞の破壊方法。