JP2003015050A

JP2003015050A - レーザー顕微鏡

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Publication number: JP2003015050A
Application number: JP2001202584A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Shimada; 佳弘島田
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2001-07-03
Filing date: 2001-07-03
Publication date: 2003-01-15
Anticipated expiration: 2021-07-03
Also published as: EP1278092B1; EP1278092A3; US20030007145A1; JP4854878B2; DE60233774D1; EP1278092A2; US6934020B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ミスアライメントの発生を抑えることができ、
反ストークスビームを安定して検出することができるレ
ーザー顕微鏡を提供する。【解決手段】レーザー顕微鏡は、それぞれ異なる振動数
を有する基準レーザービームω_１およびストークスビー
ムω_２を出射するレーザー光源６，８と、反ストークス
ビームω_３を試料３４から得るためのこれら２つのビー
ムω_１，ω_２を対物レンズ３２を介して試料３４上に集
光して照射する照射手段と、試料３４からの反ストーク
スビームω_３を導き、かつ２つのビームω_１，ω_２を遮
断するビーム選択手段と、試料からの反ストークスビー
ムω_３を検出する光検出器４０とを有する。２つのビー
ムω_１，ω_２は、レーザー光源２と照射手段２２〜３２
との間に配設された共通の光ファイバー２０の入射端２
０ａに入射される。この光ファイバー２０に入射された
２つのビームω_１，ω_２は、出射端２０ｂから出射され
て、照射手段に導かれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、それぞれ異なる振
動数を有する基準レーザービームとストークスビームと
を試料に照射して、試料から得られる反ストークスビー
ムを検出して、像を得るレーザー顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、医学、生物の研究分野では、
細胞機能の研究が盛んに行なわれてきた。近年では、細
胞機能だけを研究するのではなく、問題とする機能とタ
ンパク質分子構造との関係を直接観察する要求が高まり
つつある。

【０００３】ところで、分子の指紋と呼ばれるラマン散
乱光を直接観察する方法は、広く用いられている。特
に、試料からの蛍光を容易に除去できる、ＣＡＲＳ（Ｃ
ｏｈｅｒｅｎｔＡｎｔｉ−ＳｔｏｋｅｓＲａｍａｎ
Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分光が注目されている。これ
は、基準レーザービームとストークスビームとを試料に
照射し、試料から得られる反ストークスビーム（反スト
ークスラマン散乱光）を検出するものである。

【０００４】図５および図６に示すように、平４−５１
７８４号特許公報には、レーザー計測装置１００が開示
されている。このレーザー計測装置１００は、レーザー
光源として、波長１０６４ｎｍのレーザービームを発振
するパルスＹＡＧレーザー１０２を備えている。このレ
ーザー１０２の前方には、レーザービームの波長を５３
２ｎｍに変換し、基準レーザービームω_１１（波長λ
_１１）を出射させる第２高調波発生器１０４が設けられ
ている。このビームω_１１の光路上には、ビームスプリ
ッタ１０６がビームω_１１を２方向に分割するように配
置されている。このビームスプリッタ１０６に入射され
たビームω_１１は、反射ビームω_１１と透過ビームω
_１１’とに分割される。

【０００５】反射ビームω_１１の光路上には、この反射
ビームω_１１を反射させる、ミラー１０８が設けられて
いる。前記透過ビームω_１１’の光路上には、このビー
ムω_１１’を振動数の異なるストークスビームω
_２２（波長６０７ｎｍ）に変換して出射させる、色素レ
ーザー１１０が設けられている。そして、ストークスビ
ームω_２２の光路上には、このストークスビームω_２２
の横断面パターンを半分遮断し、半円形にするナイフエ
ッジ１１２が配置されている。

【０００６】そして、これら基準レーザービームω_１１
とストークスビームω_２２との光路上の交叉したところ
には、基準レーザービーム（反射ビーム）ω_１１を透過
し、ストークスビームω_２２を反射して１本のビームω
_１１，ω_２２にする、ダイクロイックミラー１１４が設
けられている。このビームω_１１，ω_２２の光路上に
は、ビームω_１１，ω_２２を所定の距離で集光するレン
ズ１１６が設けられている。そして、この集光位置に
は、試料Ｍが配設されている。この試料Ｍには、ビーム
ω_１１，ω_２２が照射され、この試料Ｍから反ストーク
スビームω_３３が発生される。なお、試料Ｍを透過する
ビームには、反ストークスビームω_３３の他に、基準レ
ーザービームω_１１およびストークスビームω_２２が含
まれている。

【０００７】これらビームω_１１，ω_２２，ω_３３の光
路上には、これらビームω_１１，ω _２２，ω_３３を平行
光にするレンズ１１８が設けられている。また、これら
ビームω_１１，ω_２２，ω_３３の光路上には、基準レー
ザービームω_１１およびストークスビームω_２２の混合
部のみを遮断するナイフエッジ１２０が設けられてい
る。そして、これらビームω_１１，ω_３３の光路上に
は、基準レーザービームω _１１のみを遮断する適当な波
長選択器１２２が配設されている。そして、残された反
ストークスビームω_３３の光路上には、反ストークスビ
ームω_３３を反射する２つの反射ミラー１２４が設けら
れている。また、このビームω_３３の光路上には、反ス
トークスビームω_３３をスペクトルに分光する分光器１
２６が設けられている。そして、この分光器の前方に
は、検出器１２８が設けられており、分光されたスペク
トルが検出される。さらに、この検出器１２８には、ミ
ニコンピュータ１３０が接続されている。また、このミ
ニコンピュータ１３０には、画像表示装置１３２が接続
され、検出器１２８で検出されたスペクトルは、ミニコ
ンピュータ１３０を用いて電気信号に変換され、この信
号が画像表示装置１３２で表示される。

【０００８】これらビームω_１，ω_２，ω_３の位相を整
合するための調整は、上記の構成からナイフエッジ１２
０が除かれ、基準レーザービームω_１１の横断面パター
ンに含まれる全ての反ストークスビームω_３３が検出さ
れて、行なわれる。この調整が行なわれた後、ナイフエ
ッジ１２０によって、基準レーザービームω_１１とスト
ークスビームω_２２との混合部のみが遮断されて、空間
上の微小な交叉点から生じる空間分解能の高い反ストー
クスビームω_３３が容易に得られる。

【０００９】従って、このレーザー計測装置１００は、
基準レーザービームω_１１（波長λ _１１）の横断面パタ
ーンの一部にストークスビームω_２２（波長λ_２２）が
混合されて、試料Ｍに入射される手段を備えている。ま
た、出射側では、基準レーザービームω_１１とストーク
スビームω_２２との混合部のみが遮断され、その他の基
準レーザービームω_１１の横断面パターンに含まれる反
ストークスビームω_３ _３が抽出される手段を備えてい
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】このような構成は、空
間分解能の高い最小交叉角法を精度良く調整することに
関するものである。しかしながら、基本的に、光学軸の
ミスアライメントが生じる可能性を除くことができな
い。例えば、理想的な調整が行なわれたとしても、環境
温度の変化や振動などの影響でミスアライメントが生じ
る可能性がある。このため、基準レーザービームω_１１
とストークスビームω_２２との出射方位が一致していて
も、ミスアライメントが生じる可能性がある。

【００１１】従って、ミスアライメントによって、反ス
トークスビームの強度が弱められてしまうだけでなく、
反ストークスビームの発生に寄与しない基準レーザービ
ームとストークスビームとがノイズ成分として検出され
てしまう可能性がある。すなわち、反ストークスビーム
の検出において、ＳＮ比の低下をまねくという欠点を有
する。

【００１２】また、従来技術では、ミスアライメントを
生じると、反ストークスビームの発生に寄与しない基準
レーザービームとストークスビームとが試料に照射され
てしまうことがある。このため、試料が化学物質の場合
はまだ良いが、生きた細胞や組織の場合は、これら２つ
のビームで試料にダメージを与えてしまう可能性があ
る。

【００１３】本発明は、このような事情によりなされ、
ミスアライメントの発生を抑えることができるととも
に、反ストークスビーム（反ストークスラマン散乱光）
を安定して高いＳＮ比で検出することができる、レーザ
ー顕微鏡を提供することを目的とする。

【００１４】また、本発明は、反ストークスビームの生
成に寄与する基準レーザービームおよびストークスビー
ムのみが試料に照射され、生きた細胞や組織を観察する
のに最適なレーザー顕微鏡を提供することを目的とす
る。

【００１５】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明によるレーザー顕微鏡は、それぞれ異なる振
動数を有する基準レーザービームおよびストークスビー
ムを出射させるレーザー光源と、反ストークスビームを
試料から得るためのこれら２つのビームを、対物レンズ
を介して試料上に集光して照射する照射手段と、試料か
らの反ストークスビームを導き、かつ前記基準レーザー
ビームおよびストークスビームを遮断するビーム選択手
段と、試料からの反ストークスビームを検出する光検出
器とを備えている。そして、前記基準レーザービームお
よびストークスビームは、前記レーザー光源と照射手段
との間に配設された共通の光ファイバーの入射端に入射
され、この光ファイバーに入射された２つのビームは、
出射端から出射されて、前記照射手段に導かれることを
特徴とするものである。

【００１６】また、前記照射手段は、対物レンズを介し
て前記基準レーザービームおよびストークスビームを前
記試料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備
えていることを特徴とするものである。

【００１７】さらに、前記照射手段は、前記基準レーザ
ービームおよびストークスビームの一方または両方のビ
ームの一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特
徴とするものである。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態について説明する。

【００１９】（第１の実施の形態）まず、第１の実施の
形態について、図１ないし図３を用いて説明する。図１
に示すように、レーザー顕微鏡は、レーザー光源とし
て、出射口（図示せず）から所定の方向にレーザービー
ムを出射させるモードロックアルゴンレーザー２を備え
ている。このレーザー２の前方には、ビームスプリッタ
４が配設されている。このビームスプリッタ４は、入射
されたレーザービームを透過ビームと、このビームに対
して直角方向に反射される反射ビームとの２つのビーム
に分割する。

【００２０】透過ビームの光路上には、基準レーザービ
ームω_１（波長５７０ｎｍ）を出射する第１の色素レー
ザー６が配設されている。また、前記反射ビームの光路
上には、ビームスプリッタ４に平行となるように傾斜さ
れた反射ミラー７が配設されている。反射ミラー７は、
入射されたビームを直角に反射させる。このビームの光
路上には、ストークスビームω_２（波長６２０ｎｍ〜６
８０ｎｍに可変可能）を出射する第２の色素レーザー８
が配設されている。なお、前記第１および第２の色素レ
ーザー６，８は、それぞれモードロックアルゴンレーザ
ー２と同じ繰り返し周波数でパルス発振される。

【００２１】そして、第２の色素レーザー８の前方に
は、プリズム１０および反射ミラー１２を有する光学遅
延装置１４が設けられている。このプリズム１０は、ス
トークスビームω_２を反射させる。このストークスビー
ムω_２の光路上には、ビームスプリッタ４と平行となる
ように傾斜された反射ミラー１２が配設されている。こ
の反射ミラー１２は、入射されたストークスビームω_２
を直角に反射させる。また、第１の色素レーザー６から
出射された基準レーザービームω_１と、このストークス
ビームω_２との光路上の交叉したところには、ダイクロ
イックミラー１６が基準レーザービームω_１に対して１
３５°、ストークスビームω_２に対しては、４５°傾け
られて配置されている。このダイクロイックミラー１６
は、基準レーザービームω_１を透過させ、ストークスビ
ームω_２を基準レーザービームω_１と同一方向に反射さ
せ、基準レーザービームω_１とストークスビームω_２と
を合成させる。

【００２２】このように合成された基準レーザービーム
ω_１およびストークスビームω_２（以下、ビームω_１，
ω_２と称する）の光路上には、入射されたビームω_１，
ω_２を所定の焦点距離で集光させる、集光レンズ１８が
設けられている。このビームω_１，ω_２が集光される集
光位置には、任意の長さを有する光ファイバー（例え
ば、シングルモードファイバー）２０の一端（入射端）
２０ａが配設されている。また、このシングルモードフ
ァイバー２０の他端には、出射端２０ｂが配設され、入
射端２０ａに入射されたビームω_１，ω_２を出射端２０
ｂに伝送して出射させる。この場合、このビームω_１，
ω_２（基準レーザービームω_１およびストークスビーム
ω_２）の出射位置は、完全に一致するので、光学軸のミ
スアライメントが発生する可能性を防止することができ
る。

【００２３】そして、このビームω_１，ω_２の光路上に
は、後述する試料３４にビームω_１，ω_２を導く照射手
段が設けられている。この照射手段は、まず、コリメー
トレンズ２２を備えている。コリメートレンズ２２は、
入射されたビームω_１，ω_２を平行ビームにする。そし
て、このコリメートレンズ２２の前方には、例えばガラ
ス材からなる平行平面体２４が配設されている。この平
行平面体２４は、図示しないが、紙面に垂直な軸回りに
回転可能に保持されている。そして、この平行平面体２
４は、一方の側から入射されたビームω_１，ω_２を基準
レーザービームω_１とストークスビームω_２とに分光さ
せる。これら２つのビームω_１，ω_２を他方の側でそれ
ぞれ屈折させ、互いのビームω_１，ω_２に対して平行に
出射させる。

【００２４】そして、平行平面体２４を透過した２つの
ビームω_１，ω_２の出射先には、ミラー２６が配設され
ている。このミラー２６は、これらビームω_１，ω_２を
試料３４上に導くために設けられ、図１中の矢印の方向
に移動させることにより、入射されたビームω_１，ω_２
を所定距離だけ平行移動させる。

【００２５】また、これらビームω_１，ω_２の光路上に
は、リレーレンズ２８，３０が配設されている。これら
リレーレンズ２８，３０は、入射されたビームω_１，ω
_２を中継させる。そして、リレーレンズ３０を透過した
これら２つのビームω_１，ω_２の出射先には、図２の
（ａ）に示すようにそれぞれのビームω_１，ω_２が入射
される、対物レンズ３２が配設されている。図１に示す
ように、対物レンズ３２を透過したビームω_１，ω_２の
出射先には、図示しない電動ステージに配設された試料
３４が配置されている。この対物レンズ３２は、入射さ
れた基準レーザービームω_１およびストークスビームω
_２を試料３４上に集光、照射して、反ストークスビーム
（反ストークスラマン散乱光）ω_３を試料から発生させ
る。

【００２６】この試料３４を透過した基準レーザービー
ムω_１およびストークスビームω_２と反ストークスビー
ムω_３との光路上には、入射された各種ビームω_１，ω
_２，ω_３を所定の焦点距離で集光する、集光レンズ３６
が配設されている。この集光レンズ３６を透過した各種
ビームω_１，ω_２，ω_３の出射先には、基準レーザービ
ームω_１とストークスビームω_２とを遮断し、反ストー
クスビームω_３のみを透過させる、波長選択フィルタ
（ビーム選択手段）３８が設けられている。また、透過
された反ストークスビームω_３の光路上には、光検出器
４０が設けられている。電動ステージの位置信号と、光
検出器４０で検出される反ストークスビームω _３の光信
号とは、信号処理器（図示せず）で処理されて電気信号
に変換され、試料３４の反ストークスラマン散乱画像を
得ることができる。

【００２７】なお、ストークスビームω_２は、基準レー
ザービームω_１との角振動数の差（ω_２−ω_１）がラマ
ン活性な分子振動の角振動数と一致するように、６２０
ｎｍ〜６８０ｎｍの間でチューニングされる。また、ス
トークスビームω_２と基準レーザービームω_１とは、共
にパルス発振されるので、これらのパルスが同時に試料
３４に照射されるように光学遅延装置１４を調整する。

【００２８】そして、第１の実施の形態では、平行平面
体２４が回転可能に保持されているので、基準レーザー
ビームω_１とストークスビームω_２との光軸間隔を自由
に変えることができる。このため、使用される対物レン
ズ３２に合わせてミラー２６の位置を調整し、瞳を合わ
せることができる。

【００２９】さらに、以下に、第１の実施の形態の変形
例を記す。コリメートレンズ２２は、図示しないズーム
光学系を備え、焦点距離が可変にされていてもよい。こ
のため、対物レンズ３２へ入射される、基準レーザービ
ームω_１およびストークスビームω_２のビーム径は、使
用される対物レンズ３２の瞳径に合わせて調整され得
る。

【００３０】従って、例えば、図２の（ａ）に示すより
も大きい瞳径の対物レンズ３２に対しても、最適なビー
ム径で入射され得る。また、図３に示すように、２つの
ビームω_１，ω_２の一部は、光路の途中に部分的に設け
られた瞳変調手段として機能する遮断部材４２で遮断さ
れ、図２の（ｂ）に示すように対物レンズ３２の瞳に入
射される。この場合、対物レンズ３２の焦点位置以外で
は、基準レーザービームω_１とストークスビームω_２と
が交叉しないので、空間分解能の高い反ストークスビー
ムω_３を得ることができる。

【００３１】なお、図２の（ｂ）に示す場合は、基準レ
ーザービームω_１とストークスビームω_２とのほぼ中央
に遮断部材４２が設けられて、両方のビームの一部が遮
断されることを示している。この遮断部材４２を基準レ
ーザービームω_１およびストークスビームω_２のどちら
かに偏らせて、どちらか一方のビームのみを遮断する瞳
変調手段を行なってもよい。

【００３２】このようにすることで、どちらかのレーザ
ーのパワーが十分でなくともこの顕微鏡を有効に使用す
ることができる。

【００３３】（第２の実施の形態）次に、第２の実施の
形態について、図４を用いて説明する。以下、同様な作
用および機能を有する部材には、第１の実施の形態で用
いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略す
る。図４に示すように、レーザー顕微鏡は、レーザー光
源として、モードロックチタンサファイアレーザー５０
と光パラメトリックオシレータ５２とを備えている。

【００３４】モードロックチタンサファイアレーザー５
０は、出射口（図示せず）から所定の方向に、所定の振
動数を有する基準レーザービームω_１（波長８５０ｎ
ｍ）を出射させる。また、光パラメトリックオシレータ
５２には、図示しないモードロックチタンサファイアレ
ーザーが接続されており、当該光パラメトリックオシレ
ータ５２の出射口（図示せず）から基準レーザービーム
ω_１と振動数が異なるストークスビームω_２（波長１１
００ｎｍ〜１３５０ｎｍに変調可能）を所定の方向に出
射させる。

【００３５】これらレーザー５０およびオシレータ５２
は、共に８２ＭＨｚの繰り返し周波数でパルスを発振す
る。なお、これらレーザー５０およびオシレータ５２
は、パルス幅が１００〜１５０ｆｓ程度の超短パルスを
発振する。これらレーザー５０およびオシレータ５２を
出射されたそれぞれ基準レーザービームω_１およびスト
ークスビームω_２の光路上には、それぞれ４つのプリズ
ム５４，５６が設けられ、分散補償光学系５８を形成し
ている。これらプリズム５４，５６は、それぞれ所定の
間隔で、隣接するプリズムに対してそれぞれ所定の角度
傾けられて設置されている。そして、これらプリズム５
４，５６は、それぞれのビームω_１，ω_２に対して負の
分散を発生させる。この分散補償光学系５８について
は、後述する。

【００３６】プリズム５６から出射されたストークスビ
ームω_２は、それぞれプリズム１０の直角を挟む面に入
射され、反射される。そして、反射ミラー１２に入射さ
れ、ストークスビームω_２が直角に反射される。そし
て、基準レーザービームω_１およびストークスビームω
_２をダイクロイックミラー１６に入射し、基準レーザー
ビームω_１を透過させ、ストークスビームω_２を基準レ
ーザービームω_１と同一方向に反射させ、基準レーザー
ビームω_１とストークスビームω_２とを合成させる。

【００３７】そして、集光レンズ１８を介して、集光さ
れたビームω_１，ω_２をその集光位置で、光ファイバー
（例えば、シングルモードファイバー）２０の入射端２
０ａに入射させる。シングルモードファイバー２０は、
入射されたビームω_１，ω_２を出射端２０ｂに伝送し
て、出射させる。

【００３８】このビームω_１，ω_２の光路上には、後述
する試料３４にビームω_１，ω_２を導く照射手段が設け
られている。この照射手段は、まず、コリメートレンズ
２２を介して入射されたビームω_１，ω_２を平行ビーム
にする。そして、このコリメートレンズ２２の前方に
は、例えば、ＳＦ１０のような高分散ガラス６０が設け
られている。この高分散ガラス６０は、正の分散を発生
させる分散補償光学系として作用される。この分散補償
光学系については、後述する。

【００３９】そして、このビームω_１，ω_２を平行平面
体２４に入射させる。一方の側から入射されたビームω
_１，ω_２は、任意の角度で基準レーザービームω_１およ
びストークスビームω_２の２つのビームに分光され、そ
れぞれ屈折された後、他方の側より互いのビームω_１，
ω_２に対して平行に出射される。

【００４０】これら２つのビームω_１，ω_２の光路上に
は、ミラー６１が設けられており、当該ミラー６１を図
４中の矢印の方向に移動させることにより、これらビー
ムω _１，ω_２を試料３４上で所定距離だけ平行移動させ
ることができる。

【００４１】次いで、ミラー６１を通過したこれら２つ
のビームω_１，ω_２の光路上には、走査ミラー６２ａ，
６２ｃを備えたＸ−Ｙ走査装置６２が設けられており、
走査ミラー６２ａをＸ方向に揺動させてミラー６１から
の２つのビームω_１，ω_２を試料３４上でＸ方向に走査
させ、同様に、走査ミラー６２ｃを走査ミラー６２ａの
揺動に直交する方向、すなわちＹ方向に揺動させてミラ
ー６１からの２つのビームω_１，ω_２を試料３４上でＹ
方向に走査させる。

【００４２】なお、走査ミラー６１と走査ミラー６２ｃ
との間におけるこれら２つのビームω_１，ω_２の光路上
には、１組のリレーレンズ６２ｂが設けられており、こ
れらリレーレンズ６２ｂによって、走査ミラー６２ｃか
らのＸ方向に走査された２つのビームω_１，ω_２を走査
ミラー６２ｃに中継する。

【００４３】このようにして、Ｘ−Ｙ走査装置６２でＸ
−Ｙ方向に光偏向されたこれらビームω_１，ω_２をリレ
ーレンズ２８，３０を介して対物レンズ３２に入射させ
る。なお、ミラー６２ｃの像は、リレーレンズ２８，３
０により、対物レンズ３２のほぼ瞳位置に投影される。
対物レンズ３２の瞳には、図２の（ａ）に示すように、
これら２つのビームω_１，ω_２が入射される。

【００４４】対物レンズ３２は、入射されたこれら基準
レーザービームω_１とストークスビームω_２とを試料３
４上に集光、照射することによって、反ストークスビー
ム（反ストークスラマン散乱光）ω_３を試料３４から発
生させる。この試料３４を透過した基準レーザービーム
ω_１およびストークスビームω_２と、反ストークスビー
ムω_３との光路上には、集光レンズ３６が配設され、入
射されたビームω_１，ω_２，ω_３を集光させる。集光レ
ンズ３６を透過した各ビームω_１，ω_２，ω_３の出射先
には、波長選択フィルタ３８が設けられ、この波長選択
フィルタ３８で、基準レーザービームω_１とストークス
ビームω_２とが遮断され、反ストークスビームω_３のみ
が透過される。

【００４５】光検出器４０は、反ストークスビームω_３
の光路上の集光レンズ３６に入射されたビームω_３を集
光させる位置に好ましくは設けられている。そして、Ｘ
−Ｙ走査装置６２の走査信号と、光検出器４０で検出さ
れる反ストークスビームω_３の光信号とは、信号処理器
（図示せず）で処理されて電気信号に変換され、試料３
４の反ストークスラマン散乱画像を得ることができる。

【００４６】なお、ストークスビームω_２は、基準レー
ザービームω_１との角振動数の差（ω_２−ω_１）がラマ
ン活性な分子振動の角振動数と一致するように、１１０
０ｎｍ〜１３５０ｎｍの間でチューニングされる。ま
た、ストークスビームω_２と基準レーザービームω_１と
は、共にパルス発振されるので、これらのパルスが同時
に試料３４に照射されるように光学遅延装置１４を調整
する。

【００４７】次に、上述した分散補償光学系５８，６０
について説明する。シングルモードファイバー２０にパ
ルス幅が１００〜１５０ｆｓ程度の高密度の光が伝送さ
れると、自己位相変調が生じる。このため、ファイバー
２０からビームω_１，ω_２が出射された後に適当な分散
補償が行われても元のパルス幅を再現できない可能性が
ある。これは、レーザー出力を強めるほど顕著に現れ
る。

【００４８】そこで、本実施の形態では、シングルモー
ドファイバー２０から出射されるビームω_１，ω_２がピ
コ秒レベルのパルス幅で出射されるように、大きな負の
分散が与えられる分散補償光学系５８が基準レーザービ
ームω_１およびストークスビームω_２に対してそれぞれ
配置されている。そして、この負の分散補償光学系５８
の分散量は、それぞれ光路中に配置されている光学素子
の分散量の総和を相殺する値が選択されるのが好まし
い。

【００４９】しかし、本実施の形態では、集光レンズ１
８からコリメートレンズ２２までと、平行平面体２４か
ら対物レンズ３２までとの分散量の合計が、分散補償光
学系５８の分散を相殺するまでには至らない。このた
め、正の分散を与えることができる、例えばＳＦ１０の
ような高分散ガラス６０が光路に配置されている。

【００５０】このため、レーザー５０およびオシレータ
５２からそれぞれ出射される、基準レーザービームω_１
およびストークスビームω_２が有するレーザーパルス幅
は、広がることなく対物レンズ３２から出射され、試料
３４上に照射される。

【００５１】従って、光学系の分散が補償される分散補
償光学系５８は、２つのレーザービームω_１，ω_２に対
してそれぞれ配置されている。シングルモードファイバ
ー２０には、ピコ秒レベルに広がる光パルスが伝送され
るので、自己位相変調の問題が生じ難い。このため、対
物レンズ３２から出射されるレーザービームのパルス幅
は、それぞれレーザー５０およびオシレータ５２から出
射されるパルス幅としてほぼ再現される。

【００５２】反ストークスラマン散乱は、非線形光学過
程なので、上記に示すような超短パルスレーザービーム
を使用することにより、高い光子密度で試料３４上に照
射されるので、強い反ストークスビームω_３が試料３４
から得られる。従って、ＳＮ比の良いデータが得られ
る。これは、平均出力が低いレーザーを使用しても、デ
ータ取得が可能であることを示している。ゆえに、試料
３４が生きた生物標本などの場合に極めて有利である。

【００５３】さらに、以下に、第２の実施の形態の変形
例を記す。分散補償光学系には、いくつかの変形例が挙
げられる。シングルモードファイバー２０に２つのビー
ムω_１，ω_２が入射される前に、正の分散が発生される
分散部材（例えば、ＳＦ１０のような高分散ガラス）が
配置されてもよい。そして、シングルモードファイバー
２０からこのビームω_１，ω_２が出射された後に、負の
分散が発生される、例えば、４つのプリズムのような光
学系が配置されてもよい。また、プリズムの代わりに回
折格子が用いられてもよい。

【００５４】そして、レーザー出力が極めて低く、シン
グルモードファイバーの自己位相変調が問題にならない
場合には、正の分散が発生される部材を除いてもよい。
そして、集光レンズ１８から対物レンズ３２までの分散
量の合計を相殺する負の分散が与えられる分散補償光学
系がそれぞれのレーザーに対して配置されてもよい。

【００５５】ところで、第１および第２の実施の形態で
は、光ファイバーとしてシングルモードファイバー２０
を用いて説明したが、このファイバーは、シングルモー
ドの範囲内だけでなく、ほぼシングルモードとして扱え
る範囲内であれば、第１および第２の実施の形態で使用
したもの以外のものも用いることができる。

【００５６】また、シングルモードファイバーでかつ、
偏波面が保存されるファイバーが用いられてもよい。こ
のため、レーザービームが直線偏光の場合には、偏光が
保持され、ファイバーの屈曲状態が変わっても出力の変
動が少なく、安定してデータの取得を行なうことができ
る。

【００５７】また、第１および第２の実施の形態では、
それぞれ図１および図４に示すような光学系を説明した
が、このような光学系は一例であって、要旨を逸脱しな
い範囲であれば、他の光学系を用いてももちろん構わな
い。

【００５８】また、第１および第２の実施の形態では、
それぞれ図１および図４に示すような照射手段を説明し
たが、このような照射手段は、一例であって、要旨を逸
脱しない範囲であれば、他の照射手段を用いてももちろ
ん構わない。

【００５９】以上説明したように、基準レーザービーム
とストークスビームとが光ファイバーを介して出射され
るので、対物レンズの集光位置で、これらビームの位置
の重合性が保証される。従って、反ストークスビームを
得るのに寄与する基準レーザービームおよびストークス
ビームのみが試料に照射される。このため、試料に余計
なレーザービームが照射されることを防ぐので、生きた
生物細胞や組織を観察する場合に極めて有利である。ま
た、検出信号が安定した高いＳＮ比で検出される。

【００６０】また、環境温度の変化や振動などの影響
で、ミスアライメントが生じたとしても、光ファイバー
へのレーザービームの入射効率に影響を及ぼすのみであ
る。これは、対物レンズの集光位置でのビームの位置重
合性に影響を及ぼすことを防ぐものである。従って、検
出信号を高いＳＮ比で安定して検出することができる。

【００６１】これまで、いくつかの実施の形態について
図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上
述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨
を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。

【００６２】上記説明によれば、下記の事項の発明が得
られる。また、各項の組み合わせも可能である。

【００６３】［付記］１．それぞれ異なる振動数を有する基準レーザービーム
およびストークスビームを出射させるレーザー光源と、
反ストークスビームを試料から得るためのこれら２つの
ビームを、対物レンズを介して試料上に集光して照射す
る照射手段と、試料からの反ストークスビームを導き、
かつ前記基準レーザービームおよびストークスビームを
遮断するビーム選択手段と、試料からの反ストークスビ
ームを検出する光検出器と、を具備するレーザー顕微鏡
において、前記基準レーザービームおよびストークスビ
ームは、前記レーザー光源と照射手段との間に配設され
た共通の光ファイバーの入射端に入射され、この光ファ
イバーに入射された２つのビームは、出射端から出射さ
れて、前記照射手段に導かれることを特徴とするレーザ
ー顕微鏡。

【００６４】２．前記照射手段は、対物レンズを介して
前記基準レーザービームおよびストークスビームを前記
試料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備え
ていることを特徴とする付記項１に記載のレーザー顕微
鏡。

【００６５】３．前記照射手段は、前記基準レーザービ
ームおよびストークスビームの一方または両方のビーム
の一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特徴と
する付記項１もしくは２に記載のレーザー顕微鏡。

【００６６】４．前記光ファイバーには、シングルモー
ドファイバーが用いられていることを特徴とする付記項
１ないし３のいずれか１に記載のレーザー顕微鏡。

【００６７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
ミスアライメントの発生を抑えることができるととも
に、反ストークスビームを安定して高いＳＮ比で検出す
ることができる、レーザー顕微鏡を提供することができ
る。

【００６８】また、本発明によれば、反ストークスビー
ムの生成に寄与する基準レーザービームおよびストーク
スビームのみが試料に照射され、生きた細胞や組織を観
察するのに最適なレーザー顕微鏡を提供することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１の実施の形態にかかる、レーザー顕微鏡の
構成を示す概略図。

【図２】（ａ）は対物レンズの瞳にレーザービームが入
射されたときの概略的な説明図、（ｂ）は図３に示す遮
断部材が設けられた場合に、対物レンズの瞳にレーザー
ビームが入射されたときの概略的な説明図。

【図３】光路の途中に部分的にビームを遮断する遮断部
材が設けられた場合の概略図。

【図４】第２の実施の形態にかかる、レーザー顕微鏡の
構成を示す概略図。

【図５】従来のレーザー計測装置を示す説明図。

【図６】図５に示すレーザー計測装置の主要部を示す概
略図。

【符号の説明】

ω_１…基準レーザービーム、ω_２…ストークスビーム、
ω_３…反ストークスビーム、２…モードロックアルゴン
レーザー、２０…シングルモードファイバー、３２…対
物レンズ、３４…試料、３８…波長選択フィルタ、４０
…光検出器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G043 AA03 BA16 CA03 EA03 FA02 GA04 GB01 HA01 HA02 HA05 HA09 KA08 KA09 LA01 MA01 MA04 2H052 AA00 AC05 AC13 AC15 AC26 AC34 AF14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】それぞれ異なる振動数を有する基準レー
ザービームおよびストークスビームを出射させるレーザ
ー光源と、反ストークスビームを試料から得るためのこれら２つの
ビームを、対物レンズを介して試料上に集光して照射す
る照射手段と、試料からの反ストークスビームを導き、かつ前記基準レ
ーザービームおよびストークスビームを遮断するビーム
選択手段と、試料からの反ストークスビームを検出する光検出器と、を具備するレーザー顕微鏡において、前記基準レーザービームおよびストークスビームは、前
記レーザー光源と照射手段との間に配設された共通の光
ファイバーの入射端に入射され、この光ファイバーに入射された２つのビームは、出射端
から出射されて、前記照射手段に導かれることを特徴と
するレーザー顕微鏡。
【請求項２】前記照射手段は、対物レンズを介して前
記基準レーザービームおよびストークスビームを前記試
料上で集光して、試料上を走査させる走査手段を備えて
いることを特徴とする請求項１に記載のレーザー顕微
鏡。
【請求項３】前記照射手段は、前記基準レーザービー
ムおよびストークスビームの一方または両方のビームの
一部を遮断する瞳変調手段を備えていることを特徴とす
る請求項１もしくは２に記載のレーザー顕微鏡。