JP3291554B2 - Ｒｎａの合成方法、該方法によって得られたｒｎａ、該ｒｎａから他のｒｎａに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスｒｎａを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスｒｎａ、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法 - Google Patents
Ｒｎａの合成方法、該方法によって得られたｒｎａ、該ｒｎａから他のｒｎａに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスｒｎａを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスｒｎａ、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＲＮＡの合成方法、
リボザイム活性を有するＲＮＡ混合物の調製方法及びア
ンチセンスＲＮＡの調製方法に関し、詳しくは鋳型並び
にプライマー非依存的にＲＮＡを合成する方法、換言す
れば、遺伝情報を蛋白質の持つ情報のみに依存してＲＮ
Ａを創造し合成する方法、リボザイムの調製方法及びア
ンチセンスＲＮＡの調製方法に関する。
リボザイム活性を有するＲＮＡ混合物の調製方法及びア
ンチセンスＲＮＡの調製方法に関し、詳しくは鋳型並び
にプライマー非依存的にＲＮＡを合成する方法、換言す
れば、遺伝情報を蛋白質の持つ情報のみに依存してＲＮ
Ａを創造し合成する方法、リボザイムの調製方法及びア
ンチセンスＲＮＡの調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】近年、遺
伝子工学のめざましい発展にともない、医学、農学、発
酵工学等の分野は、多大な恩恵を受けている。例えば、
医学分野においては、遺伝子治療や遺伝子診断等が遺伝
子工学を用いた手法を多く取り入れ、今まさに大きな発
展を遂げようとしている。
伝子工学のめざましい発展にともない、医学、農学、発
酵工学等の分野は、多大な恩恵を受けている。例えば、
医学分野においては、遺伝子治療や遺伝子診断等が遺伝
子工学を用いた手法を多く取り入れ、今まさに大きな発
展を遂げようとしている。
【０００３】ここで、遺伝子治療を例として挙げると、
この遺伝子治療の一部には、例えば、アンチセンスＲＮ
Ａやリボザイム等を用いる治療方法も研究されている。
この遺伝子治療の一部には、例えば、アンチセンスＲＮ
Ａやリボザイム等を用いる治療方法も研究されている。
【０００４】エイズ治療においては、アンチセンスＲＮ
Ａによるエイズウィルス（以下、「ＨＩＶ」という）蛋
白質合成の阻害（他のＲＮＡに対するアンチセンスＲＮ
Ａのハイブリッド箇所における翻訳の停止による阻害）
や、リボザイムによるＨＩＶＲＮＡの切断等の試みが行
われている。
Ａによるエイズウィルス（以下、「ＨＩＶ」という）蛋
白質合成の阻害（他のＲＮＡに対するアンチセンスＲＮ
Ａのハイブリッド箇所における翻訳の停止による阻害）
や、リボザイムによるＨＩＶＲＮＡの切断等の試みが行
われている。
【０００５】しかし、ＨＩＶは変わり身（変異）が速
く、自らの構造を変化させて免疫系によるＨＩＶ排除の
網をうまく潜り抜ける性質を持っているので、ＨＩＶに
特異的なアンチセンスＲＮＡやリボザイムを開発して
も、このＨＩＶが変異する結果、特異性を失ってもはや
ＨＩＶに対してハイブリダイズしなくなるという問題点
があった。
く、自らの構造を変化させて免疫系によるＨＩＶ排除の
網をうまく潜り抜ける性質を持っているので、ＨＩＶに
特異的なアンチセンスＲＮＡやリボザイムを開発して
も、このＨＩＶが変異する結果、特異性を失ってもはや
ＨＩＶに対してハイブリダイズしなくなるという問題点
があった。
【０００６】この問題点を解決するためには、変異後の
ＨＩＶにでも対処できる多様性を持ったリボザイムライ
ブラリー（リボザイム分子集団）やアンチセンスＲＮＡ
ライブラリー（アンチセンスＲＮＡ分子集団）、及びこ
の分子集団から、有用なＲＮＡ（リボザイムやアンチセ
ンスＲＮＡ）をスクリーニングする技術の開発が課題で
あった。なお、この課題はＨＩＶに限られるものでもな
く、例えば他のレトロウィルスであるインフルエンザウ
ィルスやＣ型肝炎ウィルスやＤ型肝炎ウィルス等を含む
遺伝子治療全般の課題でもある。
ＨＩＶにでも対処できる多様性を持ったリボザイムライ
ブラリー（リボザイム分子集団）やアンチセンスＲＮＡ
ライブラリー（アンチセンスＲＮＡ分子集団）、及びこ
の分子集団から、有用なＲＮＡ（リボザイムやアンチセ
ンスＲＮＡ）をスクリーニングする技術の開発が課題で
あった。なお、この課題はＨＩＶに限られるものでもな
く、例えば他のレトロウィルスであるインフルエンザウ
ィルスやＣ型肝炎ウィルスやＤ型肝炎ウィルス等を含む
遺伝子治療全般の課題でもある。
【０００７】しかしながら、リボザイムやアンチセンス
ＲＮＡの開発は、ＲＮＡ合成の開発と密接な関係にある
ものの、従来のＲＮＡ合成技術により得られるＲＮＡで
は、以下の理由により、多様性を持つリボザイムやアン
チセンスＲＮＡ等のライブラリーの生産は不可能であっ
た。
ＲＮＡの開発は、ＲＮＡ合成の開発と密接な関係にある
ものの、従来のＲＮＡ合成技術により得られるＲＮＡで
は、以下の理由により、多様性を持つリボザイムやアン
チセンスＲＮＡ等のライブラリーの生産は不可能であっ
た。
【０００８】すなわち、ＲＮＡは、言うまでもなくＤ−
リボースの糖成分とアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、
シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）等の塩基成分を持つ
ヌクレオチドが、ホスホジエステル結合で一本の鎖状重
合体を形成したポリヌクレオチドであり、このＲＮＡの
生合成は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ等のヌクレ
オチド三燐酸を基質としてＤＮＡまたはＲＮＡ依存的に
ＲＮＡポリメラーゼにより行われる。その反応産物はメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮ
Ａ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等であ
るが、いずれもＤＮＡまたはＲＮＡの鋳型を前もって必
要とし、その反応産物は鋳型に相補的なＲＮＡしか得ら
れなかった。つまり、蛋白質のみの情報に依存し、配列
に多様性を持つＲＮＡを合成することは不可能であっ
た。従って、多様性を持つリボザイムやアンチセンスＲ
ＮＡ等のライブラリー生産も、従来の技術では不可能で
あった。
リボースの糖成分とアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、
シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）等の塩基成分を持つ
ヌクレオチドが、ホスホジエステル結合で一本の鎖状重
合体を形成したポリヌクレオチドであり、このＲＮＡの
生合成は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ等のヌクレ
オチド三燐酸を基質としてＤＮＡまたはＲＮＡ依存的に
ＲＮＡポリメラーゼにより行われる。その反応産物はメ
ッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮ
Ａ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等であ
るが、いずれもＤＮＡまたはＲＮＡの鋳型を前もって必
要とし、その反応産物は鋳型に相補的なＲＮＡしか得ら
れなかった。つまり、蛋白質のみの情報に依存し、配列
に多様性を持つＲＮＡを合成することは不可能であっ
た。従って、多様性を持つリボザイムやアンチセンスＲ
ＮＡ等のライブラリー生産も、従来の技術では不可能で
あった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】請求項１記載のＲＮＡの
合成方法は、鋳型およびプライマーの不存在下、セルモ
コッカス属及び／又はセルマス属に属する細菌の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼの存在下でリボヌクレオチドを重合
させることを特徴とする方法である。
合成方法は、鋳型およびプライマーの不存在下、セルモ
コッカス属及び／又はセルマス属に属する細菌の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼの存在下でリボヌクレオチドを重合
させることを特徴とする方法である。
【００１０】請求項２記載のＲＮＡの合成方法は、請求
項１記載の方法において、約２０〜９０℃の温度下で重
合を行なうことを特徴とする方法である。
項１記載の方法において、約２０〜９０℃の温度下で重
合を行なうことを特徴とする方法である。
【００１１】請求項３記載のＲＮＡの合成方法は、請求
項１又は２記載の方法において、中性〜弱アルカリ性の
条件下で重合を行なうことを特徴とする方法である。
項１又は２記載の方法において、中性〜弱アルカリ性の
条件下で重合を行なうことを特徴とする方法である。
【００１２】請求項４記載のリボザイム活性を有するＲ
ＮＡ混合物の調製方法は、リボザイム活性を有するＲＮ
Ａ混合物の調製方法であって、鋳型及びプライマーの不
存在下、セルモコッカス属及び／又はセルマス属に属す
る細菌の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下でリボヌク
レオチドを重合させることにより調製され、目的とする
他のＲＮＡをリガンドとして共有結合したアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いることによりリボザイム活
性が確認されることを特徴とする方法である。
ＮＡ混合物の調製方法は、リボザイム活性を有するＲＮ
Ａ混合物の調製方法であって、鋳型及びプライマーの不
存在下、セルモコッカス属及び／又はセルマス属に属す
る細菌の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下でリボヌク
レオチドを重合させることにより調製され、目的とする
他のＲＮＡをリガンドとして共有結合したアフィニティ
ークロマトグラフィーを用いることによりリボザイム活
性が確認されることを特徴とする方法である。
【００１３】請求項５記載のアンチセンスＲＮＡの調製
方法は、請求項１〜３のいずれか１項記載の合成方法に
より得られてなる鋳型・プライマー非依存的なＲＮＡ混
合物から、他のＲＮＡとハイブリッドを形成する能力を
有するアンチセンスＲＮＡを調製する方法であって、前
記した他のＲＮＡをリガンドとして共有結合したアフィ
ニティークロマトグラフィーを用いることにより行なわ
れることを特徴とする方法である。
方法は、請求項１〜３のいずれか１項記載の合成方法に
より得られてなる鋳型・プライマー非依存的なＲＮＡ混
合物から、他のＲＮＡとハイブリッドを形成する能力を
有するアンチセンスＲＮＡを調製する方法であって、前
記した他のＲＮＡをリガンドとして共有結合したアフィ
ニティークロマトグラフィーを用いることにより行なわ
れることを特徴とする方法である。
【００１４】
【００１５】
【００１６】
【００１７】
【００１８】
【００１９】
【００２０】
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明者等は、ＲＮＡ合成の研究
において種々の発見をした。蛋白質、中でも耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えばセルモコッカス・リトラリス
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）の
ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＶｅｎｔＤＮＡポリメラ
ーゼ、ニューイングランド・バイオ・レイブス社製）
（以下、「Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ」という）をｐ
Ｈ約７または１０以下の弱アルカリ性条件下で、リボヌ
クレオチド三燐酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）
を基質として、ポリメラーゼが失活しない約２０℃以上
（好ましくは約６０℃以上、さらに好ましくは約７０℃
以上の温度でも失活しないもの）のポリメラーゼ活性を
示す範囲の昇温下で、１時間以上反応させることによ
り、鋳型及びプライマー非依存的にＲＮＡ（さまざまな
塩基配列、及びさまざまな大きさを有するＲＮＡ分子集
合体）を合成することができることを発見した。
において種々の発見をした。蛋白質、中でも耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えばセルモコッカス・リトラリス
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）の
ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＶｅｎｔＤＮＡポリメラ
ーゼ、ニューイングランド・バイオ・レイブス社製）
（以下、「Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ」という）をｐ
Ｈ約７または１０以下の弱アルカリ性条件下で、リボヌ
クレオチド三燐酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）
を基質として、ポリメラーゼが失活しない約２０℃以上
（好ましくは約６０℃以上、さらに好ましくは約７０℃
以上の温度でも失活しないもの）のポリメラーゼ活性を
示す範囲の昇温下で、１時間以上反応させることによ
り、鋳型及びプライマー非依存的にＲＮＡ（さまざまな
塩基配列、及びさまざまな大きさを有するＲＮＡ分子集
合体）を合成することができることを発見した。
【００２２】しかも驚くべきことに、このＲＮＡ群の中
には、アンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮＡ（つまり
は、他のＲＮＡとハイブリッドを形成する能力のあるＲ
ＮＡ）、さらには、リボザイムとなり得るＲＮＡ（つま
りは、他のＲＮＡとハイブリッド形成するとともにその
ＲＮＡを切断せしめるＲＮＡ）が多数含まれていること
が分かった。
には、アンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮＡ（つまり
は、他のＲＮＡとハイブリッドを形成する能力のあるＲ
ＮＡ）、さらには、リボザイムとなり得るＲＮＡ（つま
りは、他のＲＮＡとハイブリッド形成するとともにその
ＲＮＡを切断せしめるＲＮＡ）が多数含まれていること
が分かった。
【００２３】ＤＮＡポリメラーゼの具体例としては、上
掲したセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）等のセルモコッカス属
以外に、セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィルス（Ｔ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属に属する細菌の
ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
掲したセルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）等のセルモコッカス属
以外に、セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィルス（Ｔ．ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属に属する細菌の
ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００２４】上記ＤＮＡポリメラーゼは１種を単独で使
用してもよいし、２種以上（２種、３種、……）を併用
した混合系として用いることもできる。ＤＮＡポリメラ
ーゼを２種以上で併用してリボヌクレオチドを重合する
場合は、１種単独で重合する場合と比べ、一度に合成さ
れるＲＮＡがさらに多様化し（すなわち、塩基配列がよ
り様々なＲＮＡ（群）が得られ）、アンチセンスＲＮＡ
またはリボザイムとなり得るＲＮＡの含有率が高くな
る。この場合、同属の異なる細菌のＤＮＡポリメラーゼ
の併用でもよいし、異なる属の細菌のＤＮＡポリメラー
ゼでもよい。
用してもよいし、２種以上（２種、３種、……）を併用
した混合系として用いることもできる。ＤＮＡポリメラ
ーゼを２種以上で併用してリボヌクレオチドを重合する
場合は、１種単独で重合する場合と比べ、一度に合成さ
れるＲＮＡがさらに多様化し（すなわち、塩基配列がよ
り様々なＲＮＡ（群）が得られ）、アンチセンスＲＮＡ
またはリボザイムとなり得るＲＮＡの含有率が高くな
る。この場合、同属の異なる細菌のＤＮＡポリメラーゼ
の併用でもよいし、異なる属の細菌のＤＮＡポリメラー
ゼでもよい。
【００２５】リボヌクレオチドとしては、前述したよう
に、例えばＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰが用いら
れ、それらの４種類または３種類を反応系に存在させれ
ば反応は進行する。
に、例えばＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰが用いら
れ、それらの４種類または３種類を反応系に存在させれ
ば反応は進行する。
【００２６】上記リボヌクレオチドとＤＮＡポリメラー
ゼとの反応は、ｐＨ約７またはｐＨ１０以下の弱アルカ
リ性で行なうのが好ましい。
ゼとの反応は、ｐＨ約７またはｐＨ１０以下の弱アルカ
リ性で行なうのが好ましい。
【００２７】反応温度と時間はＤＮＡポリメラーゼが失
活しない範囲で選ぶことができ、約２０℃以上でポリメ
ラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で反応させることに
より、反応を速やかに進行させることができる。たとえ
ば、７４℃で数時間反応させてもよく、また通常のＰＣ
Ｒ反応の条件、たとえば、（１）９５℃で１分間保持、
（２）４５℃で２分間保持、（３）７４℃で３分間保持
のサイクルを反復してもよい。
活しない範囲で選ぶことができ、約２０℃以上でポリメ
ラーゼ活性を示す範囲の温度条件下で反応させることに
より、反応を速やかに進行させることができる。たとえ
ば、７４℃で数時間反応させてもよく、また通常のＰＣ
Ｒ反応の条件、たとえば、（１）９５℃で１分間保持、
（２）４５℃で２分間保持、（３）７４℃で３分間保持
のサイクルを反復してもよい。
【００２８】反応は初期に若干の遅延時間を経たのち開
始され、やがて最大速度に達する。本発明の方法により
合成されるＲＮＡは鋳型やプライマーとなるべきＤＮＡ
やＲＮＡに依存せずに、反応系に存在するＤＮＡポリメ
ラーゼの情報に依存して合成されると考えられる。
始され、やがて最大速度に達する。本発明の方法により
合成されるＲＮＡは鋳型やプライマーとなるべきＤＮＡ
やＲＮＡに依存せずに、反応系に存在するＤＮＡポリメ
ラーゼの情報に依存して合成されると考えられる。
【００２９】上記のようにして得られたＲＮＡは２本鎖
であるが、これを１本鎖に変性する方法としては、例え
ば、ＲＮＡの溶液を５分間煮沸し、その後直ちに氷中に
５分インキュベートする方法が挙げられる。
であるが、これを１本鎖に変性する方法としては、例え
ば、ＲＮＡの溶液を５分間煮沸し、その後直ちに氷中に
５分インキュベートする方法が挙げられる。
【００３０】次に、本発明により得られたＲＮＡのリボ
ザイム活性を検出するため、ＨＩＶＲＮＡに対する切断
活性を調べた。
ザイム活性を検出するため、ＨＩＶＲＮＡに対する切断
活性を調べた。
【００３１】まず、５′末端標識したＨＩＶ ＲＮＡを
マグネシウムイオンを含む中性〜弱アルカリ性ｐＨ約６
〜１０の条件下で鋳型・プライマー非依存的ＲＮＡ（以
下、「ＮＴ−ＲＮＡ」という）と混合し、約２０〜６０
℃の昇温下で反応させた。
マグネシウムイオンを含む中性〜弱アルカリ性ｐＨ約６
〜１０の条件下で鋳型・プライマー非依存的ＲＮＡ（以
下、「ＮＴ−ＲＮＡ」という）と混合し、約２０〜６０
℃の昇温下で反応させた。
【００３２】この反応液とＨＩＶ ＲＮＡとを共にアル
カリアガロースゲルへ電気泳動する［サムロック・Ｔ
等、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・
マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ））、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１
９８９年発行］。
カリアガロースゲルへ電気泳動する［サムロック・Ｔ
等、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・
マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ））、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，１
９８９年発行］。
【００３３】このアガロースゲルにサランラップ（商品
名、旭化成社製）をかけ、オートラジオグラフィーを行
った。その結果、オートラジオグラフィーのバンドはＮ
Ｔ−ＲＮＡを添加したものについて、無添加の対照に比
べ、短くなっていることが確認された。
名、旭化成社製）をかけ、オートラジオグラフィーを行
った。その結果、オートラジオグラフィーのバンドはＮ
Ｔ−ＲＮＡを添加したものについて、無添加の対照に比
べ、短くなっていることが確認された。
【００３４】次に別の種類のＨＩＶ ＲＮＡに対するリ
ボザイム活性を上述の方法で測定した。その結果、ＨＩ
Ｖ−１ ＲＮＡにおいても上記と同様、リボザイム活性
を有することが確認された。
ボザイム活性を上述の方法で測定した。その結果、ＨＩ
Ｖ−１ ＲＮＡにおいても上記と同様、リボザイム活性
を有することが確認された。
【００３５】次に、Ｃ型肝炎ウィルス（以下、「ＨＣ
Ｖ」という）に対するリボザイム活性を上述の方法にて
測定した。その結果、ＨＣＶにおいてもこのＮＴ−ＲＮ
Ａはリボザイム活性を有していることが確認された。
Ｖ」という）に対するリボザイム活性を上述の方法にて
測定した。その結果、ＨＣＶにおいてもこのＮＴ−ＲＮ
Ａはリボザイム活性を有していることが確認された。
【００３６】かくして、ＮＴ−ＲＮＡにはＨＩＶ ＲＮ
Ａに対してのリボザイム活性を有することが確認され、
これはＨＩＶの変異種においても使用できることが確認
された。また、ＨＩＶ以外のウィルスにもリボザイムと
して使用でき、よって、一般のＲＮＡに対するリボザイ
ムライブラリーを提供することが可能となる。
Ａに対してのリボザイム活性を有することが確認され、
これはＨＩＶの変異種においても使用できることが確認
された。また、ＨＩＶ以外のウィルスにもリボザイムと
して使用でき、よって、一般のＲＮＡに対するリボザイ
ムライブラリーを提供することが可能となる。
【００３７】次に、このＮＴ−ＲＮＡ中に存在する、他
のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡをスクリーニン
グした。
のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡをスクリーニン
グした。
【００３８】ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡ（ク
ローンテック社、ＣＬ６５２２−１）をアルカリアガロ
ースゲルにて電気泳動後、公知の手法によりニトロセル
ロース膜（シュライヒャー＆シュウェル社製）にトラン
スファーした。ＮＴ−ＲＮＡを公知の方法にて、例えば
放射性同位元素にて標識したプローブを作製し、ノザン
・ブロット法（市野、細胞工学実験プロトコール、秀潤
社、1992年発行）を行った。
ローンテック社、ＣＬ６５２２−１）をアルカリアガロ
ースゲルにて電気泳動後、公知の手法によりニトロセル
ロース膜（シュライヒャー＆シュウェル社製）にトラン
スファーした。ＮＴ−ＲＮＡを公知の方法にて、例えば
放射性同位元素にて標識したプローブを作製し、ノザン
・ブロット法（市野、細胞工学実験プロトコール、秀潤
社、1992年発行）を行った。
【００３９】この結果、ｍＲＮＡ中に特異的にハイブリ
ッドできるＲＮＡがＮＴ−ＲＮＡ中に存在していること
が確認され、このＮＴ−ＲＮＡがアンチセンスＲＮＡと
なり得ることが判明した。
ッドできるＲＮＡがＮＴ−ＲＮＡ中に存在していること
が確認され、このＮＴ−ＲＮＡがアンチセンスＲＮＡと
なり得ることが判明した。
【００４０】このことより、ＮＴ−ＲＮＡは、アンチセ
ンスＲＮＡライブラリーをも提供できることが確認され
た。
ンスＲＮＡライブラリーをも提供できることが確認され
た。
【００４１】次に、ＮＴ−ＲＮＡ中のリボザイム及びア
ンチセンスＲＮＡの精製を、ＨＩＶ−１ ＲＮＡをリガ
ンドとして行った。
ンチセンスＲＮＡの精製を、ＨＩＶ−１ ＲＮＡをリガ
ンドとして行った。
【００４２】ＨＩＶ−１ ＲＮＡをリガンドとして適当
なクロマトグラフィー担体、例えば、ＣＮＢｒ−活性化
セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）等の担体に共有
結合せしめ、ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティーカラム
を作製し、液体クロマトグラフィーを行った。クロマト
グラフィー条件としては、中性〜弱アルカリ性ｐＨ約６
〜９以下の高塩濃度の緩衝液にてＮＴ−ＲＮＡを供し、
ＨＩＶ−１ ＲＮＡとハイブリッド形成させた。
なクロマトグラフィー担体、例えば、ＣＮＢｒ−活性化
セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）等の担体に共有
結合せしめ、ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティーカラム
を作製し、液体クロマトグラフィーを行った。クロマト
グラフィー条件としては、中性〜弱アルカリ性ｐＨ約６
〜９以下の高塩濃度の緩衝液にてＮＴ−ＲＮＡを供し、
ＨＩＶ−１ ＲＮＡとハイブリッド形成させた。
【００４３】次に、マグネシウムイオンを含む中性〜弱
アルカリ性ｐＨ約６〜９以下の中塩濃度の緩衝液にて溶
出されてくるリボザイムを２６０ｎｍの吸収を測定する
ことにより回収した。その後、まだハイブリッド形成し
ているアンチセンスＲＮＡを高濃度ホルムアミドを含む
中性〜弱アルカリ性ｐＨ約６〜９以下の緩衝液にて回収
した。
アルカリ性ｐＨ約６〜９以下の中塩濃度の緩衝液にて溶
出されてくるリボザイムを２６０ｎｍの吸収を測定する
ことにより回収した。その後、まだハイブリッド形成し
ているアンチセンスＲＮＡを高濃度ホルムアミドを含む
中性〜弱アルカリ性ｐＨ約６〜９以下の緩衝液にて回収
した。
【００４４】このアフィニティークロマトグラフィーに
用いるリガンドＲＮＡは、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの他、Ｃ
型肝炎ウイルスやインフルエンザウイルスのＲＮＡや細
胞の腫瘍化に深く関与している癌遺伝子や成長因子のｍ
ＲＮＡ等広く多くのＲＮＡを使用することができる。
用いるリガンドＲＮＡは、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの他、Ｃ
型肝炎ウイルスやインフルエンザウイルスのＲＮＡや細
胞の腫瘍化に深く関与している癌遺伝子や成長因子のｍ
ＲＮＡ等広く多くのＲＮＡを使用することができる。
【００４５】また、この方法を用いて１つのカラムにて
リボザイムとアンチセンスＲＮＡを両方同時に精製する
ことが可能となる。よってこの方法は、本発明によって
得られるＮＴ−ＲＮＡより、簡単に、かつ効率よく目的
のＲＮＡに対するリボザイムやアンチセンスＲＮＡを精
製する優れた手法であるといえる。その意味で、前記Ｎ
Ｔ−ＲＮＡは、リボザイムライブラリー、アンチセンス
ＲＮＡライブラリーであるということもできる。
リボザイムとアンチセンスＲＮＡを両方同時に精製する
ことが可能となる。よってこの方法は、本発明によって
得られるＮＴ−ＲＮＡより、簡単に、かつ効率よく目的
のＲＮＡに対するリボザイムやアンチセンスＲＮＡを精
製する優れた手法であるといえる。その意味で、前記Ｎ
Ｔ−ＲＮＡは、リボザイムライブラリー、アンチセンス
ＲＮＡライブラリーであるということもできる。
【００４６】次に、上述の方法にて精製したリボザイ
ム、及びアンチセンスＲＮＡを用いてＨＩＶ−１に対す
る増殖抑制効果を調べた。
ム、及びアンチセンスＲＮＡを用いてＨＩＶ−１に対す
る増殖抑制効果を調べた。
【００４７】この調査に用いる細胞はＣＤ４を発現して
いる細胞（以下、「ＣＤ４＋細胞」という）全てについ
て行うことが可能で、例えばＣＤ４＋発現ＨｅＬａ細胞
等も用いることができる。
いる細胞（以下、「ＣＤ４＋細胞」という）全てについ
て行うことが可能で、例えばＣＤ４＋発現ＨｅＬａ細胞
等も用いることができる。
【００４８】手順としては、ＣＤ４＋細胞に燐酸カルシ
ウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション
法、マイクロインジェクション法などの既存の方法を用
いて、ＮＴ−ＲＮＡより精製したＨＩＶ−１特異的リボ
ザイム、ＨＩＶ−１特異的アンチセンスＲＮＡ、及びそ
の両方をトランスフェクションする。対照としてリボザ
イム及びアンチセンスＲＮＡのいずれをもトランスフェ
クションしていない細胞を用意した。そして、これら全
ての細胞にＨＩＶを感染させた。
ウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション
法、マイクロインジェクション法などの既存の方法を用
いて、ＮＴ−ＲＮＡより精製したＨＩＶ−１特異的リボ
ザイム、ＨＩＶ−１特異的アンチセンスＲＮＡ、及びそ
の両方をトランスフェクションする。対照としてリボザ
イム及びアンチセンスＲＮＡのいずれをもトランスフェ
クションしていない細胞を用意した。そして、これら全
ての細胞にＨＩＶを感染させた。
【００４９】その後、ＨＩＶ感染の指標となる、例えば
ＨＩＶ ｇａｇ ｍＲＮＡの量や、ＨＩＶ ｐ２４の量
等を調べることにより、増殖抑制効果を見た。
ＨＩＶ ｇａｇ ｍＲＮＡの量や、ＨＩＶ ｐ２４の量
等を調べることにより、増殖抑制効果を見た。
【００５０】結果として、リボザイム、アンチセンスＲ
ＮＡ、及びその両方、をトランスフェクションした細胞
からは、ＨＩＶ ｇａｇ ｍＲＮＡの量の減少が確認で
きた。このことより、ＮＴ−ＲＮＡから分離されたリボ
ザイムＲＮＡやアンチセンスＲＮＡは生体内において作
用することが確認され、抗ウイルス剤となり得ることが
確認された。このことは、他のウイルスや生体内ＲＮＡ
についても適用できることを意味する。
ＮＡ、及びその両方、をトランスフェクションした細胞
からは、ＨＩＶ ｇａｇ ｍＲＮＡの量の減少が確認で
きた。このことより、ＮＴ−ＲＮＡから分離されたリボ
ザイムＲＮＡやアンチセンスＲＮＡは生体内において作
用することが確認され、抗ウイルス剤となり得ることが
確認された。このことは、他のウイルスや生体内ＲＮＡ
についても適用できることを意味する。
【００５１】本発明で用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
の製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法として
は今日において公知であり、当業者であれば容易に行う
ことができる。なお、以下に関連公報を列挙する（これ
らによっても得ることができる）。特開平２−６０５８
５号公報、特公平８−２４５７０号公報（特開平２−４
３４号公報）、特開平５−６８５４７号公報、特公平７
−５９１９５号公報（特開平５−１３０８７１号公
報）、特開平５−３２８９６９号公報、特開平７−５１
０６１号公報、特開平６−３３９３７３号公報、特開平
６−７１６０号公報
の製法、あるいはこれをコードする遺伝子の製法として
は今日において公知であり、当業者であれば容易に行う
ことができる。なお、以下に関連公報を列挙する（これ
らによっても得ることができる）。特開平２−６０５８
５号公報、特公平８−２４５７０号公報（特開平２−４
３４号公報）、特開平５−６８５４７号公報、特公平７
−５９１９５号公報（特開平５−１３０８７１号公
報）、特開平５−３２８９６９号公報、特開平７−５１
０６１号公報、特開平６−３３９３７３号公報、特開平
６−７１６０号公報
【００５２】
【実施例】本発明を具体的に表すために以下に実施例を
述べるが、本発明はこれらの実施例に限られるものでは
ない。
述べるが、本発明はこれらの実施例に限られるものでは
ない。
【００５３】実施例１ （ＮＴ−ＲＮＡの合成）緩衝液Ｒ［１０ｍＭ ＫＣｌ，
１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，２０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．１％
トリトンＸ−１００（全て最終濃度）］及びリボヌクレ
オチド三燐酸［ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（全て
最終濃度）５００ｍＭ）］、２０単位／ｍｌ Ｔｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼから構成される反応液１００μｌを
７４℃で３時間反応させた。
１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，２０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．８），１５ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．１％
トリトンＸ−１００（全て最終濃度）］及びリボヌクレ
オチド三燐酸［ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（全て
最終濃度）５００ｍＭ）］、２０単位／ｍｌ Ｔｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼから構成される反応液１００μｌを
７４℃で３時間反応させた。
【００５４】その後、０．８％アガロースゲルにて電気
泳動し、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムにて染色した
結果、５０〜１０，０００塩基対（以下、「ｂｐ」とい
う）の染色バンドが確認された。
泳動し、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムにて染色した
結果、５０〜１０，０００塩基対（以下、「ｂｐ」とい
う）の染色バンドが確認された。
【００５５】次に、このＮＴ−ＲＮＡを大量調整するた
めに上記と同じ組成の反応液５００ｍｌを反応させた。
その結果、１０ｍｇのＮＴ−ＲＮＡが調整できた。
めに上記と同じ組成の反応液５００ｍｌを反応させた。
その結果、１０ｍｇのＮＴ−ＲＮＡが調整できた。
【００５６】実施例２ （各種ＲＮＡに対するＮＴ−ＲＮＡのリボザイム活性の
検出）２０μｇ／ｍｌ 各種ＲＮＡ（ＨＩＶ−１ ＲＮ
Ａ，ＨＩＶ−２ ＲＮＡ及びＨＣＶ ＲＮＡ）に、交換
緩衝液［５０ｍＭ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．
４）、１８ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ジスレイトー
ル、０．１ｍＭ スペルミジンＨＣｌ、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ］と０．１ｍＭ ＡＤＰ、１ｎＭ ＡＴＰ、１μ
Ｍ ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、
４．８％ポリエチレングリコール８０００、４００単位
／ｍｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、全量１
００μｌとし、３７℃、３０分間培養し、最終２０ｍＭ
となるようにＥＤＴＡを加え、反応を停止させた。その
後、フェノール処理、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収
し、これをリボザイムのための基質ＲＮＡとする。
検出）２０μｇ／ｍｌ 各種ＲＮＡ（ＨＩＶ−１ ＲＮ
Ａ，ＨＩＶ−２ ＲＮＡ及びＨＣＶ ＲＮＡ）に、交換
緩衝液［５０ｍＭ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．
４）、１８ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ジスレイトー
ル、０．１ｍＭ スペルミジンＨＣｌ、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ］と０．１ｍＭ ＡＤＰ、１ｎＭ ＡＴＰ、１μ
Ｍ ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、
４．８％ポリエチレングリコール８０００、４００単位
／ｍｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、全量１
００μｌとし、３７℃、３０分間培養し、最終２０ｍＭ
となるようにＥＤＴＡを加え、反応を停止させた。その
後、フェノール処理、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収
し、これをリボザイムのための基質ＲＮＡとする。
【００５７】次に、ＮＴ−ＲＮＡのリボザイム活性の検
出を行った。まず、リボザイム緩衝液［５０ｍＭ トリ
ス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２］、
及び各種ＲＮＡ（上掲）２μｇ、ＮＴ−ＲＮＡを１０μ
ｇ又は０μｇ（比較対照用）含む反応液（２０μｌ）
（５分間煮沸し、その後直ちに氷中に５分間インキュベ
ートしたもの）を３７℃で６時間反応させた。
出を行った。まず、リボザイム緩衝液［５０ｍＭ トリ
ス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２］、
及び各種ＲＮＡ（上掲）２μｇ、ＮＴ−ＲＮＡを１０μ
ｇ又は０μｇ（比較対照用）含む反応液（２０μｌ）
（５分間煮沸し、その後直ちに氷中に５分間インキュベ
ートしたもの）を３７℃で６時間反応させた。
【００５８】これらの反応液を１％アルカリアガロース
ゲル［５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ ア
ガロースＧＰ−３６（ナカライ・テスク社製）］にて電
気泳動後オートラジオグラフィーした。
ゲル［５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ ア
ガロースＧＰ−３６（ナカライ・テスク社製）］にて電
気泳動後オートラジオグラフィーした。
【００５９】その結果、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ、ＨＩＶ−
２ ＲＮＡ、ＨＣＶ ＲＮＡは共に、天然のＲＮＡより
短くなっていることが確認され、このＮＴ−ＲＮＡには
リボザイム活性が存在することが確認された。また、Ｎ
Ｔ−ＲＮＡが０μｇの例については上記のようなリボザ
イム活性は確認されなかった。
２ ＲＮＡ、ＨＣＶ ＲＮＡは共に、天然のＲＮＡより
短くなっていることが確認され、このＮＴ−ＲＮＡには
リボザイム活性が存在することが確認された。また、Ｎ
Ｔ−ＲＮＡが０μｇの例については上記のようなリボザ
イム活性は確認されなかった。
【００６０】これにより、実施例１で得られた本発明の
ＮＴ−ＲＮＡは、上記の結果の如く、各種ＲＮＡのいず
れにもリボザイム活性を示すことから、リボザイムライ
ブラリーを形成しているといえる。
ＮＴ−ＲＮＡは、上記の結果の如く、各種ＲＮＡのいず
れにもリボザイム活性を示すことから、リボザイムライ
ブラリーを形成しているといえる。
【００６１】実施例３ （ｍＲＮＡに対するＮＴ−ＲＮＡ中のアンチセンスＲＮ
Ａの検出（１））既存のｍＲＮＡに対するＮＴ−ＲＮＡ
中のアンチセンスＲＮＡの検出をノザンブロット法にて
行った。まず、ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡ
１０μｇをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］１０μｌに溶かし、１
％変性ゲル［０．２Ｍ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．
０）、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０％ ホルムアミド、１％ アガロースＧＰ−３
６］にて電気泳動をした（ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルホ
リノ）プロパンスルホン酸（ナカライテクス社製））。
Ａの検出（１））既存のｍＲＮＡに対するＮＴ−ＲＮＡ
中のアンチセンスＲＮＡの検出をノザンブロット法にて
行った。まず、ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡ
１０μｇをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］１０μｌに溶かし、１
％変性ゲル［０．２Ｍ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．
０）、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０％ ホルムアミド、１％ アガロースＧＰ−３
６］にて電気泳動をした（ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルホ
リノ）プロパンスルホン酸（ナカライテクス社製））。
【００６２】その後、ニトロセルロースフィルター（シ
ュライヒャー＆シュウェル社）に、ＲＮＡ（ＨｅＬａ
Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡ）をトランスファーし、この
フィルターを８０℃、２時間乾燥させた。このフィルタ
ーをノザンプレハイブリダイゼーション緩衝液［５０％
ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、
７５ｍＭ クエン酸 ３ナトリウム２水和物）、５０ｍ
Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、４０μｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、０．２％ポリビニルピロリ
ドン、０．２％ フィコール４００、０．２％ 仔牛血
清アルブミン］１０ｍｌに浸し、４２℃、２時間、プレ
ハイブリッド形成をさせた。
ュライヒャー＆シュウェル社）に、ＲＮＡ（ＨｅＬａ
Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡ）をトランスファーし、この
フィルターを８０℃、２時間乾燥させた。このフィルタ
ーをノザンプレハイブリダイゼーション緩衝液［５０％
ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、
７５ｍＭ クエン酸 ３ナトリウム２水和物）、５０ｍ
Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、４０μｇ
／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、０．２％ポリビニルピロリ
ドン、０．２％ フィコール４００、０．２％ 仔牛血
清アルブミン］１０ｍｌに浸し、４２℃、２時間、プレ
ハイブリッド形成をさせた。
【００６３】プレハイブリッド形成緩衝液を抜き取り、
１０ｍｌのプレハイブリッド形成緩衝液とポリヌクレオ
チドキナーゼにて５′末端の燐酸を標識した一本鎖変性
ＮＴ−ＲＮＡ（プローブとして用いる）１μｇを用いて
４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。
１０ｍｌのプレハイブリッド形成緩衝液とポリヌクレオ
チドキナーゼにて５′末端の燐酸を標識した一本鎖変性
ＮＴ−ＲＮＡ（プローブとして用いる）１μｇを用いて
４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。
【００６４】その後、洗浄液１（２ＸＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ）にて１０分間の洗浄を合計３回行い、洗浄液
２（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で５０℃、２
０分間の洗浄を合計３回行った。
ＳＤＳ）にて１０分間の洗浄を合計３回行い、洗浄液
２（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で５０℃、２
０分間の洗浄を合計３回行った。
【００６５】フィルターを乾燥後、オートラジオグラフ
ィーにてＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３ｍＲＮＡにハイブリ
ッドするＮＴ−ＲＮＡ由来のバンドを観察したところ、
数ヶ所にバンドが検出できた。この結果、ＮＴ−ＲＮＡ
中にはアンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮＡが存在して
いることが示唆された。
ィーにてＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３ｍＲＮＡにハイブリ
ッドするＮＴ−ＲＮＡ由来のバンドを観察したところ、
数ヶ所にバンドが検出できた。この結果、ＮＴ−ＲＮＡ
中にはアンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮＡが存在して
いることが示唆された。
【００６６】実施例４ （ｍＲＮＡに対するＮＴ−ＲＮＡ中のアンチセンスＲＮ
Ａの検出（２））ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡ
の代わりに、ヒト白血病リンパ芽球細胞ＭＯＬＴ−４
ｍＲＮＡを用いたという以外は、実施例３と同様にして
アンチセンスＲＮＡの検出を行なった。その結果、ＮＴ
−ＲＮＡ中にヒト白血病リンパ芽球細胞 ＭＯＬＴ−４
ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮ
Ａが存在していることが確認された。
Ａの検出（２））ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡ
の代わりに、ヒト白血病リンパ芽球細胞ＭＯＬＴ−４
ｍＲＮＡを用いたという以外は、実施例３と同様にして
アンチセンスＲＮＡの検出を行なった。その結果、ＮＴ
−ＲＮＡ中にヒト白血病リンパ芽球細胞 ＭＯＬＴ−４
ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮ
Ａが存在していることが確認された。
【００６７】実施例５ （ｍＲＮＡに対するＮＴ−ＲＮＡ中のアンチセンスＲＮ
Ａの検出（３））上記実施例３において用いたＨｅＬａ
Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡの代わりに、ＨＩＶ−１
ＲＮＡを用いても、ＮＴ−ＲＮＡ中に該ｍＲＮＡに対す
るアンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮＡが存在している
ことが確認された。
Ａの検出（３））上記実施例３において用いたＨｅＬａ
Ｃｅｌｌ Ｓ３ ｍＲＮＡの代わりに、ＨＩＶ−１
ＲＮＡを用いても、ＮＴ−ＲＮＡ中に該ｍＲＮＡに対す
るアンチセンスＲＮＡとなり得るＲＮＡが存在している
ことが確認された。
【００６８】実施例６ （ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いてのＮＴ−ＲＮＡ中のリボザイム及びアンチセ
ンスＲＮＡの精製）ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティー
クロマトカラムの調整を行った。まず、ＣＮＢｒ−活性
化 セファロース ４Ｂ（ファルマシア社製）を１ｍＭ
ＨＣｌにて洗浄し、ゲルを膨潤させた。
ーを用いてのＮＴ−ＲＮＡ中のリボザイム及びアンチセ
ンスＲＮＡの精製）ＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニティー
クロマトカラムの調整を行った。まず、ＣＮＢｒ−活性
化 セファロース ４Ｂ（ファルマシア社製）を１ｍＭ
ＨＣｌにて洗浄し、ゲルを膨潤させた。
【００６９】次に、ゲルをカップリング緩衝液［０．１
Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ］で洗浄した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡ１０μｇをこのカ
ップリングバッファーに溶解し、ゲル懸濁液と混ぜ、室
温で２時間混合した。残りの活性基をブロックするため
に、ゲルをブロッキング試薬（０．２Ｍ グリシン、ｐ
Ｈ８．０）に移し、室温で２時間混合した。カップリン
グ緩衝液で１回洗浄後、洗浄液［０．１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］にて洗浄後、再
びカップリング緩衝液にて洗浄した。
Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ］で洗浄した。ＨＩＶ−１ ＲＮＡ１０μｇをこのカ
ップリングバッファーに溶解し、ゲル懸濁液と混ぜ、室
温で２時間混合した。残りの活性基をブロックするため
に、ゲルをブロッキング試薬（０．２Ｍ グリシン、ｐ
Ｈ８．０）に移し、室温で２時間混合した。カップリン
グ緩衝液で１回洗浄後、洗浄液［０．１Ｍ 酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ］にて洗浄後、再
びカップリング緩衝液にて洗浄した。
【００７０】次に、このＨＩＶ−１ ＲＮＡアフィニテ
ィークロマトグラフィー担体を用いてリボザイム及びア
ンチセンスＲＮＡの精製を行った。まず、開始緩衝液
［０．７Ｍ ＮａＣｌ ５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、２５％ ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ］にてカラムを平衡化し、このカラムに１本鎖変性Ｎ
Ｔ−ＲＮＡ １０μｇを供した。
ィークロマトグラフィー担体を用いてリボザイム及びア
ンチセンスＲＮＡの精製を行った。まず、開始緩衝液
［０．７Ｍ ＮａＣｌ ５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）、２５％ ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ］にてカラムを平衡化し、このカラムに１本鎖変性Ｎ
Ｔ−ＲＮＡ １０μｇを供した。
【００７１】開始緩衝液でカラムを洗浄後、リボザイム
溶出緩衝液［０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２］にてリ
ボザイムを溶出させ回収した。
溶出緩衝液［０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２］にてリ
ボザイムを溶出させ回収した。
【００７２】次に、ＲＮＡ溶出緩衝液［１０ｍＭ リン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．２％ ラウロイル−サルコシン、９０％ ホル
ムアミド］にてアンチセンスＲＮＡを溶出させ回収し
た。
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．２％ ラウロイル−サルコシン、９０％ ホル
ムアミド］にてアンチセンスＲＮＡを溶出させ回収し
た。
【００７３】これら回収したＲＮＡのリボザイム活性と
アンチセンス活性をそれぞれ実施例２〜５の方法で検出
したところ、それぞれ活性を有することが確認できた。
アンチセンス活性をそれぞれ実施例２〜５の方法で検出
したところ、それぞれ活性を有することが確認できた。
【００７４】実施例７ （精製リボザイム及びアンチセンスＲＮＡのＨＩＶ感染
ＨｅＬａ細胞に対するＨＩＶ増殖抑制効果）ＮＴ−ＲＮ
Ａより分離したＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的なリボザイム
及びアンチセンスＲＮＡのＨＩＶに対する効果を調べ
た。
ＨｅＬａ細胞に対するＨＩＶ増殖抑制効果）ＮＴ−ＲＮ
Ａより分離したＨＩＶ−１ ＲＮＡ特異的なリボザイム
及びアンチセンスＲＮＡのＨＩＶに対する効果を調べ
た。
【００７５】まず、ＣＤ４＋発現ＨｅＬａ細胞を培養補
助液［１０％（ｖ／ｖ） 牛胎児血清、１００μｇ／ｍ
ｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシ
ン、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ｍＭ ピルビ
ン酸ナトリウム］を含むダルベッコ変法イーグル培地
（以下、「ＤＭＥＭ」という）（ギブコ社製）にて３７
℃で培養した。 ７０％コンフルエントに培養した細胞
を、トランスフェクション前日にφ１０ｃｍペトリ皿に
まいた。リン酸カルシウム共沈法を用いて、ＨＩＶ−１
特異的リボザイム１０μｇ、ＨＩＶ−１特異的アンチセ
ンスＲＮＡ１０μｇ、及びこれら両方をトランスフェク
ションし、２４時間培養した。なお、対照用として、こ
れらのＲＮＡをいずれをもトランスフェクションしなか
った細胞を、同様に２４時間培養した。
助液［１０％（ｖ／ｖ） 牛胎児血清、１００μｇ／ｍ
ｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシ
ン、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ｍＭ ピルビ
ン酸ナトリウム］を含むダルベッコ変法イーグル培地
（以下、「ＤＭＥＭ」という）（ギブコ社製）にて３７
℃で培養した。 ７０％コンフルエントに培養した細胞
を、トランスフェクション前日にφ１０ｃｍペトリ皿に
まいた。リン酸カルシウム共沈法を用いて、ＨＩＶ−１
特異的リボザイム１０μｇ、ＨＩＶ−１特異的アンチセ
ンスＲＮＡ１０μｇ、及びこれら両方をトランスフェク
ションし、２４時間培養した。なお、対照用として、こ
れらのＲＮＡをいずれをもトランスフェクションしなか
った細胞を、同様に２４時間培養した。
【００７６】その後、細胞を３回燐酸緩衝塩水（以下、
「ＰＢＳ」という）（１３２．５ｍｇ／リットル Ｃａ
Ｃｌ２・２Ｈ２Ｏ、１２１．２ｍｇ／リットル ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ／リットル ＫＣｌ、２０
０ｍｇ／リットル ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／リットル Ｎ
ａＣｌ、１．１５ｇ／リットル Ｎａ２ＨＰＯ４）にて
洗浄した。
「ＰＢＳ」という）（１３２．５ｍｇ／リットル Ｃａ
Ｃｌ２・２Ｈ２Ｏ、１２１．２ｍｇ／リットル ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ／リットル ＫＣｌ、２０
０ｍｇ／リットル ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／リットル Ｎ
ａＣｌ、１．１５ｇ／リットル Ｎａ２ＨＰＯ４）にて
洗浄した。
【００７７】この細胞に、培養補助液を含むＤＭＥＭ
２ｍｌと、ＨＩＶ−１溶液２０μｌを加え、３７℃で培
養した。
２ｍｌと、ＨＩＶ−１溶液２０μｌを加え、３７℃で培
養した。
【００７８】ＨＩＶ増殖抑制効果を調べるために、ＨＩ
Ｖ−１のｇａｇ ｍＲＮＡ量をノザンブロット法にて調
べた。まず、４８時間培養したＨｅＬａ細胞をＰＢＳに
て２回洗浄し、緩衝液Ｌ［２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ＳＤＳ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
２）］にて細胞を溶かした。フェノール処理・エタノー
ル沈澱にて全核酸を回収し、ＤＮＡ分解溶液［３０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２、１０ｍｇ／ｍｌ デオキシリボヌクレアーゼＩ］に
溶解し、３７℃、２時間ＤＮＡを分解した。
Ｖ−１のｇａｇ ｍＲＮＡ量をノザンブロット法にて調
べた。まず、４８時間培養したＨｅＬａ細胞をＰＢＳに
て２回洗浄し、緩衝液Ｌ［２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５
％ＳＤＳ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
２）］にて細胞を溶かした。フェノール処理・エタノー
ル沈澱にて全核酸を回収し、ＤＮＡ分解溶液［３０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２、１０ｍｇ／ｍｌ デオキシリボヌクレアーゼＩ］に
溶解し、３７℃、２時間ＤＮＡを分解した。
【００７９】反応を停止させるために１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．２％ ＳＤＳとなるように反応液を調節し、フ
ェノール処理・エタノール沈澱にてＲＮＡを回収した。
このＲＮＡを用いて実施例３に示したノザン・ブロット
法にてＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子に対する配列をプロー
ブとしてＨＩＶ−１ ｍＲＮＡ量を調べた。
Ａ、０．２％ ＳＤＳとなるように反応液を調節し、フ
ェノール処理・エタノール沈澱にてＲＮＡを回収した。
このＲＮＡを用いて実施例３に示したノザン・ブロット
法にてＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子に対する配列をプロー
ブとしてＨＩＶ−１ ｍＲＮＡ量を調べた。
【００８０】その結果、ＨＩＶ−１ ｍＲＮＡの量は、
対照として用いたリボザイムやアンチセンスＲＮＡをト
ランスフェクションしていないＨＩＶ−１感染細胞と比
較して、リボザイムをトランスフェクションしたものは
５％、アンチセンスＲＮＡをトランスフェクションした
ものは６０％、両方トランスフェクションしたものは２
％しか存在しなかった。
対照として用いたリボザイムやアンチセンスＲＮＡをト
ランスフェクションしていないＨＩＶ−１感染細胞と比
較して、リボザイムをトランスフェクションしたものは
５％、アンチセンスＲＮＡをトランスフェクションした
ものは６０％、両方トランスフェクションしたものは２
％しか存在しなかった。
【００８１】実施例８ （他のＤＮＡポリメラーゼによるＮＴ−ＲＮＡの合成
（１））セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼについても
同様の結果が得られることを確認すべく、実施例１〜７
の操作を繰り返した。すなわち、鋳型およびプライマー
の不存在下、セルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラ
ーゼ存在下でリボヌクレオチドを重合させ、これにより
得られたＮＴ−ＲＮＡについて、上記と同様の操作を行
なった。
（１））セルマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼについても
同様の結果が得られることを確認すべく、実施例１〜７
の操作を繰り返した。すなわち、鋳型およびプライマー
の不存在下、セルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラ
ーゼ存在下でリボヌクレオチドを重合させ、これにより
得られたＮＴ−ＲＮＡについて、上記と同様の操作を行
なった。
【００８２】その結果、セルモコッカス・リトラリス
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）Ｄ
ＮＡポリメラーゼによって得られたＮＴ−ＲＮＡと同
様、セルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼによ
って得られたＮＴ−ＲＮＡもまた、多様性のあるリボザ
イム活性およびアンチセンスＲＮＡ活性を呈した。これ
により、得られたＮＴ−ＲＮＡは、リボザイムライブラ
リーや、アンチセンスＲＮＡライブラリーとなり得、延
いては、ウイルスの多様な変異に対し、これを幅広くカ
バーし得る抗ウイルス剤として使用することが分かっ
た。
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）Ｄ
ＮＡポリメラーゼによって得られたＮＴ−ＲＮＡと同
様、セルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼによ
って得られたＮＴ−ＲＮＡもまた、多様性のあるリボザ
イム活性およびアンチセンスＲＮＡ活性を呈した。これ
により、得られたＮＴ−ＲＮＡは、リボザイムライブラ
リーや、アンチセンスＲＮＡライブラリーとなり得、延
いては、ウイルスの多様な変異に対し、これを幅広くカ
バーし得る抗ウイルス剤として使用することが分かっ
た。
【００８３】実施例９ （他のＤＮＡポリメラーゼによるＮＴ−ＲＮＡの合成
（２））セルマス・セルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼにつ
いても同様の結果が得られることを確認すべく、実施例
１〜７の操作を繰り返した。すなわち、鋳型およびプラ
イマーの不存在下、セルマス・セルモフィルスＤＮＡポ
リメラーゼ存在下でリボヌクレオチドを重合させ、これ
により得られたＮＴ−ＲＮＡについて、上記と同様の操
作を行なった。
（２））セルマス・セルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼにつ
いても同様の結果が得られることを確認すべく、実施例
１〜７の操作を繰り返した。すなわち、鋳型およびプラ
イマーの不存在下、セルマス・セルモフィルスＤＮＡポ
リメラーゼ存在下でリボヌクレオチドを重合させ、これ
により得られたＮＴ−ＲＮＡについて、上記と同様の操
作を行なった。
【００８４】その結果、セルマス・セルモフィルスＤＮ
Ａポリメラーゼによって得られたＮＴ−ＲＮＡは、セル
モコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼによって得ら
れたＮＴ−ＲＮＡと同様、多様性のあるリボザイム活性
およびアンチセンスＲＮＡ活性を呈した。これにより、
得られたＮＴ−ＲＮＡは、リボザイムライブラリー、ア
ンチセンスＲＮＡライブラリーとなり得、延いては、ウ
イルスの多様な変異に対し、これを幅広くカバーし得る
抗ウイルス剤としての使用が可能となることが分かっ
た。
Ａポリメラーゼによって得られたＮＴ−ＲＮＡは、セル
モコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼによって得ら
れたＮＴ−ＲＮＡと同様、多様性のあるリボザイム活性
およびアンチセンスＲＮＡ活性を呈した。これにより、
得られたＮＴ−ＲＮＡは、リボザイムライブラリー、ア
ンチセンスＲＮＡライブラリーとなり得、延いては、ウ
イルスの多様な変異に対し、これを幅広くカバーし得る
抗ウイルス剤としての使用が可能となることが分かっ
た。
【００８５】実施例１０ （複数のＤＮＡポリメラーゼ併用系でのＮＴ−ＲＮＡ合
成）実施例１におけるＤＮＡポリメラーゼ単独での使用
に代え、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとセルマス・アク
アティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の
ＤＮＡポリメラーゼとを併用し、ＤＮＡポリメラーゼ混
合反応液にて実施例１と同様、リボヌクレオチドを重合
させた。
成）実施例１におけるＤＮＡポリメラーゼ単独での使用
に代え、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとセルマス・アク
アティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の
ＤＮＡポリメラーゼとを併用し、ＤＮＡポリメラーゼ混
合反応液にて実施例１と同様、リボヌクレオチドを重合
させた。
【００８６】その結果、ＤＮＡポリメラーゼを複数併用
した場合でも、様々な大きさの塩基配列をもつＲＮＡ
（ＮＴ−ＲＮＡ）が得られることがわかった（０．８％
アガロースゲルにて行なった電気泳動および０．５μｇ
／ｍｌ臭化エチジウムによる染色で確認）。
した場合でも、様々な大きさの塩基配列をもつＲＮＡ
（ＮＴ−ＲＮＡ）が得られることがわかった（０．８％
アガロースゲルにて行なった電気泳動および０．５μｇ
／ｍｌ臭化エチジウムによる染色で確認）。
【００８７】得られたＮＴ−ＲＮＡのなかに、ＨＩＶ−
１ ＲＮＡ、ＨＩＶ−２ ＲＮＡおよびＨＣＶ ＲＮＡ
に対するリボザイム活性を有しているＲＮＡが存在して
いるか否かを調べるために、実施例２と同様の操作を行
なった。
１ ＲＮＡ、ＨＩＶ−２ ＲＮＡおよびＨＣＶ ＲＮＡ
に対するリボザイム活性を有しているＲＮＡが存在して
いるか否かを調べるために、実施例２と同様の操作を行
なった。
【００８８】その結果、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ、ＨＩＶ−
２ ＲＮＡおよびＨＣＶ ＲＮＡは共に、天然のＲＮＡ
より短くなっていることが確認され、このＮＴ−ＲＮＡ
のなかに、上記各種ＲＮＡに対するリボザイム活性を有
するＲＮＡが含まれていることがわかった。
２ ＲＮＡおよびＨＣＶ ＲＮＡは共に、天然のＲＮＡ
より短くなっていることが確認され、このＮＴ−ＲＮＡ
のなかに、上記各種ＲＮＡに対するリボザイム活性を有
するＲＮＡが含まれていることがわかった。
【００８９】また、アンチセンスＲＮＡ活性について
も、ＤＮＡポリメラーゼ単独によるＮＴ−ＲＮＡの場合
（実施例３〜５）と同様、ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３
ｍＲＮＡ、ヒト白血病リンパ芽球細胞ＭＯＬＴ−４ ｍ
ＲＮＡ、及びＨＩＶ−１ ＲＮＡに対するアンチセンス
活性が確認された。
も、ＤＮＡポリメラーゼ単独によるＮＴ−ＲＮＡの場合
（実施例３〜５）と同様、ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｓ３
ｍＲＮＡ、ヒト白血病リンパ芽球細胞ＭＯＬＴ−４ ｍ
ＲＮＡ、及びＨＩＶ−１ ＲＮＡに対するアンチセンス
活性が確認された。
【００９０】上記の結果から、複数のＤＮＡポリメラー
ゼを併用した混合反応系であっても、各ＤＮＡポリメラ
ーゼによるリボヌクレオチドの重合は保持され、互いに
悪影響を及ぼさないことがわかった。
ゼを併用した混合反応系であっても、各ＤＮＡポリメラ
ーゼによるリボヌクレオチドの重合は保持され、互いに
悪影響を及ぼさないことがわかった。
【００９１】ＤＮＡポリメラーゼを２種以上で併用して
リボヌクレオチドを重合する場合は、１種単独で重合す
る場合と比べ、一度に合成されるＲＮＡがさらに多様化
していることが予想されるので、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ、
ＨＩＶ−２ ＲＮＡおよびＨＣＶ ＲＮＡ以外にも、多
種類のＲＮＡに対してリボザイム活性を呈するＲＮＡが
含まれていることが容易に判断できる。またアンチセン
スＲＮＡ活性についても同様で、ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ
Ｓ３ ｍＲＮＡ、ヒト白血病リンパ芽球細胞ＭＯＬＴ−
４ ｍＲＮＡ、及びＨＩＶ−１ ＲＮＡ以外にも、多種
類のＲＮＡに対してアンチセンスＲＮＡ活性を呈するＲ
ＮＡが含まれていると思われる。
リボヌクレオチドを重合する場合は、１種単独で重合す
る場合と比べ、一度に合成されるＲＮＡがさらに多様化
していることが予想されるので、ＨＩＶ−１ ＲＮＡ、
ＨＩＶ−２ ＲＮＡおよびＨＣＶ ＲＮＡ以外にも、多
種類のＲＮＡに対してリボザイム活性を呈するＲＮＡが
含まれていることが容易に判断できる。またアンチセン
スＲＮＡ活性についても同様で、ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ
Ｓ３ ｍＲＮＡ、ヒト白血病リンパ芽球細胞ＭＯＬＴ−
４ ｍＲＮＡ、及びＨＩＶ−１ ＲＮＡ以外にも、多種
類のＲＮＡに対してアンチセンスＲＮＡ活性を呈するＲ
ＮＡが含まれていると思われる。
【００９２】
【発明の効果】本発明により、多様性を持ったリボザイ
ムライブラリーやアンチセンスＲＮＡライブラリーを得
ることが可能となり、変異後のウィルスでも充分対処で
きるようになる。
ムライブラリーやアンチセンスＲＮＡライブラリーを得
ることが可能となり、変異後のウィルスでも充分対処で
きるようになる。
【００９３】しかも、本発明のＲＮＡ精製方法は、前記
ライブラリーから、有用なＲＮＡ（リボザイム、アンチ
センスＲＮＡ）を簡単に、しかも同時に精製（選別、ス
クリーニング）することが可能となる。
ライブラリーから、有用なＲＮＡ（リボザイム、アンチ
センスＲＮＡ）を簡単に、しかも同時に精製（選別、ス
クリーニング）することが可能となる。
【００９４】精製されたＲＮＡをウイルス感染細胞にト
ランスフェクションすることによりウイルスの複製を阻
害することができる。
ランスフェクションすることによりウイルスの複製を阻
害することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−236781（ＪＰ，Ａ) 日経バイオテク，日経バイオ最新用語 辞典，1995年 ６月30日，第４版，ｐ. 29，38，39，740，741 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) (54)【発明の名称】 ＲＮＡの合成方法、該方法によって得られたＲＮＡ、該ＲＮＡから他のＲＮＡに対してハイブリ ッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡを精製する方法、該方法によって精 製されたリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法
Claims (5)
- 【請求項１】鋳型およびプライマーの不存在下、セルモ
コッカス属及び／又はセルマス属に属する細菌の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼの存在下でリボヌクレオチドを重合
させることを特徴とするＲＮＡの合成方法。 - 【請求項２】約２０〜９０℃の温度下で重合を行なう請
求項１記載の合成方法。 - 【請求項３】中性〜弱アルカリ性の条件下で重合を行な
う請求項１又は２記載の合成方法。 - 【請求項４】リボザイム活性を有するＲＮＡ混合物の調
製方法であって、 鋳型およびプライマーの不存在下、セルモコッカス属及
び／又はセルマス属に属する細菌の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼの存在下でリボヌクレオチドを重合させることに
より調製され、目的とする他のＲＮＡをリガンドとして
共有結合したアフィニティークロマトグラフィーを用い
ることによりリボザイム活性が確認されることを特徴と
するリボザイム活性を有するＲＮＡ混合物の調製方法。 - 【請求項５】請求項１〜３のいずれか１項記載の合成方
法により得られてなる鋳型・プライマー非依存的なＲＮ
Ａ混合物から、他のＲＮＡとハイブリッドを形成する能
力を有するアンチセンスＲＮＡを調製する方法であっ
て、前記した他のＲＮＡをリガンドとして共有結合した
アフィニティークロマトグラフィーを用いることにより
行なわれるアンチセンスＲＮＡの調製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16260796A JP3291554B2 (ja) | 1996-06-24 | 1996-06-24 | Ｒｎａの合成方法、該方法によって得られたｒｎａ、該ｒｎａから他のｒｎａに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスｒｎａを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスｒｎａ、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16260796A JP3291554B2 (ja) | 1996-06-24 | 1996-06-24 | Ｒｎａの合成方法、該方法によって得られたｒｎａ、該ｒｎａから他のｒｎａに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスｒｎａを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスｒｎａ、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH104964A JPH104964A (ja) | 1998-01-13 |
| JP3291554B2 true JP3291554B2 (ja) | 2002-06-10 |
Family
ID=15757818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16260796A Expired - Fee Related JP3291554B2 (ja) | 1996-06-24 | 1996-06-24 | Ｒｎａの合成方法、該方法によって得られたｒｎａ、該ｒｎａから他のｒｎａに対してハイブリッド形成能力を有するリボザイムまたはアンチセンスｒｎａを精製する方法、該方法によって精製されたリボザイムまたはアンチセンスｒｎａ、及びこれによるウイルスの複製を阻害する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3291554B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| WO2005012487A2 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for preparing short rna molecules and other nucleic acids |
-
1996
- 1996-06-24 JP JP16260796A patent/JP3291554B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 日経バイオテク，日経バイオ最新用語辞典，１９９５年 ６月３０日，第４版，ｐ．２９，３８，３９，７４０，７４１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH104964A (ja) | 1998-01-13 |
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