JPH10130291A - 核酸分離方法 - Google Patents
核酸分離方法Info
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- JPH10130291A JPH10130291A JP9124074A JP12407497A JPH10130291A JP H10130291 A JPH10130291 A JP H10130291A JP 9124074 A JP9124074 A JP 9124074A JP 12407497 A JP12407497 A JP 12407497A JP H10130291 A JPH10130291 A JP H10130291A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 他の非核酸分子を含む様々な成分からなる混
合物の中から核酸を回収、精製、または同定するのに有
益な方法を提供する。 【解決手段】ａ）以下の構造： 【化１】 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水
素、または該構造で示される１以上の追加のモノマーユ
ニットであって、該追加のモノマーユニットはモノマー
ユニット中の珪素残基によって酸素原子と結合してい
る）を有する化合物に核酸含有溶液を接触させることに
より核酸を該化合物に結合させ、そして ｂ）核酸の結合したポリマーを溶液より分離する工程か
らなる、核酸含有溶液から核酸を分離する方法。
合物の中から核酸を回収、精製、または同定するのに有
益な方法を提供する。 【解決手段】ａ）以下の構造： 【化１】 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水
素、または該構造で示される１以上の追加のモノマーユ
ニットであって、該追加のモノマーユニットはモノマー
ユニット中の珪素残基によって酸素原子と結合してい
る）を有する化合物に核酸含有溶液を接触させることに
より核酸を該化合物に結合させ、そして ｂ）核酸の結合したポリマーを溶液より分離する工程か
らなる、核酸含有溶液から核酸を分離する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸含有溶液から
核酸を分離する方法に関し、特に、他の非核酸分子を含
む様々な成分からなる混合物の中から核酸を回収、精
製、または同定するのに有益な方法に関する。
核酸を分離する方法に関し、特に、他の非核酸分子を含
む様々な成分からなる混合物の中から核酸を回収、精
製、または同定するのに有益な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ある種のシリコンを含んだ化合物は核酸
に結合することが知られており、様々な成分からなる混
合物の中から核酸を精製、同定するのに用いられてき
た。シリカまたはガラス粒子(二酸化シリコン)または単
細胞藻類の化石化した細胞壁(珪藻、二酸化シリコンを
ふくむ)が、核酸の精製用として最もよく知られてい
る。微粒子からなるシリカを含む結合試薬を用いる核酸
の同定の方法は、マルコら(Marko，et al.)(1982．Ana
l. Biochem．121：382-387)、ブームら(Boom，et al.)
(1990．J．Clin．Microbiol．28：495-503；欧州特許出
願 90292006/39)、ヤマダら（Yamada, et al.）(1990.
J.Viorl.Mtds.27:203-210)によって述べられている。核
酸は、不均質な混合物をグラスファイバーフィルターに
通すことによっても回収されてきた［チェンら(Chen，e
t al.) 1980．Anal．Biochem．101：339-341；チョウら
(Chow，et al．1989．Anal．Biochem．183：42-45］。
フェノールで誘導されたシリカゲル粒子および固相抽出
法により核酸試料から蛋白質を除去し、それによって精
製された核酸を溶液に残すための該粒子の使用法につい
て、マコーミック(McCormick)は述べている(1989.Anal.
Biochem.181:66-74)。
に結合することが知られており、様々な成分からなる混
合物の中から核酸を精製、同定するのに用いられてき
た。シリカまたはガラス粒子(二酸化シリコン)または単
細胞藻類の化石化した細胞壁(珪藻、二酸化シリコンを
ふくむ)が、核酸の精製用として最もよく知られてい
る。微粒子からなるシリカを含む結合試薬を用いる核酸
の同定の方法は、マルコら(Marko，et al.)(1982．Ana
l. Biochem．121：382-387)、ブームら(Boom，et al.)
(1990．J．Clin．Microbiol．28：495-503；欧州特許出
願 90292006/39)、ヤマダら（Yamada, et al.）(1990.
J.Viorl.Mtds.27:203-210)によって述べられている。核
酸は、不均質な混合物をグラスファイバーフィルターに
通すことによっても回収されてきた［チェンら(Chen，e
t al.) 1980．Anal．Biochem．101：339-341；チョウら
(Chow，et al．1989．Anal．Biochem．183：42-45］。
フェノールで誘導されたシリカゲル粒子および固相抽出
法により核酸試料から蛋白質を除去し、それによって精
製された核酸を溶液に残すための該粒子の使用法につい
て、マコーミック(McCormick)は述べている(1989.Anal.
Biochem.181:66-74)。
【０００３】プレップ エイ ジーン（Prep-A-Gene（商
標名））ＤＮＡ精製マトリックス(アルミニウム珪酸塩
珪藻)がバイオ ラド ラボラトリーズ (Bio-Rad Laborat
ories)(リッチモンド、カリホルニア(Richmond，Califo
rnia))より販売されており、ウイリスら(Willis，et a
l.)によって述べられている(1990．Biotechniques 9：9
2-99)。このマトリックスは、マトリックスのμｌあた
り０．２μｇのスーパーコイルＤＮＡを結合する能力を
もつ。プレップ エイ ジーン マトリックスを用いて約
０．２−２０ｋｂの直鎖状ＤＮＡとスーパーコイルＤＮ
Ａを精製または濃縮することができる。精製マトリック
スと共に用いるために、製造者は過塩素酸結合緩衝液(5
0mM トリス，1mM EDTA，6M NaClO4，pH7.5)、洗浄緩衝
液(40mM トリス，4mM EDTA，0.8M NaCl，pH7.4，約45-5
0%エタノール中)、溶出緩衝液(10mMトリス，1mM EDTA，
pH8.0)を供給している。
標名））ＤＮＡ精製マトリックス(アルミニウム珪酸塩
珪藻)がバイオ ラド ラボラトリーズ (Bio-Rad Laborat
ories)(リッチモンド、カリホルニア(Richmond，Califo
rnia))より販売されており、ウイリスら(Willis，et a
l.)によって述べられている(1990．Biotechniques 9：9
2-99)。このマトリックスは、マトリックスのμｌあた
り０．２μｇのスーパーコイルＤＮＡを結合する能力を
もつ。プレップ エイ ジーン マトリックスを用いて約
０．２−２０ｋｂの直鎖状ＤＮＡとスーパーコイルＤＮ
Ａを精製または濃縮することができる。精製マトリック
スと共に用いるために、製造者は過塩素酸結合緩衝液(5
0mM トリス，1mM EDTA，6M NaClO4，pH7.5)、洗浄緩衝
液(40mM トリス，4mM EDTA，0.8M NaCl，pH7.4，約45-5
0%エタノール中)、溶出緩衝液(10mMトリス，1mM EDTA，
pH8.0)を供給している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の核酸を分離す
る方法は、プレップ エイ ジーン マトリックスのような
二酸化シリコンから成る商品を用いる方法に比べて核酸
に対する優れた結合および回収を提供する。
る方法は、プレップ エイ ジーン マトリックスのような
二酸化シリコンから成る商品を用いる方法に比べて核酸
に対する優れた結合および回収を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ａ）以下の構
造：
造：
【化２】 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水
素、または該構造で示される１以上の追加のモノマーユ
ニットであって、該追加のモノマーユニットはモノマー
ユニット中の珪素残基によって酸素原子と結合してい
る）を有する化合物に核酸含有溶液を接触させることに
より核酸を該化合物に結合させ、そして ｂ）核酸の結合したポリマーを溶液より分離する工程か
らなる、核酸含有溶液から核酸を分離する方法を提供す
る。
素、または該構造で示される１以上の追加のモノマーユ
ニットであって、該追加のモノマーユニットはモノマー
ユニット中の珪素残基によって酸素原子と結合してい
る）を有する化合物に核酸含有溶液を接触させることに
より核酸を該化合物に結合させ、そして ｂ）核酸の結合したポリマーを溶液より分離する工程か
らなる、核酸含有溶液から核酸を分離する方法を提供す
る。
【０００６】本発明の核酸を分離する方法には、非重合
シラン試薬(シリコン テトロール)を単独で、あるいは
シリコンポリマーと混合した状態で使用する。さらに、
本発明と同様の目的である核酸の分離には以下にシリコ
ンジオールポリマーとして記載する重合試薬を用いても
よい。本発明の方法に使用する化合物は固体なので、核
酸に結合させ単離することは、遠心分離、濾過などによ
り簡単に実施される。結合した核酸は次に結合試薬から
溶出され、希釈緩衝液で固体を処理することにより、必
要であれば加熱することにより回収される。
シラン試薬(シリコン テトロール)を単独で、あるいは
シリコンポリマーと混合した状態で使用する。さらに、
本発明と同様の目的である核酸の分離には以下にシリコ
ンジオールポリマーとして記載する重合試薬を用いても
よい。本発明の方法に使用する化合物は固体なので、核
酸に結合させ単離することは、遠心分離、濾過などによ
り簡単に実施される。結合した核酸は次に結合試薬から
溶出され、希釈緩衝液で固体を処理することにより、必
要であれば加熱することにより回収される。
【０００７】上述したシリコンジオール試薬は、以下の
構造:
構造:
【化３】 の繰り返しユニットを有するシリコンジオールポリマー
からなる核酸結合用の微粒子である。以下、便宜上この
シリコンジオールポリマーは、化合物Iあるいは省略し
て（ＳｉＯ3Ｈ2）Nと表す。
からなる核酸結合用の微粒子である。以下、便宜上この
シリコンジオールポリマーは、化合物Iあるいは省略し
て（ＳｉＯ3Ｈ2）Nと表す。
【０００８】化合物I核酸結合試薬は、以下の式に従う
メタ珪酸ナトリウムポリマーのプロトネイションにより
合成される：反応Ａ
メタ珪酸ナトリウムポリマーのプロトネイションにより
合成される：反応Ａ
【化４】 一方、本発明の方法に使用する核酸結合試薬は以下の構
造：
造：
【化５】 をもち、ここでＲ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞ
れ、水素、または珪素部分を介して酸素原子と結合して
シランポリマーを形成する１以上の追加のモノマーユニ
ットである。Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４がすべて水素
の場合、化合物はシリコンテトロールである。
れ、水素、または珪素部分を介して酸素原子と結合して
シランポリマーを形成する１以上の追加のモノマーユニ
ットである。Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４がすべて水素
の場合、化合物はシリコンテトロールである。
【０００９】化合物IIは、以下に示すような四塩化シリ
コンの加水分解により合成される:反応Ｂ
コンの加水分解により合成される:反応Ｂ
【化６】 特定の理論により束縛されることを望んではいないが、
シリコンテトロールと、モノマーサブユニットがもう一
つのモノマーと様々な程度で重合したことを示す様々な
シランポリマーとの混合物である核酸結合試薬が反応Ｂ
により生成されると本願出願人は信じている。反応Ｂの
反応産物は特徴づけられていないし定量されていないの
で、便宜上、上述の化学反応の産物の核酸結合試薬を以
下においては化合物IIあるいは省略してＳｉ（ＯＨ）4
と表す。化合物IIあるいは省略したＳｉ（ＯＨ）4とい
う語は、シリコンテトロールや上述したポリマー誘導物
を含み、反応Ｂの産物の単独のものあるいは混合物を含
むものである。
シリコンテトロールと、モノマーサブユニットがもう一
つのモノマーと様々な程度で重合したことを示す様々な
シランポリマーとの混合物である核酸結合試薬が反応Ｂ
により生成されると本願出願人は信じている。反応Ｂの
反応産物は特徴づけられていないし定量されていないの
で、便宜上、上述の化学反応の産物の核酸結合試薬を以
下においては化合物IIあるいは省略してＳｉ（ＯＨ）4
と表す。化合物IIあるいは省略したＳｉ（ＯＨ）4とい
う語は、シリコンテトロールや上述したポリマー誘導物
を含み、反応Ｂの産物の単独のものあるいは混合物を含
むものである。
【００１０】溶液中で核酸と結合する新しい化学試薬が
開発された。これらは、蛋白質やその他の細胞の構成要
素等の非核酸分子を含む不均質な混合物から核酸を分離
する場合に有用である。当該試薬に結合した後に、核酸
は遠心分離、濾過および同様の操作によって、固体試薬
と共に、溶液から分離することが可能である。核酸は、
続いて行なわれる洗浄段階中も試薬に結合したままであ
り、希釈緩衝液にさらすことによって、そこから本質的
に純粋な形状で溶出され得る。溶出は、温度を上昇させ
ることによって最も効率よく行なうことができる。精製
された核酸は、重合連鎖反応、分子クローニング、制限
酵素切断、逆転写、および分子プローブとしての使用を
含む、継続して行なう様々な操作および反応に用いるの
に適当な形状で回収される。
開発された。これらは、蛋白質やその他の細胞の構成要
素等の非核酸分子を含む不均質な混合物から核酸を分離
する場合に有用である。当該試薬に結合した後に、核酸
は遠心分離、濾過および同様の操作によって、固体試薬
と共に、溶液から分離することが可能である。核酸は、
続いて行なわれる洗浄段階中も試薬に結合したままであ
り、希釈緩衝液にさらすことによって、そこから本質的
に純粋な形状で溶出され得る。溶出は、温度を上昇させ
ることによって最も効率よく行なうことができる。精製
された核酸は、重合連鎖反応、分子クローニング、制限
酵素切断、逆転写、および分子プローブとしての使用を
含む、継続して行なう様々な操作および反応に用いるの
に適当な形状で回収される。
【００１１】核酸結合試薬である（ＳｉＯ3Ｈ2）Nおよ
びＳｉ（ＯＨ）4は両方とも固体であり、核酸に効率的
に結合する。以下に述べたような利点がもたらされるた
めに、本発明がどの様に作用するかという任意の特定の
理論によって束縛されることを望んでいるわけではない
が、出願人は、本試薬の化学構造中に相対的に数多くシ
ランモエティが存在することが、表面に、負に荷電した
核酸の結合を促進かつ増進する親水性を提供すると仮定
している。従って、試薬は一本鎖あるいは二本鎖のいず
れかの形状にあるＤＮＡまたはＲＮＡを結合し、回収す
るために用いることが可能である。試薬が固体であるた
め、不均質な溶液の残余物から結合した核酸を分離する
ことは、遠心操作あるいは濾過によって溶液中から固体
を回収することによって簡単に遂行される。別法とし
て、試薬はカラムクロマトグラフィー用として、あるい
は濾過機器中に充填することによって用いることも可能
である。ひとつの態様では、注射筒に接続した濾過機器
中に試薬を充填することも可能である。そのような機器
を用いれば不均質な溶液は注射筒を用いて濾過機器中を
通過することを余儀なくされ、核酸以外の望ましくない
物質は通り抜け、核酸が結合する。これによって簡便で
迅速な核酸の精製法が供給される。発明された試薬を用
いて核酸を精製および／または分離するのに適切な、こ
れらおよびその他の方法は、上で従来技術として挙げた
文献に述べられている。
びＳｉ（ＯＨ）4は両方とも固体であり、核酸に効率的
に結合する。以下に述べたような利点がもたらされるた
めに、本発明がどの様に作用するかという任意の特定の
理論によって束縛されることを望んでいるわけではない
が、出願人は、本試薬の化学構造中に相対的に数多くシ
ランモエティが存在することが、表面に、負に荷電した
核酸の結合を促進かつ増進する親水性を提供すると仮定
している。従って、試薬は一本鎖あるいは二本鎖のいず
れかの形状にあるＤＮＡまたはＲＮＡを結合し、回収す
るために用いることが可能である。試薬が固体であるた
め、不均質な溶液の残余物から結合した核酸を分離する
ことは、遠心操作あるいは濾過によって溶液中から固体
を回収することによって簡単に遂行される。別法とし
て、試薬はカラムクロマトグラフィー用として、あるい
は濾過機器中に充填することによって用いることも可能
である。ひとつの態様では、注射筒に接続した濾過機器
中に試薬を充填することも可能である。そのような機器
を用いれば不均質な溶液は注射筒を用いて濾過機器中を
通過することを余儀なくされ、核酸以外の望ましくない
物質は通り抜け、核酸が結合する。これによって簡便で
迅速な核酸の精製法が供給される。発明された試薬を用
いて核酸を精製および／または分離するのに適切な、こ
れらおよびその他の方法は、上で従来技術として挙げた
文献に述べられている。
【００１２】核酸分離に使用できる上述した核酸結合試
薬化合物Ｉは以下に示す構造：
薬化合物Ｉは以下に示す構造：
【化７】 に従った一つまたはそれ以上の単量体ユニットからなる
シリコンジオールポリマーであるが、その際、Ｎは重合
体構造に置ける繰り返し単位の数を表わす。
シリコンジオールポリマーであるが、その際、Ｎは重合
体構造に置ける繰り返し単位の数を表わす。
【００１３】シリコンジオール重合体試薬は、硫酸、塩
酸あるいは氷酢酸等の強酸で処理することによってメタ
ケイ酸ナトリウム重合体を陽イオン化することにより合
成することが可能である。商業的に利用可能なメタケイ
酸ナトリウム重合体の長さ（すなわち、"Ｎ"）はわから
ないが、出願人は、それは様々な長さの混合物であると
考えている。本開示は、これらの商業的に利用可能なメ
タケイ酸ナトリウム重合体を用いた核酸結合試薬の合成
を記述している。しかし、もし均一な長さのメタケイ酸
ナトリウム重合体が利用可能となれば、これらはここに
開示された合成にとって代わる可能性があり、また付随
する反応生成物は本発明の範囲に含まれるよう意図され
る。
酸あるいは氷酢酸等の強酸で処理することによってメタ
ケイ酸ナトリウム重合体を陽イオン化することにより合
成することが可能である。商業的に利用可能なメタケイ
酸ナトリウム重合体の長さ（すなわち、"Ｎ"）はわから
ないが、出願人は、それは様々な長さの混合物であると
考えている。本開示は、これらの商業的に利用可能なメ
タケイ酸ナトリウム重合体を用いた核酸結合試薬の合成
を記述している。しかし、もし均一な長さのメタケイ酸
ナトリウム重合体が利用可能となれば、これらはここに
開示された合成にとって代わる可能性があり、また付随
する反応生成物は本発明の範囲に含まれるよう意図され
る。
【００１４】望ましい化合物Ｉの合成法では、メタケイ
酸ナトリウム重合体を２０％硫酸と混合し、その反応を
終夜進行させる。それから生成物を濾過し、水で洗い、
乾燥させて、粉末や粒子等の微粒子の形状にする。必要
であれば、粒子はデシケーター中で保存可能である。
酸ナトリウム重合体を２０％硫酸と混合し、その反応を
終夜進行させる。それから生成物を濾過し、水で洗い、
乾燥させて、粉末や粒子等の微粒子の形状にする。必要
であれば、粒子はデシケーター中で保存可能である。
【００１５】核酸結合試薬化合物IIは以下の一般構造：
【化８】 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水
素、または該構造で示される１以上の追加のモノマーユ
ニットであって、該追加のモノマーユニットはモノマー
ユニット中の珪素残基によって酸素原子と結合してい
る）を有する。核酸結合試薬化合物IIは、それゆえＲ
１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４が水素である以下の構造の単
量体試薬：
素、または該構造で示される１以上の追加のモノマーユ
ニットであって、該追加のモノマーユニットはモノマー
ユニット中の珪素残基によって酸素原子と結合してい
る）を有する。核酸結合試薬化合物IIは、それゆえＲ
１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４が水素である以下の構造の単
量体試薬：
【化９】 ならびにテトロールの一つまたはそれ以上の水素が、一
つまたはそれ以上の単量体ユニットで置き換えられたよ
うな、関連したシラン重合体を含む。例としては以下の
もの：
つまたはそれ以上の単量体ユニットで置き換えられたよ
うな、関連したシラン重合体を含む。例としては以下の
もの：
【化１０】 を含んでいるが、それに限定されず、その際、Ｒ１，Ｒ
３およびＲ４はさらなる単量体ユニットであり、Ｒ２は
水素である。代わりに、全ての"Ｒ"基が化合物IIの単量
体ユニットであることも可能であるし、あるいはただ一
つあるいは二つの"Ｒ"基が単量体ユニットで残りが水素
であることも可能である。もちろん、さらなる単量体ユ
ニット上の"Ｒ"基が水素であったり、またはさらに単量
体ユニットであっってもよく、その結果、様々な大きさ
と立体構造の重合分子が形成される。
３およびＲ４はさらなる単量体ユニットであり、Ｒ２は
水素である。代わりに、全ての"Ｒ"基が化合物IIの単量
体ユニットであることも可能であるし、あるいはただ一
つあるいは二つの"Ｒ"基が単量体ユニットで残りが水素
であることも可能である。もちろん、さらなる単量体ユ
ニット上の"Ｒ"基が水素であったり、またはさらに単量
体ユニットであっってもよく、その結果、様々な大きさ
と立体構造の重合分子が形成される。
【００１６】本発明の核酸結合試薬化合物IIは四塩化珪
素（ＳｉＣｌ4）の加水分解により合成することが可能
である。望ましい合成に於いては、ＳｉＣｌ4はゲルが
形成されるまで水の中に滴下される。ゲルは空気乾燥
し、それから粉末状にするためにオーブンで乾燥され
る。この反応によって生成された生成物は、多面的に性
質が調べられているわけではないが、この理論にとらわ
れることなく、出願人は、ＳｉＣｌ4の加水分解によ
り、シリコンテトロールおよび、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およ
びＲ４置換基の様々な組合せを表わす様々なシラン重合
体（すなわち、各々の位置に於ける水素や重合された単
量体サブユニット）を含む反応生成物の混合物が生じ
る、と思われる。試薬のシランモエティが核酸と結合す
るという作業仮説に基づいて、出願人は、これらの反応
生成物は、個々で、あるいは一つまたはそれ以上の反応
生成物と組合わさって、核酸の単離および／または精製
にも有用であると考えている。従って、四塩化珪素の加
水分解で生じる実質的に均一な個々の反応産物は、ま
た、本発明中に含まれることを意図している。
素（ＳｉＣｌ4）の加水分解により合成することが可能
である。望ましい合成に於いては、ＳｉＣｌ4はゲルが
形成されるまで水の中に滴下される。ゲルは空気乾燥
し、それから粉末状にするためにオーブンで乾燥され
る。この反応によって生成された生成物は、多面的に性
質が調べられているわけではないが、この理論にとらわ
れることなく、出願人は、ＳｉＣｌ4の加水分解によ
り、シリコンテトロールおよび、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およ
びＲ４置換基の様々な組合せを表わす様々なシラン重合
体（すなわち、各々の位置に於ける水素や重合された単
量体サブユニット）を含む反応生成物の混合物が生じ
る、と思われる。試薬のシランモエティが核酸と結合す
るという作業仮説に基づいて、出願人は、これらの反応
生成物は、個々で、あるいは一つまたはそれ以上の反応
生成物と組合わさって、核酸の単離および／または精製
にも有用であると考えている。従って、四塩化珪素の加
水分解で生じる実質的に均一な個々の反応産物は、ま
た、本発明中に含まれることを意図している。
【００１７】多数の利用可能な水酸基を有するある種の
試薬もまた、思いがけなく、合成可能であることが見い
だされたのだが、核酸の溶出と回収が従来の方法では困
難であるか不可能であるほど、核酸が非常に強く結合す
ることも思いがけなく見いだされた。そのような化合物
の一つは、メタケイ酸ナトリウムと四塩化珪素を反応さ
せ、反応産物を水酸化ナトリウムで処理することによっ
て合成される。この試薬は以下の構造：
試薬もまた、思いがけなく、合成可能であることが見い
だされたのだが、核酸の溶出と回収が従来の方法では困
難であるか不可能であるほど、核酸が非常に強く結合す
ることも思いがけなく見いだされた。そのような化合物
の一つは、メタケイ酸ナトリウムと四塩化珪素を反応さ
せ、反応産物を水酸化ナトリウムで処理することによっ
て合成される。この試薬は以下の構造：
【化１１】 を有するポリマーである。
【００１８】化合物IIIは核酸の精製および／または単
離には一般に適切ではないが、核酸と実質的に不可逆的
に結合する能力を思いがけず有していたため、核酸が望
ましくない不純物であるような不均質な混合物中から核
酸を除去するためには有用である。化合物IIIの様な試
薬は、したがって、核酸を含むヘテロな混合物中に存在
している非核酸分子の精製および／または単離に有用で
ある。
離には一般に適切ではないが、核酸と実質的に不可逆的
に結合する能力を思いがけず有していたため、核酸が望
ましくない不純物であるような不均質な混合物中から核
酸を除去するためには有用である。化合物IIIの様な試
薬は、したがって、核酸を含むヘテロな混合物中に存在
している非核酸分子の精製および／または単離に有用で
ある。
【００１９】全ての核酸結合試薬について、より小さい
粒子はその表面積を大きくするためにより有効であり、
核酸結合能を増大させる。上述したような合成により産
生された粉末は、それ故、より均一な望ましい大きさの
粒子を選択するために、望ましい多孔性のメッシュで濾
過することにより、使用に先だって大きさを揃えておく
必要がある。
粒子はその表面積を大きくするためにより有効であり、
核酸結合能を増大させる。上述したような合成により産
生された粉末は、それ故、より均一な望ましい大きさの
粒子を選択するために、望ましい多孔性のメッシュで濾
過することにより、使用に先だって大きさを揃えておく
必要がある。
【００２０】本発明の試薬を用いることにより、不均質
な溶液から核酸を単離および回収すること、あるいは不
純な核酸を除去することは、本試薬を溶液と混合し、そ
して核酸を試薬に結合させるのに十分な長さの時間にわ
たって混合物を保温することにより行なうことができ
る。結合工程は適切な緩衝液の存在下で行なうことが望
ましい。さらに、結合緩衝液は50mM Tris, 1mM EDTAお
よび6M NaClO4，pH7.5であることが望ましい。
な溶液から核酸を単離および回収すること、あるいは不
純な核酸を除去することは、本試薬を溶液と混合し、そ
して核酸を試薬に結合させるのに十分な長さの時間にわ
たって混合物を保温することにより行なうことができ
る。結合工程は適切な緩衝液の存在下で行なうことが望
ましい。さらに、結合緩衝液は50mM Tris, 1mM EDTAお
よび6M NaClO4，pH7.5であることが望ましい。
【００２１】核酸の単離あるいは精製が必要な場合に
は、核酸を結合させた試薬は混合液より回収でき、核酸
は試薬から溶出できる。核酸の除去が必要な場合には、
核酸を結合させた試薬を分離し、溶液から所望の成分を
精製することを続ける。試薬の不均質な溶液中でのイン
キュベーションは、二本鎖あるいは一本鎖の核酸のどち
らが必要であるかにより、室温あるいは加熱して行う。
結合試薬中にカオトロープを含むこともまた、一本鎖の
核酸の試薬への結合を促進する。適切なカオトロピック
試薬は、6M NaClO4，6M グアニジンHCl、6Mグアニジン
チオシアネートを含むが、これに限定されるわけではな
い。
は、核酸を結合させた試薬は混合液より回収でき、核酸
は試薬から溶出できる。核酸の除去が必要な場合には、
核酸を結合させた試薬を分離し、溶液から所望の成分を
精製することを続ける。試薬の不均質な溶液中でのイン
キュベーションは、二本鎖あるいは一本鎖の核酸のどち
らが必要であるかにより、室温あるいは加熱して行う。
結合試薬中にカオトロープを含むこともまた、一本鎖の
核酸の試薬への結合を促進する。適切なカオトロピック
試薬は、6M NaClO4，6M グアニジンHCl、6Mグアニジン
チオシアネートを含むが、これに限定されるわけではな
い。
【００２２】適用するほとんどの場合に於いて、核酸を
結合した試薬の溶液からの回収は、遠心操作または濾過
によって行なう。しかしながら、従事者にとって代替法
が明らかで有り得るし、発明の才を働かせなくても、特
異的な必要に対して代替法は簡単に適用され得る。これ
らは、本発明の試薬を親和性担体として用いたカラムク
ロマトグラフィーによる核酸の単離、および、結合した
核酸の回収を希釈緩衝液によってカラムから溶出させる
ことによって行なう場合を含んでいるが、これに限られ
ているわけではない。本発明の試薬を用いたカラムクロ
マトグラフィーは、溶液をカラムに通し、さらなる操作
のために結合しなかった画分を集めることによって、溶
液から核酸を除去するためにも用いることが可能であ
る。別法として、試薬は濾過機器の形態でも調製可能で
あるが、この場合、ヘテロな溶液が圧力または真空で吸
引されることによって濾過機器を通過し、結合した核酸
は、望まれる場合には、希釈緩衝液によって機器を洗浄
することにより回収される。
結合した試薬の溶液からの回収は、遠心操作または濾過
によって行なう。しかしながら、従事者にとって代替法
が明らかで有り得るし、発明の才を働かせなくても、特
異的な必要に対して代替法は簡単に適用され得る。これ
らは、本発明の試薬を親和性担体として用いたカラムク
ロマトグラフィーによる核酸の単離、および、結合した
核酸の回収を希釈緩衝液によってカラムから溶出させる
ことによって行なう場合を含んでいるが、これに限られ
ているわけではない。本発明の試薬を用いたカラムクロ
マトグラフィーは、溶液をカラムに通し、さらなる操作
のために結合しなかった画分を集めることによって、溶
液から核酸を除去するためにも用いることが可能であ
る。別法として、試薬は濾過機器の形態でも調製可能で
あるが、この場合、ヘテロな溶液が圧力または真空で吸
引されることによって濾過機器を通過し、結合した核酸
は、望まれる場合には、希釈緩衝液によって機器を洗浄
することにより回収される。
【００２３】結合された核酸を溶出するには、試薬を水
または希釈Tris緩衝液で洗浄することが望ましい。Tris
緩衝液を溶出に用いる場合、Trisの濃度は1mMと20mMの
間が望ましく、10mM程度がさらに望ましい。最適な溶出
緩衝液は10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0である。prep-A-G
ene核酸回収キットの緩衝液は、製作者の指示によれ
ば、核酸の結合と溶出に関して、本発明に於いても有用
である。
または希釈Tris緩衝液で洗浄することが望ましい。Tris
緩衝液を溶出に用いる場合、Trisの濃度は1mMと20mMの
間が望ましく、10mM程度がさらに望ましい。最適な溶出
緩衝液は10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0である。prep-A-G
ene核酸回収キットの緩衝液は、製作者の指示によれ
ば、核酸の結合と溶出に関して、本発明に於いても有用
である。
【００２４】結合試薬からいったん溶出させれば、核酸
は溶出緩衝液から回収することが可能であり、そして／
あるいは既知の手段のいずれによっても濃縮可能であ
る。例えば、全ＤＮＡあるいはＲＮＡはエタノールを加
えることにより、緩衝液から沈澱させることが可能であ
る。同時に、特別な核酸の種類はアガロースあるいはポ
リアクリルアミドゲルを電気泳動に用い、望むバンドを
ゲルから一定体積の液体に溶出させることにより、回収
および／または濃縮させることが可能である。特定の種
類のＤＮＡあるいはＲＮＡもまた、モレキュラークロー
ニング（Molecular cloning）に従って、溶出緩衝液か
ら回収あるいは単離できる。この技術に於いては、既存
の方法がよく知られている。例えば、モレキュラークロ
ーニング（Molecular Cloning）, マニアティス（T. Ma
niatis), Cold Spring Harbor Laboratories参照のこ
と。核酸を溶出緩衝液から回収するのによりよい方法
は、望む結果と何の目的で核酸を単離するかに拠るであ
ろう。
は溶出緩衝液から回収することが可能であり、そして／
あるいは既知の手段のいずれによっても濃縮可能であ
る。例えば、全ＤＮＡあるいはＲＮＡはエタノールを加
えることにより、緩衝液から沈澱させることが可能であ
る。同時に、特別な核酸の種類はアガロースあるいはポ
リアクリルアミドゲルを電気泳動に用い、望むバンドを
ゲルから一定体積の液体に溶出させることにより、回収
および／または濃縮させることが可能である。特定の種
類のＤＮＡあるいはＲＮＡもまた、モレキュラークロー
ニング（Molecular cloning）に従って、溶出緩衝液か
ら回収あるいは単離できる。この技術に於いては、既存
の方法がよく知られている。例えば、モレキュラークロ
ーニング（Molecular Cloning）, マニアティス（T. Ma
niatis), Cold Spring Harbor Laboratories参照のこ
と。核酸を溶出緩衝液から回収するのによりよい方法
は、望む結果と何の目的で核酸を単離するかに拠るであ
ろう。
【００２５】本発明の核酸結合試薬を用いる上述の方法
により単離された核酸は、さらなる操作あるいは精製を
行なうことなく、多くの分子遺伝学的方法において用い
るのに適切な形態で回収される。例えば回収されたＤＮ
ＡあるいはＲＮＡは重合連鎖反応(PCR)あるいはPCR の
応用により増幅される。ＲＮＡはｃＤＮＡの合成の鋳型
として用いられ、あるいは、一本鎖ＤＮＡは第二の相補
ＤＮＡ鎖の鋳型として用いられる。回収された核酸は、
ホモポリマーテールの添加、特定のリンカーの添加、あ
るいはベクター中のクローニング部位に適切な制限酵素
で消化することにより、適切なクローニングベクター中
にクローニングする事が可能である。回収された核酸
は、さらに、サザンブロット、ノザンブロット、インサ
イチュ（insitu）ハイブリダイゼーション、そして、組
換えクローンのハイブリダイゼーションスクリーニング
の分子プローブとして用いることが可能である。
により単離された核酸は、さらなる操作あるいは精製を
行なうことなく、多くの分子遺伝学的方法において用い
るのに適切な形態で回収される。例えば回収されたＤＮ
ＡあるいはＲＮＡは重合連鎖反応(PCR)あるいはPCR の
応用により増幅される。ＲＮＡはｃＤＮＡの合成の鋳型
として用いられ、あるいは、一本鎖ＤＮＡは第二の相補
ＤＮＡ鎖の鋳型として用いられる。回収された核酸は、
ホモポリマーテールの添加、特定のリンカーの添加、あ
るいはベクター中のクローニング部位に適切な制限酵素
で消化することにより、適切なクローニングベクター中
にクローニングする事が可能である。回収された核酸
は、さらに、サザンブロット、ノザンブロット、インサ
イチュ（insitu）ハイブリダイゼーション、そして、組
換えクローンのハイブリダイゼーションスクリーニング
の分子プローブとして用いることが可能である。
【００２６】本発明の特徴のいくつかは、以下に示す実
験実施例に示されている。これらの実施例は、付随する
請求の範囲で定義する発明に限定することを意図するも
のではない。本明細書を読むことにより、発明の才を働
かせることなく、修正や変更がなしうることが当業者に
は自明であろう。そのような修正と変更は本発明の範囲
に含まれる。
験実施例に示されている。これらの実施例は、付随する
請求の範囲で定義する発明に限定することを意図するも
のではない。本明細書を読むことにより、発明の才を働
かせることなく、修正や変更がなしうることが当業者に
は自明であろう。そのような修正と変更は本発明の範囲
に含まれる。
【００２７】
【実施例】実施例１ 化合物Ｉ（ＳｉＯ3Ｈ2）Nは以下のように合成した。２
ｇのメタケイ酸ナトリウムポリマー（ＳｉＯ3Ｎａ2）N
（ペトラルフ社、ペンシルバニア州ブリストル（Ｐｅｔ
ｒａｒｃｈ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉ
ａ））を１２５ｍｌの三角フラスコ中の２０％硫酸５０
ｍｌに溶解し、一晩放置した。生成物をフィルターで濾
過し、２０ｍｌの水で１０回洗浄した後、２０分間風乾
した。その後この生成物をオーブンで乾かして粉末状に
して、使用するまでデシケーター中に保存した。
ｇのメタケイ酸ナトリウムポリマー（ＳｉＯ3Ｎａ2）N
（ペトラルフ社、ペンシルバニア州ブリストル（Ｐｅｔ
ｒａｒｃｈ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉ
ａ））を１２５ｍｌの三角フラスコ中の２０％硫酸５０
ｍｌに溶解し、一晩放置した。生成物をフィルターで濾
過し、２０ｍｌの水で１０回洗浄した後、２０分間風乾
した。その後この生成物をオーブンで乾かして粉末状に
して、使用するまでデシケーター中に保存した。
【００２８】化合物IIのＳｉ（ＯＨ）4は以下のように
合成した。２５０ｍｌビーカー中の水２５ｍｌにＳｉＣ
ｌ4を滴下し、ゲルを形成させた。この反応はＨＣｌガ
スを生成する。ゲルを１０ｍｌの水で３回洗浄してさら
に１０ｍｌのアセトンで３回洗浄した。これを始めに風
乾し、その後オーブンで白い粉末になるまで乾かした。
合成した。２５０ｍｌビーカー中の水２５ｍｌにＳｉＣ
ｌ4を滴下し、ゲルを形成させた。この反応はＨＣｌガ
スを生成する。ゲルを１０ｍｌの水で３回洗浄してさら
に１０ｍｌのアセトンで３回洗浄した。これを始めに風
乾し、その後オーブンで白い粉末になるまで乾かした。
【００２９】反応生成物赤外線吸収解析の結果、化合物
Ｉがシラノールに高濃度に濃縮されたもの、化合物IIが
シラノールにさらに高濃度に濃縮されたものが得られた
ことがわかった。化合物Ｉについては吸収スペクトルの
Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ領域にもはっきりとした吸収が見られ
た。
Ｉがシラノールに高濃度に濃縮されたもの、化合物IIが
シラノールにさらに高濃度に濃縮されたものが得られた
ことがわかった。化合物Ｉについては吸収スペクトルの
Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ領域にもはっきりとした吸収が見られ
た。
【００３０】実施例２ 上で述べた方法で得られた試薬のＤＮＡ結合能およびＤ
ＮＡ回収能をＳｉＯ2と比較した。比較には市販のＤＮ
Ａ結合基質であるＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（商標名）を
用いた。この製品は現在入手できるＤＮＡ結合表面とし
ては最良のものと考えられる。ラムダファージＤＮＡを
ＨｉｎｄIIIで分解したものを５種の異なる濃度で用意
し、それぞれの結合基質／試薬に対して検定した。用意
した濃度は２μｌ（約１．３μｇ）、１μｌ（約０．６
５μｇ）、０．５μｌ（約０．３μｇ）、０．２５μｌ
（約０．１５μｇ）、０．１２５μｌ（約０．０７５μ
ｇ）をＴＥ緩衝液で総容量２５０μｌとしたものであ
る。検定に用いた試薬は１００ｍｇの固体を２００μｌ
のＴＥ緩衝液に懸濁したストック溶液として調製した。
ＮＡ回収能をＳｉＯ2と比較した。比較には市販のＤＮ
Ａ結合基質であるＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（商標名）を
用いた。この製品は現在入手できるＤＮＡ結合表面とし
ては最良のものと考えられる。ラムダファージＤＮＡを
ＨｉｎｄIIIで分解したものを５種の異なる濃度で用意
し、それぞれの結合基質／試薬に対して検定した。用意
した濃度は２μｌ（約１．３μｇ）、１μｌ（約０．６
５μｇ）、０．５μｌ（約０．３μｇ）、０．２５μｌ
（約０．１５μｇ）、０．１２５μｌ（約０．０７５μ
ｇ）をＴＥ緩衝液で総容量２５０μｌとしたものであ
る。検定に用いた試薬は１００ｍｇの固体を２００μｌ
のＴＥ緩衝液に懸濁したストック溶液として調製した。
【００３１】各ＤＮＡ試料に対してＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅ
ｎｅ基質または３０μｌの検定試薬と７５０μｌのＰｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ結合緩衝液を加えた。試料を室温で
５分間振盪し、６０℃で１０分間温めた。試料を遠心分
離して基質／試薬を沈殿させ、上清をデカンテーション
により捨て、結合の工程を繰り返した。２回目の遠心分
離、デカンテーションの後、基質／試薬を５００μｌの
Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄溶液で洗い、１０分間室温
で混合させて遠心分離、デカンテーションした。残った
エタノールは６０℃で１０分間の処理工程を除いた。２
５μｌのＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ溶出溶液を加え、試料
を再度６０℃で１０分間加熱した。遠心分離して溶出溶
液を回収し、この溶出工程を繰り返した。２回目の溶出
工程で回収した溶出溶液は、最初に回収した溶出溶液に
加えた。
ｎｅ基質または３０μｌの検定試薬と７５０μｌのＰｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ結合緩衝液を加えた。試料を室温で
５分間振盪し、６０℃で１０分間温めた。試料を遠心分
離して基質／試薬を沈殿させ、上清をデカンテーション
により捨て、結合の工程を繰り返した。２回目の遠心分
離、デカンテーションの後、基質／試薬を５００μｌの
Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄溶液で洗い、１０分間室温
で混合させて遠心分離、デカンテーションした。残った
エタノールは６０℃で１０分間の処理工程を除いた。２
５μｌのＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ溶出溶液を加え、試料
を再度６０℃で１０分間加熱した。遠心分離して溶出溶
液を回収し、この溶出工程を繰り返した。２回目の溶出
工程で回収した溶出溶液は、最初に回収した溶出溶液に
加えた。
【００３２】各操作で回収したＤＮＡは１×ＴＡＥを用
いた１％アガロースゲルで電気泳動し（７μｌ溶出溶液
＋３μｌローディングダイ）、エチジウム ブロマイド
で染色することにより解析した。収率の検定を行うため
に用いたのと同量のラムダＤＮＡを含む標準試料も同時
にゲルで電気泳動した。各操作で回収したＤＮＡ量を定
量するために、ゲルの写真のネガをゲルマンサイエンス
社ＡＣＤ−１８自動解析デンシトメーター（Ｇｅｌｍａ
ｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＣＤ−１８ Ａｕｔｏｍａｔ
ｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅ
ｒ）でスキャンした。このときのスキャニングは６５ｎ
ｍ、吸光度範囲は０．２５、スリットは０．２×１０ｍ
ｍ、そして波長は５２５ｎｍである。
いた１％アガロースゲルで電気泳動し（７μｌ溶出溶液
＋３μｌローディングダイ）、エチジウム ブロマイド
で染色することにより解析した。収率の検定を行うため
に用いたのと同量のラムダＤＮＡを含む標準試料も同時
にゲルで電気泳動した。各操作で回収したＤＮＡ量を定
量するために、ゲルの写真のネガをゲルマンサイエンス
社ＡＣＤ−１８自動解析デンシトメーター（Ｇｅｌｍａ
ｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＣＤ−１８ Ａｕｔｏｍａｔ
ｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅ
ｒ）でスキャンした。このときのスキャニングは６５ｎ
ｍ、吸光度範囲は０．２５、スリットは０．２×１０ｍ
ｍ、そして波長は５２５ｎｍである。
【００３３】ラムダＤＮＡの高分子量のバンドに対する
デンシトメーターのスキャン結果をプロットしたのが図
１である。本発明の試薬で検定に用いたものすべてが、
市販のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅに比較して優れた核酸の
収率を示しており、また標準曲線と比較した場合、加え
た核酸の量に対して定量的な回収が達成されていること
がわかる。本発明の核酸結合試薬は、ラムダＤＮＡの低
分子量のバンドの回収においてもＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎ
ｅに対して優れている（図２）。
デンシトメーターのスキャン結果をプロットしたのが図
１である。本発明の試薬で検定に用いたものすべてが、
市販のＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅに比較して優れた核酸の
収率を示しており、また標準曲線と比較した場合、加え
た核酸の量に対して定量的な回収が達成されていること
がわかる。本発明の核酸結合試薬は、ラムダＤＮＡの低
分子量のバンドの回収においてもＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎ
ｅに対して優れている（図２）。
【００３４】すべてのスキャンにおいて微量の試料につ
いてはピペッティングによる誤差が見られるが、この誤
差は検定に用いたすべての基質／試薬に一貫しているの
で、結果の解釈に影響はない。この実験結果は核酸結合
試薬としてのＳｉ（ＯＨ）4と（ＳｉＯ3Ｈ2）Nが、低分
子量および高分子量のＤＮＡの保持、回収において市販
の結合試薬よりも優れていることを示している。
いてはピペッティングによる誤差が見られるが、この誤
差は検定に用いたすべての基質／試薬に一貫しているの
で、結果の解釈に影響はない。この実験結果は核酸結合
試薬としてのＳｉ（ＯＨ）4と（ＳｉＯ3Ｈ2）Nが、低分
子量および高分子量のＤＮＡの保持、回収において市販
の結合試薬よりも優れていることを示している。
【００３５】実施例３ 実施例２のプロトコルは核酸の結合、溶出の際に試料を
加熱しており、一本鎖ＤＮＡの結合に関する結果を示す
ものと考えられた。そこで本実験では結合時の加熱の工
程以外は基本的に同一のプロトコルを繰り返すことによ
り、本試薬に対する二本鎖ＤＮＡの結合能を市販のＤＮ
Ａ結合基質と比較決定した。ラムダＤＮＡをさらに希釈
したものを用いることで、微小溶量を分取する際のピペ
ッティングによる誤差を低減した。
加熱しており、一本鎖ＤＮＡの結合に関する結果を示す
ものと考えられた。そこで本実験では結合時の加熱の工
程以外は基本的に同一のプロトコルを繰り返すことによ
り、本試薬に対する二本鎖ＤＮＡの結合能を市販のＤＮ
Ａ結合基質と比較決定した。ラムダＤＮＡをさらに希釈
したものを用いることで、微小溶量を分取する際のピペ
ッティングによる誤差を低減した。
【００３６】デンシトメーターによりゲルの写真のネガ
をスキャンした結果を図３から図５にプロットした。結
合の工程で加熱した実験とは対照的に、ラムダＤＮＡの
各分子量に対するＳｉ（ＯＨ）4試薬のＤＮＡ保持量
は、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅと同程度か若干低かった。
これとは逆に、先の実験ではＳｉ（ＯＨ）4試薬は検定
に用いた他のいかなる結合試薬よりもＤＮＡをよく保持
した。この結果は、Ｓｉ（ＯＨ）4と一本鎖ＤＮＡとの
間により強い水素結合が存在することに起因すると考え
られる。一方、（ＳｉＯ3Ｈ2）N試薬は検定に用いたす
べてのＤＮＡ濃度のすべての分子量において、常にＰｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅよりも多くのＤＮＡを保持し、ほと
んどの場合に標準曲線と比較してＤＮＡ量の定量的な回
収が達成されていた。
をスキャンした結果を図３から図５にプロットした。結
合の工程で加熱した実験とは対照的に、ラムダＤＮＡの
各分子量に対するＳｉ（ＯＨ）4試薬のＤＮＡ保持量
は、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅと同程度か若干低かった。
これとは逆に、先の実験ではＳｉ（ＯＨ）4試薬は検定
に用いた他のいかなる結合試薬よりもＤＮＡをよく保持
した。この結果は、Ｓｉ（ＯＨ）4と一本鎖ＤＮＡとの
間により強い水素結合が存在することに起因すると考え
られる。一方、（ＳｉＯ3Ｈ2）N試薬は検定に用いたす
べてのＤＮＡ濃度のすべての分子量において、常にＰｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅよりも多くのＤＮＡを保持し、ほと
んどの場合に標準曲線と比較してＤＮＡ量の定量的な回
収が達成されていた。
【図１】図１は、（ＳｉＯ3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の高
分子量ラムダＤＮＡに対するＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−
Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較したグラフである。
分子量ラムダＤＮＡに対するＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−
Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較したグラフである。
【図２】図２は、（ＳｉＯ3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の低
分子量ラムダＤＮＡに対するＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−
Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較したグラフである。
分子量ラムダＤＮＡに対するＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−
Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較したグラフである。
【図３】図３は、加熱操作をしないときの（ＳｉＯ
3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の高分子量ラムダＤＮＡに対す
るＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較し
たグラフである。
3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の高分子量ラムダＤＮＡに対す
るＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較し
たグラフである。
【図４】図４は、加熱操作をしないときの（ＳｉＯ
3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の中程度の分子量のラムダＤＮ
Ａに対するＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ基質
と比較したグラフである。
3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の中程度の分子量のラムダＤＮ
Ａに対するＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ基質
と比較したグラフである。
【図５】図４は、加熱操作をしないときの（ＳｉＯ
3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の低分子量ラムダＤＮＡに対す
るＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較し
たグラフである。
3Ｈ2）N、Ｓｉ（ＯＨ）4の低分子量ラムダＤＮＡに対す
るＤＮＡ結合能をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ基質と比較し
たグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (3)
- 【請求項１】ａ）以下の構造： 【化１】 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水
素、または該構造で示される１以上の追加のモノマーユ
ニットであって、該追加のモノマーユニットはモノマー
ユニット中の珪素残基によって酸素原子と結合してい
る）を有する化合物に核酸含有溶液を接触させることに
より核酸を該化合物に結合させ、そして ｂ）核酸の結合したポリマーを溶液より分離する工程か
らなる、核酸含有溶液から核酸を分離する方法。 - 【請求項２】結合した核酸を化合物より溶出することに
より核酸を単離することをさらに含む請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】核酸を加熱により溶出する請求項２記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89106592A | 1992-06-01 | 1992-06-01 | |
| US891065 | 1992-06-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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