JPH10502624A - Ｐｌａ▲下２▼インヒビターおよび腸管コレステロール吸収の阻害のためのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ある種の化合物が合成され、それらがホスホリパーゼA₂(PLA₂)の効果的なインヒビターであり、したがって腸管のコレステロール吸収およびそれに起因する疾患状態たとえば高コレステロール血症および冠動脈疾患の処置に有用であることが見出された。

Description

【発明の詳細な説明】 PLA₂インヒビターおよび腸管コレステロール 吸収の阻害のためのその使用 発明の背景 腸管内容物から吸収されるコレステロールは、非HDLコレステロールの血漿レ ベルに有意に寄与する。非HDLコレステロールプテローム性は動脈硬化および冠 動脈疾患（CAD）の進行に対する陽性の危険因子であるから、腸管のコレステロ ール吸収を阻害する方法は、CADの危険がある高コレステロール血症患者の処置 に臨床的意義が考えられる。 胆汁および食餌から腸管腔に入るホスファチジルコリン（以下“PC”という） は胆汁酸ミセル中のコレステロールの溶解度を上昇させることによってコレステ ロールの吸収に関与するものと考えられる。しかしながら、胆汁のPCはまた腸管 のコレステロール吸収を遅延させることも報告されている。コレステロール吸収 に対するPCのこの矛盾する作用は最近、単離ラット腸管セグメントを用いたイン ビトロ試験〔Rampone A.J．& Machida C.M.，“Mode of action of lecithin in suppressing cholesterol absorption.”J. Lipid Res.，22：744-752(1981)〕 ならびに腸管灌流試験〔Hollander D.& Morgan D.，“Effect of plant sterols ,fatty acids and lecit-hin on cholesterol absorption in vivo in the rat. “Lipids,15：395-400(1980)］によって確認された。PCによる同様のコレステロ ールの吸収抑制がヒトを対象にインビボにおいて証明されている〔Beil F.U．& Grundy S.M.,“Studies on plasma lipoproteinsduring absorption of exo gen ous lecithin in man.”J. Lipid Res .，21：525-536(1980)〕。 腸管腔のPCは膵臓ホスホリパーゼA₂によってリゾホスファチジルコリンと遊離 脂肪酸に加水分解される。腸管セグメントによるコレステロール吸収に対するリ ゾホスファチジルコリンの作用を調べたところ、阻害は認められず、コレステロ ールの吸収の抑制には無傷のPCが必要であることが指示された〔Rampone A.J．& Long L.R.，“The effect of phosphatidylcholine and lysophosphatidylcho- line on the absorption and mucosal metabolism of oleic acid and choleste rol in vitro.”Biochim ．Biophys．Acta，486：500-510(1977)〕。 腸管内容物中のPCが腸管の脂質吸収を遮断するという上述の結論は、非消化性 ジエーテルPC類縁体を含有するコレステロール負荷脂質乳化物を給餌されたラッ トにおいてコレステロール吸収が有意に阻害された試験において支持される〔O' Connor P.J.，Loiudice T.A.，Bochenek W．& Rodgers J.B．“Effect of diest er and diether phosphatidylcholine on intestinal absorption of neutralan d acidic sterols.”Digestive Diseases，23：316-320(1978)〕。 膵臓ホスホリパーゼA₂によるPCの加水分解は腸管のコレステール吸収の開始に 重要な工程であるものと思われる。コレステロール吸収の膵臓ホスホリパーゼA₂ 活性に対する依存性は非吸収性膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターによる高脂質 血症患者の薬理学的処置の基盤になり得るものである。 発明の概要 本発明は、高コレステロール血症患者の腸管コレステロール吸収 を防止し、それにより血中コレステロールレベルを低下させることを目的とする 膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターの投与に関する。本発明はまた、コレステロ ールの吸収阻害作用を有する一群の新規な化合物の発見に関連する。腸管コレス テロール吸収の阻害剤として、膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターは冠動脈疾患 の危険がある高コレステロール血症患者の処置に使用される。これらの化合物は 医薬的に許容される担体と配合し、治療有効量がそれを必要とする患者に投与さ れる。 発明の詳細な説明 したがって、本発明の一実施態様は、動物における腸管コレステロール吸収を 遮断する方法において、膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターの有効量を投与する ことからなる方法である。他の実施態様は、膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビター の治療有効量をその処置を必要とする患者に投与することからなる高コレステロ ール血症患者の血中コレステロールレベルを低下させる方法である。 本発明の他の実施態様は、式Ｉ〜II： の化合物またはそれらの医薬的に許容される塩（式中、ＲおよびR₁ は水素、ヒドロキシ、低級アルキル、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、 ニトロ、メチルチオ、低級アルケニル、および低級アルキニルからなる群より選 択される）である。 本明細書における用語は一般に以下の意味を有する。 低級アルキルは、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の基を意味 し、それらに限定されるものではないが、たとえばメチル、エチル、プロピル、 ブチルを包含する。 低級アルケニルは２〜４個の炭素原子を有する基を意味し、それらに限定され るものではないが、たとえばエチレン、1,2−もしくは2,3−プロピレン、1,2− 、2,3−、もしくは3,4−ブチレンまたはそれらの異性体を包含する。 低級アルキニルは２〜４個の炭素原子を有する基を意味し、それらに限定され るものではないが、たとえばエチニル、2,3−プロピニル、2,3−もしくは3,4− ブチニルまたはそれらの異性体を包含する。 低級アルコキシは１〜４個の炭素原子を有する基を意味し、それらに限定され るものではないが、たとえばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシまたは それらの異性体を包含する。 ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である。 好ましくは、Ｒは低級アルキルであり、とくに好ましくはメチル基である。 また、R₁はハロゲンであることが好ましい。式ＩにおいてR₁がハロゲンである 場合には、R₁はフッ素であることが好ましく、４位に置換されたフッ素であるこ とがとくに好ましい。式IIにおいてR₁がハロゲンである場合には、R₁は塩素また はフッ素であることが好ま しく、３位に置換された塩素および２位に置換されたフッ素であることがとくに 好ましい。 好ましくは、本発明は、 １−〔4,4−ビス（４−フルオロフェニル）ブチル〕−３−(３−メトキシフェ ニル)−３−メチル−ピロリジン、 ２−（ｍ−クロロアニリノ）−５−メチル−trans−桂皮酸、および ２−（ｏ−フルオロアニリノ）−５−メチル−trans−桂皮酸からなる群より 選択される化合物である。 本発明の化合物は、上記化合物の溶媒和化合物、水和物、および医薬的に許容 される塩を包含する。 本発明の化合物の一部は不斉炭素原子を含有する。本発明は、本技術分野で周 知の方法によって製造または単離できる個々のエナンチオマーを包含する。 本発明の選ばれた化合物はsynおよびanti型としても存在することが可能で、 これらも本発明に包含される。選ばれた化合物はまた、ＥおよびＺ二重結合異性 体としても存在可能である。いずれの型も本発明に包含される。 得られたラセミ体はすべて、既知の方法、たとえばその光学活性な酸とのジア ステレオマー塩の分離ついで塩基処理による光学活性化合物の遊離によって光学 的対掌体に分割することができる。すなわち、本発明のラセミ化合物は、たとえ ばｄ−またはｌ−（酒石酸、マンデル酸またはカンファースルホン酸）塩の分別 結晶によってそれらの光学的対掌体に分割することができる。 本技術分野の熟練者に周知の他の光学異性体の分割方法、たと えば J．Jaques，A.Collet & S.Wilen，“Enantiomers，Racemates and Resolut ions”，John Wiley and Sons，New York（1981）に記載されている方法が使用 できる。 本発明の化合物の製造 本発明の化合物は既知の出発原料から、たとえば以下に記述するような様々な 方法によって製造することができる。 化合物１ Ａ． 460ｇ（3.06Ｍ）のメトキシアセトフェノンナトリウム、700ｇ（6.2Ｍ）のシ アノ酢酸エチル、200mlの氷酢酸、50ｇのβ−アラニンおよび500mlのヘキサンの 混合物を、水を捕集しながら18時間還流した。20ｇのβ−アラニンを加え、還流 を６時間−水の分離が事実上認められなくなるまで継続し、ロータリーエバポレ ーターで蒸発させた。1.5ｌのエーテルを加え、５×400mlの水ついで飽和NaHCO₃ で洗浄し、HClで希釈し、乾燥し、蒸発させた。残留物を減圧下に蒸留すると(３ )365ｇ（収率48％）、沸点135〜140℃が得られた。 Ｂ． (３)365ｇ（1.49Ｍ）をエタノール400mlに溶解した。150mlの水中106ｇ（1.68 Ｍ）のKCNの溶液を加えた。18時間撹拌還流した。エタノールをゴム状残留物か ら傾瀉し、ロータリーエバポレーターで撹拌した。残留物をエーテルに溶解して ３×350mlの水で洗浄し、MgSO₄上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残留物を注意 深く減圧下に蒸留すると(４)237ｇ（80％）、沸点128〜131℃が得られた。 Ｃ． (４)236ｇを濃H₂SO₄を含むメタノール中Pd／Ｃを添加して還元し、ろ過した。 ロータリーエバポレーターで蒸発させて氷水中に溶解し、50％NaOHを加え、エー テルを添加した。エーテル溶液を水で洗浄し、乾燥し、蒸発させた。残留物を蒸 留すると(５)187ｇ（83％）、沸点88〜90℃が得られた。 Ｄ． 977ｇ（5.58Ｍ）のブロモベンゼンを常法によりグリニャール試薬に変換し、 最終容量５ｌの溶液とした。700mlのエーテル中192ｇ（2.23Ｍ）のブチルアルコ ールを徐々に添加した。２時間撹拌還流した。800mlの濃HBr、ついで水1.5ｌを 加え、十分撹拌し、分離した。有機層を蒸発させた。残留物を1500mlの48％HBr と混合し、40時間激しく還流した。氷水で希釈し、エーテルで２回抽出した。エ ーテル層を水、希NaOH、水で洗浄し、MgSO₄上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。 残留物を減圧下に蒸留すると(８)513ｇ（71％）、沸点129〜131℃が得られた。 Ｅ． 43ｇ（0.225M）の(５)、76.5ｇ(0.237M)の(8)、50ｇのK₂CO₃ および200mlのアセトニトリルを、20時間撹拌還流した。ろ過し、ロータリーエ バポレーターで蒸発させた。残留物をエーテルに溶解し、水で洗浄し、MgSO₄上 で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残留物を20mlの無水酢酸で処理し、エーテルで 希釈し、希HClで抽出した。水相および油状の塩酸塩を取り、塩基性にしてエー テルで抽出した。エーテル溶液を水で洗浄し、MgSO₄上で乾燥し、ろ過し、蒸発 させた。残留物は塩酸塩に変換し、イソプロパノール／エーテルで結晶化した。 50ｇ（融点123〜127℃）が得られた。イソプロパノール／エーテルから再結晶す ると43ｇの（９）融点123〜127℃が得られ、10ｇをトルエンから再結晶すると融 点127〜130℃の生成物８ｇが得られた。 分析：計算値：Ｃ，71.55；Ｈ，6.43；Ｎ，2.90 分析値：Ｃ，71.66；Ｈ，6.48；Ｎ，2.99 化合物２ 工程１：Ｎ−〔ｍ−クロロフェニル〕ベンズイミドイルクロリド 化合物(Ａ)23.17ｇ（0.1Ｍ）および五塩化リン20.8ｇ（0.1Ｍ）を20〜25℃の 水浴で冷却しながら一緒に撹拌する。ついで水浴を徐々に加熱すると、反応混合 物は液体になり、HClが発生する。加熱は80℃で20分間継続する。室温まで放冷 したのち、減圧下にPOCl₃をできる限り完全に蒸発させる。蒸発は２×50mlの乾 燥ベンゼンを用いて反復する。残留物(Ｂ)を100mlの乾燥エーテルに溶解する。 このエーテル溶液はそのまま工程３に使用する。 工程２： ６−メチルクマリン(Ｃ)80ｇ（0.5Ｍ）を350mlの無水EtOH中ナトリウム17.2ｇ （0.75Ｍ）の溶液に加える。反応溶液を一夜還流する（湿気を排除して）。室温 まで放冷したのち、反応溶液を氷水2000ml中に注ぐ。撹拌し、接種しながら300m lの水中50mlのAcOHを滴下して生成物を沈殿させる。氷浴で冷却したのち固体(Ｄ )を集め、水で洗浄し、真空中60℃で一夜乾燥する。収量：灰白色の固体94.5ｇ 融点112〜114℃。 工程３：固体(Ｄ)＋trans−２−ヒドロキシ−５−メチル桂皮酸エチル ナトリウム2.3ｇ（0.1Ｍ）を100mlの乾燥エタノールに溶解する。この溶液を 氷浴で冷却しながら撹拌する。50mlの乾燥THF中固体(Ｄ)20.6ｇ（0.1Ｍ）を少量 ずつ添加し、ついで、残留物(Ｂ)の溶液を滴下して加え（30分を要する）、この 間温度は０〜５℃に保持する。撹拌は室温で一夜継続する。ついで、反応混合物 を冷水1000 ml中に注ぎ、３×150mlのベンゼンで抽出する。抽出液を合わせて水で洗浄し、M gSO₄上で乾燥し、ベンゼンを減圧下に蒸発させると淡黄色のシロップ42ｇが得ら れる。この粗生成物(Ｅ)はそのまま工程４に使用する。 工程４：trans−２−〔ｍ−クロロアニリノ〕−５−メチル桂皮酸 生成物(Ｅ)を金属浴を用いて300℃に加熱する。温度は反応混合物の内部で測 定する。反応混合物を室温まで放冷したのち、350mlのエタノールに取り、50ml の50％NaOHおよび50mlの水を加え、この溶液を蒸気浴上で３時間還流する。大部 分のEtOHを減圧下に蒸発させ、残留物を1000mlの温水に取る。生成物を100mlの 濃HClおよび200mlの水の混合物で一度に沈殿させる。油状の沈殿は放置すると固 化する。固体を集め、水洗し、80mlのCCl₄と磨砕し、水およびCCl₄で洗浄する。 黄色の固体を再結晶し、洗浄し、真空中I00℃で３時間乾燥する。収量：明黄色 の固体(Ｆ)7.6ｇ、融点166〜168℃。 サンプル：50％EtOHから再結晶、融点167〜168℃。 計算値：Ｃ，66.80％：Ｈ，4.91％；Ｎ，4.87％；Cl，12.33％ 分析値：Ｃ，66.82％；Ｈ，4.96％；Ｎ，4.91％ 化合物３ 工程１： ６−メチルクマリン(１)80ｇ（0.5Ｍ）を350mlの無水EtOH中ナトリウム17.2ｇ （0.75Ｍ）の溶液に加える。反応溶液を一夜還流する（湿気を排除して）。室温 まで放冷したのち、反応溶液を氷水2000ml中に注ぐ。撹拌し、接種し、氷浴で冷 却しながら300mlの水中50mlのAcOHを滴下して加えて生成物を沈殿させる。固体( ２)を集めて、水で洗浄し、真空中60℃において一夜乾燥する。収量：灰白色の 固体94.5ｇ、融点112〜114℃。 工程２：Ｎ−ベンゾイル−ｏ−フルオロアニリン ｏ−フルオロアニリン(３)50ｇ（0.45Ｍ）およびベンゼン450mlの溶液を撹拌 しながら加熱する。次に57.5ml（0.5Ｍ）のベンゾイルクロリドを滴下して加え る。反応混合物を一夜還流する。HClが発生し、沈殿したHCl塩は徐々に消失して 澄明な溶液が得られる。室温まで放冷したのち、同容量のヘキサンを加えてフラ スコをガラス棒で擦ると結晶化が起こる。固体(４)を集め、ヘキサンで洗浄し、 真空中60℃で一夜乾燥する。収量：ほぼ白色の固体81.5ｇ、融点111〜113℃。 工程３：Ｎ−〔ｏ−フルオロフェニル〕ベンズイミドイルクロリド 化合物(４)21.5ｇ（0.1Ｍ）およびPCl₅ 20.8ｇ（0.1Ｍ）を20〜25℃の水浴で 冷却しながら一緒に撹拌する。ついで水浴を80℃に加熱すると、固体の混合物は HClを発生しながら液化する。撹拌は80℃で20分間継続する。減圧下にPOCl₃を蒸 発させ、蒸発は２×50mlの乾燥ベンゼンを用いて反復する。残留物(５)を100ml の乾燥エーテルに溶解し、そのまま工程５に使用する（最終的にろ過）。 工程４： ナトリウム2.3ｇ（0.1Ｍ）を100mlの無水EtOHに溶解する。この溶液を氷浴で 冷却しながら撹拌する。50mlの乾燥THF中20.6ｇ（0.1Ｍ）の化合物２を少量ずつ 添加し、ついで、残留物(５)の溶液を30分を要して滴下して加える。ついで撹拌 を室温において一夜継続する。反応混合物を1000mlの冷水中に注ぎ、３×150ml のベンゼンにより抽出し、ベンゼン抽出液を合わせて300mlの水で洗浄し、MgSO₄ 上で乾燥し、ろ過し、ベンゼンを減圧下に蒸発させると、淡黄色の シロップ44ｇが得られる。生成物(３)は工程５に使用する。 工程５：trans−２−〔ｏ−フルオロアニリノ〕−５−メチル桂皮酸 生成物(３)を金属浴を用いて300℃に加熱する。温度は反応混合物内に浸した 温度計で測定する。室温まで放冷したのち、反応混合物を350mlのエタノールに 取り、50mlの50％NaOHおよび50mlの水を加え、この溶液を蒸気浴上で５時間還流 し、ついで室温に一夜放置する。大部分のEtOHを蒸発させ、残留物を1000mlの熱 水に取り、生成物は200mlの水中100mlの濃HClで沈殿させる。油状の沈殿を分離 し、100mlのCCl₄と磨砕すると結晶化が起こる。固体を集めて（３時間後）、CCl₄ で洗浄する。100mlのEtOHおよび100mlの水から再結晶し（Noriteを添加）、50 ％EtOHで洗浄し、真空中にて80℃で５時間乾燥する。収量：暗黄色の固体(４)6. 1ｇ、融点167〜170℃。 分析：計算値：C，70.85％；H，5.20％；N，5.17％ 分析値：C，70.82％；H，5.11％；N，4.98％(燃焼困難)。 本発明によれば、コレステロールの腸管吸収を遮断し、それによって動物の血 流中のコレステロールレベルを低下させるために、任意のホスホリパーゼA₂イン ヒビターを使用できる。上述の化合物に 加えて、ホスホリパーゼA₂を阻害することが明らかにされた他の多くの化合物が 知られている。ホスホリパーゼA₂はグリセロリン脂質を２−位で切断して脂肪酸 とリゾリン脂質を生成するヒドロラーゼ酵素としてよく知られている。ホスホリ パーゼA₂インヒビターはこのような加水分解を低減させる任意の化合物である。 たとえばWilkerson：Drugs ofthe Future，15(2)：140-147（1990）に記載され ているように多くの異なる種類の有機分子がホスホリパーゼA₂のインヒビターで あることが知られている。上記記載はこのようなインヒビターの教示に関し引用 により本明細書に導入される。本発明による血中コレステロールレベルの低下を 実現するには膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターの有効量を投与すればよい。共 通して使用されるインヒビターには、４−アミノブチロフェノン類、フルオロケ トン類、アミノアミド類、ベンジルアミン類、ベンズオキサピン類、エポキシド 類、アラキドン酸誘導体、アルキルアミン類、レチノイド類、ポリエン類、ヒド ロキシケトン類、1,4−ジヒドロピリジン類、芳香族チオエーテル類、スルフィ ド類、異項環アミド類、キノン類、環状炭化水素アミン類、脂肪族チオエーテル 類およびα−ヒドロキシチオエーテル類、グリセロール誘導体、リン脂質類、な らびにペプチドたとえばプリパスタチン等が包含される。他のホスホリパーゼA₂ インヒビターはBeatonら、J. Med. Chem.，37(5)：557-559（1994）に記載され ている。この記載も引用により本明細書に導入される。 特定の化合物が膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターとして分類できるか否かを 決定するためには、多くの方法が利用できる。たとえばReynoldsら、Methodsin Enzymology ，197：３-23にはホスホリパ ーゼA₂に特異的に適用可能な様々のアッセイが記載されている。これらのアッセ イには、物理的アッセイたとえば滴定法および分光法、ならびに生物学的アッセ イたとえば大腸菌および補酵素Ａを用いる方法−連結アッセイがある。特定の化 合物が膵臓ホスホリパーゼA₂酵素のインヒビターとして有効であるか否かを決定 するためには、任意の技術的に承認されたアッセイを使用できる。膵臓ホスホリ パーゼA₂インヒビターであることを示し得る任意の化合物が、本発明において、 コレステロールの腸管吸収の阻害によりコレステロールの血中レベルを低下させ るために使用できる。 さらに他の実施態様において、本発明は、上述の膵臓ホスホリパーゼA₂インヒ ビター化合物またはその医薬的に許容される塩のその状態の処置に有効な量を医 薬的に許容される担体とともに投与することからなる高コレステロール血症およ び／または冠動脈疾患の処置のための医薬組成物を包含する。「状態」の語は動 脈硬化、冠動脈疾患等を包含する意味である。 活性成分を含有する医薬組成物は、経口的使用に適した形態、たとえば錠剤、 トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳化 液、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップもしくはエリキシルとすること ができる。経口的使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のための本技術分 野で周知の任意の方法によって製造可能であり、このような組成物には、医薬と して品位のある口に合う製剤を提供するため、甘味剤、着香剤、着色剤および防 腐剤からなる群より選ばれる１または２以上の物質を含有させることができる。 錠剤は活性成分を、錠剤の製造に適当な非毒性の医薬的に許容される賦形剤と混 合して含有する。これらの 賦形剤は、たとえば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウ ムまたはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤、たとえばトーモロコシデンプ ンまたはアルギン酸のような顆粒化剤および崩壊剤、たとえばデンプン、ゼラチ ンまたはアラビアゴムのような結合剤、ならびに、たとえばステアリン酸マグネ シウム、ステアリン酸またはタルクのような滑沢剤とすることができる。錠剤は 裸錠でも、また胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、それによって長時間 にわたる持続作用を与えるために、既知の方法でコーティングすることもできる 。たとえば、グリセロールモノステアレート、またはグリセロールジステアレー トのような徐放化物質を使用できる。それらはまた、米国特許第4,256,108号、 第4,166,452号、および第4,265,874号に記載の方法によってコーティングして、 制御放出のための浸透圧治療錠を形成させることもできる。 経口的に用いられる製剤は、活性成分が不活性希釈剤、たとえば炭酸カルシウ ム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合された硬質ゼラチンカプセル剤、 または活性成分が水もしくは油性媒質、たとえば落花生油、流動パラフィンもし くはオリーブ油と混合された軟質ゼラチンカプセルとして提供することもできる 。 水性の懸濁液には活性成分が水性の懸濁液の製造に適当な賦形剤と混合されて 含まれる。このような賦形剤は、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウ ム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナト リウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムおよびアラビアゴムのような懸 濁剤、たとえばレシチンのような天然のホスファチド、たとえばポリオキシエチ レンステアレートのようなアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成 物、たとえばヘプタデカエチレンオキシセタールのようなエチレンオキシドと長 鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビトールモ ノオレエートのようなエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキセタールから誘導さ れる部分エステルとの縮合生成物、または、たとえばポリエチレンソルビタンモ ノオレエートのようなエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキセタール無水物から 誘導される部分エステルとの縮合生成物とすることができる分散剤または湿潤剤 である。水性懸濁液にはまた１種もしくは２種以上の防腐剤、たとえばｐ−ヒド ロキシ安息香酸エチルもしくはｎ−プロピルエステル、１種もしくは２種以上の 着色剤、１種もしくは２種以上の着香剤、ならびに１種もしくは２種以上の甘味 剤たとえば蔗糖もしくはサッカリンを含有させることもできる。 油性の懸濁液は、活性成分を植物油、たとえば落花生油、オリーブ油、胡麻油 もしくはココナッツ油または鉱油たとえば流動パラフィンに懸濁することによっ て製剤化できる。油性の懸濁液には、増粘剤たとえば密蝋、硬質パラフィンまた はセチルアルコールを含有させることができる。口あたりのよい経口用製剤を提 供するために、上述したような甘味剤、および着香剤を添加することもできる。 これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を添加して保存することが できる。水を加えて水性懸濁液を調製するのに適した分散性の散剤および顆粒剤 は活性成分を分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤および１種または２種以上の防腐剤 と混合して調製される。適当な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁剤はすでに上に 例示した通りである。その他の賦形剤、たとえば甘味剤、着香剤および着色剤も 含有させることができる。 本発明の医薬組成物はまた、水中油型の乳化液の形態とすることもできる。油 相は、植物油たとえばオリーブ油もしくは落花生油、鉱油たとえば流動パラフィ ンまたはこれらの混合物とすることができる。適当な乳化剤は、天然のゴムたと えばアラビアゴムまたはトラガントゴム、天然のホスファチドたとえばソルビタ ンモノオレート、および上記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、 たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。乳化液には甘味 剤および着香剤を含有させることもできる。 シロップおよびエリキシルは、甘味剤たとえばグリセロール、プロピレングリ コール、ソルビトール、または蔗糖で製剤化することができる。このような製剤 にはさらに、粘滑剤、防腐剤、ならびに着香剤および着色剤を含有させることが できる。医薬組成物は、滅菌された注射用の水性または油性懸濁液の形態とする ことができる。この懸濁液は上述した適当な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁剤 を用いて既知の技術に従って製剤化することができる。 膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターは、体重１kgあたり１日約0.01mg〜約150m gのオーダーの投与量レベルが上述の疾患の処置に有用である（患者あたり約0.5 mg〜約7.5ｇ／日）。たとえば、高コレステロール血症は、体重１kgあたり１日 約0.2〜50mg（患者あたり約20mg〜約3.５ｇ／日）の膵臓ホスホリパーゼA₂イン ヒビター化合物の投与によって効果的に処置できる。好ましくは、体重１kgあた り１日約１mg〜約20mgの投与量が良好な結果を生じる（患者あたり約25mg〜約１ ｇ／日）。 単一の剤形を製造するために担体物質と配合される活性成分の量は、処置され る対象および特定の投与様式に依存して変動する。 たとえば、ヒトに経口投与することを意図した製剤では、活性薬物0.5mg〜５ｇ を、総組成物に対して約５％〜約95％の間で変動する適当な便利な量の担体物質 と配合して含有させることができる。剤形は一般に約１mg〜約500mgの活性成分 を含有する。 高コレステロール血症または冠動脈疾患の処置に使用するためには、膵臓ホス ホリパーゼA₂インヒビターは、それが適当であれば、経口的に投与することがで きる。投与される１日用量は、最低0.1〜25mgまたはそれ以上で、単回にもしく は好ましくは１日２〜４回の分割用量での投与計画とすることができるが、１日 １回投与でも十分である。経口投与の場合には、薬物は通常の任意の剤形、たと えば錠剤またはカプセル剤として同時送達または持続放出のいずれかの形態で使 用することができる。通常の賦形剤または打錠補助剤の任意の数を、同様に包含 させることができる。 すなわち、溶液、挿入体、懸濁液、または錠剤中には、活性医薬もしくは等量 のその塩を使用し、残部はこの種の組成物に慣用される担体、賦形剤、防腐剤等 とする。 すべての投与計画、必要な投与量は、疾患および患者の応答を基盤に変動する ものであり、個々の患者について決定されなければならないものである。 本発明はさらに他の実施態様において、上述のような状態にあるヒトを含む哺 乳動物のその状態の処置方法であって、膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターたと えば以下の式Ｉ〜VI： の化合物またはそれらの医薬的に許容される塩を単位剤形の形で投与する方法を 包含する。医薬組成物または式Ｉ〜VIの化合物もしくは塩を用いる上述の処置方 法は、上述の状態の予防的処置を包含するものである。 本発明の処置方法において医薬組成物中の活性薬物として用いら れる式Ｉ〜VIの好ましい化合物は 4,4′−ヘプチリデンビス−２−メチル−フェノール； 1,4−ジヒドロ−１−(フェニルメチル)−４−ウンデシル−5H−テトラゾール −５−イミン； １−〔4,4−ビス(４−フルオロフェニル)ブチル〕−３−(３−メトキシフェニ ル)−３−メチルピロリジン； ホスホン酸メチル−〔２−(ヘキサデシルオキシ)フェニル〕メチルエステル； ９−オクタデセンアミド、とくにその(Ｚ)型； ２−(ｍ−クロロアニリノ)−５−メチル−桂皮酸、とくにそのtrans型、およ び ２−(ｏ−フルオロアニリノ)−５−メチル−桂皮酸、とくにそのtrans型 からなる群より選ばれる。 ホスホリパーゼA₂によるPCの加水分解は腸管脂質吸収の開始工程であるとの結 論を支持するデータ 膵臓ホスホリパーゼA₂（以下“PLA₂”と呼ぶ）によるPCの加水分解が腸管脂質 吸収の開始に重要な工程であるとの結論は、培養腸管細胞（Caco-2）による脂質 吸収に対するミセルＰＣの作用、ならびにリンパ管瘻ラットおよびコレステロー ル給餌ラットにおける脂質吸収に対するPLA2インヒビターの作用を検討した実験 によって以下のように支持される。 Ｉ．Caco-2細胞試験 Caco-2細胞は、脂質吸収ならびにそれに続く再エステル化およびミセル由来の 脂質の分泌に対するホスファチジルコリンおよびリゾ ホスファチジルコリンの作用を比較するために、ヒト腸上皮の組織培養モデルと して使用された。Caco-2細胞はヒト結腸腺癌に由来し、培養すると自然に分極し た細胞単層を形成し、吸収された脂質から合成されるリポ蛋白の産生および極性 分泌を含めて、正常腸管細胞の多くの形態学的および機能的な特徴を示す〔Trab er M.G.，KaydenH.J．& Rindler M.J.，Polarized secretion of newly synthes i-zed lipoproteins by the Caco-2 human intestinal cell line，J.Lipid Res .，28：1350-1363(1987)；Field F．J.，Albright E.& Mathur S.N.，Regulatio n of triglyceride-rich lipoproteinsecretion by fatty acids in Caco-2 cel ls，J.Lipid Res.，29：1427-1437(1988)〕。 脂質吸収とミセルのリン脂質組成 頂部および基底側部培養液を分離する微孔性膜上で増殖させたCaco-2細胞単層 をタウロコレート、ならびに５mMタウロコール酸、300μMモノオレオイルグリセ ロール、500μM[³H]オレイン酸、100μM[¹⁴C]コレステロールと各種比率の１− パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリンおよび１−パルミトイルリ ゾホスファチジルコリンからなる200μMのリン脂質によって構成される混合脂質 ミセルとインキュベートした。ミセルは細胞単層の頂部側に添加した。リン脂質 を含まないミセルについても比較のために試験した。６時間のインキュベーショ ンの終わりに、細胞および基底側部メジウム中の放射標識脂質の含量を測定した 。リン脂質の含量はコレステロールの吸収および代謝に著しく影響した（図１お よび２）が、脂肪酸の取り込みおよび代謝にはわずかな作用しか示さなかった（ 図３）。リン脂質としてホスファチジルコリンのみを含むミセル とインキュベートしたCaco-2単層はリン脂質を含まないミセルとインキュベート した細胞単層に比し、[¹⁴C]コレステロールの吸収が65％低かった。ホスファチ ジルコリンをリゾホスファチジルコリンで置換するとこの作用は逆転したが、こ れはミセルリゾホスファチジルコリンのモル分画が50％を越えた場合のみであっ た。 コレステロールの取り込みに対する結果とは対照的に、ミセルのリン脂質組成 はミセルの[³H]オレイン酸の取り込みには有意な影響を与えなかった。細胞に輸 送される[³H]オレイン酸の95％以上がは細胞のアシル化脂質に取り込まれ、その 92％以上が[³H]−標識TGおよびPCに認められた。図３から明らかなように、[³H] オレイン酸のTGおよびPCへの取り込みはミセルのリン脂質組成によって実質的に 影響されなかった。アシル−CoA：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（A CAT）活性はPC含有ミセルとインキュベートした細胞中では低下した（図１Ｂお よび１Ｃ）が、TGおよびPC合成についての結果は、アシルトランスフェラーゼに 利用できる[³H]オレオイル−CoAの細胞への供給はミセルのリン脂質組成によっ て修飾されなかったことを示唆している。[³H]オレイン酸の取り込みによって測 定されるACAT活性の低下は、細胞に入るミセルコレステロールの供給に正比例し た（図１Ａおよび１Ｂ）。リン脂質を含まないミセルとのインキュベーションの 場合に比較して、50％またはそれ以上のコリン脂質をPCの型で含有するミセルと のインキュベーションではコレステリル[³H]−オレエートの合成が65％低下した 。ミセルの[¹⁴C]コレステロールのエステル化はさらに大幅に低下した（図１Ｃ ）。 脂質の分泌は細胞の脂質合成に直接依存した。図２にプロットし たデータが指示するように、放射能標識された脂質代謝物のCaco-2細胞単層の基 底側部側のメジウムへの細胞性分泌がミセルのリン脂質の組成の修飾の結果とし ての細胞の脂質合成における変動に直接相関した（図１）。 ホスホリパーゼA₂−依存性のコレステロール吸収 Caco-2単層のPC含有ミセルとのインキュベーションへのブタ膵臓ホスホリパー ゼA₂の添加はコレステロール吸収の抑制を逆転した。これはミセル[¹⁴C]コレス テロールの吸収およびエステル化の時間経過を、リン脂質を含まないミセル、リ ゾ−PCもしくはPC、またはPLA₂の存在下にPCを含有するミセルとインキュベート したCaco-2単層で比較した図４から明らかである。いずれの場合も、細胞により 取り込まれたミセル[¹⁴C]コレステロールの大部分（約90％）は12時間のインキ ュベーション期間を通じてエステル化されないままであった。リン脂質を含まな いかまたはリゾ−PC−含有ミセルとインキュベートした単層の場合には、３時間 のインキュベーション後に細胞の遊離[¹⁴C]コレステロールは定常状態のレベル にあった。これに対して、PC含有ミセルを与えられた細胞では、12時間のインキ ュベーション後にも、細胞会合[¹⁴C]コレステロールのそのレベルの高々45％が 得られたにすぎなかった。これは、PC含有ミセルとのインキュベーションにPLA₂ を添加することによってPCの不存在下に得られたレベルの76％に上昇した。細胞 の[¹⁴C]コレステロールのエステル化はミセルのリン脂質組成によってさらに強 力に影響された。12時間までに、ミセルにリン脂質を加えないでインキュベート した場合に対し、リゾPC、PCまたはPLA₂の存在下にPCを含有するミセルとインキ ュベートした場合の[¹⁴C]コレステリルエステルの細 胞レベルはそれぞれ152％、7％および60％であった。すなわち、PLA₂はミセルPC の阻害効果を部分的に逆転した。 ミセル[¹⁴C]コレステロールの吸収における結果とは対照的に、ミセル[³H]オ レイン酸の取り込みおよび代謝はミセルのリン脂質組成によってわずかしか影響 されなかった（図５）。吸収された[³H]オレイン酸から形成される主要な細胞生 成物であった[³H]オレエート標識トリグリセライドの細胞内蓄積はミセルのリン 脂質組成によって有意な影響を受けなかった（図５Ａ）。リン脂質を含まないミ セルとインキュベートした場合に比較して、PLA₂の存在下にリゾPCまたはPCを含 有するミセルとインキュベートした場合、６時間後に、[³H]オレエート標識PCの 合成にわずかな低下が検出された（図５Ｂ）。多分PC合成のアシル化前駆体とし て利用できるミセル由来のリゾPCの供給の増加により、細胞内でのPCのアシル化 が低下したものと考えられる。 レチノールの吸収 図４に記載の実験に用いられたミセルプレパレーションは、10μMのレチノー ルも含んでいた。レチノールは、コレステロールの吸収に対するミセルのリン脂 質組成の影響が他の脂肪アルコールにも及ぶかどうかを決定するために包含させ た。コレステロールと同様に、レチノールは、食餌から腸管上皮によって吸収さ れ、脂肪酸によるアシル化ならびに生成したレチニルエステルのカイロミクロン への組込みを包含する類似の輸送過程によって循環中に運ばれる[Blomhoff R.， Green M．H.，Berg T．& Norum K．R.，“Transport and storage of vitamin A ．“Science 250：399-404(1990)]。[¹⁴C]コレステロールの吸収がミセルのPCに より遮断された同じ実 験（図４）で驚くべきことに、レチノールの取り込みおよびエステル化はミセル リン脂質組成の変化により修飾されなかった（図６）。 リパーゼ試験 パーゼおよびカルボキシルエステルリパーゼの相当するミセル化基質に対する活 性もPLA₂によるPCの分解に依存することが示唆されている［Borgstrom B.，“Im portanceof phospholipids，pancreaticphospholipase A₂and fatty acid for t he digestion of dietaryfat.”Gastroenterology 78：954-962(1980)］。これ についてCaco-2細胞で試験した。ホスファチジルコリン、トリオレイン、コレス テリルオレエートおよびコレステロールを含むタウロコール酸ミセルをCaco-2細 胞単層の頂部表面を覆うメジウム中に加えた。試験した中性脂質リパーゼに応じ て、トリオレインまたはコレステリルオレエートのいずれかがトリチウム標識さ れた。放射標識脂質の取り込みおよび代謝の時間経過を、中性脂質リパーゼの存 在下または不存在下に、PLA₂を加えてまたは加えないで検討した。カルボキシル エステルリパーゼおよびトリグリセライドリパーゼの結果をそれぞ る結果と一致する。ミセルの[³H]コレステリルオレエートの標識は、カルボキシ ルエステルリパーゼおよびPLA₂の両者がインキュベーション中に含まれていない と細胞内には入らなかった。ミセルのトリ[³H]オレインの取り込みについての結 果は、PLA₂に対するトリグリセライドリパーゼ活性の類似のしかしそれほど厳密 ではない依存性を示している。トリチウム標識はいずれのリパーゼ単独で実施し たインキュベーションにおいても細胞内に入ったが、両リパーゼ を一緒に含有するインキュベーションにおいてトリチウム化脂質の最大の細胞内 蓄積が認められた。 II．リンパ管瘻ラットによる試験 ラットの近位十二指腸に灌流カニューレを挿入し、第二のカニューレは腸管か らのリポ蛋白の排出を遮断するために腸間膜リンパ管に植え込み、腸管の脂質吸 収経路を隔離した。このリンパ管瘻ラットモデルを用いて、灌流脂質乳化液の腸 管吸収に対する膵臓PLA₂の阻害作用をインシトゥで検討した。典型的な実験では 、実験灌流の前日にカニューレの植え込みを行った。手術後、動物をデキストロ ース含有等張性食塩水（2.5ml／時）で灌流して、GI管を洗浄し、リンパ管の脂 質排出の基底レベルを測定した。実験当日にはデキストロース回復溶液の灌流を １時間継続して、基底のリンパ分画を収集した。次の１時間の開始時に、十二指 腸灌流カニューレへの取り込みを、サフラワー油（59mM）、コレステロール（5. 2mM）、PC（3.3mM）およびタウロコール酸（1.9mM）を含有する等張性食塩水の 脂質乳化液に切り換えた。実験終了時まで、１時間リンパ分画を収集した。リン パ分画の脂質含量（質量）を質量感受性蒸発型光散乱検出器付HPLCによって測定 した。 ミセルのジエステルおよびジエーテルPC類縁体の脂質吸収に対する影響 正常のアシル鎖がグリセロール骨格にエーテル結合によって連結したアルキル 炭素鎖により置換されたPCの類縁体は、慣用のジエステルPC分子と同様の物理− 化学的性質を有するが、PLA₂によって加水分解されない。腸管の脂質吸収におけ るミセルPCの加水分解の意義を決定するために、PC構成成分として、1,2−ジパ ルミトイルPC ［DPPC（エステル）］もしくは1,2−ジパルミチルPC［DPPC（エーテル）］によ り調製された脂質マイクロエマルジョンで灌流したラットからの腸間膜リンパ管 の脂質排出を比較した。結果を図９にプロットするが、これは、リンパ管のコレ ステリルエステル（CE）排出がDPPC（エステル）での灌流に比較してDPPC（エー テル）の灌流により著しく低下したことを示している。実際、DPPC（エステル） の灌流とは異なりDPPC（エーテル）の灌流によるリンパ管コレステリルエステル の排出は、脂質エマルジョンの灌流を開始して８時間後まで基底の排出レベル以 上に上昇しなかった。DPPC（エーテル）灌流時の12時間の間の総リンパ管ＣＥ排 出はDPPC（エステル）エマルジョンで得られた総CE排出のわずか47％であった。 腸間膜リンパ管へのTGおよびPCの腸からの排出もジエーテルPC類縁体によって 低下した。DPPC（エーテル）灌流の場合、TGおよびPCの総排出はDPPC（エステル ）での灌流の場合に比しそれぞれ71％および75％であった。CEの分泌の結果とは 異なり、脂質灌流の開始後のリンパ管のTGおよびPCの排出の上昇開始はDPPC（エ ーテル）によって遅延しなかった。これらの結果は、腸管の脂質吸収は管腔内PC の分解に依存するとの仮説を支持する。 脂質吸収に対するPLA₂の影響 脂質吸収に対する無傷のPCの効果を評価できるように腸管内容物中のPCを保持 させる別法は、特異的なインヒビターで膵臓PLA₂を不活性化する方法である。２ 種のPLA₂インヒビター、[1,4−ジヒドロ−１−(フェニルメチル)−４−ウンデシ ル−５Ｈ−テトラゾール−５−イミン（化合物Ｂ）およびホスホン酸メチル−１ −[２−(ヘキサデシルオキシ)フェニル]メチルエステル（化合物Ｄ）をリンパ管 瘻ラットの脂質吸収について試験した。基底リンパ液サンプルの収集および脂質 エマルジョンの灌流は、エマルジョンのPC成分として鶏卵のPCを用いた以外は上 述の場合と本質的に同様とした。インヒビターは脂質エマルジョン灌流液の一部 として試験動物の腸管に導入した。基底リンパ液の収集のためのデキストロース ／食塩水での灌流１時間後に、十二指腸カニューレへの取り込みを、インヒビタ ー（試験ラット）またはインヒビターの可溶化に用いたビヒクルを含む脂質エマ ルジョン（対照ラット）に移行させた。灌流したインヒビターの総量は30mg／kg であった。それは7.5mlのエマルジョンに加え３時間で灌流させた。インヒビタ ー／エマルジョンまたはビヒクル／エマルジョン混合物の灌流完了後、実験の残 余時間は十二指腸カニューレの取り込みを単純な脂質エマルジョンに移した。 対照の灌流液で得られたリンパ管ＣＥ排出の脂質エマルジョン依存性上昇は、 いずれのインヒビターによっても著しく平坦化した（図10および11）。これに対 してインヒビター処置によるリンパ管からのTGの排出には有意な低下は認められ なかった。いずれのインヒビターもリンパ管からのPCの排出率に有意な低下を生 じたが、CEの場合に検出されたほどではなかった。リンパ管からのCEの排出低下 が、その結果を同じく説明できるアシル−CoA：コレステロールアシルトランス フェラーゼ（ACAT）の阻害による可能性を除外するため、両化合物ともにACATの インビトロアッセイ中で試験された。このインビトロアッセイに用いたラット肝 ACATはいずれの化合物によっても阻害されなかった。 III．コレステロール給餌ラット血漿脂質に対するPLA₂インヒビターの効果 食餌中のコレステロールの吸収を阻害する薬物は最終的に、食後の血漿コレス テロールの上昇を抑制しなければならない。これは数種のPLA₂インヒビターにつ いてコレステロール給餌ラットで試験した。一般的プロトコールでは、関心化合 物のカルボキシメチルセルロース／Tween 20分散液を調製して、100mg／kgの用 量で胃チューブにより予め給餌に馴化させたラットに強制投与した。インヒビタ ーの投与直後に、コレステロール、落花生油およびコール酸を補充した富脂質固 形餌料を給餌した。対照動物で給餌開始から約８時間後に血漿コレステロールレ ベルが通常ピークに達したので、ラットはこの時点で屠殺し血漿脂質レベルを測 定した。 結果は以下の表１に示す。表から、経口的に投与されたPLA₂インヒビター（表 中の化合物Ａ〜Ｇ）は食餌による血漿コレステロールの上昇を有意に阻止するこ とが明らかである。インビボ活性との比較のために、ブタ膵臓PLA₂のインビトロ 阻害のIC₅₀値をともに示す。 VI．結論 Caco−細胞およびラットを用いた上述の試験は、膵臓PLA₂が脂質の腸管吸収に 重要であることを示している。これらのデータはまた、ここに確認された化合物 がコレステロールの低下に有用であることを確証するものである。 本発明の範囲に包含される化合物の有用性を支持するデータ １．膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターのマススクリーニング蛍光法の使用 膵臓ホスホリパーゼA₂（PLA₂）のインビトロにおける活性を測定するために高 感度の蛍光方法を使用した。PLA₂は脂肪酸をグリセロリン脂質中のsn−２位置に 結合するエステル結合を加水分解する。蛇毒液、関節液、血小板、免疫活性細胞 種および膵臓から単離されるPLA₂を含めて数種のPLA₂が存在する。膵臓PLA₂は腸 管における脂質の吸収を促進するその基本的な役割により、この実験の課題であ った。 PLA₂活性は、（１−ピレニル）−デカン酸がPLA₂の作用により1,2−ビス−（ １−ピレンデカノイル）sn−グリセロ−３−ホスホコリン［(P10)₂PC］のsn−２ 位置から加水分解される時に発生するピレンエキサイマーの蛍光喪失により検出 された。PLA₂活性の検出への類似のピレン標識PC基質の使用は以前に記載されて いる［Radvanyi F.，Jordan L.，Russo-Marie F.，Bon C.，“A sensitive andc on-tinuous fluorometric assay for phospholipase A₂ using pyre-nelabeled phospholipids in the presence of serum albumin.”Anal.Biochem.，117：103 -109(1989)］。このアッセイの光物理学的な基盤については、他に詳細に記載さ れている［Birks J．B.,“Photophysics of Aromatic Molecules,”Wiley-Inter science,New York，301-371頁(1970)］。 略述すれば、ピレンエキサイマーは基底状態の１つのピレン残基が励起状態の １つのピレン残基と複合体化して形成される励起状態の二量体（エキサイマー） であり、励起状態のピレンモノマーの波長域（370〜400nm）より長波長域（発光 極大475nm）に蛍光を発す る。エキサイマーの形成はピレン残基の濃度に依存する。(P10)₂PCは、ほぼもっ ぱらピレン発色団の固定された並列配置により、エキサイマー蛍光を発する。PL A₂作用の産物すなわちリゾPY10PCと(１−ピレニル)−デカン酸の間のエキサイマ ーの形成がきわめてわずかになるように基質濃度は十分に希薄にする。 一般に、このアッセイ計画はすべてのタイプのPLA₂に適用可能なはずである。 しかしながら、膵臓PLA₂はほぼもっぱらミセル化されたPCに対して作用する点で 独特で他のPLA₂とは異なるので、このアッセイではPC基質を１mMのデオキシコー ル酸でミセル化した。ミセルのPC成分は99倍過剰の（495μM）の１−オレイル− ２−パルミチルホスファチジルコリン（OPPC）で希釈した５μMの(P10)₂PC基質 とした。OPPCは通常のPCのエステル結合脂肪族アシル鎖の代わりにエーテル結合 脂肪族アルキル鎖を含有するのでPLA₂の加水分解には不活性であった。OPPCは、 １）ミセルの(P10)₂PC濃度を希釈し分子間エキサイマー形成を最小限にするため 、および２）非特異的なミセルの破壊は非線形キネティクスと脂肪の分解に無関 係な蛍光変化を招く可能性があるので、PLA₂の作用に対してミセルの統合性を維 持するために含有させた。 ２．材料および方法 ２.１．試薬および科学物質 ホスホリパーゼA₂（ブタ膵臓）、ウシ血清アルブミン（BSA）（分画Ｖ，実質 的に脂肪酸を含まない）とデオキシコール酸ナトリウムはSigma Chemical Compa ny（St.Louis，MO）から入手した。１−オレイル−２−パルミチル−DL−ホスフ ァチジルコリン（OPPC）はSerdary Research Laboratories，Inc．(London，Ont .，Canada) に注文した。1,2−ビス−(１−ピレンデカノイル)−sn−グリセロ−３−ホスフ ァチジルコリン［(P10)₂PC］はMolecular Probes,Inc．(Eugene，OR)より入手し た。 ２.２．保存溶液 HEPES緩衝液（SHE）は150mM NaCl、20mM HEPES（Ｎ−[2−ヒドロキシエチル] ピペラジン−N′−[２−エタンスルホン酸]）ならびに１mM EDTA（エチレンジア ミン四酢酸）pH8.0を含有した。 水中１Ｍ CaCl₂ クロロホルム中１mMの(P10)₂PC溶液は、Molecular Probesから入手したままの (P10)₂PC １mgを含むバイアルにクロロホルム１mlを加えて調製した。実際の濃 度はクロロホルム溶液10μlをエタノール２mlで希釈し分光光度法で決定した。 エタノール溶液の吸収スペクトルを380nm〜280nmで測定した（Beckman DU-64） 。342nmの吸収のピーク高（ODU）に200を乗じ、1.5×10⁵M^-1cm^-1（吸光係数）で 除し、(P10)₂PCのクロロホルム中濃度を得た。 SHE中２mMのデオキシコール酸ナトリウムは、適当量のデオキシコール酸ナト リウムをSHEに加え、１Ｎ NaOHでpHを8.0に調整することによって調製した。 クロロホルム中26.7mMのOPPC（20mg／ml）はSerdary Research Laboratories から購入したまま使用した。 SHE中0.2％（v／v）BSA ２.３．操作溶液 基質溶液10mlあたり、１mMの(P10)₂PC溶液50μlおよび26.7mMのOPPC溶液185μ lをガラス容器中で混合して、N₂気流下にクロロホルムを蒸発させた。残留した 溶媒を真空下に１〜２時間置いて除去し た。乾燥した脂質をSHE中２mMのデオキシコール酸ナトリウム10ml中に分散させ た。脂質の完全な分散を保証するため、水浴ソニケーター中に置いた。最終溶液 は光学的に透明でなければならない。 酵素溶液は、3.2Ｍ硫酸アンモニウム中の懸濁液としてSigmaから供給されたPL A₂（約5000単位／ml、６〜７mg／ml）３μlを20mlの0.2％BSA／SHE中に希釈して 調製した。１ＭのCaCl₂ 240μlを加えて最終[Ca⁺⁺]を12mMとした。各PLA₂操作溶 液の活性は、基質の50％加水分解が約60分で起こることを確認するために試験し た。それに応じて酵素希釈液を調整した。 ２.４．装置 励起光のパスに340nmバンドパスフィルター（38％ピーク透過率）（EalingEle ctro-Optics，Holliston，MA）およびSchott UGllフィルター(２mm厚)(Scott Gl ass Technologies，Inc.，Duryea，PA)ならびに放射光のパスに480nmバンドパス フィルター(50％ピーク透過)(Corion Corp.，Holliston，MA)を装着したICN／La bsystems Fluoroskan−II蛍光マイクロプレートスキャナー。 ２.５．アッセイ方法 ・各96−ウエルマスタープレートのウエルＡ１，Ａ12，Ｂ１，Ｂ12，Ｃ１，Ｃ 12に５μlのDMSOを添加した。 ・５μlの基準インヒビターをウエルＤ１，Ｅ１およびＦ１に添加した。 ・対照ウエルは、SHE中0.2％BSA50μlを加えてＡ12，Ｂ12およびＣ12の位置に 設けた。 ・カラム１〜11のすべてのウエルに50μlの酵素操作溶液を添加した。 ・プレートを覆い、振盪し、５〜10分間放置して化合物を酵素と平衡化した。 ・プレートをFluoroskan-IIで走査してバックグランド蛍光を読み取った。 ・カラム１〜12のすべてのウエルに50μlの基質操作溶液を添加し、振盪し、 ５分間放置した。 ・プレートをFluoroskanで走査して当初蛍光を得た。 ・プレートを覆い、60分間放置した（室温）。 ・再び走査して60分反応時の蛍光を得た。 ３．データ分析 96ウエル、Ｘ−Ｙマスタープレート中の基準ウエルの配置。ＺはPLA₂と基質を 含有し、インヒビターを含まないウエルを示す。ＲはPLA₂と基質に加えて基準イ ンヒビターを含むウエルを示す。Ｘは基質のみを含有し、PLA₂を含まないウエル を指示する。 阻害率％は、各ウエルについて基質の添加後０分および60分に得られた蛍光値 から計算した。この計算を実施する前に、60分に得られた蛍光値は60分間にわた る検出器のドリフトに対して補正した。この目的には、Ｘと標識したウエルにお ける基質蛍光は一定であるからそれらを使用した。これは、60分に得られた蛍光 値にｔ＝０分におけるＸ−ウエル値と60分におけるＸ−ウエル値の比を乗じて行 われた（式１）。 式中、Ｆ(α,β)は列＝α，欄＝βのウエルの補正された蛍光値である。観察 された蛍光値はｆ(α,β)である。60分の間における各ウエル位置での蛍光の変 化とＺと標識されたウエルにおける蛍光の相当する変化の比を用いて次のように 阻害率％を計算した。 式中、ＺはＺと標識されたウエルにおける平均蛍光値を示す。 ４．結果 PLA₂インヒビターの検出および特性決定のためのアッセイの有用性は、Ｚ−９ −オクタデセンアミド（化合物Ｅ）がPLA₂による1,2−ビス−(１−ピレンデカノ イル)−PCの加水分解を阻害する図12によって明らかである。オレオイルアミド （化合物Ｅの通常名）は、最初にJainと共同研究者によりPLA₂インヒビターとし て同定され［Jain M.K.，Ghomaschi F.，Yu B-Z ら，J.Med.Chem.，35:3584-358 6(1992)］、基質としてメチルホスファチド酸の使用に基づく「スクーティング 様式」アッセイで0.1μMのIC₅₀値が得られている。化合物Ｅは蛍光アッセイでは ３μMのIC₅₀値が得られた（図12）。 ネオマイシンならびにβ−シトステロール（サイテリン）は、高コレステロー ル血症患者の処置のために、コレステロールの吸収阻害剤として使用されている ［Kesaniemiら，Serum choresterollowering by inhibition by cholesterol ab sorption，Atherosc-lerosis，VIII：791-794(1989)］。これらの薬物が腸管コ レステロール吸収を阻害する機構はわかっていない。血清コレステロールレベル の25％までの低下を達成するためには、比較的大用量が投与されなければならな い（ネオマイシン1.5〜2ｇ／日、β−シトステロール３〜50ｇ／日）。これらの 薬物に対するPLA₂インヒビターの利点は、コレステロール吸収阻害の機構がわか っていること、および十分強力なPLA₂インヒビターははるかに小用量を投与して （副作用が少なく患者のコンプライアンスが良好であると考えられる）血清コレ ステロールレベルのより大きな低下が達成されることである。たとえば、コレス テロール給餌ハムスターモデルにおいて、ホスホリパーゼA₂のインヒビターであ るホスホン酸メチル−[２−(ヘキサデシルオキシ)フェニル]メチルエステル（化 合物Ｄ，図13）100mg／kgの投与によって生じる血漿および肝臓コレステロール レベルの低下はβ−シトステロールの10倍高用量（すなわち1000mg／kg）で得ら れる低下にほぼ匹敵する。これらのデータは図13にグラフとして示す。膵臓PLA₂ インヒビターは現在の薬物に比して明らかな進歩を示し、それらの使用は高コレ ステロール血症の有益かつ効果的な治療を達成できるコレステロールの吸収阻害 作用を示すことがすで証明されている。 コレステロール吸収インヒビターで得られる血漿コレステロールレベルの最大 低下は不明である。PLA₂についての実験データはPLA₂ がコレステロールの吸収に対して強力な作用をもつことを示唆している。非吸収 性のインヒビターが好ましいと考えられる。理由は、１）それらが作用部位に保 持されること、および２）全身的に作用する薬物に伴う副作用の可能性が回避さ れることである。 腸管のコレステロール吸収は生体におけるコレステロールの代謝回転サイクル の独特の成分の一つであるから、使用されるコレステロール吸収阻害剤によって はコレステロール代謝経路の別の部分に向けられた他の高コレステロール血症治 療剤（たとえばHMG-CoAリダクターゼ阻害剤）の作用を増強する可能性が考えら れる。 PLA₂ インヒビターのトリグリセライドまたはコレステリルエステル脂肪分解を 遮断するための使用 phospholipase A₂ and fatty acidfor the digestion of dietary phospholipase A₂ and gastric lipase on the action of pancreatic carboxyl ester lipase against lipid substrates in vitro.”Biochem ．Biophys．Acta ，1084：194-197(1991)］は、無傷の腸管内PCがコレステロール吸収のみではな く、さらに他の腸管内脂質成分の取り込みに影響することが示唆している。彼ら はトリグリセライド（TG）またはコレステリルエステル（CE）を含むPCの混合脂 質分散液中において、膵臓トリグリセライドリパーゼおよびカルボキシルエステ ルリパーゼは、まずPCを加水分解するためにホスホリパーゼA₂が脂質混合物に添 加されないとそれらのそれぞれの基質を加 水分解できないことを観察した。これらの結果は、管腔内PCはまた腸内のTGおよ びCE脂肪分解を遮断することが可能で、したがって本発明のPLA₂インヒビターの 使用はTGおよびCE吸収から起こる疾患の処置に応用できる可能性がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/41 ＡＤＮ 9454−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/41 ＡＤＮ 31/66 9551−4Ｃ 31/66 45/00 8615−4Ｃ 45/00 Ｃ０７Ｃ 255/28 9357−4Ｈ Ｃ０７Ｃ 255/28 323/36 7419−4Ｈ 323/36 323/63 7419−4Ｈ 323/63 Ｃ０７Ｄ 207/08 9638−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 207/08 Ｃ０７Ｆ 9/40 9450−4Ｈ Ｃ０７Ｆ 9/40 Ｚ // Ｃ０７Ｃ 15/16 9734−4Ｈ Ｃ０７Ｃ 15/16 22/08 7106−4Ｈ 22/08 25/18 7106−4Ｈ 25/18 233/09 9547−4Ｈ 233/09 Ｚ Ｃ０７Ｄ 257/04 7822−4Ｃ Ｃ０７Ｄ 257/04 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＥＥ，ＪＰ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＸ，ＳＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式Ｉ〜II： （式中ＲおよびR₁は水素、ヒドロキシ、低級アルキル、ハロゲン、トリフルオ ロメチル、シアノ、ニトロ、メチルチオ、低級アルケニル、および低級アルキニ ルからなる群より選択される）の化合物またはそれらの医薬的に許容される塩。 ２．Ｒは低級アルキルである請求項１記載の化合物。 ３．R₁はハロゲンである請求項１記載の化合物。 ４．R₁は式Ｉにおける４−位置のフッ素である請求項３記載の化合物。 ５．R₁は式IIにおける３−位置の塩素であるかまたは２−位置のフッ素である請 求項３記載の化合物。 ６．１−[4,4−ビス(４−フルオロフェニル)ブチル]−３−(３−メトキシフェニ ル)−３−メチル−ピロリジン、 ２−(ｍ−クロロアニリノ)−５−メチル桂皮酸、 ２−(ｍ−クロロアニリノ)−５−メチル−trans−桂皮酸、 ２−(ｏ−フルオロアニリノ)−５−メチル−桂皮酸、および ２−(ｏ−フルオロアニリノ)−５−メチル−trans−桂皮酸 からなる群より選ばれる請求項１記載の化合物または医薬的に許容される塩。 ７．１−[4,4−ビス(４−フルオロフェニル)ブチル]−３−(３−メトキシフェニ ル)−３−メチルピロリジンである請求項１記載の化合物。 ８．２−(ｍ−クロロアニリノ)−５−メチル−trans−桂皮酸である請求項１記 載の化合物。 ９．２−(ｏ−フルオロアニリノ)−５−メチル−trans−桂皮酸である請求項１ 記載の化合物。 10．治療有効量の請求項１記載の化合物またはその医薬的に許容される塩および 医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。 11．治療有効量の請求項６記載の化合物またはその医薬的に許容される塩および 医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。 12．動脈硬化または冠動脈疾患に罹患している哺乳動物におけるその疾患の処置 方法において、式Ｉ〜VI： （式中、ＲおよびR₁は水素、ヒドロキシ、低級アルキル、ハロゲン、トリフル オロメチル、シアノ、ニトロ、メチルチオ、低級アルケニル、および低級アルキ ニルからなる群より選択される）の化合物またはそれらの医薬的に許容される塩 および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物を投与する方法。 13．Ｒは低級アルキルである請求項12記載の方法。 14．R₁はハロゲンである請求項12記載の方法。 15．R₁は式Ｉにおける４−位置のフッ素である請求項14記載の方法。 16．R₁は式VIおける３−位置の塩素または２−位置のフッ素である請求項14記載 の方法。 17．請求項12に記載のアテローム性動脈硬化または冠動脈疾患の処 置方法において、使用される化合物は、 4,4′−ヘプチリデンビス−２−メチル−フェノール、 1,4−ジヒドロ−１−(フェニルメチル)−４−ウンデシル−5H−テトラゾー ル−５−イミン、 １−[4,4−ビス(４−フルオロフェニル)ブチル]−３−(３−メトキシフェニ ル)−３−メチル−ピロリジン、 ホスホン酸メチル−[２−(ヘキサデシルオキシ)フェニル]メチルエステル、 (Ｚ)−９−オクタデセンアミド、 ２−(ｍ−クロロアニリノ)−５−メチル−桂皮酸、および ２−(ｏ−フルオロアニリノ)−５−メチル−桂皮酸、 からなる群より選ばれる化合物またはそれらの医薬的に許容される塩および医 薬的に許容される担体である方法。 18．化合物は、１−[4,4−ビス(４−フルオロフェニル)ブチル]−３−(３−メト キシフェニル)−３−メチル−ピロリジンである請求項12記載の方法。 19．化合物は、２−(ｍ−クロロアニリノ)−５−メチル−trans−桂皮酸である 請求項12記載の方法。 20．化合物は、２−(ｏ−フルオロアニリノ)−５−メチル−trans−桂皮酸であ る請求項12記載の方法。 21．動物におけるコレステロールの腸管吸収を防止する方法において、処置を必 要とする動物に治療有効量の膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターを投与すること からなる方法。 22．高コレステロール血症状患者における血中コレステロールレベルを低下させ る方法において、処置を必要とする患者に、治療有 効量の膵臓ホスホリパーゼA₂インヒビターを投与することからなる方法。