JPH10304892A

JPH10304892A - 標識化合物の製造方法

Info

Publication number: JPH10304892A
Application number: JP9114592A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Ikemoto; 昌弘池本; Keigo Komura; 啓悟小村; Yuji Furuya; 祐治古谷; Motohito Sasaki; 基仁佐々木; Yasuyoshi Watanabe; 恭良渡辺; Kazutoshi Suzuki; 和年鈴木
Original assignee: KAGAKU GIJUTSUCHO HOSHASEN IGAKU SOGO KENKYUSHO; Osaka Bioscience Institute; Sumitomo Heavy Industries Ltd; Ikeda Shokken KK
Current assignee: KAGAKU GIJUTSUCHO HOSHASEN IGAKU SOGO KENKYUSHO; Osaka Bioscience Institute; Sumitomo Heavy Industries Ltd; Ikeda Shokken KK
Priority date: 1997-05-02
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 1998-11-17
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: JP3896477B2

Abstract

(57)【要約】【課題】３位炭素が［¹¹Ｃ］ポジトロン核種で置き換
えられた［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸の新規製造法を提供す
る。【解決手段】アラニンラセマーゼ、Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼおよびカタラーゼの組み合わせ、またはアラニ
ンラセマーゼとアラニンデヒドロゲナーゼの組み合わせ
からなる酵素系を用いれば［3−¹¹Ｃ］アラニンを効率
よく［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸に変換することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は標識化合物の製造
方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、腫瘍や脳のイメージング・臨床診断・生体の機能学
的研究等に有用なポジトロン標識化合物あるいは、安定
同位体標識化合物の合成中間体である標識ピルビン酸の
製造法に関するものである。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題】以下、本発明を、同位
元素として¹¹Ｃポジトロン核種を用いた場合について説
明するが、同位元素が¹³Ｃまたは¹⁴Ｃである場合にも、
本発明方法が適用できることは、当業者には明らかであ
ろう。

【０００３】¹¹Ｃポジトロン核種の半減期は、20.4分と
短いことから、L−［3'−¹¹Ｃ］DOPA、L−［3'−¹¹Ｃ］
チロシン、L−［3'−¹¹Ｃ］トリプトファン、L−［3'−
¹¹Ｃ］−5−ヒドロキシトリプトファンの合成原料とな
る、［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸の製造は、有機合成法では
困難であり、酵素（グルタミン酸−ピルビン酸トランス
アミナーゼ・D-アミノ酸オキシダーゼ・カタラーゼ）を
用いた以下の製造法（反応式１）が知られている（特開
平3-151889、特願平1-292686)。

【化１】

【０００４】しかし、グルタミン酸−ピルビン酸トラン
スアミナーゼとD-アミノ酸オキシダーゼは安定性に問題
があり、また、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミ
ナーゼのアラニンに対する作用性は低く、原料となる標
識D,L-アラニンからピルビン酸への変換率が低いという
問題を抱えていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アラニン
ラセマーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼおよびカタラーゼ
を用いた酵素系（下記反応式２）またはアラニンラセマ
ーゼとアラニンデヒドロゲナーゼを用いた酵素系（下記
反応式３）を用いると、D,L-アラニンをピルビン酸へ効
率よく変換することができ、また、これらの酵素は安定
であるので、固定化することにより自動合成装置にも適
用可能であり、オンカラム・フロー系で、短時間に効率
よく［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸を製造することができるこ
とを見い出し、本発明を完成した。

【化２】

【化３】

【０００６】本発明を実施するに当たり、ポジトロン核
種¹¹Ｃ標識されたヨウ化メチルは、サイクロトロンによ
り作成した［¹¹Ｃ］二酸化炭素を用いて文献記載の一般
的方法により合成できる（B. Langstromら、J. Nucl. M
ed., 28, 1037, 1987)。N−（ジフェニルメチレン）グ
リシン第４級ブチルエステルは文献記載の方法により合
成できる（W. A. Woodら、J. Biol. Chem., 170, 313,
1947)。ポジトロン核種¹¹Ｃ標識されたD,L−アラニン
は、アラニンラセマーゼとD−アミノ酸オキシダーゼ及
びカタラーゼを用いた酵素反応またはアラニンラセマー
ゼとアラニンデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応をさせ
ることにより効率よくポジトロン核種¹¹Ｃ標識されたピ
ルビン酸を製造することができる。同様にして、¹³Ｃ、
¹⁴Ｃ等で標識された化合物を得ることもできる。

【０００７】本発明を実施する際に使用する酵素は市販
品を利用できる。即ち、アラニンラセマーゼは、ユニチ
カより、アラニンデヒドロゲナーゼは生化学工業より、
カタラーゼは、ベーリンガー・マンハイムから購入でき
る。また、D−アミノ酸オキシダーゼ、グルタミン酸−
ピルビン酸トランスアミナーゼはシグマ社より購入でき
る。但し、これらの酵素は、その活性を持つものであれ
ば、その起源、由来、状態は特に限定されないことは言
うまでもない。目的標識化合物への酵素の混入を抑える
ために、これら酵素は、水に不溶性の担体に固定化し、
固定化酵素として使用することも可能である。固定化の
方法としては、共有結合法、物理的吸着法、イオン結合
法、包括法等が代表的なものであり、これらに使用され
る担体も、有機化合物、無機化合物、あるいは天然物
質、人工物質がある。特に好ましい固定化酵素法として
は、固定化担体にアミノ化多孔質ガラスを用い、酵素と
担体との固定化は、グルタルアルデヒドを用いた共有結
合法が挙げられるが、その方法は特に限定されるもので
はない。

【０００８】この発明により、D,L−［３−¹¹Ｃ］アラ
ニンを短時間に効率よく［３−¹¹Ｃ］ピルビン酸に変換
でき、又、目的標識化合物への酵素の混入を抑えること
が可能となったため、［３−¹¹Ｃ］ピルビン酸はポジト
ロン標識化合物あるいは、安定同位体標識化合物の合成
中間体として腫瘍や脳のイメージング・臨床診断・生体
の機能学的研究等に極めて有用なものである。本発明に
おいては、ポジトロン核種¹¹Ｃばかりではなく、¹³Ｃの
ような安定同位体元素による標識や¹⁴Ｃのような放射性
同位元素の標識も可能である。

【０００９】以下、製造例および実施例を挙げて本発明
をより詳細に説明する。製造例１［¹¹Ｃ］ヨウ化メチルの製造ターゲットより回収した、［¹¹Ｃ］二酸化炭素を反応フ
ラスコに入れた水素化リチウムアルミニウムのTHF溶液
（40μM、0.5ml）に導いた。THFを蒸発させた後、ヨウ
化水素酸（57％、0.3ml）を加えて還流し、生成した［
¹¹Ｃ］ヨウ化メチルを留去して反応容器に移した。

【００１０】製造例２ D,L−［3−¹¹Ｃ］アラニンの製
造 N−(ジフェニルメチレン)グリシン第４級ブチルエステ
ル（3mg)、DMF（0.3ml)、水酸化カリウム水溶液（5M、5
μl）をあらかじめ入れた反応容器に、［¹¹Ｃ］ヨウ化
メチルを窒素気流中、この反応容器に加えた。反応混合
物を70℃で3分間加熱した後、蒸留水（15ml）を入れた
リザーバー（液溜）にこの混合物を移し、Sep-Pak C−1
8カラムに通した。このカラムを水（3ml）で洗浄した
後、カラムに吸着した放射活性物質をジクロロメタン
（3ml）で溶出し、塩酸（6M、0.7ml）を入れた反応器に
受けた。この混合物からジクロロメタンと塩酸を蒸発さ
せ、ラセミ体の［３−¹¹Ｃ］アラニン溶液を水（1ml）
で溶解し、Sep-Pak C−18カラムに通して精製した。分
析は、以下の条件で行った。カラム：Finepak SIL C18S（4.6mm×150mm）（日本分光
（株）製）溶離液：10mMリン酸二水素ナトリウム（pH2.2)、5mM 1
−オクタンスルホン酸ナトリウム/アセトニトリル（9
0：10）カラム温度：室温検出：UV検出器（Abs₂₁₀）ならびに放射能検出器を連
結

【００１１】実施例１［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸の製造製造例２で得たD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニン溶液に、最終
濃度がそれぞれ、0.1M、17μM、0.1mMになるようにトリ
スエチレンヒドロキシアミン/塩酸（Tris/HCl）緩衝液
（pH8.5)、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD)、ピ
リドキサールリン酸（PLP）を加えた。さらに、アラニ
ンラセマーゼ（24単位)、D-アミノ酸オキシダーゼ（3.6
単位)、カタラーゼ（4300単位）を加え、反応混合物を4
分間、45℃に保った。塩酸（6M、0.2ml）を加えて反応
を停止させ、0.22μm細孔フィルターで濾過した後、製
造例２の条件で分析を行った。基質であるD,L−［3−¹¹
Ｃ］アラニンが完全に消費され、［3−¹¹Ｃ］ピルビン
酸に転換されていた（図１の参照)。転換物が［3−¹¹
Ｃ］ピルビン酸であることは、これをピルビン酸標品と
混合してＨＰＬＣ分析を行い、ＵＶ検出シグナルと放射
線検出シグナルが示す保持時間が両者で一致することに
より確認することができた（図２参照)。

【００１２】実施例２［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸の製造製造例２で得たD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニン溶液に、最終
濃度がそれぞれ、0.1M、2.5mM、0.1mMになるようにTris
/HCl緩衝液（pH8.5)、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（NAD)、PLPを加えた。さらに、アラニンラセマ
ーゼ（24単位)、アラニンデヒドロゲナーゼ（3.6単位）
を加え、反応混合物を4分間、45℃に保った。塩酸（6
M、0.2ml）を加えて反応を停止させ、0.22μm細孔フィ
ルターで濾過した後、製造例２の条件で分析を行った。
基質であるD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニンが完全に消費さ
れ、［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸に転換されていた（図１の
参照)。転換物が［3−¹¹Ｃ]ピルビン酸であることの
確認は、実施例１と同様にして行った。

【００１３】比較例１［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸の製造製造例２で得たD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニン溶液に、最終
濃度がそれぞれ、0.1M、10mM、17μM、0.1mMになるよう
にTris/HCl緩衝液（pH8.5)、α-ケトグルタル酸、FAD、
PLPを加えた。さらに、グルタミン酸−ピルビン酸トラ
ンスアミナーゼ（24単位)、D-アミノ酸オキシダーゼ
（3.6単位)、カタラーゼ（4300単位）を加え、反応混合
物を4分間、45℃に保った。塩酸（6M、0.2ml）を加えて
反応を停止させ、0.22μm細孔フィルターで濾過した
後、製造例２の条件で分析を行った。実施例１および２
と異なり、基質であるD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニンが完全
にピルビン酸に転換されず残存していた（図１の参
照)。

【００１４】製造例３固定化アラニンラセマーゼの調
製 0.2 gのアミノプロピル−CPG（ポアーサイズ1400オング
ストロームフナコシ（株）販売）に2.5％グルタルア
ルデヒド水溶液10mlを添加し、1時間室温で反応させた
後、十分水洗した。これに10mg のアラニンラセマーゼ
を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）10mlを加え、4℃で一
晩撹拌しながら反応させた。このアラニンラセマーゼ固
定化担体粒子を上記リン酸緩衝液で洗浄し、未反応のア
ラニンラセマーゼを除去し、固定化アラニンラセマーゼ
を作成した。

【００１５】製造例４固定化D-アミノ酸オキシダーゼ
の調製 0.2 gのアミノプロピル−CPG（ポアーサイズ1400オング
ストロームフナコシ（株）販売）に2.5％グルタルア
ルデヒド水溶液10mlを添加し、1時間室温で反応させた
後、十分水洗した。これに10mg のD-アミノ酸オキシダ
ーゼを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）10mlを加え、4℃
で一晩撹拌しながら反応させた。このD-アミノ酸オキシ
ダーゼ固定化担体粒子を上記リン酸緩衝液で洗浄し、未
反応のD-アミノ酸オキシダーゼを除去し、固定化D-アミ
ノ酸オキシダーゼを作成した。

【００１６】製造例５固定化アラニンデヒドロゲナー
ゼの調製 0.2 gのアミノプロピル−CPG（ポアーサイズ1400オング
ストロームフナコシ（株）販売）に2.5％グルタルア
ルデヒド水溶液10mlを添加し、1時間室温で反応させた
後、十分水洗した。これに10mg のアラニンデヒドロゲ
ナーゼを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）10mlを加え、4
℃で一晩撹拌しながら反応させた。このアラニンデヒド
ロゲナーゼ固定化担体粒子を上記リン酸緩衝液で洗浄
し、未反応のアラニンデヒドロゲナーゼを除去し、固定
化アラニンデヒドロゲナーゼを作成した。

【００１７】製造例６内径4mm、長さ6cm（内容積720μl）のカラムに製造例３
で調製した固定化アラニンラセマーゼと製造例４で調製
した固定化D-アミノ酸オキシダーゼを1：1の量比に混合
したものを充填し、ピルビン酸合成用反応カラムAとし
た。

【００１８】製造例７内径4mm、長さ6cm（内容積720μl）のカラムに製造例３
で調製した固定化アラニンラセマーゼと製造例５で調製
した固定化アラニンデヒドロゲナーゼを1：1の量比に混
合したものを充填し、ピルビン酸合成用反応カラムBと
した。

【００１９】実施例３固定化酵素カラムAを用いた［3
−¹¹Ｃ］ピルビン酸の製造 45℃に保温した、0.01mM PLPを含む0.1M Tris/HCl 緩衝
液（pH8.5）をペリスタポンプで同温度に保温した固定
化酵素カラムA に送液し、カラムを平衡化させた。次
に、製造例２で得たD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニン溶液に、
最終濃度がそれぞれ、0.1M、17μM、0.1mMになるように
Tris/HCl 緩衝液（pH8.5)、FAD、PLPを加え、流速5ml/
分でカラムに送液した。さらに、同流速で0.01mM PLPを
含む0.1M Tris/HCl 緩衝液（pH8.5）を送液した。カラ
ム通過後の溶液を分取し、製造例２の条件で分析を行っ
た。基質であるD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニンが完全に消費
され、［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸に転換されていた。

【００２０】実施例４固定化酵素カラムBを用いた［3
−¹¹Ｃ］ピルビン酸の製造 45℃に保温した、0.01mM PLPを含む0.1M Tris/HCl 緩衝
液（pH8.5）をペリスタポンプで同温度に保温した固定
化酵素カラムB に送液し、カラムを平衡化させた。次
に、製造例２で得たD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニン溶液に、
最終濃度がそれぞれ、0.1M、2.5mM、0.1mMになるように
Tris/HCl 緩衝液（pH8.5)、NAD、PLPを加え、流速5ml/
分でカラムに送液した。さらに、同流速で0.01mM PLPを
含む0.1M Tris/HCl 緩衝液（pH8.5）を送液した。カラ
ム通過後の溶液を分取し、製造例２の条件で分析を行っ
た。基質であるD,L−［3−¹¹Ｃ］アラニンが完全に消費
され、［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸に転換されていた。

【００２１】実施例３および４に於いて、固定化酵素カ
ラムＡ、Ｂを用いて合成された放射活性物質を、ピルビ
ン酸標品と混合し、HPLC分析を行った結果、ＵＶ検出シ
グナルと放射線検出シグナルが示す保持時間が両者で一
致した。このことから該放射活性物質が［3−¹¹Ｃ］ピ
ルビン酸であることを確認した。

【図面の簡単な説明】

【図１】［3−¹¹Ｃ］ピルビン酸合成反応終了後のフ
ィルター濾過液をHPLCで分析したクロマトグラムを示す
図であり、は比較例１、は実施例１、は実施例２
の結果を示す。

【図２】実施例１で合成された放射活性物質とピルビ
ン酸標品との混合物のHPLC分析の結果を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者池本昌弘千葉県千葉市稲毛区小仲台３−１−22 ＳＫハイツＢ−203号 (72)発明者小村啓悟広島県福山市南松永町２−179−２ (72)発明者古谷祐治広島県深安郡神辺町十三軒屋20−９ (72)発明者佐々木基仁神奈川県横浜市戸塚区鳥戸塚町2400−１コスモ戸塚ツインコートＢ−202号 (72)発明者渡辺恭良大阪府箕面市小野原東５−20−19 (72)発明者鈴木和年千葉県船橋市田喜野井４−22−６

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ピルビン酸、もしくはその塩の、3位炭
素が¹¹Ｃ、¹³Ｃ、または¹⁴Ｃ同位元素で置き換えられた
標識化合物の製造法であって、3位炭素が¹¹Ｃ、¹³Ｃ、
または¹⁴Ｃ同位元素で置き換えられたD,L-アラニンもし
くはその塩に、アラニンラセマーゼ［EC.5.1.1.1］と、
アラニンに作用してピルビン酸を生成する酵素を作用さ
せることを特徴とする方法。
【請求項２】アラニンに作用してピルビン酸を生成す
る酵素がD-アミノ酸オキシダーゼ［EC.1.4.3.3］である
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】アラニンに作用してピルビン酸を生成す
る酵素がL-アラニンデヒドロゲナーゼ［EC.1.4.1.1］で
あることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】同位元素が¹¹Ｃである請求項１記載の方
法。
【請求項５】同位元素が¹³Ｃまたは¹⁴Ｃである請求
項１記載の方法。
【請求項６】アラニンラセマーゼと、アラニンに作用
してピルビン酸を生成する酵素を適当な固定化担体に固
定化することにより、目的標識化合物への酵素の混入を
抑えることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記
載の方法。