JPH10293099A - 顕微鏡装置 - Google Patents
顕微鏡装置Info
- Publication number
- JPH10293099A JPH10293099A JP10202397A JP10202397A JPH10293099A JP H10293099 A JPH10293099 A JP H10293099A JP 10202397 A JP10202397 A JP 10202397A JP 10202397 A JP10202397 A JP 10202397A JP H10293099 A JPH10293099 A JP H10293099A
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- JP
- Japan
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- sample
- light
- polarization
- fluorescence
- excitation light
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 光分解性試薬が光分解されて活性化された蛍
光分子が結合している試料中のターゲットのみを検出
し、試料中に引き起こされる反応を解析する。 【解決手段】 分解用光源１０から出力された分解光Ａ
は、分解光照射時間制御部１１および分解光照射範囲調
整部１２等を経て試料７０に照射され、試料７０に導入
されている光分解性試薬を光分解する。一方、励起用光
源２０から出力されたパルス励起光Ｂは、励起光照射時
間制御部２１および分解光照射範囲調整部２４等を経て
試料７０に照射され、光分解により生じた蛍光分子を励
起する。試料７０から発生した蛍光Ｃは、偏光ビームス
プリッタ５１等を経て、そのｐ偏光成分が光検出器５３
により撮像され、そのｓ偏光成分が光検出器５４により
撮像され、偏光解消度が演算部６０により求められる。
光分子が結合している試料中のターゲットのみを検出
し、試料中に引き起こされる反応を解析する。 【解決手段】 分解用光源１０から出力された分解光Ａ
は、分解光照射時間制御部１１および分解光照射範囲調
整部１２等を経て試料７０に照射され、試料７０に導入
されている光分解性試薬を光分解する。一方、励起用光
源２０から出力されたパルス励起光Ｂは、励起光照射時
間制御部２１および分解光照射範囲調整部２４等を経て
試料７０に照射され、光分解により生じた蛍光分子を励
起する。試料７０から発生した蛍光Ｃは、偏光ビームス
プリッタ５１等を経て、そのｐ偏光成分が光検出器５３
により撮像され、そのｓ偏光成分が光検出器５４により
撮像され、偏光解消度が演算部６０により求められる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料に導入された
光分解性試薬を分解光の照射により光分解し、その試料
に励起光を照射して、試料中の蛍光分子から発生する蛍
光を検出し、試料を解析する顕微鏡装置に関するもので
ある。
光分解性試薬を分解光の照射により光分解し、その試料
に励起光を照射して、試料中の蛍光分子から発生する蛍
光を検出し、試料を解析する顕微鏡装置に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】光分解性試薬（例えば、光ケージド試
薬）は、活性分子の活性部位がニトロベンジル基等でブ
ロックされ不活性化された試薬であって、所定波長の分
解光が照射されると光分解して活性部位のブロックが解
除され、活性分子が活性を持つようになる試薬である。
したがって、この光分解性試薬が導入された試料に分解
光が照射されると、その分解光が照射された範囲におい
てのみ活性分子の量が変化する。例えば、光分解性試薬
を予め細胞中に導入しておき、その後その細胞の所定領
域に分解光を照射することにより、その所定領域におい
てのみ活性分子の量を急激に増加させることができる。
薬）は、活性分子の活性部位がニトロベンジル基等でブ
ロックされ不活性化された試薬であって、所定波長の分
解光が照射されると光分解して活性部位のブロックが解
除され、活性分子が活性を持つようになる試薬である。
したがって、この光分解性試薬が導入された試料に分解
光が照射されると、その分解光が照射された範囲におい
てのみ活性分子の量が変化する。例えば、光分解性試薬
を予め細胞中に導入しておき、その後その細胞の所定領
域に分解光を照射することにより、その所定領域におい
てのみ活性分子の量を急激に増加させることができる。
【０００３】ここで、光分解されて活性を有するように
なった活性分子によって細胞内に誘起される反応を検出
する手段としては、カルシウムイオン検出用色素を使用
して細胞内カルシウムイオン濃度の変化を検出する手
段、膜電位測定色素を使用して膜電位の変化を検出する
手段、パッチクランプを使用して膜電位の変化を検出す
る手段、および、細胞の形態変化や収縮を検出する手段
などが知られている（例えば、J.W.Tanner, et al., J.
Mol.Biol., Vol.223 (1992) pp.185-203、T.St.C.Alle
n, et al., Biophys.J., Vol.70 (1996) pp.1847-186
2、および、A.H.Gough, el al., J.Cell Biol., Vol.12
1 (1993) pp.1095-1107）。
なった活性分子によって細胞内に誘起される反応を検出
する手段としては、カルシウムイオン検出用色素を使用
して細胞内カルシウムイオン濃度の変化を検出する手
段、膜電位測定色素を使用して膜電位の変化を検出する
手段、パッチクランプを使用して膜電位の変化を検出す
る手段、および、細胞の形態変化や収縮を検出する手段
などが知られている（例えば、J.W.Tanner, et al., J.
Mol.Biol., Vol.223 (1992) pp.185-203、T.St.C.Alle
n, et al., Biophys.J., Vol.70 (1996) pp.1847-186
2、および、A.H.Gough, el al., J.Cell Biol., Vol.12
1 (1993) pp.1095-1107）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記何
れの検出手段も、分解光照射により活性化された活性分
子によって細胞等の試料内で起こると予想される様々な
分子間反応を十分には計測できないという問題点があ
る。
れの検出手段も、分解光照射により活性化された活性分
子によって細胞等の試料内で起こると予想される様々な
分子間反応を十分には計測できないという問題点があ
る。
【０００５】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、光分解性試薬が光分解されて活性化さ
れた活性分子によって試料中に引き起こされる反応を検
出することができる顕微鏡装置を提供することを目的と
する。
れたものであり、光分解性試薬が光分解されて活性化さ
れた活性分子によって試料中に引き起こされる反応を検
出することができる顕微鏡装置を提供することを目的と
する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明に係る顕微鏡装置
は、(1) 分解光を出力する分解用光源部と、(2) 分解光
を試料に照射し、試料に導入されている光分解性試薬を
光分解する分解用光学系と、(3) 直線偏光の励起光を出
力する励起用光源部と、(4) 励起光を所定方向から試料
に照射し、試料中の光分解性試薬が光分解されて放出さ
れた物質によって引き起こされる変化を検出するための
蛍光分子を励起する励起用光学系と、(5) 励起光が試料
に照射されて発生した蛍光を入力し、試料に照射される
ときの励起光の偏光方位に平行な第１の偏光方位および
これに直交する第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分
に分岐する受光光学系と、(6) 受光光学系により互いに
分岐された蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの
直線偏光成分をそれぞれ撮像する第１および第２の撮像
手段と、(7) 第１および第２の撮像手段それぞれにより
撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの
直線偏光成分の画像に基づいて、蛍光の偏光解消の２次
元画像を求める画像演算手段と、を備えることを特徴と
する。
は、(1) 分解光を出力する分解用光源部と、(2) 分解光
を試料に照射し、試料に導入されている光分解性試薬を
光分解する分解用光学系と、(3) 直線偏光の励起光を出
力する励起用光源部と、(4) 励起光を所定方向から試料
に照射し、試料中の光分解性試薬が光分解されて放出さ
れた物質によって引き起こされる変化を検出するための
蛍光分子を励起する励起用光学系と、(5) 励起光が試料
に照射されて発生した蛍光を入力し、試料に照射される
ときの励起光の偏光方位に平行な第１の偏光方位および
これに直交する第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分
に分岐する受光光学系と、(6) 受光光学系により互いに
分岐された蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの
直線偏光成分をそれぞれ撮像する第１および第２の撮像
手段と、(7) 第１および第２の撮像手段それぞれにより
撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの
直線偏光成分の画像に基づいて、蛍光の偏光解消の２次
元画像を求める画像演算手段と、を備えることを特徴と
する。
【０００７】この顕微鏡装置によれば、分解用光源部か
ら出力される分解光は、分解用光学系により試料に照射
され、試料に導入されている光分解性試薬を光分解す
る。一方、励起用光源部から出力される直線偏光の励起
光は、励起用光学系により所定方向から試料に照射さ
れ、試料中の光分解性試薬が光分解されて放出された物
質によって引き起こされる変化を検出するための蛍光分
子を励起する。励起光が試料に照射されて発生した蛍光
は、受光光学系により、試料に照射されるときの励起光
の偏光方位に平行な第１の偏光方位およびこれに直交す
る第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐され、
その蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏
光成分は、第１および第２の撮像手段それぞれにより撮
像される。そして、画像演算手段により、その撮像され
た蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光
成分の画像に基づいて、蛍光の偏光解消の２次元画像が
求められる。
ら出力される分解光は、分解用光学系により試料に照射
され、試料に導入されている光分解性試薬を光分解す
る。一方、励起用光源部から出力される直線偏光の励起
光は、励起用光学系により所定方向から試料に照射さ
れ、試料中の光分解性試薬が光分解されて放出された物
質によって引き起こされる変化を検出するための蛍光分
子を励起する。励起光が試料に照射されて発生した蛍光
は、受光光学系により、試料に照射されるときの励起光
の偏光方位に平行な第１の偏光方位およびこれに直交す
る第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分に分岐され、
その蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏
光成分は、第１および第２の撮像手段それぞれにより撮
像される。そして、画像演算手段により、その撮像され
た蛍光の第１および第２の偏光方位それぞれの直線偏光
成分の画像に基づいて、蛍光の偏光解消の２次元画像が
求められる。
【０００８】また、さらに、分解光が試料に照射される
範囲を調整する分解光照射範囲調整手段を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、分解光照射範囲調整手
段により、試料上の所定範囲のみに分解光が照射される
ので、その所定範囲に存在する光分解性試薬のみが光分
解される。
範囲を調整する分解光照射範囲調整手段を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、分解光照射範囲調整手
段により、試料上の所定範囲のみに分解光が照射される
ので、その所定範囲に存在する光分解性試薬のみが光分
解される。
【０００９】また、さらに、励起光が試料に照射される
範囲を調整する励起光照射範囲調整手段を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、励起光照射範囲調整手
段により、試料上の所定範囲のみに励起光が照射される
ので、その所定範囲に存在する蛍光分子のみが励起さ
れ、その蛍光分子から蛍光が発生する。
範囲を調整する励起光照射範囲調整手段を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、励起光照射範囲調整手
段により、試料上の所定範囲のみに励起光が照射される
ので、その所定範囲に存在する蛍光分子のみが励起さ
れ、その蛍光分子から蛍光が発生する。
【００１０】また、さらに、試料に照射される励起光の
偏光方位を回転させる偏光方位回転手段を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、励起光は、偏光方位回
転手段により所定方位の直線偏光に設定されて試料に照
射される。
偏光方位を回転させる偏光方位回転手段を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、励起光は、偏光方位回
転手段により所定方位の直線偏光に設定されて試料に照
射される。
【００１１】また、画像演算手段は、偏光方位回転手段
により第１の偏光方位とされた励起光が試料に照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、偏光方位回転手
段により第２の偏光方位とされた励起光が試料に照射さ
れたときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位
それぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、偏光応答補
正を行って蛍光の偏光解消の２次元画像を求めるのが好
適である。このようにすることにより、試料中の蛍光分
子の分子軸が配向しておらず全くランダムに分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
により第１の偏光方位とされた励起光が試料に照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、偏光方位回転手
段により第２の偏光方位とされた励起光が試料に照射さ
れたときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位
それぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、偏光応答補
正を行って蛍光の偏光解消の２次元画像を求めるのが好
適である。このようにすることにより、試料中の蛍光分
子の分子軸が配向しておらず全くランダムに分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
【００１２】また、画像演算手段は、所定方向を中心軸
とする所定回転角度位置にある試料に対して偏光方位回
転手段により第１の偏光方位とされた励起光が照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、中心軸について
所定回転角度位置とは９０度異なる回転角度位置にある
試料に対して偏光方位回転手段により第２の偏光方位と
された励起光が照射されたときに撮像された蛍光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分の画像に
基づいて、偏光応答補正を行って蛍光の偏光解消の２次
元画像を求めるのも好適である。このようにすることに
より、試料中の蛍光分子の分子軸が配向して分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
とする所定回転角度位置にある試料に対して偏光方位回
転手段により第１の偏光方位とされた励起光が照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、中心軸について
所定回転角度位置とは９０度異なる回転角度位置にある
試料に対して偏光方位回転手段により第２の偏光方位と
された励起光が照射されたときに撮像された蛍光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分の画像に
基づいて、偏光応答補正を行って蛍光の偏光解消の２次
元画像を求めるのも好適である。このようにすることに
より、試料中の蛍光分子の分子軸が配向して分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置の構成図
である。
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置の構成図
である。
【００１４】分解用光源１０は、測定対象である試料７
０に導入されている光分解性試薬を光分解する分解光Ａ
を出射する光源である。この分解用光源１０として、例
えば、パルスＹＡＧレーザ光源が好適に用いられ、これ
から出射されるレーザ光の第三高調波（波長：３５５ｎ
ｍ、パルス幅：例えば５ｎｓ）が分解光Ａとして用いら
れる。また、分解用光源１０および分解光Ａとして、ア
ルゴンレーザ光源から出射される紫外レーザ光、モード
同期チタンサファイアレーザ光源から出射されるレーザ
光の第二高調波、モード同期レーザ光励起色素レーザ光
源から出射されるレーザ光の第二高調波、モード同期ル
ビーレーザ光源から出射されるレーザ光の第二高調波、
エキシマレーザ光源から出射されるレーザ光、キセノン
ランプ光源から出射される紫外光、および、水銀ランプ
光源から出射される紫外光なども好適に用いられる。
０に導入されている光分解性試薬を光分解する分解光Ａ
を出射する光源である。この分解用光源１０として、例
えば、パルスＹＡＧレーザ光源が好適に用いられ、これ
から出射されるレーザ光の第三高調波（波長：３５５ｎ
ｍ、パルス幅：例えば５ｎｓ）が分解光Ａとして用いら
れる。また、分解用光源１０および分解光Ａとして、ア
ルゴンレーザ光源から出射される紫外レーザ光、モード
同期チタンサファイアレーザ光源から出射されるレーザ
光の第二高調波、モード同期レーザ光励起色素レーザ光
源から出射されるレーザ光の第二高調波、モード同期ル
ビーレーザ光源から出射されるレーザ光の第二高調波、
エキシマレーザ光源から出射されるレーザ光、キセノン
ランプ光源から出射される紫外光、および、水銀ランプ
光源から出射される紫外光なども好適に用いられる。
【００１５】この分解用光源１０の出射口の前方に設け
られた分解光照射時間制御部１１は、分解用光源１０か
ら出射された分解光Ａが試料７０に照射される時間を制
御するものであり、制御部６１により開閉タイミングが
制御される。分解光照射時間制御部１１として、例え
ば、シャッタや光音響素子が好適に用いられる。なお、
分解用光源１０からの分解光Ａの出射タイミングが外部
からのトリガ信号により制御することができる場合に
は、分解光照射時間制御部１１を設けることなく、制御
部６１により直接に分解用光源１０からの分解光Ａの出
射タイミングを制御してもよい。
られた分解光照射時間制御部１１は、分解用光源１０か
ら出射された分解光Ａが試料７０に照射される時間を制
御するものであり、制御部６１により開閉タイミングが
制御される。分解光照射時間制御部１１として、例え
ば、シャッタや光音響素子が好適に用いられる。なお、
分解用光源１０からの分解光Ａの出射タイミングが外部
からのトリガ信号により制御することができる場合に
は、分解光照射時間制御部１１を設けることなく、制御
部６１により直接に分解用光源１０からの分解光Ａの出
射タイミングを制御してもよい。
【００１６】分解光照射時間制御部１１から出力された
分解光Ａは、分解光照射範囲調整部１２に入力する。こ
の分解光照射範囲調整部１２は、分解光Ａを試料７０上
の所定位置に集光照射し、或いは、ピンホール１３の開
口部の像を試料７０上の所定位置に結像するものであ
る。分解光照射範囲調整部１２から出射された分解光Ａ
は、ダイクロイックミラー３１を透過し、ダイクロイッ
クミラー４１により反射され、対物レンズ４２により試
料７０の所定位置に照射される。
分解光Ａは、分解光照射範囲調整部１２に入力する。こ
の分解光照射範囲調整部１２は、分解光Ａを試料７０上
の所定位置に集光照射し、或いは、ピンホール１３の開
口部の像を試料７０上の所定位置に結像するものであ
る。分解光照射範囲調整部１２から出射された分解光Ａ
は、ダイクロイックミラー３１を透過し、ダイクロイッ
クミラー４１により反射され、対物レンズ４２により試
料７０の所定位置に照射される。
【００１７】試料７０は、例えば、培養皿７１に容れら
れて培養された細胞であり、光分解性試薬が予め導入さ
れている。この培養皿７１は、下面中心部が厚みの薄い
カバーガラスになっており、そのカバーガラスの上に試
料７０が置かれ、中央に孔部を有するステージ４３の上
に載置される。対物レンズ４２から出射される分解光Ａ
および後述するパルス励起光Ｂは、ステージ４３中央の
孔部を通過し、培養皿７１の下面中心部のカバーガラス
を透過して、下方から試料７０に照射される。
れて培養された細胞であり、光分解性試薬が予め導入さ
れている。この培養皿７１は、下面中心部が厚みの薄い
カバーガラスになっており、そのカバーガラスの上に試
料７０が置かれ、中央に孔部を有するステージ４３の上
に載置される。対物レンズ４２から出射される分解光Ａ
および後述するパルス励起光Ｂは、ステージ４３中央の
孔部を通過し、培養皿７１の下面中心部のカバーガラス
を透過して、下方から試料７０に照射される。
【００１８】この試料７０に導入される光分解性試薬と
しては幾つかのタイプのものが知られており、活性部位
がブロックされ不活性化されているが光分解によりブロ
ックが解除されて活性を有するようになる蛍光分子を含
む試薬（例えば、ケージド試薬）、光分解により自ら蛍
光性を有するようになる試薬（例えば、ケージドフルオ
レセイン）、あるいは、光分解により生じる物質により
他の蛍光物質を活性化させる試薬（例えば、光分解によ
り生じるカルシウムイオンによりフルオレセインで蛍光
標識されたカルモジュリンを活性化させるケージドカル
シウム）が好適に用いられる。なお、以下では、以上の
何れのタイプの光分解性試薬の場合とも、光分解性試薬
が光分解された結果生じた蛍光性を有する物質を単に蛍
光分子と呼ぶ。
しては幾つかのタイプのものが知られており、活性部位
がブロックされ不活性化されているが光分解によりブロ
ックが解除されて活性を有するようになる蛍光分子を含
む試薬（例えば、ケージド試薬）、光分解により自ら蛍
光性を有するようになる試薬（例えば、ケージドフルオ
レセイン）、あるいは、光分解により生じる物質により
他の蛍光物質を活性化させる試薬（例えば、光分解によ
り生じるカルシウムイオンによりフルオレセインで蛍光
標識されたカルモジュリンを活性化させるケージドカル
シウム）が好適に用いられる。なお、以下では、以上の
何れのタイプの光分解性試薬の場合とも、光分解性試薬
が光分解された結果生じた蛍光性を有する物質を単に蛍
光分子と呼ぶ。
【００１９】一方、励起用光源２０は、以上のような光
分解性試薬が光分解されて生じた蛍光分子を励起して蛍
光を発生させ得るパルス励起光Ｂを出射する光源であ
る。この励起用光源２０として、例えば、モード同期チ
タンサファイアレーザ光源が好適に用いられ、これから
出射されるレーザ光の第二高調波（波長：例えば４８０
ｎｍ）がパルス励起光Ｂとして用いられる。
分解性試薬が光分解されて生じた蛍光分子を励起して蛍
光を発生させ得るパルス励起光Ｂを出射する光源であ
る。この励起用光源２０として、例えば、モード同期チ
タンサファイアレーザ光源が好適に用いられ、これから
出射されるレーザ光の第二高調波（波長：例えば４８０
ｎｍ）がパルス励起光Ｂとして用いられる。
【００２０】この励起用光源２０の出射口の前方に設け
られた励起光照射時間制御部２１は、励起用光源２０か
ら出射されたパルス励起光Ｂが試料７０に照射される時
間を制御するものであり、制御部６１により開閉タイミ
ングが制御される。励起光照射時間制御部２１として、
例えば、シャッタや光音響素子が好適に用いられる。な
お、励起用光源２０からのパルス励起光Ｂの出射タイミ
ングが外部からのトリガ信号により制御することができ
る場合には、励起光照射時間制御部２１を設けることな
く、制御部６１により直接に励起用光源２０からのパル
ス励起光Ｂの出射タイミングを制御してもよい。
られた励起光照射時間制御部２１は、励起用光源２０か
ら出射されたパルス励起光Ｂが試料７０に照射される時
間を制御するものであり、制御部６１により開閉タイミ
ングが制御される。励起光照射時間制御部２１として、
例えば、シャッタや光音響素子が好適に用いられる。な
お、励起用光源２０からのパルス励起光Ｂの出射タイミ
ングが外部からのトリガ信号により制御することができ
る場合には、励起光照射時間制御部２１を設けることな
く、制御部６１により直接に励起用光源２０からのパル
ス励起光Ｂの出射タイミングを制御してもよい。
【００２１】励起光照射時間制御部２１から出力された
パルス励起光Ｂは、偏光子２２および１／２波長板２３
により、試料７０への照射時において所定の偏光方位の
直線偏光となるよう設定され、励起光照射範囲調整部２
４により試料７０上における照射範囲が調整される。こ
の励起光照射範囲調整部２４は、分解光照射範囲調整部
１２と同様の構成・作用である。励起光照射範囲調整部
２４から出射されたパルス励起光Ｂは、ダイクロイック
ミラー３１および４１により順次反射され、対物レンズ
４２により試料７０の所定位置に照射される。
パルス励起光Ｂは、偏光子２２および１／２波長板２３
により、試料７０への照射時において所定の偏光方位の
直線偏光となるよう設定され、励起光照射範囲調整部２
４により試料７０上における照射範囲が調整される。こ
の励起光照射範囲調整部２４は、分解光照射範囲調整部
１２と同様の構成・作用である。励起光照射範囲調整部
２４から出射されたパルス励起光Ｂは、ダイクロイック
ミラー３１および４１により順次反射され、対物レンズ
４２により試料７０の所定位置に照射される。
【００２２】ここで、ダイクロイックミラー３１は、分
解光Ａを透過させ、パルス励起光Ｂを反射するものであ
る。また、ダイクロイックミラー４１は、分解光Ａおよ
びパルス励起光Ｂの双方を反射し、試料７０で発生する
蛍光Ｃを透過させるものである。
解光Ａを透過させ、パルス励起光Ｂを反射するものであ
る。また、ダイクロイックミラー４１は、分解光Ａおよ
びパルス励起光Ｂの双方を反射し、試料７０で発生する
蛍光Ｃを透過させるものである。
【００２３】パルス励起光Ｂの試料７０への照射に伴い
発生した蛍光Ｃは、培養皿７１の下面中心部のカバーガ
ラスを透過し、ステージ４３の孔部を通過し、対物レン
ズ４２を経て、ダイクロイックミラー４１および励起光
除去フィルタ４４を順次透過し、反射鏡４５により反射
され、偏光ビームスプリッタ５１に入射する。励起光除
去フィルタ４４は、蛍光Ｃを透過させるが、パルス励起
光Ｂの散乱光を遮断するものである。偏光ビームスプリ
ッタ５１は、入射した蛍光Ｃのうち、ｐ偏光成分を透過
させ、ｓ偏光成分を反射させるものである。
発生した蛍光Ｃは、培養皿７１の下面中心部のカバーガ
ラスを透過し、ステージ４３の孔部を通過し、対物レン
ズ４２を経て、ダイクロイックミラー４１および励起光
除去フィルタ４４を順次透過し、反射鏡４５により反射
され、偏光ビームスプリッタ５１に入射する。励起光除
去フィルタ４４は、蛍光Ｃを透過させるが、パルス励起
光Ｂの散乱光を遮断するものである。偏光ビームスプリ
ッタ５１は、入射した蛍光Ｃのうち、ｐ偏光成分を透過
させ、ｓ偏光成分を反射させるものである。
【００２４】偏光ビームスプリッタ５１を透過した蛍光
Ｃのｐ偏光成分は、光検出器５３にの撮像面に結像さ
れ、一方、偏光ビームスプリッタ５１により反射された
蛍光Ｃのｓ偏光成分は、反射鏡５２により反射された後
に光検出器５４の撮像面に結像される。そして、光検出
器５３および５４それぞれは、それぞれの撮像面上に結
像された蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれ
の画像を撮像する。光検出器５３および５４として、例
えば、ゲート機能付きイメージインテンシファイアが好
適に用いられる。
Ｃのｐ偏光成分は、光検出器５３にの撮像面に結像さ
れ、一方、偏光ビームスプリッタ５１により反射された
蛍光Ｃのｓ偏光成分は、反射鏡５２により反射された後
に光検出器５４の撮像面に結像される。そして、光検出
器５３および５４それぞれは、それぞれの撮像面上に結
像された蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれ
の画像を撮像する。光検出器５３および５４として、例
えば、ゲート機能付きイメージインテンシファイアが好
適に用いられる。
【００２５】演算部６０は、光検出器５３および５４そ
れぞれにより撮像された蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏
光成分それぞれの画像を入力し、これらの画像に基づい
て、試料７０で発生した蛍光Ｃの異方性を計測して偏光
解消度を求め、そして、試料７０中における光分解性試
薬が光分解されて活性化された蛍光分子が結合している
ターゲットの分布や運動を解析する。また、制御部６１
は、分解用光源１０、分解光照射時間制御部１１、励起
用光源２０、励起光照射時間制御部２１、光検出器５
３，５４および演算部６０それぞれの動作タイミングを
制御するものである。
れぞれにより撮像された蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏
光成分それぞれの画像を入力し、これらの画像に基づい
て、試料７０で発生した蛍光Ｃの異方性を計測して偏光
解消度を求め、そして、試料７０中における光分解性試
薬が光分解されて活性化された蛍光分子が結合している
ターゲットの分布や運動を解析する。また、制御部６１
は、分解用光源１０、分解光照射時間制御部１１、励起
用光源２０、励起光照射時間制御部２１、光検出器５
３，５４および演算部６０それぞれの動作タイミングを
制御するものである。
【００２６】本実施形態に係る顕微鏡装置は、例えば以
下のように用いられる。制御部６１は、先ず、分解用光
源１０および分解光照射時間制御部１１を制御して分解
光Ａを所定時間だけ出射させる。この分解光Ａは、分解
光照射範囲調整部１２、ダイクロイックミラー３１，４
１および対物レンズ４２を経て、試料７０に照射され
る。このとき、分解光Ａは、分解光照射範囲調整部１２
により定められる対物レンズ４２の視野内の試料７０の
所定領域のみに照射され、その試料７０の所定領域に存
在する光分解性試薬のみを光分解する。
下のように用いられる。制御部６１は、先ず、分解用光
源１０および分解光照射時間制御部１１を制御して分解
光Ａを所定時間だけ出射させる。この分解光Ａは、分解
光照射範囲調整部１２、ダイクロイックミラー３１，４
１および対物レンズ４２を経て、試料７０に照射され
る。このとき、分解光Ａは、分解光照射範囲調整部１２
により定められる対物レンズ４２の視野内の試料７０の
所定領域のみに照射され、その試料７０の所定領域に存
在する光分解性試薬のみを光分解する。
【００２７】その後、制御部６１は、励起用光源２０お
よび励起光照射時間制御部２１を制御して、パルス励起
光Ｂを一定繰り返し周波数で試料７０に照射させるとと
もに、パルス励起光Ｂの１パルス毎に、パルス励起光Ｂ
出射時刻を基準として一定時刻から一定時間だけ光検出
器５３，５４それぞれに指示して蛍光Ｃのｐ偏光成分お
よびｓ偏光成分それぞれの画像を撮像させ、それらの画
像を演算部６０に入力させる。このとき、パルス励起光
Ｂは、励起光照射範囲調整部２４により定められる対物
レンズ４２の視野内の試料７０の所定領域のみに照射さ
れ、その試料７０の所定領域に存在する蛍光分子のみを
励起する。すなわち、光検出器５３および５４それぞれ
により撮像される蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏光成分
それぞれの画像は、励起光照射範囲調整部２４により調
整されたパルス励起光Ｂの試料７０上の照射範囲から発
生した蛍光のみである。
よび励起光照射時間制御部２１を制御して、パルス励起
光Ｂを一定繰り返し周波数で試料７０に照射させるとと
もに、パルス励起光Ｂの１パルス毎に、パルス励起光Ｂ
出射時刻を基準として一定時刻から一定時間だけ光検出
器５３，５４それぞれに指示して蛍光Ｃのｐ偏光成分お
よびｓ偏光成分それぞれの画像を撮像させ、それらの画
像を演算部６０に入力させる。このとき、パルス励起光
Ｂは、励起光照射範囲調整部２４により定められる対物
レンズ４２の視野内の試料７０の所定領域のみに照射さ
れ、その試料７０の所定領域に存在する蛍光分子のみを
励起する。すなわち、光検出器５３および５４それぞれ
により撮像される蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏光成分
それぞれの画像は、励起光照射範囲調整部２４により調
整されたパルス励起光Ｂの試料７０上の照射範囲から発
生した蛍光のみである。
【００２８】また、試料７０に照射されるパルス励起光
Ｂが直線偏光であるので、試料７０から発生する蛍光Ｃ
は、パルス励起光Ｂ照射当初は直線偏光である。しか
し、その後、蛍光分子またはそれが結合しているターゲ
ットがブラウン運動等により方位が変動するのに伴っ
て、蛍光Ｃの偏光は次第に解消されていく。その偏光解
消の速度は、蛍光分子がターゲットに結合しているか或
いはフリーな状態にあるかに依って異なる。すなわち、
ターゲットに結合している蛍光分子から発生する蛍光の
偏光解消の速度よりも、フリーな状態にある蛍光分子か
ら発生する蛍光の偏光解消の速度の方が速い。
Ｂが直線偏光であるので、試料７０から発生する蛍光Ｃ
は、パルス励起光Ｂ照射当初は直線偏光である。しか
し、その後、蛍光分子またはそれが結合しているターゲ
ットがブラウン運動等により方位が変動するのに伴っ
て、蛍光Ｃの偏光は次第に解消されていく。その偏光解
消の速度は、蛍光分子がターゲットに結合しているか或
いはフリーな状態にあるかに依って異なる。すなわち、
ターゲットに結合している蛍光分子から発生する蛍光の
偏光解消の速度よりも、フリーな状態にある蛍光分子か
ら発生する蛍光の偏光解消の速度の方が速い。
【００２９】したがって、演算部６０により、光検出器
５３および５４それぞれにより撮像された蛍光Ｃのｐ偏
光成分およびｓ偏光成分それぞれの画像に基づいて、蛍
光異方性すなわち偏光解消度を解析することにより、試
料７０内において蛍光分子が結合しているターゲットの
みが検出される。具体的には、以下のようにして蛍光異
方性比ｒを求め、偏光解消度を求める。
５３および５４それぞれにより撮像された蛍光Ｃのｐ偏
光成分およびｓ偏光成分それぞれの画像に基づいて、蛍
光異方性すなわち偏光解消度を解析することにより、試
料７０内において蛍光分子が結合しているターゲットの
みが検出される。具体的には、以下のようにして蛍光異
方性比ｒを求め、偏光解消度を求める。
【００３０】すなわち、ｓ偏光のパルス励起光Ｂを試料
７０に照射し、これにより発生した蛍光Ｃのｐ偏光成分
およびｓ偏光成分の画像を、光検出器５３および５４そ
れぞれにより時刻ｔから一定時間Δｔに亘り撮像する。
このようにして得られたｐ偏光蛍光画像およびｓ偏光蛍
光画像それぞれを、ＩspおよびＩssそれぞれで表す。ま
た、ｐ偏光のパルス励起光Ｂを試料７０に照射し、これ
により発生した蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏光成分の
画像を、光検出器５３および５４それぞれにより時刻ｔ
から一定時間Δｔに亘り撮像する。このようにして得ら
れたｐ偏光蛍光画像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、
ＩppおよびＩpsそれぞれで表す。
７０に照射し、これにより発生した蛍光Ｃのｐ偏光成分
およびｓ偏光成分の画像を、光検出器５３および５４そ
れぞれにより時刻ｔから一定時間Δｔに亘り撮像する。
このようにして得られたｐ偏光蛍光画像およびｓ偏光蛍
光画像それぞれを、ＩspおよびＩssそれぞれで表す。ま
た、ｐ偏光のパルス励起光Ｂを試料７０に照射し、これ
により発生した蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏光成分の
画像を、光検出器５３および５４それぞれにより時刻ｔ
から一定時間Δｔに亘り撮像する。このようにして得ら
れたｐ偏光蛍光画像およびｓ偏光蛍光画像それぞれを、
ＩppおよびＩpsそれぞれで表す。
【００３１】なお、ここで、試料７０に照射されるパル
ス励起光Ｂのｓ偏光およびｐ偏光それぞれの偏光方位
は、蛍光Ｃのｓ偏光およびｐ偏光それぞれの偏光方位と
同一であり、偏光子２２および１／２波長板２３それぞ
れの光学軸の方位を適切に調整することにより設定され
る。また、時刻ｔは、パルス励起光Ｂの１パルス毎に、
その出射タイミングを基準とする時刻である。
ス励起光Ｂのｓ偏光およびｐ偏光それぞれの偏光方位
は、蛍光Ｃのｓ偏光およびｐ偏光それぞれの偏光方位と
同一であり、偏光子２２および１／２波長板２３それぞ
れの光学軸の方位を適切に調整することにより設定され
る。また、時刻ｔは、パルス励起光Ｂの１パルス毎に、
その出射タイミングを基準とする時刻である。
【００３２】そして、演算部６０は、このようにして撮
像された蛍光画像Ｉsp，Ｉss，ＩppおよびＩpsを入力
し、これらに基づいて、ｓ偏光励起に対する蛍光異方性
比ｒsを、 rs＝(Iss−Isp)／(Iss＋2Isp) …(1a) なる式で、また、ｐ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒp
を、 rp＝(Ipp−Ips)／(Ipp＋2Ips) …(1b) なる式で、それぞれ求める。この蛍光異方性比ｒsおよ
びｒpそれぞれは、試料７０上の位置変数および時間変
数ｔの関数であり、偏光解消度の２次元画像を表すもの
である。
像された蛍光画像Ｉsp，Ｉss，ＩppおよびＩpsを入力
し、これらに基づいて、ｓ偏光励起に対する蛍光異方性
比ｒsを、 rs＝(Iss−Isp)／(Iss＋2Isp) …(1a) なる式で、また、ｐ偏光励起に対する蛍光異方性比ｒp
を、 rp＝(Ipp−Ips)／(Ipp＋2Ips) …(1b) なる式で、それぞれ求める。この蛍光異方性比ｒsおよ
びｒpそれぞれは、試料７０上の位置変数および時間変
数ｔの関数であり、偏光解消度の２次元画像を表すもの
である。
【００３３】しかし、実際には、受光光学系（試料７０
から光検出器５３，５４それぞれの撮像面に到るまでの
光学系）および光検出器５３，５４は、蛍光Ｃの偏光方
位に依って異なる応答を示す。すなわち、試料７０で発
生する真の蛍光画像をＩsp，Ｉss，ＩppおよびＩpsで表
し、また、受光光学系を経て光検出器５３，５４それぞ
れにより実際に撮像される蛍光画像をＩsp'，Ｉss'，Ｉ
pp'およびＩps'で表すと、 Isp'＝Tp・Isp …(2a) Iss'＝Ts・Iss …(2b) Ipp'＝Tp・Ipp …(2c) Ips'＝Ts・Ips …(2d) なる関係が成立する。ここで、Ｔp は、試料７０から光
検出器５３の撮像面に到るまでの受光光学系および光検
出器５３における蛍光Ｃのｐ偏光成分に対する応答を表
し、また、Ｔs は、試料７０から光検出器５４の撮像面
に到るまでの受光光学系および光検出器５４における蛍
光Ｃのｓ偏光成分に対する応答を表す。
から光検出器５３，５４それぞれの撮像面に到るまでの
光学系）および光検出器５３，５４は、蛍光Ｃの偏光方
位に依って異なる応答を示す。すなわち、試料７０で発
生する真の蛍光画像をＩsp，Ｉss，ＩppおよびＩpsで表
し、また、受光光学系を経て光検出器５３，５４それぞ
れにより実際に撮像される蛍光画像をＩsp'，Ｉss'，Ｉ
pp'およびＩps'で表すと、 Isp'＝Tp・Isp …(2a) Iss'＝Ts・Iss …(2b) Ipp'＝Tp・Ipp …(2c) Ips'＝Ts・Ips …(2d) なる関係が成立する。ここで、Ｔp は、試料７０から光
検出器５３の撮像面に到るまでの受光光学系および光検
出器５３における蛍光Ｃのｐ偏光成分に対する応答を表
し、また、Ｔs は、試料７０から光検出器５４の撮像面
に到るまでの受光光学系および光検出器５４における蛍
光Ｃのｓ偏光成分に対する応答を表す。
【００３４】したがって、蛍光異方性比ｒsおよびｒpそ
れぞれは、光検出器５３，５４それぞれにより実際に撮
像された蛍光画像Ｉsp'，Ｉss'，Ｉpp'およびＩps'で表
すと、 rs＝(G・Iss'−Isp')／(G・Iss'＋2Isp') …(3a) rp＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋2G・Ips') …(3b) で表される。ここで、Ｇは、 G＝Tp／Ts …(4) で定義される偏光応答補正因子である。すなわち、演算
部６０は、光検出器５３および５４により実際に撮像さ
れた蛍光画像Ｉsp'，Ｉss'，Ｉpp'およびＩps'に基づい
て、 (4)式で定義される偏光応答補正因子Ｇを用いて、
(3a)式および(3b)式により蛍光異方性比ｒsおよびｒpの
偏光応答補正を行うことで、真の偏光解消の２次元画像
を求めることができる。なお、この偏光応答補正因子Ｇ
は、一般には、試料７０上の位置変数の関数である。
れぞれは、光検出器５３，５４それぞれにより実際に撮
像された蛍光画像Ｉsp'，Ｉss'，Ｉpp'およびＩps'で表
すと、 rs＝(G・Iss'−Isp')／(G・Iss'＋2Isp') …(3a) rp＝(Ipp'−G・Ips')／(Ipp'＋2G・Ips') …(3b) で表される。ここで、Ｇは、 G＝Tp／Ts …(4) で定義される偏光応答補正因子である。すなわち、演算
部６０は、光検出器５３および５４により実際に撮像さ
れた蛍光画像Ｉsp'，Ｉss'，Ｉpp'およびＩps'に基づい
て、 (4)式で定義される偏光応答補正因子Ｇを用いて、
(3a)式および(3b)式により蛍光異方性比ｒsおよびｒpの
偏光応答補正を行うことで、真の偏光解消の２次元画像
を求めることができる。なお、この偏光応答補正因子Ｇ
は、一般には、試料７０上の位置変数の関数である。
【００３５】次に、偏光応答補正因子Ｇの算出方法を説
明する。以下では、試料７０中の蛍光分子の分子軸が配
向しておらず全くランダムに分布している場合と、試料
７０中の蛍光分子の分子軸が配向して分布している場合
とに分けて説明する。
明する。以下では、試料７０中の蛍光分子の分子軸が配
向しておらず全くランダムに分布している場合と、試料
７０中の蛍光分子の分子軸が配向して分布している場合
とに分けて説明する。
【００３６】試料７０中の蛍光分子の分子軸が配向して
おらず全くランダムに分布している場合における偏光応
答補正因子Ｇは以下のようにして求める。この場合に
は、試料７０が等方的であるので、ｐ偏光励起により発
生する蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比
は、ｓ偏光励起により発生する蛍光のｓ偏光成分Ｉssと
ｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく、 Ips／Ipp＝Isp／Iss …(5) となる。そして、この (5)式および(2a)式乃至(2d)式か
ら、偏光応答補正因子Ｇを表す式として、 G＝[(Ipp'・Isp')／(Ips'・Iss')]1/2 …(6) が得られる。
おらず全くランダムに分布している場合における偏光応
答補正因子Ｇは以下のようにして求める。この場合に
は、試料７０が等方的であるので、ｐ偏光励起により発
生する蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ偏光成分Ｉpsとの比
は、ｓ偏光励起により発生する蛍光のｓ偏光成分Ｉssと
ｐ偏光成分Ｉspとの比と相等しく、 Ips／Ipp＝Isp／Iss …(5) となる。そして、この (5)式および(2a)式乃至(2d)式か
ら、偏光応答補正因子Ｇを表す式として、 G＝[(Ipp'・Isp')／(Ips'・Iss')]1/2 …(6) が得られる。
【００３７】また、試料７０中の蛍光分子の分子軸が配
向して分布している場合における偏光応答補正因子Ｇ
は、上記の方法により直ちに求めることはできず、以下
のようにして求める。なお、細胞膜等の実際の測定対象
はこのような系に近い場合が多い。この場合には、ｐ偏
光励起時における試料７０の方位とｓ偏光励起時におけ
る試料７０の方位とを、ステージ４３を回転させること
により、９０度異なるものとする。このようにすれば、
試料７０が或方位にあるときにおけるｐ偏光励起と、ス
テージ４３により試料７０を９０度回転した後における
ｓ偏光励起とは、試料７０中においては同一の励起偏光
方位となる。したがって、試料７０が或方位にあるとき
にｐ偏光励起により発生する蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ
偏光成分Ｉpsとの比は、試料７０を９０度回転した後に
ｓ偏光励起により発生する蛍光のｓ偏光成分Ｉssとｐ偏
光成分Ｉspとの比と相等しくなり、結局、 (5)式と同様
の関係式が成り立ち、偏光応答補正因子Ｇは (6)式で表
される。
向して分布している場合における偏光応答補正因子Ｇ
は、上記の方法により直ちに求めることはできず、以下
のようにして求める。なお、細胞膜等の実際の測定対象
はこのような系に近い場合が多い。この場合には、ｐ偏
光励起時における試料７０の方位とｓ偏光励起時におけ
る試料７０の方位とを、ステージ４３を回転させること
により、９０度異なるものとする。このようにすれば、
試料７０が或方位にあるときにおけるｐ偏光励起と、ス
テージ４３により試料７０を９０度回転した後における
ｓ偏光励起とは、試料７０中においては同一の励起偏光
方位となる。したがって、試料７０が或方位にあるとき
にｐ偏光励起により発生する蛍光のｐ偏光成分Ｉppとｓ
偏光成分Ｉpsとの比は、試料７０を９０度回転した後に
ｓ偏光励起により発生する蛍光のｓ偏光成分Ｉssとｐ偏
光成分Ｉspとの比と相等しくなり、結局、 (5)式と同様
の関係式が成り立ち、偏光応答補正因子Ｇは (6)式で表
される。
【００３８】次に、本実施形態に係る顕微鏡装置の第１
の使用例について説明する。ここで用いた試料７０は、
培養皿７１の下面中心部のカバーガラス上に培養された
神経細胞（ＮＧ細胞）であり、光分解性試薬としてケー
ジドフルオレセイン（5-(N-dodecanoyl)aminofluoresce
in-bis-4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl ether）が予め導
入されている。この光分解性試薬は、試料（ＮＧ細胞）
７０の細胞膜に結合するものであって、分解光Ａが照射
されると光分解されて蛍光性を有するようになり、パル
ス励起光Ｂが照射されると蛍光Ｃを発生するものであ
る。
の使用例について説明する。ここで用いた試料７０は、
培養皿７１の下面中心部のカバーガラス上に培養された
神経細胞（ＮＧ細胞）であり、光分解性試薬としてケー
ジドフルオレセイン（5-(N-dodecanoyl)aminofluoresce
in-bis-4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl ether）が予め導
入されている。この光分解性試薬は、試料（ＮＧ細胞）
７０の細胞膜に結合するものであって、分解光Ａが照射
されると光分解されて蛍光性を有するようになり、パル
ス励起光Ｂが照射されると蛍光Ｃを発生するものであ
る。
【００３９】このような試料７０に、分解用光源１０か
ら出射された分解光Ａが所定時間照射されると、その試
料７０の照射範囲に存在する光分解性試薬は、光分解さ
れ蛍光性を有するようになる。続いて、励起用光源２０
から一定繰り返し周波数で出射されて直線偏光とされた
パルス励起光Ｂが試料７０に照射されると、試料７０に
おけるパルス励起光Ｂの照射範囲および分解光Ａの照射
範囲の重複範囲に存在する光分解された光分解性試薬か
ら蛍光Ｃが発生する。
ら出射された分解光Ａが所定時間照射されると、その試
料７０の照射範囲に存在する光分解性試薬は、光分解さ
れ蛍光性を有するようになる。続いて、励起用光源２０
から一定繰り返し周波数で出射されて直線偏光とされた
パルス励起光Ｂが試料７０に照射されると、試料７０に
おけるパルス励起光Ｂの照射範囲および分解光Ａの照射
範囲の重複範囲に存在する光分解された光分解性試薬か
ら蛍光Ｃが発生する。
【００４０】その蛍光Ｃのｐ偏光成分およびｓ偏光成分
それぞれの画像は、パルス励起光Ｂの照射時刻を基準と
する所定時刻から一定時間だけ光検出器５３および５４
それぞれにより撮像され、演算部６０に入力される。そ
して、演算部６０により、上述した偏光応答補正がなさ
れた蛍光異方性比ｒsおよびｒpにより偏光解消度が求め
られ、その偏光解消度の２次元画像に基づいて、分解光
Ａの照射範囲およびパルス励起光Ｂの照射範囲の重複範
囲の試料７０中における光分解性試薬が導入されている
細胞膜が検出される。
それぞれの画像は、パルス励起光Ｂの照射時刻を基準と
する所定時刻から一定時間だけ光検出器５３および５４
それぞれにより撮像され、演算部６０に入力される。そ
して、演算部６０により、上述した偏光応答補正がなさ
れた蛍光異方性比ｒsおよびｒpにより偏光解消度が求め
られ、その偏光解消度の２次元画像に基づいて、分解光
Ａの照射範囲およびパルス励起光Ｂの照射範囲の重複範
囲の試料７０中における光分解性試薬が導入されている
細胞膜が検出される。
【００４１】次に、本実施形態に係る顕微鏡装置の第２
の使用例について説明する。ここで用いた試料７０は、
培養皿７１の下面中心部のカバーガラス上に培養された
神経細胞（ＮＧ細胞）であり、分解光Ａの照射によりカ
ルシウムイオンを放出するケージドカルシウム（nitr-
5）が予め光分解性試薬として導入されるとともに、蛍
光色素であるフルオレセインで標識されたカルモジュリ
ンも予め導入されている。このカルモジュリンは、カル
シウムイオンにより活性化される蛋白質の一種であり、
活性化されると試料（ＮＧ細胞）７０内の他の分子に結
合する。そして、活性化されたカルモジュリンが試料７
０内の他の分子に結合しているか否かに依って、カルモ
ジュリンに標識されているフルオレセインから発生する
蛍光の偏光解消度が異なる。
の使用例について説明する。ここで用いた試料７０は、
培養皿７１の下面中心部のカバーガラス上に培養された
神経細胞（ＮＧ細胞）であり、分解光Ａの照射によりカ
ルシウムイオンを放出するケージドカルシウム（nitr-
5）が予め光分解性試薬として導入されるとともに、蛍
光色素であるフルオレセインで標識されたカルモジュリ
ンも予め導入されている。このカルモジュリンは、カル
シウムイオンにより活性化される蛋白質の一種であり、
活性化されると試料（ＮＧ細胞）７０内の他の分子に結
合する。そして、活性化されたカルモジュリンが試料７
０内の他の分子に結合しているか否かに依って、カルモ
ジュリンに標識されているフルオレセインから発生する
蛍光の偏光解消度が異なる。
【００４２】この場合には、先ず、分解光Ａを試料７０
に照射するに先だって、励起用光源２０から一定繰り返
し周波数で出射されて直線偏光とされたパルス励起光Ｂ
が試料７０に照射され、試料７０から発生した蛍光Ｃの
ｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの画像は、光検出
器５３および５４それぞれにより撮像され、演算部６０
に記憶される。
に照射するに先だって、励起用光源２０から一定繰り返
し周波数で出射されて直線偏光とされたパルス励起光Ｂ
が試料７０に照射され、試料７０から発生した蛍光Ｃの
ｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの画像は、光検出
器５３および５４それぞれにより撮像され、演算部６０
に記憶される。
【００４３】その後、分解用光源１０から出射された分
解光Ａが試料７０に所定時間照射されて、その試料７０
内の照射範囲に存在する光分解性試薬であるケージドカ
ルシウムが光分解されて、カルシウムイオンが放出され
る。そして、そのカルシウムイオンにより活性化された
カルモジュリンの一部は、試料７０内の他の分子に結合
する。
解光Ａが試料７０に所定時間照射されて、その試料７０
内の照射範囲に存在する光分解性試薬であるケージドカ
ルシウムが光分解されて、カルシウムイオンが放出され
る。そして、そのカルシウムイオンにより活性化された
カルモジュリンの一部は、試料７０内の他の分子に結合
する。
【００４４】続いて、励起用光源２０から一定繰り返し
周波数で出射されて直線偏光とされたパルス励起光Ｂが
試料７０に照射されると、試料７０におけるパルス励起
光Ｂの照射範囲に存在するカルモジュリンに標識された
フルオレセインから蛍光Ｃが発生する。この蛍光Ｃのｐ
偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの画像は、分解光Ａ
の照射後の各時刻それぞれにおいて、パルス励起光Ｂの
照射時刻を基準とする所定時刻から一定時間だけ光検出
器５３および５４それぞれにより撮像され、演算部６０
に記憶される。
周波数で出射されて直線偏光とされたパルス励起光Ｂが
試料７０に照射されると、試料７０におけるパルス励起
光Ｂの照射範囲に存在するカルモジュリンに標識された
フルオレセインから蛍光Ｃが発生する。この蛍光Ｃのｐ
偏光成分およびｓ偏光成分それぞれの画像は、分解光Ａ
の照射後の各時刻それぞれにおいて、パルス励起光Ｂの
照射時刻を基準とする所定時刻から一定時間だけ光検出
器５３および５４それぞれにより撮像され、演算部６０
に記憶される。
【００４５】そして、演算部６０により、分解光Ａの照
射前および照射後の各時刻それぞれについて、上述した
偏光応答補正がなされた蛍光異方性比ｒsおよびｒpによ
り偏光解消度が求められ、その偏光解消度の２次元画像
に基づいて、パルス励起光Ｂの照射範囲の試料７０中に
おけるカルモジュリンが結合している分子の空間的な分
布だけでなく、時間的な変化も検出され、試料７０内に
おけるカルモジュリンが結合している分子の運動が解析
される。
射前および照射後の各時刻それぞれについて、上述した
偏光応答補正がなされた蛍光異方性比ｒsおよびｒpによ
り偏光解消度が求められ、その偏光解消度の２次元画像
に基づいて、パルス励起光Ｂの照射範囲の試料７０中に
おけるカルモジュリンが結合している分子の空間的な分
布だけでなく、時間的な変化も検出され、試料７０内に
おけるカルモジュリンが結合している分子の運動が解析
される。
【００４６】以上のように、本実施形態に係る顕微鏡装
置を用いれば、分解光Ａが照射された試料７０の所定範
囲に存在する光分解性試薬のみが光分解されて蛍光分子
が活性化され、パルス励起光の照射に伴い試料７０の所
定範囲に存在する活性化された蛍光分子から発生する蛍
光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれが検出され、
その蛍光の異方性比が求められるので、活性化された蛍
光分子が結合しているターゲットのみが検出され、ま
た、そのターゲットの運動が解析される。
置を用いれば、分解光Ａが照射された試料７０の所定範
囲に存在する光分解性試薬のみが光分解されて蛍光分子
が活性化され、パルス励起光の照射に伴い試料７０の所
定範囲に存在する活性化された蛍光分子から発生する蛍
光のｐ偏光成分およびｓ偏光成分それぞれが検出され、
その蛍光の異方性比が求められるので、活性化された蛍
光分子が結合しているターゲットのみが検出され、ま
た、そのターゲットの運動が解析される。
【００４７】なお、上記実施形態の説明では、試料中の
蛍光分子を励起する励起光はパルス励起光であって、パ
ルス励起により偏光解消を時間分解測定するものとして
説明した。しかし。励起光は定常光であってもよく、定
常光励起の場合も蛍光偏光解消の測定が可能である。
蛍光分子を励起する励起光はパルス励起光であって、パ
ルス励起により偏光解消を時間分解測定するものとして
説明した。しかし。励起光は定常光であってもよく、定
常光励起の場合も蛍光偏光解消の測定が可能である。
【００４８】
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり本発明によ
れば、分解用光源部から出力される分解光は、分解用光
学系により試料に照射され、試料に導入されている光分
解性試薬を光分解する。一方、励起用光源部から出力さ
れる直線偏光の励起光は、励起用光学系により所定方向
から試料に照射され、試料中の光分解性試薬が光分解さ
れて放出された物質によって引き起こされる変化を検出
するための蛍光分子を励起する。励起光が試料に照射さ
れて発生した蛍光は、受光光学系により、試料に照射さ
れるときの励起光の偏光方位に平行な第１の偏光方位お
よびこれに直交する第２の偏光方位それぞれの直線偏光
成分に分岐され、その蛍光の第１および第２の偏光方位
それぞれの直線偏光成分は、第１および第２の撮像手段
それぞれにより撮像される。そして、画像演算手段によ
り、その撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、蛍光の偏光解
消の２次元画像が求められる。
れば、分解用光源部から出力される分解光は、分解用光
学系により試料に照射され、試料に導入されている光分
解性試薬を光分解する。一方、励起用光源部から出力さ
れる直線偏光の励起光は、励起用光学系により所定方向
から試料に照射され、試料中の光分解性試薬が光分解さ
れて放出された物質によって引き起こされる変化を検出
するための蛍光分子を励起する。励起光が試料に照射さ
れて発生した蛍光は、受光光学系により、試料に照射さ
れるときの励起光の偏光方位に平行な第１の偏光方位お
よびこれに直交する第２の偏光方位それぞれの直線偏光
成分に分岐され、その蛍光の第１および第２の偏光方位
それぞれの直線偏光成分は、第１および第２の撮像手段
それぞれにより撮像される。そして、画像演算手段によ
り、その撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、蛍光の偏光解
消の２次元画像が求められる。
【００４９】このようにしたことにより、分解光が照射
された試料中の所定範囲に存在する光分解性試薬のみが
光分解されて活性分子が生じ、続いて、直線偏光の励起
光が照射された試料中の所定範囲に存在する蛍光分子の
みが励起されて蛍光が発生する。そして、この蛍光の第
１および第２の偏光方位の直線偏光成分（すなわちｐ偏
光成分およびｓ偏光成分）それぞれの画像が撮像され
て、蛍光の偏光解消の２次元画像が得られ、この２次元
画像に基づいて、蛍光分子が結合している試料中のター
ゲットのみが検出され、また、そのターゲットの運動の
解析に基づいて試料（例えば細胞）内の様々な分子間反
応が解析される。
された試料中の所定範囲に存在する光分解性試薬のみが
光分解されて活性分子が生じ、続いて、直線偏光の励起
光が照射された試料中の所定範囲に存在する蛍光分子の
みが励起されて蛍光が発生する。そして、この蛍光の第
１および第２の偏光方位の直線偏光成分（すなわちｐ偏
光成分およびｓ偏光成分）それぞれの画像が撮像され
て、蛍光の偏光解消の２次元画像が得られ、この２次元
画像に基づいて、蛍光分子が結合している試料中のター
ゲットのみが検出され、また、そのターゲットの運動の
解析に基づいて試料（例えば細胞）内の様々な分子間反
応が解析される。
【００５０】また、さらに、分解光が試料に照射される
範囲を調整する分解光照射範囲調整手段を更に備える場
合には、分解光照射範囲調整手段により、試料上の所定
範囲のみに分解光が照射されるので、その所定範囲に存
在する光分解性試薬のみが光分解され、したがって、そ
の所定範囲のみで活性分子が生じる。
範囲を調整する分解光照射範囲調整手段を更に備える場
合には、分解光照射範囲調整手段により、試料上の所定
範囲のみに分解光が照射されるので、その所定範囲に存
在する光分解性試薬のみが光分解され、したがって、そ
の所定範囲のみで活性分子が生じる。
【００５１】また、さらに、励起光が試料に照射される
範囲を調整する励起光照射範囲調整手段を更に備える場
合には、励起光照射範囲調整手段により、試料上の所定
範囲のみに励起光が照射されるので、その所定範囲に存
在する蛍光分子のみが励起されて蛍光が発生し、したが
って、その所定範囲のみにおける蛍光分子が結合してい
るターゲットの分布や運動が解析される。
範囲を調整する励起光照射範囲調整手段を更に備える場
合には、励起光照射範囲調整手段により、試料上の所定
範囲のみに励起光が照射されるので、その所定範囲に存
在する蛍光分子のみが励起されて蛍光が発生し、したが
って、その所定範囲のみにおける蛍光分子が結合してい
るターゲットの分布や運動が解析される。
【００５２】また、さらに、試料に照射される励起光の
偏光方位を回転させる偏光方位回転手段を更に備える場
合には、励起光は、偏光方位回転手段により所定方位の
直線偏光に設定されて試料に照射されるので、任意の方
位の直線偏光の励起光の照射に対する蛍光の異方性が求
められ、また、受光光学系の偏光応答を補正することが
可能となって、蛍光の偏光解消の２次元画像が高精度に
求められ、したがって、蛍光分子が結合しているターゲ
ットの分布や運動が高精度に解析される。
偏光方位を回転させる偏光方位回転手段を更に備える場
合には、励起光は、偏光方位回転手段により所定方位の
直線偏光に設定されて試料に照射されるので、任意の方
位の直線偏光の励起光の照射に対する蛍光の異方性が求
められ、また、受光光学系の偏光応答を補正することが
可能となって、蛍光の偏光解消の２次元画像が高精度に
求められ、したがって、蛍光分子が結合しているターゲ
ットの分布や運動が高精度に解析される。
【００５３】また、画像演算手段は、偏光方位回転手段
により第１の偏光方位とされた励起光が試料に照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、偏光方位回転手
段により第２の偏光方位とされた励起光が試料に照射さ
れたときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位
それぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、偏光応答補
正を行って蛍光の偏光解消の２次元画像を求めるのが好
適である。このようにすることにより、試料中の蛍光分
子の分子軸が配向しておらず全くランダムに分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
により第１の偏光方位とされた励起光が試料に照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、偏光方位回転手
段により第２の偏光方位とされた励起光が試料に照射さ
れたときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位
それぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、偏光応答補
正を行って蛍光の偏光解消の２次元画像を求めるのが好
適である。このようにすることにより、試料中の蛍光分
子の分子軸が配向しておらず全くランダムに分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
【００５４】また、画像演算手段は、所定方向を中心軸
とする所定回転角度位置にある試料に対して偏光方位回
転手段により第１の偏光方位とされた励起光が照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、中心軸について
所定回転角度位置とは９０度異なる回転角度位置にある
試料に対して偏光方位回転手段により第２の偏光方位と
された励起光が照射されたときに撮像された蛍光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分の画像に
基づいて、偏光応答補正を行って蛍光の偏光解消の２次
元画像を求めるのも好適である。このようにすることに
より、試料中の蛍光分子の分子軸が配向して分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
とする所定回転角度位置にある試料に対して偏光方位回
転手段により第１の偏光方位とされた励起光が照射され
たときに撮像された蛍光の第１および第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像、および、中心軸について
所定回転角度位置とは９０度異なる回転角度位置にある
試料に対して偏光方位回転手段により第２の偏光方位と
された励起光が照射されたときに撮像された蛍光の第１
および第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分の画像に
基づいて、偏光応答補正を行って蛍光の偏光解消の２次
元画像を求めるのも好適である。このようにすることに
より、試料中の蛍光分子の分子軸が配向して分布してい
る場合に受光光学系の偏光応答補正がなされて、蛍光分
子が結合しているターゲットの分布や運動が高精度に解
析される。
【図１】本実施形態に係る顕微鏡装置の構成図である。
１０…分解用光源、１１…分解光照射時間制御部、１２
…分解光照射範囲調整部、１３…ピンホール、２０…励
起用光源、２１…励起光照射時間制御部、２２…偏光
子、２３…１／２波長板、２４…励起光照射範囲調整
部、３１…ダイクロイックミラー、４１…ダイクロイッ
クミラー、４２…対物レンズ、４３…ステージ、４４…
励起光除去フィルタ、４５…反射鏡、５１…偏光ビーム
スプリッタ、５２…反射鏡、５３，５４…光検出器、６
０…演算部、６１…制御部、７０…試料、７１…培養
皿、Ａ…分解光、Ｂ…パルス励起光、Ｃ…蛍光。
…分解光照射範囲調整部、１３…ピンホール、２０…励
起用光源、２１…励起光照射時間制御部、２２…偏光
子、２３…１／２波長板、２４…励起光照射範囲調整
部、３１…ダイクロイックミラー、４１…ダイクロイッ
クミラー、４２…対物レンズ、４３…ステージ、４４…
励起光除去フィルタ、４５…反射鏡、５１…偏光ビーム
スプリッタ、５２…反射鏡、５３，５４…光検出器、６
０…演算部、６１…制御部、７０…試料、７１…培養
皿、Ａ…分解光、Ｂ…パルス励起光、Ｃ…蛍光。
Claims (6)
- 【請求項１】 分解光を出力する分解用光源部と、 前記分解光を試料に照射し、前記試料に導入されている
光分解性試薬を光分解する分解用光学系と、 直線偏光の励起光を出力する励起用光源部と、 前記励起光を所定方向から前記試料に照射し、前記試料
中の光分解性試薬が光分解されて放出された物質によっ
て引き起こされる変化を検出するための蛍光分子を励起
する励起用光学系と、 前記励起光が前記試料に照射されて発生した蛍光を入力
し、前記試料に照射されるときの前記励起光の偏光方位
に平行な第１の偏光方位およびこれに直交する第２の偏
光方位それぞれの直線偏光成分に分岐する受光光学系
と、 前記受光光学系により互いに分岐された前記蛍光の前記
第１および前記第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分
をそれぞれ撮像する第１および第２の撮像手段と、 前記第１および前記第２の撮像手段それぞれにより撮像
された前記蛍光の前記第１および前記第２の偏光方位そ
れぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、前記蛍光の偏
光解消の２次元画像を求める画像演算手段と、 を備えることを特徴とする顕微鏡装置。 - 【請求項２】 前記分解光が前記試料に照射される範囲
を調整する分解光照射範囲調整手段を更に備える、こと
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。 - 【請求項３】 前記励起光が前記試料に照射される範囲
を調整する励起光照射範囲調整手段を更に備える、こと
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。 - 【請求項４】 前記試料に照射される前記励起光の偏光
方位を回転させる偏光方位回転手段を更に備える、こと
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。 - 【請求項５】 前記画像演算手段は、前記偏光方位回転
手段により前記第１の偏光方位とされた前記励起光が前
記試料に照射されたときに撮像された前記蛍光の前記第
１および前記第２の偏光方位それぞれの直線偏光成分の
画像、および、前記偏光方位回転手段により前記第２の
偏光方位とされた前記励起光が前記試料に照射されたと
きに撮像された前記蛍光の前記第１および前記第２の偏
光方位それぞれの直線偏光成分の画像に基づいて、偏光
応答補正を行って前記蛍光の偏光解消の２次元画像を求
める、ことを特徴とする請求項４記載の顕微鏡装置。 - 【請求項６】 前記画像演算手段は、前記所定方向を中
心軸とする所定回転角度位置にある前記試料に対して前
記偏光方位回転手段により前記第１の偏光方位とされた
前記励起光が照射されたときに撮像された前記蛍光の前
記第１および前記第２の偏光方位それぞれの直線偏光成
分の画像、および、前記中心軸について前記所定回転角
度位置とは９０度異なる回転角度位置にある前記試料に
対して前記偏光方位回転手段により前記第２の偏光方位
とされた前記励起光が照射されたときに撮像された前記
蛍光の前記第１および前記第２の偏光方位それぞれの直
線偏光成分の画像に基づいて、偏光応答補正を行って前
記蛍光の偏光解消の２次元画像を求める、ことを特徴と
する請求項４記載の顕微鏡装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10202397A JPH10293099A (ja) | 1997-04-18 | 1997-04-18 | 顕微鏡装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10202397A JPH10293099A (ja) | 1997-04-18 | 1997-04-18 | 顕微鏡装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10293099A true JPH10293099A (ja) | 1998-11-04 |
Family
ID=14316163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10202397A Pending JPH10293099A (ja) | 1997-04-18 | 1997-04-18 | 顕微鏡装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10293099A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007534967A (ja) * | 2004-04-26 | 2007-11-29 | センサーズ・フォー・メデセン・アンド・サイエンス・インコーポレーテッド | 光学センサの耐用寿命を延ばすためのシステムおよび方法 |
-
1997
- 1997-04-18 JP JP10202397A patent/JPH10293099A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007534967A (ja) * | 2004-04-26 | 2007-11-29 | センサーズ・フォー・メデセン・アンド・サイエンス・インコーポレーテッド | 光学センサの耐用寿命を延ばすためのシステムおよび方法 |
| US8502167B2 (en) | 2004-04-26 | 2013-08-06 | Sensors For Medicine And Science, Inc. | Systems and methods for extending the useful life of optical sensors |
| JP2013242331A (ja) * | 2004-04-26 | 2013-12-05 | Senseonics Inc | 光学センサの耐用寿命を延ばすためのシステムおよび方法 |
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