JPH104964A - Rnaの合成方法、該方法によって得られたrna、該rnaから他のrnaに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスrnaを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスrna、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法 - Google Patents

Rnaの合成方法、該方法によって得られたrna、該rnaから他のrnaに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスrnaを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスrna、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法

Info

Publication number
JPH104964A
JPH104964A JP8162607A JP16260796A JPH104964A JP H104964 A JPH104964 A JP H104964A JP 8162607 A JP8162607 A JP 8162607A JP 16260796 A JP16260796 A JP 16260796A JP H104964 A JPH104964 A JP H104964A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rna
ribozyme
antisense
virus
hiv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP8162607A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3291554B2 (ja
Inventor
Takanori Miura
孝典 三浦
Norio Ogata
規男 緒方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TAIKO YAKUHIN KK
Taiko Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
TAIKO YAKUHIN KK
Taiko Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TAIKO YAKUHIN KK, Taiko Pharmaceutical Co Ltd filed Critical TAIKO YAKUHIN KK
Priority to JP16260796A priority Critical patent/JP3291554B2/ja
Publication of JPH104964A publication Critical patent/JPH104964A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3291554B2 publication Critical patent/JP3291554B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 変異後のウイルスにでも対処できる多様性を
持ったリボザイムライブラリーやアンチセンスRNAラ
イブラリーの製造方法を提供すること。 【解決手段】 鋳型及びプライマーの不存在下、セルモ
コッカス属に属する細菌の耐熱性DNAポリメラーゼの
存在下でリボヌクレオチドを、約20〜90℃、中性〜
弱アルカリ性の条件下で重合させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、RNAの合成方
法、該方法によって得られたRNA、他のRNAに対し
てハイブリッド形成能力を有するRNA(リボザイム、
アンチセンスRNA)を前記RNAから精製する方法、
該方法により精製されたRNA(リボザイム、アンチセ
ンスRNA)、及びこのRNAによりウイルスの複製を
阻害する方法に関し、詳しくは鋳型並びにプライマー非
依存的にRNAを合成する方法、換言すれば、遺伝情報
を蛋白質の持つ情報のみに依存してRNAを創造し合成
する方法、創造されたRNA、このRNAからリボザイ
ム、アンチセンスRNAを精製する方法、この精製され
たRNAを、有用なリボザイム、アンチセンスRNAと
して抗ウイルス剤に用いるなど、医学、発酵工学、農
学、化学分野等で利用する方法に関する。
【0002】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】近年、遺
伝子工学のめざましい発展にともない、医学、農学、発
酵工学等の分野は、多大な恩恵を受けている。例えば、
医学分野においては、遺伝子治療や遺伝子診断等が遺伝
子工学を用いた手法を多く取り入れ、今まさに大きな発
展を遂げようとしている。
【0003】ここで、遺伝子治療を例として挙げると、
この遺伝子治療の一部には、例えば、アンチセンスRN
Aやリボザイム等を用いる治療方法も研究されている。
【0004】エイズ治療においては、アンチセンスRN
Aによるエイズウィルス(以下、「HIV」という)蛋
白質合成の阻害(他のRNAに対するアンチセンスRN
Aのハイブリッド箇所における翻訳の停止による阻害)
や、リボザイムによるHIVRNAの切断等の試みが行
われている。
【0005】しかし、HIVは変わり身(変異)が速
く、自らの構造を変化させて免疫系によるHIV排除の
網をうまく潜り抜ける性質を持っているので、HIVに
特異的なアンチセンスRNAやリボザイムを開発して
も、このHIVが変異する結果、特異性を失ってもはや
HIVに対してハイブリダイズしなくなるという問題点
があった。
【0006】この問題点を解決するためには、変異後の
HIVにでも対処できる多様性を持ったリボザイムライ
ブラリー(リボザイム分子集団)やアンチセンスRNA
ライブラリー(アンチセンスRNA分子集団)、及びこ
の分子集団から、有用なRNA(リボザイムやアンチセ
ンスRNA)をスクリーニングする技術の開発が課題で
あった。なお、この課題はHIVに限られるものでもな
く、例えば他のレトロウィルスであるインフルエンザウ
ィルスやC型肝炎ウィルスやD型肝炎ウィルス等を含む
遺伝子治療全般の課題でもある。
【0007】しかしながら、リボザイムやアンチセンス
RNAの開発は、RNA合成の開発と密接な関係にある
ものの、従来のRNA合成技術により得られるRNAで
は、以下の理由により、多様性を持つリボザイムやアン
チセンスRNA等のライブラリーの生産は不可能であっ
た。
【0008】すなわち、RNAは、言うまでもなくD−
リボースの糖成分とアデニン(A)、グアニン(G)、
シトシン(C)及びウラシル(U)等の塩基成分を持つ
ヌクレオチドが、ホスホジエステル結合で一本の鎖状重
合体を形成したポリヌクレオチドであり、このRNAの
生合成は、ATP、GTP、CTP、UTP等のヌクレ
オチド三燐酸を基質としてDNAまたはRNA依存的に
RNAポリメラーゼにより行われる。その反応産物はメ
ッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRN
A(tRNA)、リボゾームRNA(rRNA)等であ
るが、いずれもDNAまたはRNAの鋳型を前もって必
要とし、その反応産物は鋳型に相補的なRNAしか得ら
れなかった。つまり、蛋白質のみの情報に依存し、配列
に多様性を持つRNAを合成することは不可能であっ
た。従って、多様性を持つリボザイムやアンチセンスR
NA等のライブラリー生産も、従来の技術では不可能で
あった。
【0009】
【課題を解決するための手段】請求項1記載のRNAの
合成方法は、鋳型およびプライマーの不存在下、蛋白質
の存在下でリボヌクレオチドを重合させることを特徴と
する方法である。
【0010】請求項2記載のRNAの合成方法は、請求
項1記載の方法において、前記蛋白質が耐熱性DNAポ
リメラーゼであることを特徴とする方法である。
【0011】請求項3記載のRNAの合成方法は、請求
項2記載の方法において、前記耐熱性DNAポリメラー
ゼがセルモコッカス属、セルマス属に属する細菌のDN
Aポリメラーゼからなる群より選ばれた少なくとも1種
であることを特徴とする方法である。
【0012】請求項4記載のRNAの合成方法は、請求
項1〜3のいずれか1項記載の方法において、約20〜
90℃の温度下で重合を行なう方法である。
【0013】請求項5記載のRNAの合成方法は、請求
項1〜4のいずれか1項記載の方法において、中性〜弱
アルカリ性の条件下で重合を行なう方法である。
【0014】請求項6記載のRNAは、請求項1〜5の
いずれか1項記載の合成方法により得られてなるもので
ある。
【0015】請求項7記載のリボザイムの精製方法は、
請求項6記載のRNAから、他のRNAとハイブリッド
を形成する能力を有するリボザイムを精製する方法であ
って、前記した他のRNAをリガンドとして共有結合し
たアフィニティークロマトグラフィーを用いることによ
り行なわれる方法である。
【0016】請求項8記載のリボザイムは、請求項7記
載の方法により精製されてなる、他のRNAとハイブリ
ッドを形成する能力を有するリボザイムである。
【0017】請求項9記載のアンチセンスRNAの精製
方法は、請求項6記載のRNAから他のRNAとハイブ
リッドを形成する能力を有するアンチセンスRNAを精
製する方法であって、前記した他のRNAをリガンドと
して共有結合したアフィニティークロマトグラフィーを
用いることにより行なわれる方法である。
【0018】請求項10記載のアンチセンスRNAは、
請求項9記載の方法により精製されてなる、他のRNA
とハイブリッドを形成する能力を有するアンチセンスR
NAである。
【0019】請求項11記載のウイルスの複製を阻害す
る方法は、請求項8記載のリボザイムまたは請求項10
記載のアンチセンスRNA、あるいはその両方を、ウイ
ルス感染細胞(生物より取り出した細胞、生物に直接導
入する場合は非ヒト。)にトランスフェクションするこ
とにより行なわれる方法である。
【0020】請求項12記載の抗ウイルス剤は、請求項
8記載のリボザイムまたは請求項10記載のアンチセン
スRNA、あるいはその両方よりなり、ウイルス感染細
胞にトランスフェクションされる抗ウイルス剤である。
【0021】
【発明の実施の形態】本発明者等は、RNA合成の研究
において種々の発見をした。蛋白質、中でも耐熱性DN
Aポリメラーゼ、例えばセルモコッカス・リトラリス
Thermococcus litoralis)の
DNAポリメラーゼ(商品名:VentDNAポリメラ
ーゼ、ニューイングランド・バイオ・レイブス社製)
(以下、「Tli DNAポリメラーゼ」という)をp
H約7または10以下の弱アルカリ性条件下で、リボヌ
クレオチド三燐酸(ATP、CTP、GTP、UTP)
を基質として、ポリメラーゼが失活しない約20℃以上
(好ましくは約60℃以上、さらに好ましくは約70℃
以上の温度でも失活しないもの)のポリメラーゼ活性を
示す範囲の昇温下で、1時間以上反応させることによ
り、鋳型及びプライマー非依存的にRNA(さまざまな
塩基配列、及びさまざまな大きさを有するRNA分子集
合体)を合成することができることを発見した。
【0022】しかも驚くべきことに、このRNA群の中
には、アンチセンスRNAとなり得るRNA(つまり
は、他のRNAとハイブリッドを形成する能力のあるR
NA)、さらには、リボザイムとなり得るRNA(つま
りは、他のRNAとハイブリッド形成するとともにその
RNAを切断せしめるRNA)が多数含まれていること
が分かった。
【0023】DNAポリメラーゼの具体例としては、上
掲したセルモコッカス・リトラリス(Thermoco
ccus litoralis)等のセルモコッカス属
以外に、セルマス・アクアティクス(Thermus
aquaticus)、同セルモフィルス(the
rmophilus)などのセルマス属に属する細菌の
DNAポリメラーゼが挙げられる。
【0024】上記DNAポリメラーゼは1種を単独で使
用してもよいし、2種以上(2種、3種、……)を併用
した混合系として用いることもできる。DNAポリメラ
ーゼを2種以上で併用してリボヌクレオチドを重合する
場合は、1種単独で重合する場合と比べ、一度に合成さ
れるRNAがさらに多様化し(すなわち、塩基配列がよ
り様々なRNA(群)が得られ)、アンチセンスRNA
またはリボザイムとなり得るRNAの含有率が高くな
る。この場合、同属の異なる細菌のDNAポリメラーゼ
の併用でもよいし、異なる属の細菌のDNAポリメラー
ゼでもよい。
【0025】リボヌクレオチドとしては、前述したよう
に、例えばATP、UTP、GTP、CTPが用いら
れ、それらの4種類または3種類を反応系に存在させれ
ば反応は進行する。
【0026】上記リボヌクレオチドとDNAポリメラー
ゼとの反応は、pH約7またはpH10以下の弱アルカ
リ性で行なうのが好ましい。
【0027】反応温度と時間はDNAポリメラーゼが失
活しない範囲で選ぶことができ、約20℃以上でポリメ
ラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で反応させることに
より、反応を速やかに進行させることができる。たとえ
ば、74℃で数時間反応させてもよく、また通常のPC
R反応の条件、たとえば、(1)95℃で1分間保持、
(2)45℃で2分間保持、(3)74℃で3分間保持
のサイクルを反復してもよい。
【0028】反応は初期に若干の遅延時間を経たのち開
始され、やがて最大速度に達する。本発明の方法により
合成されるRNAは鋳型やプライマーとなるべきDNA
やRNAに依存せずに、反応系に存在するDNAポリメ
ラーゼの情報に依存して合成されると考えられる。
【0029】上記のようにして得られたRNAは2本鎖
であるが、これを1本鎖に変性する方法としては、例え
ば、RNAの溶液を5分間煮沸し、その後直ちに氷中に
5分インキュベートする方法が挙げられる。
【0030】次に、本発明により得られたRNAのリボ
ザイム活性を検出するため、HIVRNAに対する切断
活性を調べた。
【0031】まず、5′末端標識したHIV RNAを
マグネシウムイオンを含む中性〜弱アルカリ性pH約6
〜10の条件下で鋳型・プライマー非依存的RNA(以
下、「NT−RNA」という)と混合し、約20〜60
℃の昇温下で反応させた。
【0032】この反応液とHIV RNAとを共にアル
カリアガロースゲルへ電気泳動する[サムロック・T
等、モレキュラー・クローニング(ア・ラボラトリー・
マニュアル)(Molecular Cloning
(A LaboratoryManual))、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス,1
989年発行]。
【0033】このアガロースゲルにサランラップ(商品
名、旭化成社製)をかけ、オートラジオグラフィーを行
った。その結果、オートラジオグラフィーのバンドはN
T−RNAを添加したものについて、無添加の対照に比
べ、短くなっていることが確認された。
【0034】次に別の種類のHIV RNAに対するリ
ボザイム活性を上述の方法で測定した。その結果、HI
V−1 RNAにおいても上記と同様、リボザイム活性
を有することが確認された。
【0035】次に、C型肝炎ウィルス(以下、「HC
V」という)に対するリボザイム活性を上述の方法にて
測定した。その結果、HCVにおいてもこのNT−RN
Aはリボザイム活性を有していることが確認された。
【0036】かくして、NT−RNAにはHIV RN
Aに対してのリボザイム活性を有することが確認され、
これはHIVの変異種においても使用できることが確認
された。また、HIV以外のウィルスにもリボザイムと
して使用でき、よって、一般のRNAに対するリボザイ
ムライブラリーを提供することが可能となる。
【0037】次に、このNT−RNA中に存在する、他
のmRNAに対するアンチセンスRNAをスクリーニン
グした。
【0038】HeLa Cell S3 mRNA(ク
ローンテック社、CL6522−1)をアルカリアガロ
ースゲルにて電気泳動後、公知の手法によりニトロセル
ロース膜(シュライヒャー&シュウェル社製)にトラン
スファーした。NT−RNAを公知の方法にて、例えば
放射性同位元素にて標識したプローブを作製し、ノザン
・ブロット法(市野、細胞工学実験プロトコール、秀潤
社、1992年発行)を行った。
【0039】この結果、mRNA中に特異的にハイブリ
ッドできるRNAがNT−RNA中に存在していること
が確認され、このNT−RNAがアンチセンスRNAと
なり得ることが判明した。
【0040】このことより、NT−RNAは、アンチセ
ンスRNAライブラリーをも提供できることが確認され
た。
【0041】次に、NT−RNA中のリボザイム及びア
ンチセンスRNAの精製を、HIV−1 RNAをリガ
ンドとして行った。
【0042】HIV−1 RNAをリガンドとして適当
なクロマトグラフィー担体、例えば、CNBr−活性化
セファロース4B(ファルマシア社製)等の担体に共有
結合せしめ、HIV−1 RNAアフィニティーカラム
を作製し、液体クロマトグラフィーを行った。クロマト
グラフィー条件としては、中性〜弱アルカリ性pH約6
〜9以下の高塩濃度の緩衝液にてNT−RNAを供し、
HIV−1 RNAとハイブリッド形成させた。
【0043】次に、マグネシウムイオンを含む中性〜弱
アルカリ性pH約6〜9以下の中塩濃度の緩衝液にて溶
出されてくるリボザイムを260nmの吸収を測定する
ことにより回収した。その後、まだハイブリッド形成し
ているアンチセンスRNAを高濃度ホルムアミドを含む
中性〜弱アルカリ性pH約6〜9以下の緩衝液にて回収
した。
【0044】このアフィニティークロマトグラフィーに
用いるリガンドRNAは、HIV−1 RNAの他、C
型肝炎ウイルスやインフルエンザウイルスのRNAや細
胞の腫瘍化に深く関与している癌遺伝子や成長因子のm
RNA等広く多くのRNAを使用することができる。
【0045】また、この方法を用いて1つのカラムにて
リボザイムとアンチセンスRNAを両方同時に精製する
ことが可能となる。よってこの方法は、本発明によって
得られるNT−RNAより、簡単に、かつ効率よく目的
のRNAに対するリボザイムやアンチセンスRNAを精
製する優れた手法であるといえる。その意味で、前記N
T−RNAは、リボザイムライブラリー、アンチセンス
RNAライブラリーであるということもできる。
【0046】次に、上述の方法にて精製したリボザイ
ム、及びアンチセンスRNAを用いてHIV−1に対す
る増殖抑制効果を調べた。
【0047】この調査に用いる細胞はCD4を発現して
いる細胞(以下、「CD4細胞」という)全てについ
て行うことが可能で、例えばCD4発現HeLa細胞
等も用いることができる。
【0048】手順としては、CD4細胞に燐酸カルシ
ウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション
法、マイクロインジェクション法などの既存の方法を用
いて、NT−RNAより精製したHIV−1特異的リボ
ザイム、HIV−1特異的アンチセンスRNA、及びそ
の両方をトランスフェクションする。対照としてリボザ
イム及びアンチセンスRNAのいずれをもトランスフェ
クションしていない細胞を用意した。そして、これら全
ての細胞にHIVを感染させた。
【0049】その後、HIV感染の指標となる、例えば
HIV gag mRNAの量や、HIV p24の量
等を調べることにより、増殖抑制効果を見た。
【0050】結果として、リボザイム、アンチセンスR
NA、及びその両方、をトランスフェクションした細胞
からは、HIV gag mRNAの量の減少が確認で
きた。このことより、NT−RNAから分離されたリボ
ザイムRNAやアンチセンスRNAは生体内において作
用することが確認され、抗ウイルス剤となり得ることが
確認された。このことは、他のウイルスや生体内RNA
についても適用できることを意味する。
【0051】本発明で用いる耐熱性DNAポリメラーゼ
の製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法として
は今日において公知であり、当業者であれば容易に行う
ことができる。なお、以下に関連公報を列挙する(これ
らによっても得ることができる)。特開平2−6058
5号公報、特公平8−24570号公報(特開平2−4
34号公報)、特開平5−68547号公報、特公平7
−59195号公報(特開平5−130871号公
報)、特開平5−328969号公報、特開平7−51
061号公報、特開平6−339373号公報、特開平
6−7160号公報
【0052】
【実施例】本発明を具体的に表すために以下に実施例を
述べるが、本発明はこれらの実施例に限られるものでは
ない。
【0053】実施例1 (NT−RNAの合成)緩衝液R[10mM KCl,
10mM(NHSO,20mM トリス/HC
l(pH8.8),15mM MnCl,0.1%
トリトンX−100(全て最終濃度)]及びリボヌクレ
オチド三燐酸[ATP、CTP、GTP、UTP(全て
最終濃度)500mM)]、20単位/ml Tli
DNAポリメラーゼから構成される反応液100μlを
74℃で3時間反応させた。
【0054】その後、0.8%アガロースゲルにて電気
泳動し、0.5μg/ml臭化エチジウムにて染色した
結果、50〜10,000塩基対(以下、「bp」とい
う)の染色バンドが確認された。
【0055】次に、このNT−RNAを大量調整するた
めに上記と同じ組成の反応液500mlを反応させた。
その結果、10mgのNT−RNAが調整できた。
【0056】実施例2 (各種RNAに対するNT−RNAのリボザイム活性の
検出)20μg/ml 各種RNA(HIV−1 RN
A,HIV−2 RNA及びHCV RNA)に、交換
緩衝液[50mM イミダゾール/HCl(pH6.
4)、18mM MgCl,5mM ジスレイトー
ル、0.1mM スペルミジンHCl、0.1mM E
DTA]と0.1mM ADP、1nM ATP、1μ
M [γ−32P]ATP(111TBq/mmol)、
4.8%ポリエチレングリコール8000、400単位
/ml T4ポリヌクレオチドキナーゼを加え、全量1
00μlとし、37℃、30分間培養し、最終20mM
となるようにEDTAを加え、反応を停止させた。その
後、フェノール処理、エタノール沈澱にてDNAを回収
し、これをリボザイムのための基質RNAとする。
【0057】次に、NT−RNAのリボザイム活性の検
出を行った。まず、リボザイム緩衝液[50mM トリ
ス/HCl(pH8.0)、20mM MgCl]、
及び各種RNA(上掲)2μg、NT−RNAを10μ
g又は0μg(比較対照用)含む反応液(20μl)
(5分間煮沸し、その後直ちに氷中に5分間インキュベ
ートしたもの)を37℃で6時間反応させた。
【0058】これらの反応液を1%アルカリアガロース
ゲル[50mM NaOH、1mMEDTA、1% ア
ガロースGP−36(ナカライ・テスク社製)]にて電
気泳動後オートラジオグラフィーした。
【0059】その結果、HIV−1 RNA、HIV−
2 RNA、HCV RNAは共に、天然のRNAより
短くなっていることが確認され、このNT−RNAには
リボザイム活性が存在することが確認された。また、N
T−RNAが0μgの例については上記のようなリボザ
イム活性は確認されなかった。
【0060】これにより、実施例1で得られた本発明の
NT−RNAは、上記の結果の如く、各種RNAのいず
れにもリボザイム活性を示すことから、リボザイムライ
ブラリーを形成しているといえる。
【0061】実施例3 (mRNAに対するNT−RNA中のアンチセンスRN
Aの検出(1))既存のmRNAに対するNT−RNA
中のアンチセンスRNAの検出をノザンブロット法にて
行った。まず、HeLa Cell S3 mRNA
10μgをTE緩衝液[10mM トリス/HCl(p
H8.0)、1mM EDTA]10μlに溶かし、1
%変性ゲル[0.2M MOPS/NaOH(pH7.
0)、50mM 酢酸ナトリウム、10mM EDT
A、20% ホルムアミド、1% アガロースGP−3
6]にて電気泳動をした(MOPS:3−(N−モルホ
リノ)プロパンスルホン酸(ナカライテクス社製))。
【0062】その後、ニトロセルロースフィルター(シ
ュライヒャー&シュウェル社)に、RNA(HeLa
Cell S3 mRNA)をトランスファーし、この
フィルターを80℃、2時間乾燥させた。このフィルタ
ーをノザンプレハイブリダイゼーション緩衝液[50%
ホルムアミド、5XSSC(750mM NaCl、
75mM クエン酸 3ナトリウム2水和物)、50m
M リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)、40μg
/ml変性サケ精子DNA、0.2%ポリビニルピロリ
ドン、0.2% フィコール400、0.2% 仔牛血
清アルブミン]10mlに浸し、42℃、2時間、プレ
ハイブリッド形成をさせた。
【0063】プレハイブリッド形成緩衝液を抜き取り、
10mlのプレハイブリッド形成緩衝液とポリヌクレオ
チドキナーゼにて5′末端の燐酸を標識した一本鎖変性
NT−RNA(プローブとして用いる)1μgを用いて
42℃で一晩ハイブリダイゼーションした。
【0064】その後、洗浄液1(2XSSC、0.1%
SDS)にて10分間の洗浄を合計3回行い、洗浄液
2(0.1XSSC、0.1% SDS)で50℃、2
0分間の洗浄を合計3回行った。
【0065】フィルターを乾燥後、オートラジオグラフ
ィーにてHeLa Cell S3mRNAにハイブリ
ッドするNT−RNA由来のバンドを観察したところ、
数ヶ所にバンドが検出できた。この結果、NT−RNA
中にはアンチセンスRNAとなり得るRNAが存在して
いることが示唆された。
【0066】実施例4 (mRNAに対するNT−RNA中のアンチセンスRN
Aの検出(2))HeLa Cell S3 mRNA
の代わりに、ヒト白血病リンパ芽球細胞MOLT−4
mRNAを用いたという以外は、実施例3と同様にして
アンチセンスRNAの検出を行なった。その結果、NT
−RNA中にヒト白血病リンパ芽球細胞 MOLT−4
mRNAに対するアンチセンスRNAとなり得るRN
Aが存在していることが確認された。
【0067】実施例5 (mRNAに対するNT−RNA中のアンチセンスRN
Aの検出(3))上記実施例3において用いたHeLa
Cell S3 mRNAの代わりに、HIV−1
RNAを用いても、NT−RNA中に該mRNAに対す
るアンチセンスRNAとなり得るRNAが存在している
ことが確認された。
【0068】実施例6 (HIV−1 RNAアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いてのNT−RNA中のリボザイム及びアンチセ
ンスRNAの精製)HIV−1 RNAアフィニティー
クロマトカラムの調整を行った。まず、CNBr−活性
化 セファロース 4B(ファルマシア社製)を1mM
HClにて洗浄し、ゲルを膨潤させた。
【0069】次に、ゲルをカップリング緩衝液[0.1
M NaHCO(pH8.3)、0.5M NaC
l]で洗浄した。HIV−1 RNA10μgをこのカ
ップリングバッファーに溶解し、ゲル懸濁液と混ぜ、室
温で2時間混合した。残りの活性基をブロックするため
に、ゲルをブロッキング試薬(0.2M グリシン、p
H8.0)に移し、室温で2時間混合した。カップリン
グ緩衝液で1回洗浄後、洗浄液[0.1M 酢酸緩衝液
(pH4.0)、0.5M NaCl]にて洗浄後、再
びカップリング緩衝液にて洗浄した。
【0070】次に、このHIV−1 RNAアフィニテ
ィークロマトグラフィー担体を用いてリボザイム及びア
ンチセンスRNAの精製を行った。まず、開始緩衝液
[0.7M NaCl 50mM トリス/HCl(p
H7.5)、25% ホルムアミド、20mM EDT
A]にてカラムを平衡化し、このカラムに1本鎖変性N
T−RNA 10μgを供した。
【0071】開始緩衝液でカラムを洗浄後、リボザイム
溶出緩衝液[0.2M NaCl、50mM トリス/
HCl(pH8.0)、20mM MgCl]にてリ
ボザイムを溶出させ回収した。
【0072】次に、RNA溶出緩衝液[10mM リン
酸カリウム緩衝液(pH7.5)、10mM EDT
A、0.2% ラウロイル−サルコシン、90% ホル
ムアミド]にてアンチセンスRNAを溶出させ回収し
た。
【0073】これら回収したRNAのリボザイム活性と
アンチセンス活性をそれぞれ実施例2〜5の方法で検出
したところ、それぞれ活性を有することが確認できた。
【0074】実施例7 (精製リボザイム及びアンチセンスRNAのHIV感染
HeLa細胞に対するHIV増殖抑制効果)NT−RN
Aより分離したHIV−1 RNA特異的なリボザイム
及びアンチセンスRNAのHIVに対する効果を調べ
た。
【0075】まず、CD4発現HeLa細胞を培養補
助液[10%(v/v) 牛胎児血清、100μg/m
l ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシ
ン、2mM L−glutamine、1mM ピルビ
ン酸ナトリウム]を含むダルベッコ変法イーグル培地
(以下、「DMEM」という)(ギブコ社製)にて37
℃で培養した。 70%コンフルエントに培養した細胞
を、トランスフェクション前日にφ10cmペトリ皿に
まいた。リン酸カルシウム共沈法を用いて、HIV−1
特異的リボザイム10μg、HIV−1特異的アンチセ
ンスRNA10μg、及びこれら両方をトランスフェク
ションし、24時間培養した。なお、対照用として、こ
れらのRNAをいずれをもトランスフェクションしなか
った細胞を、同様に24時間培養した。
【0076】その後、細胞を3回燐酸緩衝塩水(以下、
「PBS」という)(132.5mg/リットル Ca
Cl・2HO、121.2mg/リットル MgS
・7HO、200mg/リットル KCl、20
0mg/リットル KHPO、8g/リットル N
aCl、1.15g/リットル NaHPO)にて
洗浄した。
【0077】この細胞に、培養補助液を含むDMEM
2mlと、HIV−1溶液20μlを加え、37℃で培
養した。
【0078】HIV増殖抑制効果を調べるために、HI
V−1のgag mRNA量をノザンブロット法にて調
べた。まず、48時間培養したHeLa細胞をPBSに
て2回洗浄し、緩衝液L[20mM EDTA、0.5
%SDS、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.
2)]にて細胞を溶かした。フェノール処理・エタノー
ル沈澱にて全核酸を回収し、DNA分解溶液[30mM
トリス/HCl(pH7.6)、10mM MgCl
、10mg/ml デオキシリボヌクレアーゼI]に
溶解し、37℃、2時間DNAを分解した。
【0079】反応を停止させるために10mM EDT
A、0.2% SDSとなるように反応液を調節し、フ
ェノール処理・エタノール沈澱にてRNAを回収した。
このRNAを用いて実施例3に示したノザン・ブロット
法にてHIV−1 gag遺伝子に対する配列をプロー
ブとしてHIV−1 mRNA量を調べた。
【0080】その結果、HIV−1 mRNAの量は、
対照として用いたリボザイムやアンチセンスRNAをト
ランスフェクションしていないHIV−1感染細胞と比
較して、リボザイムをトランスフェクションしたものは
5%、アンチセンスRNAをトランスフェクションした
ものは60%、両方トランスフェクションしたものは2
%しか存在しなかった。
【0081】実施例8 (他のDNAポリメラーゼによるNT−RNAの合成
(1))セルマス・アクアティクス(Thermus
aquaticus)のDNAポリメラーゼについても
同様の結果が得られることを確認すべく、実施例1〜7
の操作を繰り返した。すなわち、鋳型およびプライマー
の不存在下、セルマス・アクアティクスDNAポリメラ
ーゼ存在下でリボヌクレオチドを重合させ、これにより
得られたNT−RNAについて、上記と同様の操作を行
なった。
【0082】その結果、セルモコッカス・リトラリス
Thermococcus litoralis)D
NAポリメラーゼによって得られたNT−RNAと同
様、セルマス・アクアティクスDNAポリメラーゼによ
って得られたNT−RNAもまた、多様性のあるリボザ
イム活性およびアンチセンスRNA活性を呈した。これ
により、得られたNT−RNAは、リボザイムライブラ
リーや、アンチセンスRNAライブラリーとなり得、延
いては、ウイルスの多様な変異に対し、これを幅広くカ
バーし得る抗ウイルス剤として使用することが分かっ
た。
【0083】実施例9 (他のDNAポリメラーゼによるNT−RNAの合成
(2))セルマス・セルモフィルス(Thermus
thermophilus)のDNAポリメラーゼにつ
いても同様の結果が得られることを確認すべく、実施例
1〜7の操作を繰り返した。すなわち、鋳型およびプラ
イマーの不存在下、セルマス・セルモフィルスDNAポ
リメラーゼ存在下でリボヌクレオチドを重合させ、これ
により得られたNT−RNAについて、上記と同様の操
作を行なった。
【0084】その結果、セルマス・セルモフィルスDN
Aポリメラーゼによって得られたNT−RNAは、セル
モコッカス・リトラリス(Thermococcus
litoralis)DNAポリメラーゼによって得ら
れたNT−RNAと同様、多様性のあるリボザイム活性
およびアンチセンスRNA活性を呈した。これにより、
得られたNT−RNAは、リボザイムライブラリー、ア
ンチセンスRNAライブラリーとなり得、延いては、ウ
イルスの多様な変異に対し、これを幅広くカバーし得る
抗ウイルス剤としての使用が可能となることが分かっ
た。
【0085】実施例10 (複数のDNAポリメラーゼ併用系でのNT−RNA合
成)実施例1におけるDNAポリメラーゼ単独での使用
に代え、Tli DNAポリメラーゼとセルマス・アク
アティクス(Thermus aquaticus)の
DNAポリメラーゼとを併用し、DNAポリメラーゼ混
合反応液にて実施例1と同様、リボヌクレオチドを重合
させた。
【0086】その結果、DNAポリメラーゼを複数併用
した場合でも、様々な大きさの塩基配列をもつRNA
(NT−RNA)が得られることがわかった(0.8%
アガロースゲルにて行なった電気泳動および0.5μg
/ml臭化エチジウムによる染色で確認)。
【0087】得られたNT−RNAのなかに、HIV−
1 RNA、HIV−2 RNAおよびHCV RNA
に対するリボザイム活性を有しているRNAが存在して
いるか否かを調べるために、実施例2と同様の操作を行
なった。
【0088】その結果、HIV−1 RNA、HIV−
2 RNAおよびHCV RNAは共に、天然のRNA
より短くなっていることが確認され、このNT−RNA
のなかに、上記各種RNAに対するリボザイム活性を有
するRNAが含まれていることがわかった。
【0089】また、アンチセンスRNA活性について
も、DNAポリメラーゼ単独によるNT−RNAの場合
(実施例3〜5)と同様、HeLa Cell S3
mRNA、ヒト白血病リンパ芽球細胞MOLT−4 m
RNA、及びHIV−1 RNAに対するアンチセンス
活性が確認された。
【0090】上記の結果から、複数のDNAポリメラー
ゼを併用した混合反応系であっても、各DNAポリメラ
ーゼによるリボヌクレオチドの重合は保持され、互いに
悪影響を及ぼさないことがわかった。
【0091】DNAポリメラーゼを2種以上で併用して
リボヌクレオチドを重合する場合は、1種単独で重合す
る場合と比べ、一度に合成されるRNAがさらに多様化
していることが予想されるので、HIV−1 RNA、
HIV−2 RNAおよびHCV RNA以外にも、多
種類のRNAに対してリボザイム活性を呈するRNAが
含まれていることが容易に判断できる。またアンチセン
スRNA活性についても同様で、HeLa Cell
S3 mRNA、ヒト白血病リンパ芽球細胞MOLT−
4 mRNA、及びHIV−1 RNA以外にも、多種
類のRNAに対してアンチセンスRNA活性を呈するR
NAが含まれていると思われる。
【0092】
【発明の効果】本発明により、多様性を持ったリボザイ
ムライブラリーやアンチセンスRNAライブラリーを得
ることが可能となり、変異後のウィルスでも充分対処で
きるようになる。
【0093】しかも、本発明のRNA精製方法は、前記
ライブラリーから、有用なRNA(リボザイム、アンチ
センスRNA)を簡単に、しかも同時に精製(選別、ス
クリーニング)することが可能となる。
【0094】精製されたRNAをウイルス感染細胞にト
ランスフェクションすることによりウイルスの複製を阻
害することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:01) (54)【発明の名称】 RNAの合成方法、該方法によって得られたRNA、該RNAから他のRNAに対してハイブリ ッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスRNAを精製する方法、該方法によって精 製されたリボザイムまたはアンチセンスRNA、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】鋳型およびプライマーの不存在下、蛋白質
    の存在下でリボヌクレオチドを重合させることを特徴と
    するRNAの合成方法。
  2. 【請求項2】前記蛋白質が耐熱性DNAポリメラーゼで
    ある請求項1記載の合成方法。
  3. 【請求項3】前記耐熱性DNAポリメラーゼがセルモコ
    ッカス属、セルマス属に属する細菌のDNAポリメラー
    ゼからなる群より選ばれた少なくとも1種である請求項
    2記載の合成方法。
  4. 【請求項4】約20〜90℃の温度下で重合を行なう請
    求項1〜3のいずれか1項に記載の合成方法。
  5. 【請求項5】中性〜弱アルカリ性の条件下で重合を行な
    う請求項1〜4のいずれか1項記載の合成方法。
  6. 【請求項6】請求項1〜5のいずれか1項記載の合成方
    法により得られてなるRNA。
  7. 【請求項7】請求項6記載のRNAから、他のRNAと
    ハイブリッドを形成する能力を有するリボザイムを精製
    する方法であって、前記した他のRNAをリガンドとし
    て共有結合したアフィニティークロマトグラフィーを用
    いることにより行なわれるリボザイムの精製方法。
  8. 【請求項8】請求項7記載の方法により精製されてな
    る、他のRNAとハイブリッドを形成する能力を有する
    リボザイム。
  9. 【請求項9】請求項6記載のRNAから、他のRNAと
    ハイブリッドを形成する能力を有するアンチセンスRN
    Aを精製する方法であって、前記した他のRNAをリガ
    ンドとして共有結合したアフィニティークロマトグラフ
    ィーを用いることにより行なわれるアンチセンスRNA
    の精製方法。
  10. 【請求項10】請求項9記載の方法により精製されてな
    る、他のRNAとハイブリッドを形成する能力を有する
    アンチセンスRNA。
  11. 【請求項11】請求項8記載のリボザイムまたは請求項
    10記載のアンチセンスRNA、あるいはその両方を、
    ウイルス感染細胞にトランスフェクションすることによ
    り行なわれるウイルスの複製を阻害する方法。
  12. 【請求項12】請求項8記載のリボザイムまたは請求項
    10記載のアンチセンスRNA、あるいはその両方より
    なり、ウイルス感染細胞にトランスフェクションされる
    抗ウイルス剤。
JP16260796A 1996-06-24 1996-06-24 Rnaの合成方法、該方法によって得られたrna、該rnaから他のrnaに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスrnaを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスrna、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法 Expired - Fee Related JP3291554B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP16260796A JP3291554B2 (ja) 1996-06-24 1996-06-24 Rnaの合成方法、該方法によって得られたrna、該rnaから他のrnaに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスrnaを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスrna、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP16260796A JP3291554B2 (ja) 1996-06-24 1996-06-24 Rnaの合成方法、該方法によって得られたrna、該rnaから他のrnaに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスrnaを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスrna、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH104964A true JPH104964A (ja) 1998-01-13
JP3291554B2 JP3291554B2 (ja) 2002-06-10

Family

ID=15757818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP16260796A Expired - Fee Related JP3291554B2 (ja) 1996-06-24 1996-06-24 Rnaの合成方法、該方法によって得られたrna、該rnaから他のrnaに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスrnaを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスrna、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP3291554B2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2311994A1 (en) * 2003-08-01 2011-04-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for preparing short RNA molecules and other nucleic acids
US8945884B2 (en) 2000-12-11 2015-02-03 Life Technologies Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiplerecognition sites

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9309520B2 (en) 2000-08-21 2016-04-12 Life Technologies Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US8945884B2 (en) 2000-12-11 2015-02-03 Life Technologies Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiplerecognition sites
EP2311994A1 (en) * 2003-08-01 2011-04-20 Life Technologies Corporation Compositions and methods for preparing short RNA molecules and other nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
JP3291554B2 (ja) 2002-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Crumplin et al. Nalidixic acid and bacterial chromosome replication
KR100735131B1 (ko) 핵산 증폭 방법
US5506212A (en) Oligonucleotides with substantially chirally pure phosphorothioate linkages
US6110462A (en) Enzymatic DNA molecules that contain modified nucleotides
EP2388322B1 (en) Enzymatic preparation containing thermostable dna polymerase, process for producing same, and method for detecting analyte organism
JP3010738B2 (ja) 核酸の交雑、増幅方法
EP3094753B1 (en) Covered sequence conversion dna and detection methods
JPH06511492A (ja) キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチド
JPH02503054A (ja) 核酸配列の増幅および検出
EA005577B1 (ru) Продукт, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, полученный способом с участием химерного олигонуклеотидного праймера, днк-полимеразы и эндонуклеазы
AU3274500A (en) Detection of mutations in genes by specific lna primers
JPH10510433A (ja) 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド
EP3207160B1 (en) Sequence conversion and signal amplifier dna having locked nucleic acids and detection methods using same
Palacio et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis as a tool for viroid characterisation
Carroll et al. Localization of a bidirectional DNA replication origin in the native locus and in episomally amplified murine adenosine deaminase loci
EP3237641B1 (en) Detection method, composition and kit based on signal amplifier dna cascade reactions with target extension
JPH09511654A (ja) マイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ
HU223384B1 (hu) Primerek HIV-1 kimutatására
Eisenberg et al. Enzymatic replication of ϕX174 duplex circles: continuous synthesis
JP3291554B2 (ja) Rnaの合成方法、該方法によって得られたrna、該rnaから他のrnaに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスrnaを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスrna、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法
AU670755B2 (en) Nucleic acid polymerase amplification
Boyer et al. The nucleoside analogs 4′ C-methyl thymidine and 4′ C-ethyl thymidine block DNA synthesis by wild-type HIV-1 RT and excision proficient NRTI resistant RT variants
US5508179A (en) Use of deoxyribose nicotinamide adenine dinucleotide to enhance the specificity of NAD+ -dependent ligation reactions
JPH08297A (ja) バクテリアを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ
JPH0716094A (ja) Rnaポリメラーゼのプロモーター配列をもつ1本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110329

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110329

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120329

Year of fee payment: 10

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees