JPH10506523A

JPH10506523A - ヒト組換えデコリンの精製方法およびグアニジウムイオンの検出方法

Info

Publication number: JPH10506523A
Application number: JP8504412A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムエス．クライグ，; ジョンアール．ハーパー，; サムディー．ヘルナンデズ，; ポールジェイ．コステル，; ジョナサンアール．パーカー，; トーマスエス．ベドビック，
Original assignee: ラホヤキャンサーリサーチファウンデーション
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 1998-06-30
Also published as: EP0772631A1; US5763276A; US5567807A; CA2194566A1; EP0772631A4; WO1996001842A1; AU2965395A; AU686841B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、実質的に純粋なヒト組換えデコリンの産生のための方法に関する。この方法は、デコリン含有細胞培養培地を、(１)第１の強アニオン交換樹脂；次いで(２)疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂；そして最後に(３)第２の強アニオン交換樹脂と接触させることによって特徴づけられる３つの別個の段階の組み合わせを包含する。工程の組み合わせ、および特定の試薬（特に、疎水性相互作用カラムからデコリンを溶出するための2.4〜３モルのGuHCl溶液）を使用することによって、本発明の方法は、ヒト組換えデコリンを精製するためのより便利で再現性のある方法を提供する。本発明はまた、試料溶液中のグアニジウムイオンの存在を検出するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト組換えデコリンの精製方法およびグアニジウムイオンの検出方法発明の背景発明の分野本発明は、一般的に、タンパク質を精製するための方法、およびタンパク質含有溶液または他の溶液中の残留イオンを検出する方法に関する。背景情報 PG-IIあるいはPG-40としても知られるデコリン(decorin)は、線維芽細胞によって産生される小さなプロテオグリカンである。そのコアタンパク質は、約40,0 00ダルトンの分子量を有する。このコアは配列決定され、そしてコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸型の一本のグリコサミノグリカン鎖を有することが知られている。デコリンのコアタンパク質のほとんどは、約24アミノ酸のロイシン-リッチな反復(LRR)の存在によって特徴づけられる。プロテオグリカンは、１つまたはそれ以上のグリコサミノグリカン鎖を有するタンパク質である。既知のプロテオグリカンは様々な機能を遂行し、そして種々の細胞位置に見出される。多くのプロテオグリカンは細胞外マトリックスの成分であり、ここでプロテオグリカンはマトリックスのアセンブリに関与し、そして細胞をマトリックスに付着させる。デコリンは、TGFβ誘導細胞増殖および細胞外マトリックス産生を防ぐために使用されてきた。従って、デコリンは、TFGβ調節活性によって引き起こされる病状(例えば、ガン、糸球体腎炎、および過剰なマトリックスによって特徴づけられる病状)を減弱させるかまたは予防するために有用である。例えば、ガンにおいて、デコリンは、ガン細胞に対するTGFβ-1の増殖刺激活性を破壊するために使用され得る。デコリンはまた、創傷萎縮(細胞外マトリックスのタンパク質が関与する)を減弱させるかまたは阻害するために有用である。ヒト組換えデコリンを発現させそして精製するための方法は、例えば、WO 90/ 00194に記載されるように、当該分野において公知である。しかし、LRRに由来するデコリンの疎水的性質を仮定すると、宿主細胞の混入物からこのプロテオグリカンを精製するためのより便利で再現性のある方法は、とらえどころのない(elu sive)ままである。 (例えば、デコリン発現チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から)ヒト組換えデコリンを発現させた後、プロテオグリカンは、本発明の精製手順によって、細胞培養培地から実質的に精製され得る。工程の組み合わせおよび特定の試薬( 特に、疎水性相互作用カラムからデコリンを溶出するための2.4〜３モルのGuHCl 溶液)を使用することによって、本発明の方法は、ヒト組換えデコリンを精製するためのより便利で再現性のある方法を提供する。現在までのところ、この方法は、既知の最も純粋なヒト組換えデコリン産物を提供する。本発明はまた、グアニジウムイオン(guanidium ion)を含有すると思われる溶液中(例えば、デコリンの上記精製スキームの場合と同様に、GuHClがタンパク質を精製するために使用されたタンパク質含有溶液中)のグアニジウムイオンの存在を検出するための新規な方法を提供する。グアニジンは、培養培地中の細胞環境からの組換えタンパク質の精製において使用される緩衝塩である。残留グアニジウムイオンは、対イオンとして、精製タンパク質と会合している。手順は、この対イオンを他のイオンで置換するよう設計されている。しかし、残留グアニジウムイオンの低い百万分率範囲での正確な測定は、分光測光のような現行の手順により実現し得ない。残留グアニジウムイオンは、医薬投与のために設計された生成物において、一般的には望ましくない成分であると考えられる。本発明は、溶液中に存在するグアニジウムイオンを検出および定量するために伝導率検出器を使用する、イオンクロマトグラフィー法を提供する。この方法は、感度が高く、再現性があり、そして高速である。百万分率範囲のグアニジウムイオンに対する高い感受性は、圧倒的濃度のナトリウムの存在下において顕著である。本発明の方法はまた、最小限の試料容量のみを必要とする利点を有し、非常にわずかの試料調製物で実施され得る。発明の要旨本発明は、実質的に純粋なヒト組換えデコリンの生産方法に関する。このデコリン精製方法は、第１に、デコリン含有細胞培養培地を、第１の強アニオン交換樹脂と、上記デコリン含有培地を約0.1〜約0.4モルの塩濃度を有する溶液中の上記樹脂に充填することにより接触させる工程、上記樹脂を、約0.3〜約0.4モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程、および結合したヒト組換えデコリンを、約0.9〜約1.2モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で溶出する工程を包含する。これに次いで、得られたデコリン含有溶出画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂と、上記デコリン含有画分を約１〜約２モルの塩酸グアニジウム(GuHCl)含有溶液中のHIC樹脂に充填することにより接触させる工程、約１〜約２モルのGuHClを含む緩衝溶液でこのHIC樹脂を洗浄する工程、および結合したヒト組換えデコリンを、約2.4〜約３モルのGuHClを含む緩衝溶液でHICカラムから溶出する工程が続く。最後に、この方法は、HIC樹脂からのデコリン含有溶出画分を約0.3モルより小さいGuHCl濃度に希釈する工程、この希釈された溶液を第２の強アニオン交換樹脂に充填する工程、この第２のイオン交換樹脂を約0.3 〜約0.4モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程、および結合したヒト組換えデコリンを、約0.9〜約1.2モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で溶出し、実質的に精製されたヒト組換えデコリンを得る工程を包含する。本発明はまた、試料溶液中のグアニジウムイオンの存在を検出する方法を提供する。この検出方法は、グアニジウムイオンを含むと考えられる試料溶液を、カチオン交換樹脂と接触させる工程、およびこの試料溶液中に存在するグアニジウムイオンを、約1.5〜約2.0のpHを有する水性緩衝溶液で溶出する工程を包含する。これに次いで、上記溶出液をカチオンサプレッサーカラムと接触させ、そして同時に上記カラムの透過膜の反対側で反対方向にサプレッサー再生溶液を流す工程、そして最後に、サプレッサーカラムと接触したイオン交換カラムからの溶出液中のグアニジウムイオンの存在を、伝導率検出器の使用により検出する工程が続く。図面の簡単な説明図１は、デコリンを発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用いて産生されたヒト組換えデコリンの核酸およびアミノ酸配列を示す。図２は、３Mおよび４M GuHCl溶液を用いてoctyl-Sepharoseカラムからの、(1) デコリンおよび(2)CHOタンパク質の溶出を比較する１対のウェスタンブロットを示す。発明の詳細な説明 PG-IIまたはPG-40としてまた知られるデコリンは、線維芽細胞により産生される小さなプロテオグリカンである。そのコアタンパク質は、約40,000ダルトンの分子量を有する。このコアは配列決定されており(KrusiusおよびRuoslahti、Pro c ．Natl．Acad．Sci．USA 、83：7683(1986))；これは本明細書に参考として援用される)、そしてコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸型の単一のグリコサミノグリカン鎖を持つことが知られている(E．Ruoslahti、Ann ．Rev．Cell Biol.、４：229-255(1988)、これは本明細書に参考として援用される)。デコリンのコアタンパク質の大部分は、約24アミノ酸のロイシン-リッチな反復(LRR)の存在により特徴付けられる。本明細書で用いられる用語「ヒト組換えデコリン」は、その最も広い意味で用いられ、ネイティブなヒトデコリンの構造、ならびに、改変されたヒトデコリンがネイティブなヒトデコリンの機能的等価物であれば、そしてさらに改変されたヒトデコリンが本発明の方法により精製されるようにネイティブなヒトデコリンに対して十分な構造的類似性を保持するのであれば、改変されたネイティブなヒトデコリンをも含む。ネイティブなヒトデコリンの機能的等価物は、例えば、構造的にはネイティブなデコリンと異なるが、ネイティブなヒトデコリンに特徴的な機能的活性に類似の機能的活性を保持するデコリンポリペプチドを含む。ネイティブなヒトデコリンの活性フラグメントは、デコリンの機能的等価物の例である。デコリンの機能的等価物はまた、改変がデコリンの機能を実質的に妨害しないのであれば、例えば、脂質または炭水化物鎖のような１つまたはそれ以上の側鎖の付加により、または側鎖のリン酸化のような化学的修飾により改変されたデコリンポリペプチドであり得る。用語「ヒト組換えデコリン」に含まれる機能的等価物の特定の例は、アミノ末端シグナル配列の全部または一部を保持する、および/またはカルボキシ末端で小さな先欠部を有するような組換えデコリン産物を含む。例えば、デコリンを発現するCHO細胞を用いて産生されたデコリンは、N-末端シグナル配列の一部、グリシン^-13〜グルタミン酸^-1(KrusiusおよびRuoslahti、前出からの番号付け)を保持し、そしてC-末端アミノ酸残基リジンを欠損し得る(KrusiusおよびRuoslaht i、前出；図１もまた参照のこと)。本明細書で用いられる用語「実質的に純粋なヒト組換えデコリン」は、実施例Ｉで記載される実験手順により得られる純度とほぼ同じレベルをいい、これは、他のタンパク質混入物および混入する核酸から少なくとも約95％純粋であり、そしてより好ましくは約99％純粋である。純度は、ゲルイメージングによりまたはデンシトメーターを用いるような、当該技術分野で公知の任意の方法により測定され得る。ヒト組換えデコリンを調製する方法は当該技術分野で公知である。例えば、WO 90/00194において、RuoslahtiおよびYamaguchiは、ヒトデコリンcDNAでCHO細胞をトランスフェクトする方法を開示している(KrusiusおよびRuoslahti、前出)。あるいは、デコリンの大規模生産は、実施例Ｉの方法により生成され得る。ヒト組換えデコリンを発現した後、このプロテオグリカンは、CHO培地のような細胞培養培地から、本発明の精製手順により実質的に精製され得る。この方法は、一般的な意味で３つの別のステージの組み合わせを含み、これは、デコリン含有細胞培養培地を、(1)第１の強アニオン交換樹脂と；次いで(2)疎水性相互作用グロマトグラフィー樹脂と；そして最後に(3)第２の強アニオン交換樹脂と接触させることにより特徴付けられる。第１の強アニオン交換樹脂：デコリン含有細胞培養培地を、最初に、第１の強アニオン交換樹脂と、(1)デコリン含有培地を約0.1〜約0.4モルの塩濃度を有する溶液中の上記樹脂に充填すること、(2)次いで、この樹脂を、約0.3〜約0.4モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄すること、および(3)結合したヒト組換えデコリンを、約0.9〜約1.2 モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で溶出することにより接触させる。本明細書で用いられる用語「塩」は、酸の水素イオンのすべてまたは一部を、１つまたはそれ以上の塩基のカチオンで置き換えることにより形成される任意の化学的化合物を意味し、そして好ましくは塩化ナトリウム(NaCl)、酢酸ナトリウムまたは塩化カリウム(KCl)のような一価の塩である。上記で定義した塩であることに加えて「溶出塩」はまた、樹脂に結合した混入物またはデコリンのいずれかを溶出し得る。例えば、約0.3〜約0.4モルの塩濃度を有する緩衝溶液を用いた洗浄は、混入物を溶出する「溶出塩」濃度である。約0.9〜約1.2モルの濃度を有する緩衝溶液を用いた溶出は、結合したデコリンを溶出する「溶出塩」である。一般に、塩は緩衝溶液中に含まれる。本明細書で用いられる用語「緩衝溶液」は、少量の酸性または塩基性物質の添加に際し、pHの実質的変化に抵抗し得る弱酸およびその共役弱塩基の混合物を含む溶液を意味する。緩衝化剤は、例えば、Na₃ PO₄、K₃PO₄、NaAc、およびTrisを含む。本明細書で用いられる用語「強アニオン交換樹脂」は、第４級アミノ基のような、広いpH範囲にわたって完全にイオン化されている正電荷を有する官能基を有するイオン交換樹脂である。強アニオン交換樹脂の例は、Q-Sepharose(Pharmaci a、Piscataway、NJ)、Poros Ｑ Strong Anion(Perceptive Biosystems、Cambrid ge、MA)、Toyopearl Super Ｑ-650M(Tosohaas、Mongomery、PA)、およびMacropr ep Ｑ(BioRad、Hercules、CA)を含むがこれらに限定されない。好ましい第１の強アニオン交換樹脂はQ-Sepharoseである。ヒト組換えデコリン含有細胞培養培地を第１の樹脂に付与する前に、阻害されるべき宿主細胞プロテアーゼに特異的なプロテアーゼインヒビターをデコリン含有細胞培養培地に添加し得る。CHO、および他の宿主細胞に対するプロテアーゼインヒビターは、ベンズアミジン、エチレンジアミノ四酢酸四ナトリウム(Na₄ED TA)、フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)およびアプロチニン(トリプシンインヒビター)である。宿主細胞がCHOである場合、プロテアーゼインヒビターは、好ましくはベンズアミジンおよびNa₄EDTAであり、そして、通常、約１ミリモルのベンズアミジンおよび５ミリモルのNa₄EDTAの濃度である。この最初のイオン交換精製からのデコリン含有溶出画分中に残存する任意のDN Aを断片化するために、この画分を、DNAaseもしくは0-4℃の低温で0.1モルの塩酸、またはDNAを断片化し得る任意の試薬で処理され得る。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂：デコリン精製方法の第２ステージは、上記の手順により得られた結果のデコリリン含有溶出画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂と、(1)デコリン含有画分を、約１〜約２モルGuHClを含有する溶液中のHIC樹脂に充填すること、(2)このHIC樹脂を、約１〜約２モルのGuHClであって、このGuHCl濃度は先の充填工程で用いられるGuHCl濃度より高い緩衝溶液洗浄すること、および(3)結合したヒト組換えデコリンを、約2.4〜３モルのGuHClの緩衝溶液でHICカラムから溶出することにより接触させる工程を包含する。本発明で用いられるHIC樹脂は、好ましくは、中程度から強い疎水性であり、このことは、この樹脂の疎水性リガンドが４炭素またはそれ以上の直鎖または分枝炭素鎖長さを有することを意味する。中程度から強い疎水性のHIC樹脂の例は、octyl-Sepharose(Pharmacia、Piscataway、NJ)を含むがこれに限定されない。好ましいHIC樹脂はoctyl-Sepharoseである。オクチルリガンドに類似の疎水性および鎖長さを有するリガンドを備えたさらなる樹脂が特に有用である。上記のように、用語「緩衝溶液」は、少量の酸性または塩基性物質の添加に際し、pHの実質的変化に抵抗し得る、弱酸およびその共役弱塩基の混合物を含有する溶液を意味する。緩衝化剤は、例えば、Na₃PO₄、K₃PO₄、NaAc、およびTrisを含む。一般に、緩衝溶液のpHはpH６とpH７との間にあるべきである。負に荷電した混入核酸を引きつけるため、および残存ヒストンDNA複合体からデコリンを解離するために、GuHCl含有溶液をHIC樹脂に充填する前に、スペルミジンのようなポリアミンが溶液に添加され得る。あるいは、またはそれに加えて、ポリアミンはまた、デコリンが結合している間に、カラムを洗浄するために用いられる１〜２モルのGuHCl緩衝溶液に添加され得る。第２の強アニオン交換樹脂：精製の第三段階は、グアニジウムイオンをその他のカチオンと交換するために、デコリン含有溶液とさらなる別の強アニオン交換樹脂とを接触させる工程を包含する。この段階は、以下の工程を包含する。(1)HIC樹脂からのデコリン含有溶出物画分を希釈して、約0.3モル濃度未満のGuHClを得、そして希釈した溶液を第２の強アニオン交換樹脂に充填する工程、(2)この樹脂を約0.3〜約0.4モル濃度の溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程、(3)結合したヒト組換えデコリンを約0.9〜約.2モル濃度の溶出塩濃度を有する緩衝溶液で溶出して、実質的に精製されたヒト組換えデコリンを得る工程。この最後の工程後、精製ヒト組換えデコリンを、任意にダイアフィルトレーションするか、または限外濾過により濃縮し得る。限外濾過は、撹拌セル（stirred cell）またはらせん結合（spiral bou nd）または平板メンブレン（flat plate membrane）のいずれかの接線流（tange ntial flow）により得る。本明細書中で用いられる用語「塩」は、酸の全部または一部の水素イオンを１以上の塩基のカチオンで置換することにより形成される化合物であり、好ましくは１価塩（例えば、塩化ナトリウム(NaCl)、酢酸ナトリウム、または塩化カリウム（KCl））である。また、上記のように、上記のような塩であることに加えて「溶出塩」はまた、樹脂に結合した混入物またはデコリンのいずれかを溶出し得る。例えば、約0.3〜約0.4モル濃度の塩濃度を有する緩衝溶液での洗浄は、混入物を溶出する「溶出塩」濃度である。約0.9〜約1.2モル濃度の濃度を有する緩衝溶液での溶出は、結合デコリンを溶出する「溶出塩」濃度である。一般に、塩は緩衝溶液に含有される。本明細書中で用いられ、先に示した用語「緩衝溶液」は、少量の酸性物質または塩基性物質の添加に際して、pHにおける実質的な変化に抵抗し得る、弱酸とその共役弱塩基との混合物を含有する溶液を意味する。いくつかの緩衝剤は、Na₃PO₄、K₃PO₄、NaAc、Trisである。また上記のように語句「強アニオン交換樹脂」は、４級アミノ基のような広い pH範囲にわたって完全にイオン化された、正電荷を有する官能基を有するイオン交換樹脂である。強アニオン交換樹脂の例は、Q-Sepharose（Pharmacia，Piscat away，NJ）、Poros Q Strong Anion（Perceptive Biosystems，Cambridge，MA）、Toyopearl Super Q-650M（Tosohaas，Mongomery，PA）、およびMacroprep Q （BioRad，Hercules，CA）を包含するが、これらに限定されない。好ましい第２のアニオン交換樹脂はQ-Sepharoseである。第１および第２の強アニオン樹脂は、同一または異なり得る。上記の３つの一般的な工程において、デコリンを含有する溶出画分を、U.V.分光光度法を用いて検出し得る。例えば、確認実施例に記載のように、U.V.検出計を280 nmおよび任意に260 nmに設定し得る。さらに、上記の樹脂の使用条件（例えば、温度、流速、カラムローディング、緩衝液pHなど）は、本明細書中で記さない限り製造者の指示に従う。好ましい実施態様において、デコリン含有培地からの実質的に純粋なヒト組換えデコリンの産生のための方法は、まず阻害されるべき宿主細胞プロテアーゼに特異的なプロテアーゼインヒビターをデコリン含有培地に添加する工程、次いで、第１工程から得られた培地に塩を添加してこの塩含有溶液の濃度を約0.1〜約0 .4モル濃度にする工程、第１の強アニオン交換樹脂に塩溶液を付与する工程、樹脂を約0.3〜約0.4モル濃度の溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程、および約0.9〜約1.2モル濃度の溶出塩濃度を有する緩衝溶液で樹脂から結合ヒト組換えデコリンを溶出する工程を包含する。好ましい方法は、第１の樹脂からのデコリン含有溶出画分に、十分量のGuHClを添加して生じる溶液の濃度を約１モル濃度から約２モル濃度にする工程、この画分を中程度から強い疎水性のHIC樹脂に添加する工程、約１〜約２モル濃度のGuHClの、そしてそのGuHCl濃度が先のローディング工程において使用したGuHCl濃度より高い緩衝溶液でHIC樹脂を洗浄する工程、および結合ヒト組換えデコリンをHIC樹脂から約2.4〜約３モル濃度のGuHC lの緩衝溶液で溶出する工程をさらに包含する。最後に、好ましい方法は、HIC樹脂からのデコリン含有溶出画分を希釈して約0.3モル濃度未満のGuHCl濃度を得る工程、希釈したデコリン含有画分を第２の強アニオン交換樹脂に付与する工程、樹脂を約0.3〜約0.4モル濃度の溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程、および結合ヒト組換えデコリン含有画分を樹脂から約0.9〜約1.2モル濃度の溶出塩濃度を有する緩衝溶液で溶出して、実質的に精製されたデコリン（これを任意にダイアフィルトレーションするかまたは限外濾過により濃縮する）を回収する工程を包含する。さらに好ましい実施態様において、デコリン含有培地から実質的に純粋なヒト組換えデコリンの産生のための方法は、先ずベンズアミジンおよびNa₄EDTAをデコリン含有培地に添加してそれぞれ約１ミリモル濃度〜約５ミリモル濃度にする工程、次いで第１工程から得た培地にNaClを添加してこのNaCl含有溶液の濃度を約0.4モル濃度にする工程、NaCl含有溶液をQ-Sepharose樹脂に付与する工程、Q- Sepharose樹脂を約0.4モル濃度の濃度を有するNaCl緩衝溶液で洗浄する工程、および結合ヒト組換えデコリンをQ-Sepharose樹脂から約1.0モル濃度のNaCl濃度を有する緩衝溶液で溶出する工程を包含する。さらに好ましい方法は、Q-Sepharos e樹脂からのデコリン含有溶出画分に十分量のGuHClを添加して得られる画分の濃度を約１モル濃度にする工程、デコリン含有画分をoctyl-Sepharose樹脂に付与する工程、octyl-Sepharose樹脂を約２モル濃度のGuHClの緩衝溶液で洗浄する工程、および結合ヒト組換えデコリンをoctyl-Sepharose樹脂から約３モル濃度のG uHClの緩衝溶液で溶出する工程を、さらに包含する。最後に、さらに好ましい方法は、octyl-Sepharoseカラムからのデコリン含有溶出画分を希釈して約３モル濃度未満のGuHCl濃度を得る工程、希釈したデコリン含有画分を第２のQ-Sepharo se樹脂に付与する工程、Q-Sepharose樹脂を約0.4モル濃度のNaCl濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程、および結合ヒト組換えデコリン含有画分を樹脂から約1. 0モルのNaCl濃度を有する緩衝溶液で溶出して実質的に精製されたデコリン（これをさらに限外濾過により濃縮する）を回収する工程を包含する。 O-結合オリゴ糖を有するタンパク質は、生物学的系においてかなり一般的であり、そして組換えタンパク質を発現する細胞の培養物中に混入タンパク質のサブセットを含有する。デコリンはO-結合オリゴ糖鎖を有さないので、精製方法における任意の工程は、デコリン含有培地とO-結合糖を優先的に結合するレクチンカラムとを接触する工程である。この目的のために好ましいレクチンは、JACALIN （これはVector Laboratories Inc.，Burlingame，CA 94010から得られ得る）である。 Choiら、J ．Biol．Chem.，264(5):2876-2884(1989)は、デコリンおよびその他のプロテオグリカン、バイグリカンをウシおよび仔ウシ組織抽出物からの、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる、４モル濃度のGuHClで溶出することによる単離を開示する。Choiらはこれらの手順を用いてバイグリカンからのデコリンの分離を示すが、HICカラムへの４モル濃度のGuHClの使用は、ヒト組換えデコリンの精製には適用し得ない。驚くべき事にそして予想外に、2.4〜３モル濃度のようなより低い濃度のGuHClが必要である。実施例Ｉにおける比較データにおいて示すように、抗デコリン抗体は３モル濃度溶出物中のデコリンを検出するが、４モル濃度溶出物中のデコリンは検出しない。さらに、抗CHO抗体は、４モル濃度溶出物中の混入宿主細胞タンパク質を検出するが、３モル濃度溶出物中の混入宿主細胞タンパク質を検出しない。本発明はまた、グアニジウムイオンを含有すると考えられる溶液中（例えば、上記のデコリン精製スキームにおけるように、GuHClを用いてタンパク質を精製した場合のタンパク質含有溶液中）のグアニジウムイオンの存在を検出するための新規な方法を提供する。本発明は、サンプル溶液中のグアニジウムイオンの存在を、グアニジウムイオンを含有すると考えられるサンプル溶液とカチオン交換樹脂とを接触しさせ、そしてサンプル溶液中存在するグアニジウムイオンを約1.5〜約２のpHを有する水性緩衝溶液で溶出することにより、グアニジウムイオンを検出するための方法を提供する。この後に、溶出物とカチオンサプレッサーカラム（cation suppresso r column）とを接触させる工程、同時にカラムの透過膜の反対側に反対方向にサプレッサー再生溶液（suppressor regenerate solution）を流す工程、および最後に伝導率検出計の使用により、サプレッサーカラムと接触させたイオン交換樹脂からの溶出物中のグアニジウムイオンの存在を検出する工程を行う。本明細書中で用いる用語「検出」は、グアニジウムイオンを含有すると考えられる溶液中のグアニジウムイオン（Gu+）の存在を定量的におよび定性的にの両方で測定することを意味する。Gu+の量が、検出の最小レベル未満の場合、一般に３ppmの検出が定性的である。３ppm以上では、検出は一般に定量的である。本明細書中で用いる語句「グアニジウムイオンを含有すると考えられるサンプル溶液」は、Gu+を含有し得る、タンパク質含有、またはその他の任意のタイプの溶液を意味する。Gu+は好ましくは、ヒト組換えデコリンを含有する溶液のようなタンパク質含有溶液において検出されるが、本発明の方法においてタンパク質を含有する溶液へのその適用性を限定するものはない。本明細書中で用いられる用語「カチオン交換樹脂」は、固定された負電荷を有する任意のイオン交換樹脂（例えば、カルボキシル基またはスルホン基を有する樹脂）である。好ましい樹脂は、CS12（カルボキシル基）またはCS10（スルホン基）のようなDionex Ionpac樹脂（Dionex，Sunnyvale，CA）であるが、その他のカチオン交換体（PorosＣＭ(カルボキシメチル)（MIT CambridgeのUniversity P ark，MA）を包含するがこれに限定されない）を使用し得る。グアニジウムイオンを、カチオン交換樹脂から、約1.5〜約2.0のpHを有する水溶液で溶出する。好ましくは、水溶液は、約10ミリモル濃度の塩酸、約２ミリモル濃度のジアミノプロピオン酸（diaminopropoinic acid）（DAP）を含有する水性緩衝液であり、そして約1.5の最終pHを有する。カチオン交換カラムからの溶出物を、カチオンサプレッサーカラムと接触させ、これに同時にカラムの透過膜の反対側に反対方向にサプレッサー再生溶液を流す。当該分野で公知の任意のカチオンサプレッサーカラム（これは、一般にH⁺イオンを吸着し、そしてGu+検出を可能にする500倍のイオン強度を有する透過膜を有するサプレッサーベッドシステムを含む）を使用し得る。好ましいカラムは、 Dionex Cation MicroMembrane Suppressor（Dionex，Sunnyvale，CA）である。サプレッサー再生溶液は、好ましくは、約100ミリモル濃度のテトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液である。サプレッサーカラムと接触させたカチオン交換体からの溶出物中のグアニジウムイオンの存在を、伝導率検出計を用いて検出する。伝導率検出計において溶液はアノードとカソードとの間を流れる。存在する電荷の量が伝導率を決定し、これはイオンの濃度に比例する。伝導率はイオン濃度が上昇すると上昇する。伝導率検出計、例えば、Dionex Bio/LCイオンクロマトグラフィー検出計のようなDionex（Sunnyvale，CA）により製造されるもの、およびAlltech Model 320伝導率検出計（Alltech，San Jose，CAまたはDeerfie1d, IL）を包含する。一般に、条件は、バックグラウンドイオン強度が、バックグラウンドノイズが、存在するイオンの量の読み（reading）を干渉しないように十分低い条件であるべきである。デコリンを用いてTGFβ誘導性細胞増殖および細胞外マトリックス産生を防止した（例えば、YamaguchiおよびRuoslahti、Nature 336:224(1988)；Borderら、Nature 360:361（1992）（両方は本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。デコリンはTGFβに結合し得、そしてそれゆえTGFβの精製のために有用である。TGFβを結合することに加えて、デコリンはTGFβ活性を阻害し得る。従って、デコリンは、TGFβに調節される活性により引き起こされる病状を軽減または防止するために有用である。処置され得る病状の特定の例は、ガン、繊維症疾患（皮膚瘢痕および内部瘢痕を含む）および糸球体腎炎を包含する。例えば、ガンにおいて、デコリンを用いてガン細胞に対するTGFβ-1の増殖刺激活性をを破壊し得る。デコリンはまたコラーゲンを結合してコラーゲン原繊維形成に影響し得、そしてまた創傷収縮を軽減または阻害するために有用である（例えば、Jo hn Harper，Wounds，6(2):70（1994）（これは本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本発明により精製されたデコリンを含有する薬学的組成物は、上記の目的のために有用であり得る。薬学的に受容可能なキャリアは当該分野において周知であり、そして緩衝化生理食塩水のような水溶液またはその他の溶媒またはグリコール、グリセロール、植物油（例えば、オリーブ油）または注射可能な有機エステルを包含する。薬学的に受容可能なキャリアを用いて、デコリンポリペプチドを細胞にインビトロでまたは被験体にインビボで投与し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、ポリペプチドを安定化するように、あるいは薬剤の吸収を増加または減少するように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。生理学的に受容可能な化合物は、例えば、グルコース、スクロース、またはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質またはその他の安定化剤または賦形剤を包含し得る。その他の生理学的に受容可能な化合物は、加湿剤、乳化剤、分散剤または保存剤（これは微生物の増殖または活動を作用するために特に有用である）を包含する。種々の保存剤が周知であり、そして例えば、フェノールおよびアスコルビン酸を包含する。当業者は、生理学的に受容可能な化合物を含む薬学的に受容可能なキャリアの選択が、例えば、ポリペプチドの投与経路および特定のポリペプチドの特定の物理化学的特性に依存することを知っている。例えば、生理学的に受容可能な化合物（例えば、アルミニウムモノステレートまたはゼラチン）は、遅延剤（これは被検体に投与された薬学的組成物の被験体への吸収速度を延長する）として特に有用である。有効量のデコリンを含有する薬学的組成物を、種々の経路（例えば、局所、経口、または非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、あるいは例えば、皮膚パッチまたは経皮イオン浸透療法をそれぞれ用いる皮膚を通した受動的または促進された吸収）を包含する）で被験体に投与し得る。局所投与は、例えば軟膏またはパウダーの直接適用により受動的であり得、または例えば鼻内噴霧または吸入剤を用いて能動的であり得る。組成物を局所噴霧として投与する場合、組成物の１つの成分は適切な噴射剤である。薬学的組成物はまた、所望であれば、リポソーム、マイクロスフェアまたはその他のポリマーマトリックスに組み込まれ得る（Gregoriadis，Liposome Technology、第１巻（CRC Press，Boca Raton, FL 1984）（これは本明細書中に参考として援用される））。例えば、リン脂質またはその他の脂質からなるリポソームは、比較的作製および投与が簡単である非毒性かつ生理学的に受容可能かつ代謝可能なキャリアである。デコリンを含有する薬学的組成物の有効量は、一般に約0.01〜100 mg/kg体重の範囲内である。有効量は、当業者に公知の方法を用いて決定され得る。総有効量を、単回用量として、ボーラスとしてかまたは比較的短期間にわたる注入によるかのいずれかで被験体に投与され得るか、あるいは細分化した処置プロトコルを用いて投与され得る（ここで、複数回の用量がより延長された期間にわたって投与される）。当業者は、被験体における有効用量を得るために必要なデコリンの量が、被験体の年齢および全般的な健康状態ならびに投与経路および投与されるべき処置数を包含する多くの因子に依存することを知っている。実施例Ｉ実質的に純粋なデコリンの調製本実施例は、実質的に純粋なヒト組換えデコリンの産生を示す。発現系デコリンを、デコリン発現CHO細胞を用いて以下のように産生した。本明細書中に参考として援用されている、KrusiusおよびRuoslahti，Proc．Natl．Acad． Sci．USA 83:7683(1986)に記載の、1.8kbの完全長デコリンcDNAを、デコリン発現ベクターの構築に使用した。デコリンコアタンパク質の発現のために、cDNAを変異誘発して、セリンをコードする第４コドンTCTを、トレオニンをコードするA CTあるいはアラニンをコードするGCTに変化させた。これは、本明細書に参考として援用されている、KunkelのProc．Natl．Acad．Sci．USA 82:488(1985)の方法に従った部位特異的変異誘発により操作した。適切な変異の存在は、DNA配列決定により証明された。哺乳類発現ベクターpSV2-デコリンおよびpSV2-デコリン／CP-thr4コアタンパク質は、pSV2の3.4kbのHindIII-Bam HIフラグメントに、デコリンcDNAあるいは変異誘発されたデコリンcDNAを連結して構築した(MulliganおよびBerg，Science 209:1423(1980);これは、本明細書中に参考として援用されている)。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)ネガティブCHO細胞(CHO-DG44)を、pSV2-デコリンあるいはpSV2-デコリン／CPおよびpSV2dhfrで、リン酸カルシウム共沈降法により、同時トランスフェクトした。pSV2-デコリンでトランスフェクトされたC HO-DG44細胞は、受託番号ATCC No．CRL 10332のもとにアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。トランスフェクトされた細胞を、９％透析ウシ胎児血清、２mM グルタミン、100 ユニット／ml ペニシリン、および100μg /ml ストレプトマイシンを補充した、ヌクレオシドを除いたα改変最少必須培地 (α-MEM)(GIBCO，Long Island)中で培養した。トランスフェクトされた細胞から生じたコロニーを、クローニングシリンダーを用いて取り出して増殖し、³⁵SO₄- 標識培養上清から免疫沈降法によりデコリン発現について調べた。次いで、デコリンの相当量を発現するコロニーを、メトトレキセート(MTX)濃度を0.64μMまで段階的に増加して、遺伝子増幅にかけた(KaufmanおよびSharp，J．Mol．Biol．1 59:601(1982);これは、本明細書中に参考として援用されている)。増幅された全細胞株を、限界希釈あるいは単一MTX耐性コロニー選択のいずれかによりクローン化した。これらの確立された細胞株の貯蔵培養物を、MTX含有培地中に保存した。タンパク質産生に使用する前に、貯蔵培養物から細胞を、MTXを除いた培地に継代培養し、そして少なくとも１度、可能性のあるMTXの影響を除くためにこの培地中に通した。あるいは、より大規模なデコリン産生を、マイクロキャリアビーズに付着した CHO細胞を用いて実施した。上記のデコリン発現CHO細胞を、マイクロキャリアビーズに接着させ、次いで懸濁液中で培養した。デコリン発現細胞の種培養を一旦確立したならば、発酵反応器に播種し、そして発酵の増殖期を、所望の細胞密度が得られるまで連続させた。この時点で、新鮮な培地を反応器にゆっくりと灌流し、そして馴化培地を１日あたり約80〜85％の反応容量の速度で回収した。デコリン産生細胞を失わないように留意して、灌水から細胞を含有するマイクロキャリアを分離した。回収した培地を、濾過前に４℃にて24時間インキュベートし、細胞破片を沈降させた。デコリンの精製デコリンを、上記のように40リットルのCHO細胞培養培地から精製した。ベンズアミジンおよびNa₄EDTAの溶液を、最終濃度の１×に培地中に添加した(100× 溶液は、100mMベンズアミジンおよび500mM Na₄EDTA)。培地を、Whatman #1濾紙を用いて濾過し、そしてNaCl濃度を0.4 NaClに調整した。 Q-Sepharoseカラムは、溶融ディスクガラス漏斗中の300mlの樹脂(Q-Sepharose fast flow gel; Pharmacia，Piscataway NJ)を、10カラム容量の脱イオン水を用いて洗浄しエタノールを除去することにより調製した。Q-Sepharoseを脱気し、そしてフローアダプター(9.6mm IDチューブを有するWatson/Marlow Peristalt ic Pump)を有する10cm×30cmカラムに配置した。気泡捕獲器およびポンプをカラムに接続し、次いでこれを200ml/分の流速で10カラム容量の緩衝液Ａ(25mM Tris ，pH7.8，0.4M NaCl)を用いて平衡化した。280nm 1.0 AUFS(吸光単位、フルスケール)におけるUV吸光度を測定した；検出器を、緩衝液Ａを用いて０にセットした。細胞培養培地を、200ml/分の流速でカラムに充填し、そしてフロースルーを回収した。カラムを緩衝液Ａ(１リットル)を用いて洗浄した。カラムを緩衝液Ｂ(( 1.5リットル)25mM Tris，pH7.8，１M NaCl)を用いて溶出し、そして１分間の画分を収集した。溶出ピークをプールし、容量(通常１〜1.5リットル)を記録し、そして280nmおよび260nmでの吸光度を測定した。後者の記録を用いてQ-Sepharos eカラムでデコリンと同時に溶出した核酸を検出した。１容量(プール容量と等しい)の２M グアニジウム-HCl(GuHCl)を添加し、そして試料をoctyl-Sepharoseカラムに充填した。 Octyl-Sepharoseカラムは、焼結ガラス漏斗中の60ml octyl-Sepharoseゲル(Ph armacia)を10カラム容量の脱イオン水を用いて洗浄してEtOHを除去することにより調製した。ゲルを脱気し、そして２つのフローアダプター(Pharmacia)を有する2.6cm×30cm水冷却筒カラム(water jacketed column)に配置した。これは、正しい位置にゲルを詰めそして維持した。カラムを、冷却循環器を用いて25℃に維持した。UVモニター(280nm)を接続し、そして緩衝液Ｃ((10カラム容量または600 ml)0.1 NaOAc，pH6.3，１M GuHCl; 0.2μM アセテートフィルターを用いて濾過および脱気した)を用いて０にセットした。 Q-Sepharoseカラムから回収した画分を、３ml/分の流速でoctyl-Sepharoseカラムに充填し、そして試料を２分／画分(６ml/チューブ)で回収した。カラムを、ベースラインが確立されるまで緩衝液Ｃを用いて、次いで、同じベースラインが確立されるまで緩衝液Ｄ(0.1M NaOAc，pH6.3，２M GuHCl; 0.2μM アセテートフィルターを用いて濾過し、次いで脱気した)を用いて洗浄した。デコリンを、緩衝液E((200ml)0.1M NaOAc，pH6.3，３M GuHCl)を用いて３ml/ 分の流速で溶出した。少量のタンパク質混入物が、デコリンと共に溶出した。溶出プロフィールを、280nmおよび260nmでの吸光度を測定することにより画分に対して行い、ほとんどの280nmでの吸光がデコリンによるものであり、そして核酸によるものではないことを示した。次いで、カラムを緩衝液Ｆ((150ml)0.1M NaO Ac，pH6.3，４M GuHCl; 0.2μM アセテートフィルターを用いて濾過し、そして脱気した)を用いて溶出し、同定されていない200kDaタンパク質およびいくつかのヒストンタンパク質を除去した。カラムを、緩衝液Ｇ((150ml)0.1M NaOAc，pH 6.3，８M GuHCl; 0.2μM アセテートフィルターを用いて濾過し、そして脱気した)を用いてストリッピングし、さらに宿主細胞混入タンパク質を除去した。デコリンを含有する３M GuHCl画分を、pH7.4で50mM NaPO₄を含有する溶液を用いて１：10希釈した。Q-Sepharoseカラム(Pharmacia)を、緩衝液(50mM NaPO₄(pH 7.4)、0.4M NaCl)を用いて平衡化し、そして希釈したデコリン溶液をカラムに３ ml/分の速度で汲み上げた(1.52 ID PVCマニホルドチューブを有するMinipu1s 2 ペリスタルチックポンプ；Gilson；Middleton WI)。カラムを、５カラム容量の同じ緩衝液を用いて洗浄し、次いでデコリンをさらなる緩衝液(50mM NaPO₄(pH7. 4)/1.0M NaCl)を用いて溶出した。溶出液を、限外濾過(Amicon Inc.，Beverly， MA)により濃縮／ダイアフィルトレーションした。最終調製物における残留核酸およびGuHClのレベルを、それぞれDNAアッセイおよびGuHClアッセイにより下記のように評価した。デコリンを、アミノ酸分析および直接的ELISAにより下記のように定量した。図２は、ヒト組換えデコリンを、３モルGuHClにおいてはHIC樹脂で精製し得るが、４モルGuHClにおいては精製し得ないことを例示する比較データを提供する。図２は、３Ｍおよび４Ｍ GuHClを用いるoctyl-Sepharoseカラムからの(1)デコリンおよび(2)チャイニーズハムスター卵巣(CHO)タンパク質の溶出を比較する１対のウェスタンブロットを示す。第１のウェスタン抗CHOブロットは、左から右にいくつかのCHO宿主細胞タンパク質(HCP)混入物を有する４Ｍの溶出液、CHO HCP混入物がほとんどまたは全くない３Ｍ溶出液、最も混入物の多い出発物質(SM)、およびCHO HCPの大部分を運び去る８Ｍストリップ(最終工程)を示す。第２のウェスタン抗デコリンブロットは、左から右に、非常に少ないデコリンを有する８Ｍストリップ、出発物質(SM)、溶出したデコリンの大部分を含有する３Ｍ溶出液、および最後に、４Ｍ GuHClを用いて溶出したデコリンの痕跡を示す。 DNA アッセイプロトコル上記組換えおよび精製手順により産生されたデコリン試料を、以下のようにDN A含量について試験した。デコリン試料を、第１にDNAアッセイプロトコルのために調製し、続いて変性し、ブロッティングし、ハイブリダイゼーションし、そしてDNAの検出を行った。試料調製：試料を、タンパク質をプロテアーゼを用いて消化すること、消化したペプチドをEthachinmateを用いて沈澱させ、そして試料を希釈することによりアッセイのために調製した。標準曲線のためのCHOゲノムDNAの試料もまた、以下のように調製した。ブロッティング前の試料の希釈により、用いるDNAアッセイプロトコルは、少ない試料容量に基づいていた。デコリン試料の容量は、一旦DNA濃度が有意に低くなれば、(1.0mlまで必要に応じて)増大し得る。DNAスパイク(spike)試料(下記 )の濃度および容量を包含する全ての他の試薬容量は、それに応じて変える必要がある。デコリン試料(非スパイク)を、以下のように調製した：50μlのデコリン試料；34μlの滅菌水；10μlの100mM Tris-Cl,100mM EDTA（pH7.5）；５μlの10％SD S；および１μlの20mg/mlプロテイナーゼＫ(Boehringer Mannheim，Chicago，IL Cat．#161519,または同等物)を組み合わせて最終容量100μlにする。プロテイナーゼＫ Ethachinmate処理後の試料におけるDNAの良好な回収を確認するために、DNAをいくつかの試料中に処理前にスパイクする。例えば、後に１：100および１：400希釈される試料を6.4ng DNAにスパイクし、希釈後のスパイクはそれぞれ64pgおよび16pgであった。スパイク試料に用いられる濃度(これは後に、１：100および１：400希釈される)は、以下のようであった：50μlのデコリン試料；10μlのDNAスパイク(640ng/ml)；24μlの滅菌水；10μlの100mM Tris -Cl，100mM EDTA(pH7.5)；５μlの10％ SDS；および１μlの20mg/mlプロテイナーゼＫを組み合わせて最終容量100μlにした。デコリンを全く含まない64pg/ml の50μlスパイクコントロール(128pg/mlの50μlが用いられ得る)もまた調製した。プロテイナーゼＫ(上記)を用いて処理したデコリン試料(＋／−スパイク)を、 37℃にて２時間インキュベートしてタンパク質を除去した。タンパク質除去後、 Ethachinmateを用いて、消化されたタンパク質を以下のように沈澱させた。試料を、100μlのタンパク質除去試料(＋／−スパイク)；300μl(３容量)の６M NaCl ；１μl(完全にボルテックスした)のEthachinmate(Nippon Gene，Cat．#9301F) から調製し、400μl(等量)の100％エタノールを添加した。試料をボルテックスし、そして15,000rpm(微小遠心)にて15分間スピンした。ペレットを、減圧下で乾燥させ、次いで50μl(出発容量に等しい)のTE緩衝液(10mM Tris-Cl，１mM EDT A，pH7.5)に再び溶解させた。 Ethachinmate沈澱後、試料をTE緩衝液中に希釈した。希釈は、評価されるDNA 混入レベルに依存した。試料あたり少なくとも２つの希釈物を試験した。標準曲線のための試料(以下、「標準」)もまた、作製した。標準曲線は256pg で始まり、そして４pgまで２倍希釈した。フィルム上の各スポットに何らかの問題がある場合は、ブロットあたり２つの標準曲線が存在する。従って、２つのセットについて十分な量を有するためには、以下の希釈法が用いられた：256pg DN Aを含有する標準溶液は、2560pg/mlの濃度のために200μl 10ng/mlゲノムDNA＋5 80μl TE緩衝液からなった；標準128pgは、1280pg/mlの濃度のために250μl 256 標準＋250μl TE緩衝液からなった；標準64pgは、640pg/mlの濃度のために250μ l 128pg標準＋250μl TE緩衝液からなった；標準32pgは、320pg/mlの濃度のために250μl 64pg標準＋250μl TE緩衝液からなった；標準16pgは、160pg/mlの濃度のために250μl 32pg標準＋250μl TE緩衝液からなった；標準８pgは、80pg/ml の濃度のために250μl 16pg標準＋250μl TE緩衝液からなった；そして標準４pg は、40pg/mlの濃度のために250μl ８pg標準＋250μl TE緩衝液からなった。変性：試料(＋／−スパイク)を変性するために、200μlの各試料希釈物を、200μl ６M KSCN溶液(これは、使用前に0.22μフィルターを通過させた)に添加し、そして96℃まで10分間加熱した。試料を直ちに氷中に置き、一旦冷蔵し、微小遠心機において軽く(２〜３秒間)スピンし、次いで200μl／スロットに充填した。標準を変性するために、300μlの各標準希釈物を、300μl ６M KSCN(これもまた、0.22μフィルターで濾過した)に添加し、そして96℃まで10分間加熱した。試料を直ちに氷中に置き、一旦冷蔵し、微小遠心機において軽く(２〜３秒間)スピンし、次いで200μl／スロットに充填した。この手順は、ブロットあたり２つの曲線のための各々の標準に十分であった。ブロッティング：変性手順の後、試料（+/-スパイク）および標準を上記のように、1X SSCで予め湿らした中性ナイロン膜（Biodyne A、VWR Brisbane 、 CA）備えたスロットブロット装置に移し換えた。DNAを、UV Stratalinker1800（ Stratagene San Diego、CA）上の自動セッティングを用いて膜に固定した。固定後、膜に以下の一連の洗浄（50ml/１洗浄）を行った：最初に加圧滅菌された水で（２回、各10分）、次に70％エタノールで（２回、各10分）、最後に0.25％酢酸／0.1Ｍトリエタノールアミンで（２回、各10分）。膜は、ハイブリダイゼーションのためにさらに処理されるまで４°で貯蔵されるかまたはかまたは即座に処理されるかのいずれかであった。ハイブリダイゼーション：10mlハイブリダイゼーション緩衝液（５X SS C、１％ I-Block^TM(TROPIX、Bedford、MA Cat.#AB100）、0.1％ N-ラウロイルサルコシン（Lauroylsarcosine）、0.02％ SDSを60℃で１時間かけて溶解し、そして-20℃で保存し、そしてそれを、解凍し、予熱し、使用前に60℃で予め平衡にしたもの）を用いて、60℃で１時間、シールされたバッグ内で膜を予備ハイブリダイズした。予備ハイブリダイゼーションの後、膜を新たなバッグに移し換えた。100μlの 500ng/mlのDIG標識されたDNAプローブ（標準と同じゲノムDNAを用い、Boehringe r Mannheim ランダム−プライマーDNA標識キット（Cat.#1093657、Kit #1 India napolis、Indiana）を販売者により指示されたように用いて調製し、次いでTE緩衝液で500ng/mlに希釈し、100μlアリコート中に-20℃で保存した）を、96℃ランダムプライマーで10分間のインキュベーションにより変性させた。プローブ変性の後、少量（約１ml）のハイブリダイゼーション緩衝液（60℃で予備平衡化する）をプローブと迅速に混合し、そして希釈されたプローブを、9.0mlの60℃に保った余分の(extra)ハイブリダイゼーション緩衝液に素早く添加し、混合し、そしてバッグに添加した。次いでシールされたバッグを、振盪しながら一晩(15 〜18時間)60℃でインキュベートした。ハイブリダイゼーション後、最初に50mlの2X SSC/0.1％ SDS（２回、各10分）、次に50mlの0.2X SSC/0.1％ SDS（２回、各10分）で膜を洗浄した。化学発光による検出：膜を、50mlのブロッキング溶液（1X PBS、0.2％ I-Block^TM、0.1％ Tween-20）中で30分間ブロックした。膜を新たなブロッキング溶液に移し換え、そしてその溶液に、最終濃度が0.15単位／mlおよび全量が50 mlになるように、アルカリ性ホスファターゼ結合抗DIG Fabフラグメント(Boehri nger Mannheim、Indianapolis、Indiana Cat.#1093-274)を添加した。膜を、抗体溶液と30分間インキュベートし、次いで50mlの新たなブロッキング溶液中で10 分間洗浄した。次いで一連の洗浄を、洗浄緩衝液（1X PBS、0.3％ Tween-20）を用いて行った。各洗浄では、各５分間50mlの洗浄緩衝液を４回ずつ用いた。洗浄後、膜を50mlのAMPPD溶媒（0.1M ジエタノールアミン、0.02％NaN₃、1mM MgCl₂ 、pH10.0）で、５分間振盪しながら平衡化した。溶媒を、AMPPD基質溶液（0.24m MのAMPPD^TM(TROPIX、Bedford、MA Cat#PD250)またはAMPPD溶媒中のLumigen PPD^T ^M （Boehringer Mannheim、Cat.#1357-328）（AMPPDの最終濃度が100μg/ml））で置き換え、そして反応物を最小限（より小さい皿に10〜15ml）に維持し、AMPP D基質を保存した。過剰の基質溶液を膜からブロットした。膜を、プラスチックバッグ内でシールし、そして即座にＸ線フィルム上に置いた。露出時間は４〜５時間であった。以下の表１に示すように、３ロットのデコリン試料を、上記の組換えおよび精製手続により調製し、そして以下の量のDNAを含むDNAアッセイプロトコルにより分析した：試料１（1:100）、800ng/mgタンパク質；試料２（1:100）、800ng/mg タンパク質；および試料３（1:45）、126ng/mgタンパク質。直接デコリンELISAについてのプロトコル上記の組換えおよび精製手続により生成されたヒト組換えデコリンを、以下のように直接デコリンELISAを用いて検出し、定量した。Immulon-2平底プレートをデコリン標準および未知試料の希釈物で覆った。希釈を、0.1M HCO₃（（500ml） 1.38ｇ Na₂CO₃;3.11ｇ NaHCO₃;ddH₂Oによる容量；9.6にチェックされたpH；濾過され、滅菌され、４℃で保存された溶液）(pH9.6)によりボロシリケートガラスチューブ内で行い、希釈後、即座に各セットをプレートに置いた。デコリン標準セットの濃度は19ng/mlで始め、そして連続的に1:1.5に希釈し、1.7ng/mlにした。未知のデコリン濃度の試料を希釈して、標準曲線に沿って低下させ、通常、精製デコリンについての希釈範囲は、２倍希釈として1×10⁵〜16×10⁵であった。用いた容量は、100μl/ウエルであった。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、シールした。コーティング溶液を少し振り(flick out)、200μl 1×PBS+1％BSA（(100ml)90 ml ddH₂O；10ml 10×PBS（（１リットル）80g NaCl；２g KCl；6.1g Na₂HPO₄；２g KH₂PO₄；ddH₂Oによる容量）；10ml 10×PBS; １gウシ血清アルブミン；アッセイ当日に新たにされる溶液）をウエル毎に添加し、37℃で0.5-1.0時間インキュベートした。次いでウエルを、1×PBS+0.1％ Tween-20で３回洗浄した。 100μl/ウエルのアリコートのウサギ抗デコリン抗体（抗PG40（WO 91/10727に記載され、La Jolla Cancer Research Foundationから入手される）1:1000における）を添加した。抗体を1×PBS+0.1％ BSA+0.1％ Tween-20（(100ml)90ml ddH₂ O；10ml 10×PBS；0.1gウシ血清アルブミン；0.1ml Tween-20；アッセイ当日に新たにされる溶液）で希釈し、37℃で60分間インキュベートした。ウエルを、1 ×PBS+0.1％ Tween-20（（１リットル）900ml ddH₂O；100ml 10×PBS；１ml Twe en-20；アッセイ当日に新たにされる溶液）で３回洗浄した。 1×PBS+0.1％ BSA+0.1％ Tween-20で1:3000に希釈された、100μl/ウエルのヤギαRb−西洋ワサビペルオキシダーゼ（BioRad（Richmond、VA）またはPromega Tustin、CA）を添加し、そして37℃で60分間インキュベートした。次いでウエルを、1×PBS+0.1％ Tween-20で５回洗浄した。次いで、１ウエルあたり200μlの新たに作成されたo-フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD）溶液（25ml 0.1M シトレートホスフェート緩衝液（(500ml)５gクエン酸；７gNa₂HPO₄（無水）；ddH₂O による容量；5.0にチェックされたpH；濾過され、滅菌され、そして４℃で保存される）；110mg OPD錠剤（Sigma）；６μl 30％ H₂O₂）を添加し、15分間暗所において室温でインキュベートした。１ウエル当たり50マイクロリットルの7.8 H₂SO₄（55ml 36M H₂SO₄；200ml蒸留水)を添加し反応を停止した。データをOD 49 0で読み、データの直線状フィットを用いて分析した。曲線の最高点は、アッセイが「トップアウト」で始まっていれば消去した。以下の表１に示すように、３ロットのデコリン試料を、0.82mg/ml、1.23mg/ml 、および1.43mg/mlのデコリンを含有する上記の実施例Iの組換えおよび精製手続により調製した。実施例II グアニジウムイオンアッセイ本実施例では、精製方法においてグアニジンを含有する緩衝液を用いて精製されたタンパク質に関連した残留グアニジウムイオンの存在を検出および定量することを例示する。１つのカチオンだけ（ナトリウム(Na+)、カリウム(K+)、グアニジウム(Gu+)）を含有する各標準溶液を調製および分析した。１mg/ml濃度のストックからの連続希釈を用いて、各イオンの標準曲線を確立した。標準曲線におけるデータ点は、３つの実行(run)の平均であった。さらに、これら３つのカチオン（Na+、K+、およびGu+）の混合物を実行して、これらのイオンの間の溶解度を確認した。グアニジウム標準曲線の直線上範囲は、0.999を越えるｒ値で3.9〜125ppmであった。３ppmの低いグアニジウムイオン濃度が、検出され得た。 Dionex CS 12カチオン交換２ミリメートル径樹脂（Dionex Ionpac樹脂；Dione x Corporation、Sunnyvale、CA）をこのアッセイのために用いた。関連するガードカラムCG12をまた、カラム性能を延長するために用いた。カチオンとしてグアニジンを維持するために、pH1.5で２ミリモーラーのジアミノプロピオン酸（DAP ）を含む水中に、10ミリモーラー塩酸（HCl）の緩衝液系を用いた。実施例Ｉの手続きにより生成された精製デコリンを含有する溶液のアリコート（25μlまで）を、濃度1〜4mg/mlで前処理なしにDionex Ionpac樹脂系に直接注入した。カラムは、アイソクラティックに（isocratically）働く(run)ので、流速１分あたり 0.2mlで、各試料間での洗浄および平衡化なしに、試料を連続的に注入した。ナトリウムカチオンおよびグアニジウムカチオンは、互いに良く分離し、ナトリウムのピークの５分後にグアニジウムイオンが溶出した。次いで、カチオン交換樹脂からの溶出液をカチオンサプレッサーカラムと接触させ、そしてグアニジウムイオンを、以下のように導電率検出器により検出し定量した。3〜5ml/minの速度でサプレッサー再生流れとして、100ミリモルのテトラブチルアンモニウムヒドロキシド（TBAOH）を用いた、Dionex CMMIIカチオンサプレッサーカラムを用いた。出力感度を導電率検出器（Dionex Bio/LC イオンクロマトグラフィー検出器、Dionex、Sunnyvale、CA）に対して100uSにセットした。サプレッサーは、透過膜により分離された反対方向に流れるの２つの異なる液流を有する。カラム溶出液は、サプレッサーを通って、そして検出器中へ流れる。再生流は、膜の反対側で反対方向にサプレッサーを通じて流れる。サプレッサーフィード内の高濃度のOHは、溶出緩衝液からH+を抽出し、検出されるべきナトリウムカチオン、カリウムカチオンおよびグアニジウムカチオンだけを残す。以下の表１に示すように、３ロットのデコリン試料を、実施例Ｉの手順により調製し、全て３百万分率（ppm）より少ないグアニジウムイオンを含有していた。本発明は、上記で提供された実施例を参照して記載されているが、種々の改変が、本発明の思想から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきである。従って、本発明は、請求項によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 30/02 Ｇ０１Ｎ 30/02 Ｅ 30/06 30/06 Ｚ 30/26 30/26 Ａ 30/46 30/46 Ａ 30/88 30/88 Ｅ 30/96 30/96 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＳＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＡＤＵＡＤＳ (72)発明者ハーパー，ジョンアール. アメリカ合衆国カリフォルニア 92009, カールスバッド，ユニコーンストリート 2433 (72)発明者ヘルナンデズ，サムディー. アメリカ合衆国カリフォルニア 92008, カールスバッド，サンフォードレーン 2883 (72)発明者コステル，ポールジェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 92122, サンディエゴ，ブライアンドアベニュー 3022 (72)発明者パーカー，ジョナサンアール. アメリカ合衆国カリフォルニア 91935, ジャムル，オリーブビスタドライブ 14092 (72)発明者ベドビック，トーマスエス. アメリカ合衆国カリフォルニア 92089, カールスバッド，ジャカランダアベニュー 2708

Claims

【特許請求の範囲】１．デコリン含有細胞培養培地から実質的に純粋なヒト組換えデコリンを調製する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ．デコリン含有培地を第１の強アニオン交換樹脂と接触させる工程であって： (1) 最初に、該デコリン含有培地を、約0.1〜約0.4モルの塩濃度を有する溶液中の該樹脂に充填すること； (2) 次いで、該第１の樹脂を、約0.3〜約0.4モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄すること； (3) 次いで、結合したヒト組換えデコリンを、約0.9〜約1.2モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で溶出すること、を包含する工程；ｂ．工程(a)(3)から得られるデコリン含有画分を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂と接触させる工程であって： (1) 該デコリン含有画分を、約１〜約２モルの塩酸グアニジウム(GuHCl)を含有する溶液中のHIC樹脂に充填すること； (2) 約１〜約２モルのGuHClを含有する緩衝溶液で該HIC樹脂を洗浄すること； (3) 結合したヒト組換えデコリンを、約2.4〜約３モルのGuHClを含有する緩衝溶液で該HIC樹脂から溶出すること、を包含する工程；ｃ．工程(b)(3)から得られるデコリン含有溶出画分を、第２の強アニオン交換樹脂と接触させる工程であって： (1) 該デコリン含有画分を希釈して約0.3モルより小さいGuHCl濃度を得ること、およびこの希釈された溶液を該第２のイオン交換樹脂に充填すること； (2) 該第２のイオン交換樹脂を、約0.3〜約0.4モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄すること； (3) 結合したヒト組換えデコリンを、約0.9〜約1.2モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で溶出し、実質的に精製されたヒト組換えデコリンを得ること、を包含する工程。２．前記第１および第２の強アニオン交換樹脂がQ-Sepharose樹脂である、請求項１に記載の方法。３．前記HIC樹脂がoctyl-Sepharoseである、請求項１に記載の方法。４．前記工程(a)(3)のデコリン含有溶出画分中に残存する任意のDNAを断片化することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。５．前記断片化が、DNAaseまたは０-４℃の低温の約0.1モル塩酸による、請求項４に記載の方法。６．前記工程(b)(1)のGuHCl含有溶液に、または前記工程(b)(2)における約１〜約２モルのGuHClを含有する緩衝溶液にポリアミンを添加することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。７．デコリン含有細胞培養培地から実質的に純粋なヒト組換えデコリンを調製する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ．該デコリン含有培地中の阻害されるべき宿主細胞プロテアーゼに特異的なプロテアーゼインヒビターを添加する工程；ｂ．工程(a)から得られる培地に塩を添加し、塩含有溶液の濃度を約0.1〜約0. 4モルにする工程；ｃ．該工程(b)の塩含有溶液を、第１の強アニオン交換樹脂に付与する工程；ｄ．該第１の樹脂を、約0.1〜0.4モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程；ｅ．結合したヒト組換えデコリンを、約0.9〜約1.2モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で樹脂から溶出する工程；ｆ．該工程(e)のデコリン含有溶出画分に、得られる画分の濃度を約１〜約２モルにするために十分な量の塩酸グアニジウム(GuHCl)を添加する工程；ｇ．該工程(f)の画分を、中程度から強い疎水性の疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂に付与する工程；ｈ．該HIC樹脂を、約１〜約２モルのGuHCl緩衝溶液であって、GuHCl濃度が工程(f)で用いられるGuHCl濃度より高い緩衝溶液で洗浄する工程；ｉ．結合したヒト組換えデコリンを、約2.4〜約３モルのGuHCl緩衝溶液でHIC 樹脂から溶出する工程；ｊ．該工程(i)のデコリン含有溶出液画分を希釈して約0.3モルより小さいGuHC l濃度を得る工程；ｋ．工程(j)からの希釈されたデコリン含有画分を、第２の強アニオン交換樹脂に付与する工程；ｌ．該第２の強アニオン交換樹脂を、約0.3〜約0.4モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程；ｍ．結合したヒト組換えデコリンを、約0.9〜約1.2モルの溶出塩濃度を有する緩衝溶液で該樹脂から溶出し、実質的に精製されたヒト組換えデコリンを回収する工程；およびｎ．必要に応じて、工程(m)から得られる溶出されたデコリンを限外濾過により濃縮する工程。８．前記第１および第２の強アニオンイオン交換樹脂がQ-Sepharoseである、請求項７に記載の方法。９．前記HIC樹脂がoctyl-Sepharoseである、請求項７に記載の方法。１０．前記工程(e)のデコリン含有溶出画分中に残存する任意のDNAを断片化する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。１１．前記断片化が、DNAaseまたは０-４℃の低温の約0.1モル塩酸による、請求項１０に記載の方法。１２．前記工程(f)のGuHCl含有溶液に、または前記工程(h)における約１〜約２モルのGuHClを含有する緩衝溶液にポリアミンを添加する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。１３．前記デコリン含有細胞培養培地が、デコリン発現チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞の培養由来である、請求項７に記載の方法。１４．前記工程(a)でデコリン含有培地に添加されるプロテアーゼインヒビターが、ベンズアミジンおよびエチレンジアミノ四酢酸四ナトリウムからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。１５．デコリン含有細胞培地から実質的に純粋なヒト組換えデコリンを生産する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ．該デコリン含有培地に、ベンズアミジンおよびエチレンジアミノ四酢酸四ナトリウムを、それらの濃度がそれぞれ１ミリモルおよび５ミリモルになるに十分な量添加する工程；ｂ．該工程(a)から得られる培地に塩化ナトリウム(NaCl)を添加して、得られるNaCl-含有溶液濃度を約0.4モルにする工程；ｃ．該工程(b)のNaCl-含有溶液を、Q-Sepharose樹脂に付与する工程；ｄ．該Q-Sepharose樹脂を、約0.4モルのNaCl濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程；ｅ．結合したヒト組換えデコリンを、約1.0モルのNaCl濃度を有する緩衝溶液でQ-Sepharose樹脂から溶出する工程；ｆ．該工程(e)のデコリン含有溶出画分に、得られる画分の濃度が約１モルになるに十分な量の塩酸グアニジウム(GuHCl)を添加する工程；ｇ．該工程(f)のデコリン含有画分を、octyl-Sepharose樹脂に付与する工程；ｈ．該octyl-Sepharose樹脂を、約２モルのGuHClで洗浄する工程；ｉ．結合したヒト組換えデコリン含有画分を、約３モルのGuHClの緩衝溶液でo ctyl-Sepharose樹脂から溶出する工程；ｊ．該工程(i)のデコリン含有溶出画分を希釈して、約0.3モルより小さいGuHC l濃度を得る工程；ｋ．該工程(j)からの希釈されたデコリン含有画分を、第２のQ-Sepharose樹脂に付与する工程；ｌ．該第２のQ-Sepharose樹脂を、約0.4モルのNaCl濃度を有する緩衝溶液で洗浄する工程；ｍ．結合したヒト組換えデコリンを、約1.0モルのNaCl濃度を有する緩衝溶液で該工程(1)の樹脂から溶出し、実質的に精製されたヒト組換えデコリンを回収する工程；およびｎ．工程(m)からの溶出されたデコリンを限外濾過により濃縮する工程。１６．グアニジウムイオンを含有すると考えられる試料溶液中のグアニジウムイオンの存在を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ．該試料溶液をカチオン交換樹脂と接触させる工程；ｂ．該試料溶液中に存在するグアニジウムイオンを、約1.5〜約2.0のpHを有する水性緩衝溶液で溶出する工程；ｃ．該工程(b)からの溶出液をカチオンサプレッサーカラムと接触させ、そして同時に該カラム中の透過膜の反対側で反対方向にサプレッサー再生溶液を流す工程；ｄ．該工程(c)のサプレッサーカラムと接触した工程(b)からの溶出液中のグアニジウムイオンの存在を、伝導率検出器の使用により検出する工程。１７．前記検出されるグアニジウムイオンが、タンパク質含有溶液中に存在する、請求項１６に記載の方法。１８．前記タンパク質含有溶液がヒト組換えデコリンを含む、請求項１７に記載の方法。１９．前記カチオン交換樹脂がDionex Ionpac樹脂である、請求項１６に記載の方法。２０．前記工程(b)の水性溶液が、約10ミリモル濃度の塩酸、約２ミリモル濃度のジアミノプロピオン酸を含有する水性緩衝液であり、そして約1.5の最終pH を有する、請求項１６に記載の方法。２１．前記工程(c)のサプレッサー再生溶液が、約100ミリモルの濃度のテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含む水性溶液である、請求項１６に記載の方法。２２．前記カチオンサプレッサーカラムが、Dionex Cation MicroMembrane Su ppressorである、請求項１６に記載の方法。