JPH10108698A - 超音波を利用する核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための装置 - Google Patents
超音波を利用する核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための装置Info
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- JPH10108698A JPH10108698A JP26180096A JP26180096A JPH10108698A JP H10108698 A JPH10108698 A JP H10108698A JP 26180096 A JP26180096 A JP 26180096A JP 26180096 A JP26180096 A JP 26180096A JP H10108698 A JPH10108698 A JP H10108698A
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- dna
- rna
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Ultrasonic Waves (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】核酸ハイブリダイゼーションの効率を向上させ
る。 【解決手段】超音波発振子の印加電圧を５０または６０
サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時
的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音
波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振
幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０
分間照射しながら、核酸ハイブリダイゼーションを行う
方法およびそのための装置。
る。 【解決手段】超音波発振子の印加電圧を５０または６０
サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時
的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超音
波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である振
幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１０
分間照射しながら、核酸ハイブリダイゼーションを行う
方法およびそのための装置。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、超音波を利用した
核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための
装置に関し、特に迅速、または高精度な核酸または核酸
結合タンパク質の分析方法及びそれらの装置に関する。
臨床検査、食品検査、環境検査等幅広い産業分野での利
用が可能となる。
核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための
装置に関し、特に迅速、または高精度な核酸または核酸
結合タンパク質の分析方法及びそれらの装置に関する。
臨床検査、食品検査、環境検査等幅広い産業分野での利
用が可能となる。
【０００２】
【従来の技術】従来から、臨床検査、食品検査、環境検
査等幅広い産業分野において、糖、タンパク質、核酸な
どの各種生体成分の分析および定量が日常的に行われて
いる。特に、臨床検査の分野では、血液、尿などの体液
中の、特定の生体成分の分析および定量を行うことによ
り病気の診断や治療効果の判定を行うことができる。一
般的な生体成分の分析および定量方法としては、対象と
する生体成分の種類によって多種、多様なものがある
が、これらの反応には酵素と基質、抗体と抗原、核酸と
酵素または核酸との親和性を利用した反応を用いる場合
と、対象物の物理的化学的性質を利用した電気泳動法、
濾紙や樹脂を用いたクロマトグラフィー法を用いる方法
がある。しかしながら、これらの方法では対象とする生
体成分によっては、反応や操作に長時間を要しているも
のや、精度が不足していたり、原理的な限界があって、
正確な分析ができていないものもある。
査等幅広い産業分野において、糖、タンパク質、核酸な
どの各種生体成分の分析および定量が日常的に行われて
いる。特に、臨床検査の分野では、血液、尿などの体液
中の、特定の生体成分の分析および定量を行うことによ
り病気の診断や治療効果の判定を行うことができる。一
般的な生体成分の分析および定量方法としては、対象と
する生体成分の種類によって多種、多様なものがある
が、これらの反応には酵素と基質、抗体と抗原、核酸と
酵素または核酸との親和性を利用した反応を用いる場合
と、対象物の物理的化学的性質を利用した電気泳動法、
濾紙や樹脂を用いたクロマトグラフィー法を用いる方法
がある。しかしながら、これらの方法では対象とする生
体成分によっては、反応や操作に長時間を要しているも
のや、精度が不足していたり、原理的な限界があって、
正確な分析ができていないものもある。
【０００３】酵素反応では通常、１時間の反応時間を要
し、この時間は生化学反応系における酵素特有の反応速
度により決定される。すなわち、基質に対する至適酵素
量が存在し、その条件下で反応時間が決定される。過剰
量の酵素を用いると反応速度は短くなるが、多くの場
合、非常に不経済であるし、また、しばしば、過剰量の
酵素は特異的反応条件を低下させ、異常産物の蓄積が認
められる。さらに抗原抗体反応でも化学反応論が適用さ
れ、至適反応時間が決定されて、通常、約１時間程度が
必要である。電気泳動では用いる媒体（例えばアガロー
スやポリアクリルアミド）の性質や生体試料の電気的性
質によって、分析可能範囲が存在する。クロマトグラフ
ィーでも同様である。核酸ハイブリダイゼーション反応
では、酵素反応や抗原抗体反応とは異なり、対になる分
子種が鎖状であるため、１回の衝突によって反応は完了
せず、複数回の分子衝突が誤対合分子を補正しつつ、連
続鎖の対合反応が順次、進行すると考えられる。また、
対合の安定性は塩基の水素結合にのみ依存するので、塩
濃度、温度によって規定される条件下での分子衝突頻度
は理論的に決定され、反応時間はそれに従う。通常、１
２時間から２日間を要する。
し、この時間は生化学反応系における酵素特有の反応速
度により決定される。すなわち、基質に対する至適酵素
量が存在し、その条件下で反応時間が決定される。過剰
量の酵素を用いると反応速度は短くなるが、多くの場
合、非常に不経済であるし、また、しばしば、過剰量の
酵素は特異的反応条件を低下させ、異常産物の蓄積が認
められる。さらに抗原抗体反応でも化学反応論が適用さ
れ、至適反応時間が決定されて、通常、約１時間程度が
必要である。電気泳動では用いる媒体（例えばアガロー
スやポリアクリルアミド）の性質や生体試料の電気的性
質によって、分析可能範囲が存在する。クロマトグラフ
ィーでも同様である。核酸ハイブリダイゼーション反応
では、酵素反応や抗原抗体反応とは異なり、対になる分
子種が鎖状であるため、１回の衝突によって反応は完了
せず、複数回の分子衝突が誤対合分子を補正しつつ、連
続鎖の対合反応が順次、進行すると考えられる。また、
対合の安定性は塩基の水素結合にのみ依存するので、塩
濃度、温度によって規定される条件下での分子衝突頻度
は理論的に決定され、反応時間はそれに従う。通常、１
２時間から２日間を要する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、一般
的に用いられている核酸ハイブリダイゼーション反応に
おいて、その反応時間を短縮することおよびその分析の
感度を高めること、または再現性を高めることにある。
的に用いられている核酸ハイブリダイゼーション反応に
おいて、その反応時間を短縮することおよびその分析の
感度を高めること、または再現性を高めることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは物理的な手
段の１つである超音波に着目し、鋭意検討したところ、
核酸ハイブリダイゼーション反応に、外部より振幅が変
調された超音波を照射することにより、著しく反応時間
を短縮できることがわかった。
段の１つである超音波に着目し、鋭意検討したところ、
核酸ハイブリダイゼーション反応に、外部より振幅が変
調された超音波を照射することにより、著しく反応時間
を短縮できることがわかった。
【０００６】すなわち、本発明は振幅が変調された超音
波を照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b)
該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を
反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーショ
ン反応方法である。
波を照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b)
該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を
反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーショ
ン反応方法である。
【０００７】また、本発明は振幅が変調された超音波を
照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該Ｒ
ＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応
させる、次いで生成した反応生成物を測定することを特
徴とする試料中の核酸を検出する方法である。
照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該Ｒ
ＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応
させる、次いで生成した反応生成物を測定することを特
徴とする試料中の核酸を検出する方法である。
【０００８】さらに、本発明は水槽および超音波振動子
または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、
攪拌子、反応用プラットホームおよび反応容器固定装置
および振幅変調回路を具備する超音波発振器を有する核
酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための機器で
ある。
または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、
攪拌子、反応用プラットホームおよび反応容器固定装置
および振幅変調回路を具備する超音波発振器を有する核
酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための機器で
ある。
【０００９】本発明は振幅が変調された超音波を照射し
ながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡま
たは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させることを特徴と
する核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法
である。
ながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡま
たは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させることを特徴と
する核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法
である。
【００１０】また、本発明は振幅が変調された超音波を
照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該Ｒ
ＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ、次いで
生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中
の核酸結合タンパク質を検出する方法である。
照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該Ｒ
ＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ、次いで
生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料中
の核酸結合タンパク質を検出する方法である。
【００１１】さらに、本発明は水槽および超音波振動子
または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、
攪拌子、反応用プラットホーム、反応容器固定装置およ
び振幅変調回路を具備する超音波発振器を有する核酸ハ
イブリダイゼーション反応を実施するための機器であ
る。
または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、
攪拌子、反応用プラットホーム、反応容器固定装置およ
び振幅変調回路を具備する超音波発振器を有する核酸ハ
イブリダイゼーション反応を実施するための機器であ
る。
【００１２】本発明では、振幅が変調された超音波を使
用することが特徴である。振幅が変調された超音波と
は、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル
／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化
させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であ
る。脈動超音波を発生する振幅変調方式には２通りあ
り、半波方式と全波方式がある。核酸のハイブリダイゼ
ーション反応は互いに分子衝突頻度で律速されると考え
られるが、連続波による一定周波数の超音波でも、それ
ら分子の運動が促進されるために、それらの分子衝突頻
度が高まり、核酸ハイブリダイゼーション反応が相対的
に速くなると推測される。しかしながら、核酸は分子に
対して１回の衝突によって対合反応は完了せず、複数回
の分子衝突によって徐々に誤対合部分を補正しつつ、連
続鎖の対合反応が順次、進行すると考えられるので、連
続波ではなく、振幅が時間とともに変化する変調波で構
成された超音波がより効果的であると考えられる。この
場合、至適出力は１〜６Ｗ（平均）であり、瞬間最大出
力は半波を用いる振幅変調方式によっても、１２Ｗ程度
であって、キャビテーションによる核酸分子の破壊は起
こらない。
用することが特徴である。振幅が変調された超音波と
は、超音波発振子の印加電圧を５０または６０サイクル
／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化
させる振幅変調方式によって発生した脈動超音波であ
る。脈動超音波を発生する振幅変調方式には２通りあ
り、半波方式と全波方式がある。核酸のハイブリダイゼ
ーション反応は互いに分子衝突頻度で律速されると考え
られるが、連続波による一定周波数の超音波でも、それ
ら分子の運動が促進されるために、それらの分子衝突頻
度が高まり、核酸ハイブリダイゼーション反応が相対的
に速くなると推測される。しかしながら、核酸は分子に
対して１回の衝突によって対合反応は完了せず、複数回
の分子衝突によって徐々に誤対合部分を補正しつつ、連
続鎖の対合反応が順次、進行すると考えられるので、連
続波ではなく、振幅が時間とともに変化する変調波で構
成された超音波がより効果的であると考えられる。この
場合、至適出力は１〜６Ｗ（平均）であり、瞬間最大出
力は半波を用いる振幅変調方式によっても、１２Ｗ程度
であって、キャビテーションによる核酸分子の破壊は起
こらない。
【００１３】また、分子の媒体中の自然拡散も超音波照
射によって促進されると考えられ、自然拡散能を高めた
新しい分離法は分子量のみに依存する再現性の高い分離
法として期待される。超音波を利用した細胞破砕、洗
浄、加工、溶接、脱泡、乳化作用、音響発光などは、超
音波照射のときに生じる空洞現象（キャビテーション）
を使用し、局所的な高温の発生とそれに伴う作用をむし
ろ利用するが、本発明においては、振幅が時間とともに
変化すること、低出力であることおよび短時間で処理す
ることから、キャビテーションによる熱上昇による作用
効果ではない。また、核酸ハイブリダイゼーションには
融解温度（Ｔｍ）による至適温度が存在するため、超音
波によって熱発生が起こった場合、むしろ成績が悪くな
ることが考えられる。
射によって促進されると考えられ、自然拡散能を高めた
新しい分離法は分子量のみに依存する再現性の高い分離
法として期待される。超音波を利用した細胞破砕、洗
浄、加工、溶接、脱泡、乳化作用、音響発光などは、超
音波照射のときに生じる空洞現象（キャビテーション）
を使用し、局所的な高温の発生とそれに伴う作用をむし
ろ利用するが、本発明においては、振幅が時間とともに
変化すること、低出力であることおよび短時間で処理す
ることから、キャビテーションによる熱上昇による作用
効果ではない。また、核酸ハイブリダイゼーションには
融解温度（Ｔｍ）による至適温度が存在するため、超音
波によって熱発生が起こった場合、むしろ成績が悪くな
ることが考えられる。
【００１４】なお、特異的に結合する対の構成員の間の
複合体の形成の速度は、特異的に結合する対の構成員に
含有する媒質の超音波処理によって増大されることが公
知である（特公平 6-54125号公報) 。しかしながら、こ
の方法では、超音波周波数は約５〜１０3 ＫＨｚ、電力
は約１０〜１００Ｗ、温度は約１５〜４０℃、時間は約
３０秒〜２時間と記載されるが、これらの条件では反応
の態様としては、１回の分子衝突が反応完了に十分であ
ることを前提としているので一定振幅で構成される超音
波を連続的に照射するものである。核酸は鎖状の二重ら
せん構造をもち、これらの対合は水素結合によるので、
変性した核酸が二本鎖を形成する場合には、より複雑な
複数回の分子衝突と塩基配列に依存した順次、進行する
補正過程を包含する。したがって、単純な一定振幅で構
成される超音波ではこの過程を十分に促進することが困
難であるが、本発明においては、脈動超音波によって初
めて効率のよい核酸ハイブリダイゼーションが可能とな
った。さらに先行技術で好ましいとされる２０ｋＨｚ前
後の超音波は人間の可聴範囲にあるため、きわめて騒音
が著しく操作上、困難を伴っていたが、本発明では、さ
らに周波数の高い音域を用い、電力も１〜１０Ｗである
ので、騒音発生は大きく軽減される。
複合体の形成の速度は、特異的に結合する対の構成員に
含有する媒質の超音波処理によって増大されることが公
知である（特公平 6-54125号公報) 。しかしながら、こ
の方法では、超音波周波数は約５〜１０3 ＫＨｚ、電力
は約１０〜１００Ｗ、温度は約１５〜４０℃、時間は約
３０秒〜２時間と記載されるが、これらの条件では反応
の態様としては、１回の分子衝突が反応完了に十分であ
ることを前提としているので一定振幅で構成される超音
波を連続的に照射するものである。核酸は鎖状の二重ら
せん構造をもち、これらの対合は水素結合によるので、
変性した核酸が二本鎖を形成する場合には、より複雑な
複数回の分子衝突と塩基配列に依存した順次、進行する
補正過程を包含する。したがって、単純な一定振幅で構
成される超音波ではこの過程を十分に促進することが困
難であるが、本発明においては、脈動超音波によって初
めて効率のよい核酸ハイブリダイゼーションが可能とな
った。さらに先行技術で好ましいとされる２０ｋＨｚ前
後の超音波は人間の可聴範囲にあるため、きわめて騒音
が著しく操作上、困難を伴っていたが、本発明では、さ
らに周波数の高い音域を用い、電力も１〜１０Ｗである
ので、騒音発生は大きく軽減される。
【００１５】
【発明の実施態様】本発明の一実施態様は、超音波発振
子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に
変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調
方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０
ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を
電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a)
ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ
に相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴と
する核酸ハイブリダイゼーション反応方法である。
子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に
変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調
方式によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０
ＫＨｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を
電力１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a)
ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ
に相補的な配列を有する核酸を反応させることを特徴と
する核酸ハイブリダイゼーション反応方法である。
【００１６】本発明においてＲＮＡとしては、前核生
物、真核生物およびウイルス由来のｍＲＮＡなどがあ
る。ＤＮＡとしては、前核生物、真核生物由来の染色体
ＤＮＡの他、オルガネラ由来のミトコンドリアＤＮＡ、
葉緑体ＤＮＡなど、およびウイルス染色体、プラスミド
ＤＮＡなどが挙げられる。標識物質としては、放射性同
位元素（32Ｐ, 32Ｐ, 35Ｓなど）、検出可能な物質と結
合し得る物質、例えばビオチンなど、またはアルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼなどの酵素などが挙げられる。
物、真核生物およびウイルス由来のｍＲＮＡなどがあ
る。ＤＮＡとしては、前核生物、真核生物由来の染色体
ＤＮＡの他、オルガネラ由来のミトコンドリアＤＮＡ、
葉緑体ＤＮＡなど、およびウイルス染色体、プラスミド
ＤＮＡなどが挙げられる。標識物質としては、放射性同
位元素（32Ｐ, 32Ｐ, 35Ｓなど）、検出可能な物質と結
合し得る物質、例えばビオチンなど、またはアルカリホ
スファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼなどの酵素などが挙げられる。
【００１７】超音波照射方法は、まず、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡをナイロン膜などの上にブロティングしたものに対
し、通常の条件でハイブリダイゼーション用溶液に、該
ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を入れ
たものを、プラスティックバッグに入れてシールする
か、またはプラスティック皿に入れる。プラスティック
バッグまたは皿を水槽型振動子の場合、恒温装置に接続
し、水面上で脈動超音波（例えば３８ｋＨｚの超音波を
半波方式で振幅を変調、電力３Ｗ）を５〜１０分間照射
する。ホーン型振動子の場合は、プラスティックバッグ
または皿を直接に載せ、同様に超音波を照射する。この
照射条件はハイブリダイゼーションのみならず、プレハ
イブリダイゼーションおよび洗浄にも適用できる。
ＮＡをナイロン膜などの上にブロティングしたものに対
し、通常の条件でハイブリダイゼーション用溶液に、該
ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を入れ
たものを、プラスティックバッグに入れてシールする
か、またはプラスティック皿に入れる。プラスティック
バッグまたは皿を水槽型振動子の場合、恒温装置に接続
し、水面上で脈動超音波（例えば３８ｋＨｚの超音波を
半波方式で振幅を変調、電力３Ｗ）を５〜１０分間照射
する。ホーン型振動子の場合は、プラスティックバッグ
または皿を直接に載せ、同様に超音波を照射する。この
照射条件はハイブリダイゼーションのみならず、プレハ
イブリダイゼーションおよび洗浄にも適用できる。
【００１８】また、核酸ハイブリダイゼーション反応を
利用した分析方法でも、ＤＮＡまたはＲＮＡを電気泳動
ゲルからナイロン膜などの膜に固定する（ブロッテイン
グ）という操作を行う場合はある。このブロッテイング
操作においても、同様にして脈動超音波を照射する。具
体的には反応プラットホームにアルカリで変性したゲル
をおき、ナイロン膜などの膜を重ね、次に濾紙３〜４
枚、ペーパータオル３ｃｍ程度を重ねる。脈動超音波を
適当量で適当時間照射することで、ＤＮＡまたはＲＮＡ
が効率よくナイロン膜などの膜に転写できる。
利用した分析方法でも、ＤＮＡまたはＲＮＡを電気泳動
ゲルからナイロン膜などの膜に固定する（ブロッテイン
グ）という操作を行う場合はある。このブロッテイング
操作においても、同様にして脈動超音波を照射する。具
体的には反応プラットホームにアルカリで変性したゲル
をおき、ナイロン膜などの膜を重ね、次に濾紙３〜４
枚、ペーパータオル３ｃｍ程度を重ねる。脈動超音波を
適当量で適当時間照射することで、ＤＮＡまたはＲＮＡ
が効率よくナイロン膜などの膜に転写できる。
【００１９】脈動超音波照射条件は、反応器に対し、超
音波を２０〜４０ＫＨｚ、好ましくは３８ＫＨｚで、電
力１〜１０Ｗ、好ましくは６Ｗ程度、照射時間２〜１０
分間、好ましくは４分間照射する。例えば３８ｋＨｚの
超音波を半波方式で振幅を変調して照射する。一定振幅
の超音波によって照射を行うと、核酸ハイブリダイゼー
ションの効果が低下する。
音波を２０〜４０ＫＨｚ、好ましくは３８ＫＨｚで、電
力１〜１０Ｗ、好ましくは６Ｗ程度、照射時間２〜１０
分間、好ましくは４分間照射する。例えば３８ｋＨｚの
超音波を半波方式で振幅を変調して照射する。一定振幅
の超音波によって照射を行うと、核酸ハイブリダイゼー
ションの効果が低下する。
【００２０】本発明の別な実施態様は、細胞内核酸と標
識核酸を脈動超音波を照射しながら反応させることを特
徴とするin situ 核酸ハイブリダイゼーション反応方法
である。細胞内核酸としては、前核生物または真核生物
の染色体、ウイルスＤＮＡ、真核生物オルガネラ由来Ｄ
ＮＡ、各種ＲＮＡなどがある。標識核酸は前記細胞内核
酸に相補的な配列を有するものである。標識物質として
は、前記した放射性同位元素(3Ｈなど）、検出可能な物
質を結合しうる物質、例えばビオチンなど、またはアル
カリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼなどが挙げられる。脈動超音波照射条件は、上
記した(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたは
ＤＮＡに相補的な核酸に超音波を照射しながら反応させ
る核酸ハイブリダイゼーション反応方法のものと同様で
ある。
識核酸を脈動超音波を照射しながら反応させることを特
徴とするin situ 核酸ハイブリダイゼーション反応方法
である。細胞内核酸としては、前核生物または真核生物
の染色体、ウイルスＤＮＡ、真核生物オルガネラ由来Ｄ
ＮＡ、各種ＲＮＡなどがある。標識核酸は前記細胞内核
酸に相補的な配列を有するものである。標識物質として
は、前記した放射性同位元素(3Ｈなど）、検出可能な物
質を結合しうる物質、例えばビオチンなど、またはアル
カリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼなどが挙げられる。脈動超音波照射条件は、上
記した(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたは
ＤＮＡに相補的な核酸に超音波を照射しながら反応させ
る核酸ハイブリダイゼーション反応方法のものと同様で
ある。
【００２１】また、本発明の一実施態様は、試料中のＲ
ＮＡまたはＤＮＡをＤＮＡまたはＲＮＡと脈動超音波を
照射しながら反応させ、次いで生成した反応生成物を測
定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法で
ある。これはＤＮＡまたはＲＮＡが相補的な配列をもつ
ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプロ
ーブ）とハイブリダイズするという性質を利用したもの
である。このハイブリダイズさせる工程においても、脈
動する超音波を照射する。超音波照射条件は、上記した
(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたはＤＮＡ
に相補的な核酸に超音波を照射しながら反応させる核酸
ハイブリダイゼーション反応方法のものと同様である。
ＮＡまたはＤＮＡをＤＮＡまたはＲＮＡと脈動超音波を
照射しながら反応させ、次いで生成した反応生成物を測
定することを特徴とする試料中の核酸を検出する方法で
ある。これはＤＮＡまたはＲＮＡが相補的な配列をもつ
ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプロ
ーブ）とハイブリダイズするという性質を利用したもの
である。このハイブリダイズさせる工程においても、脈
動する超音波を照射する。超音波照射条件は、上記した
(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたはＤＮＡ
に相補的な核酸に超音波を照射しながら反応させる核酸
ハイブリダイゼーション反応方法のものと同様である。
【００２２】また、本発明のハイブリダイゼーション反
応を利用する方法では、そのプローブ作成時に、酵素反
応を利用して核酸の末端のリン酸基を外し、アイソトー
プでラベルされたリン酸基を結合させる操作を行うこと
がある。この酵素反応においても、外部より超音波を照
射してもよい。超音波照射条件は、上記条件と同じであ
る。具体的には水槽型の場合、反応器 (例えば試験管、
プラスティックチューブなど) を水面に浮かし、ホーン
型振動子の場合、反応器の底が振動子に接するように垂
直に静置して照射する。望ましくは水槽型で恒温装置に
接続し、各酵素の至適温度を維持しながら行う。
応を利用する方法では、そのプローブ作成時に、酵素反
応を利用して核酸の末端のリン酸基を外し、アイソトー
プでラベルされたリン酸基を結合させる操作を行うこと
がある。この酵素反応においても、外部より超音波を照
射してもよい。超音波照射条件は、上記条件と同じであ
る。具体的には水槽型の場合、反応器 (例えば試験管、
プラスティックチューブなど) を水面に浮かし、ホーン
型振動子の場合、反応器の底が振動子に接するように垂
直に静置して照射する。望ましくは水槽型で恒温装置に
接続し、各酵素の至適温度を維持しながら行う。
【００２３】本発明の別な実施態様は、超音波発振子の
印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化
させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式
によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨ
ｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力
１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a) ＲＮ
ＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タン
パク質に超音波を照射しながら反応させることを特徴と
する核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法
である。
印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化
させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式
によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨ
ｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力
１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a) ＲＮ
ＡまたはＤＮＡおよび(b) ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タン
パク質に超音波を照射しながら反応させることを特徴と
する核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法
である。
【００２４】ＲＮＡまたはＤＮＡ結合タンパク質として
は、１）ＤＮＡ構造に変化を与えて遺伝子発現を調節す
る二重鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えばラムダファージ
ｃｒｏタンパク質、ｃＩリプレッサーやラクトースオペ
ロンリプレッサーなどの遺伝子発現調節タンパク質な
ど）、２）複製、組換え、修復の過程に必須な一本鎖Ｄ
ＮＡ結合タンパク質（例えば大腸菌から高等生物に至る
生物種に見いだされているＳＳＢ）、３）染色体に強く
結合し、染色体の高次構造の保持に関与するタンパク質
（例えばヒストンや非ヒストンタンパク質など）、４）
ヘリカーゼなどのＤＮＡ依存生ＡＴＰアーゼ（例えばｒ
ｅｐヘリカーゼ、ｎ’やｄｎａＢなどの複製タンパク
質、ｒｅｃＡやｒｅｃＢなどの組換えタンパク質など）
や５）ＤＮＡコンホメーションに変化を与えるトポイソ
メラーゼ（例えばトポイソメラーゼＩ、II、ラムダファ
ージｉｎｔタンパク質やφＸ１７４遺伝子Ａタンパク質
など）などがある。超音波照射条件は、上記した核酸の
ハイブリダイゼーション反応におけるものと同様であ
る。
は、１）ＤＮＡ構造に変化を与えて遺伝子発現を調節す
る二重鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えばラムダファージ
ｃｒｏタンパク質、ｃＩリプレッサーやラクトースオペ
ロンリプレッサーなどの遺伝子発現調節タンパク質な
ど）、２）複製、組換え、修復の過程に必須な一本鎖Ｄ
ＮＡ結合タンパク質（例えば大腸菌から高等生物に至る
生物種に見いだされているＳＳＢ）、３）染色体に強く
結合し、染色体の高次構造の保持に関与するタンパク質
（例えばヒストンや非ヒストンタンパク質など）、４）
ヘリカーゼなどのＤＮＡ依存生ＡＴＰアーゼ（例えばｒ
ｅｐヘリカーゼ、ｎ’やｄｎａＢなどの複製タンパク
質、ｒｅｃＡやｒｅｃＢなどの組換えタンパク質など）
や５）ＤＮＡコンホメーションに変化を与えるトポイソ
メラーゼ（例えばトポイソメラーゼＩ、II、ラムダファ
ージｉｎｔタンパク質やφＸ１７４遺伝子Ａタンパク質
など）などがある。超音波照射条件は、上記した核酸の
ハイブリダイゼーション反応におけるものと同様であ
る。
【００２５】本発明の別な実施態様は、超音波発振子の
印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化
させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式
によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨ
ｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力
１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a) ＲＮ
ＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合
タンパク質を反応させ、次いで生成した反応生成物を測
定することを特徴とする試料中の核酸結合タンパク質を
検出する方法である。超音波照射条件は、上記した核酸
のハイブリダイゼーション反応におけるものと同様であ
る。
印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に変化
させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式
によって発生した脈動超音波であって、２０〜４０ＫＨ
ｚ振幅変調超音波である振幅が変調された超音波を電力
１〜１０Ｗにて、２〜１０分間照射しながら、(a) ＲＮ
ＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合
タンパク質を反応させ、次いで生成した反応生成物を測
定することを特徴とする試料中の核酸結合タンパク質を
検出する方法である。超音波照射条件は、上記した核酸
のハイブリダイゼーション反応におけるものと同様であ
る。
【００２６】照射時間および温度は、材料により簡単に
至適化される。通常、温度は常法に従い、照射時間は５
分間程度、もしくは５分間以下である。なお、反応容器
と発振器の間には気相を介さないように、水もしくは軽
油を充填する。
至適化される。通常、温度は常法に従い、照射時間は５
分間程度、もしくは５分間以下である。なお、反応容器
と発振器の間には気相を介さないように、水もしくは軽
油を充填する。
【００２７】本発明の別な実施態様は、水槽および超音
波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制
御装置、攪拌子、反応用プラットホーム、反応容器固定
装置および振幅変調回路を具備する超音波発振器を有す
る核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための機
器である。図１にて本発明の核酸ハイブリダイゼーショ
ン反応のための機器を説明する。１は超音波発振子、２
は反応用プラットホーム、３はハイブリダイゼーション
用フィルター（ナイロン膜など）、４は反応溶液、５は
蓋、６は水、７は水槽、８はモーター、９は攪拌子、１
０は温度制御付きヒーター、１１は超音波発振子および
振幅変調回路、１２は制御装置、１３は電源を示す。
波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制
御装置、攪拌子、反応用プラットホーム、反応容器固定
装置および振幅変調回路を具備する超音波発振器を有す
る核酸ハイブリダイゼーション反応を実施するための機
器である。図１にて本発明の核酸ハイブリダイゼーショ
ン反応のための機器を説明する。１は超音波発振子、２
は反応用プラットホーム、３はハイブリダイゼーション
用フィルター（ナイロン膜など）、４は反応溶液、５は
蓋、６は水、７は水槽、８はモーター、９は攪拌子、１
０は温度制御付きヒーター、１１は超音波発振子および
振幅変調回路、１２は制御装置、１３は電源を示す。
【００２８】試料(3) は反応プラットホーム(2) に入
れ、これらは反応溶液(4) で満たされ、上部は蓋(5) で
閉じられる。超音波は超音波発振子(1) で発生し、反応
用プラットホームまで満たされ、水槽(7) 内の水(6) を
通り、試料に作用し、ここで反応が起こる。水温は温度
制御装置の付いたヒーター(10)で一定に保持されるが、
モーター(8) に接続された攪拌子(9) で水槽内全体の恒
温作用を効率化している。超音波振動子は水槽の底に設
置されるが、超音波発振子(11)によって駆動され、この
ための制御装置(12)および電源(13)が付加されている。
れ、これらは反応溶液(4) で満たされ、上部は蓋(5) で
閉じられる。超音波は超音波発振子(1) で発生し、反応
用プラットホームまで満たされ、水槽(7) 内の水(6) を
通り、試料に作用し、ここで反応が起こる。水温は温度
制御装置の付いたヒーター(10)で一定に保持されるが、
モーター(8) に接続された攪拌子(9) で水槽内全体の恒
温作用を効率化している。超音波振動子は水槽の底に設
置されるが、超音波発振子(11)によって駆動され、この
ための制御装置(12)および電源(13)が付加されている。
【００２９】反応を水槽内で行い、水槽内は設置温度が
維持できるようになっているほか、反応用プラットホー
ムに蓋を設け、エアロゾル対策を取っている。
維持できるようになっているほか、反応用プラットホー
ムに蓋を設け、エアロゾル対策を取っている。
【００３０】本発明の別な実施態様は、水槽および超音
波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制
御装置、攪拌子、反応用プラットホームおよび反応容器
固定装置および超音波発振器を有する核酸タンパク質ハ
イブリダイゼーション反応を実施するための機器であ
る。上記ハイブリダイゼーション用フィルター（ナイロ
ン膜など）も同様である。
波振動子または乾式ホーン型振動子、ヒーター、温度制
御装置、攪拌子、反応用プラットホームおよび反応容器
固定装置および超音波発振器を有する核酸タンパク質ハ
イブリダイゼーション反応を実施するための機器であ
る。上記ハイブリダイゼーション用フィルター（ナイロ
ン膜など）も同様である。
【００３１】
【発明の効果】本発明の核酸ハイブリダイゼーション反
応方法およびそのための装置では、外部より超音波を断
続的に照射することにより、その反応時間を短縮するこ
とが可能となり、生体成分の分析の精度を高めることが
可能となる。また、公知の技術で、特に効果があるとさ
れる２０ｋＨｚ前後の超音波照射と異なり、人間の可聴
域を越える４０ｋＨｚ前後の脈動超音波は極端に発生音
が軽減されるため、より実用的である。
応方法およびそのための装置では、外部より超音波を断
続的に照射することにより、その反応時間を短縮するこ
とが可能となり、生体成分の分析の精度を高めることが
可能となる。また、公知の技術で、特に効果があるとさ
れる２０ｋＨｚ前後の超音波照射と異なり、人間の可聴
域を越える４０ｋＨｚ前後の脈動超音波は極端に発生音
が軽減されるため、より実用的である。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明す
る。実施例１ 脈動超音波の核酸ハイブリダイゼーションへ
の利用 核酸ハイブリダイゼーションへの脈動超音波の効果の検
討は、ＤＮＡを転写したナイロン膜を用いて行った。ナ
イロン膜は直径６ｍｍのパンチを用いて打ち抜き円形の
ディスクとし、これを２６枚用意した。これを１１３μ
ｇ／ｍＬのラムダＤＮＡ、０．２Ｎ ＮａＯＨの溶液に
３０分間浸漬し、次いで２ｍＬの６×ＳＳＣで洗浄した
ものを通常の方法にて、熱変性したサケ精子ＤＮＡとプ
レハイブリダイゼーションを３０分間行った。次に２枚
は０分間のコントロールとして、また、他のディスクは
それぞれ３０秒、１分、２分、４分間の超音波非照射、
２８ｋＨｚ超音波照射および３８ｋＨｚ振幅変調超音波
（半波式）照射試料として、図１に示した核酸検出用機
器内でハイブリダイゼーションを経時的に行った。な
お、振幅変調超音波（半波式）では、超音波発振子の印
加電圧を６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子
の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生
した脈動超音波を使用した。
る。実施例１ 脈動超音波の核酸ハイブリダイゼーションへ
の利用 核酸ハイブリダイゼーションへの脈動超音波の効果の検
討は、ＤＮＡを転写したナイロン膜を用いて行った。ナ
イロン膜は直径６ｍｍのパンチを用いて打ち抜き円形の
ディスクとし、これを２６枚用意した。これを１１３μ
ｇ／ｍＬのラムダＤＮＡ、０．２Ｎ ＮａＯＨの溶液に
３０分間浸漬し、次いで２ｍＬの６×ＳＳＣで洗浄した
ものを通常の方法にて、熱変性したサケ精子ＤＮＡとプ
レハイブリダイゼーションを３０分間行った。次に２枚
は０分間のコントロールとして、また、他のディスクは
それぞれ３０秒、１分、２分、４分間の超音波非照射、
２８ｋＨｚ超音波照射および３８ｋＨｚ振幅変調超音波
（半波式）照射試料として、図１に示した核酸検出用機
器内でハイブリダイゼーションを経時的に行った。な
お、振幅変調超音波（半波式）では、超音波発振子の印
加電圧を６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子
の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発生
した脈動超音波を使用した。
【００３３】各点において２枚のディスクを用いた。ハ
イブリダイゼーションのプローブにはラムダＤＮＡの０
〜１０００ｂｐの断片をＰＣＲで、ビオチン化ｄＵＴＰ
を用いて標識したものを用いた。ハイブリダイゼーショ
ン後の洗浄は、常法に従い、ＳＳＣ濃度を段階的に希釈
したものを用いた。ハイブリッドの検出には東洋紡製Im
aging high-Chemilumi-/-Color-を用い、化学発光さ
せ、Ｘ線フィルムに感光させた。この濃淡をゲルスキャ
ナーで定量化したものを図２に示す。図２中、直線は脈
動超音波照射、破線は一定振幅の超音波照射、点線は非
照射を示す。各点は２点の平均値である。超音波照射サ
ンプル（直線、破線）は非照射（点線）よりハイブリダ
イゼーション効率が良いが、特に脈動超音波照射したサ
ンプル（直線）では著しい効率の改善が見られ、感度が
高くなるとが判明した。
イブリダイゼーションのプローブにはラムダＤＮＡの０
〜１０００ｂｐの断片をＰＣＲで、ビオチン化ｄＵＴＰ
を用いて標識したものを用いた。ハイブリダイゼーショ
ン後の洗浄は、常法に従い、ＳＳＣ濃度を段階的に希釈
したものを用いた。ハイブリッドの検出には東洋紡製Im
aging high-Chemilumi-/-Color-を用い、化学発光さ
せ、Ｘ線フィルムに感光させた。この濃淡をゲルスキャ
ナーで定量化したものを図２に示す。図２中、直線は脈
動超音波照射、破線は一定振幅の超音波照射、点線は非
照射を示す。各点は２点の平均値である。超音波照射サ
ンプル（直線、破線）は非照射（点線）よりハイブリダ
イゼーション効率が良いが、特に脈動超音波照射したサ
ンプル（直線）では著しい効率の改善が見られ、感度が
高くなるとが判明した。
【００３４】実施例２ 脈動超音波のサザーンブロティ
ングへの応用 サザーンブロティングへの脈動超音波の効果の検討は、
アガロースゲルからＤＮＡを転写したナイロン膜を用い
て行った。常法に従い、アガロースゲル（０．７％）上
で電気泳動したHindIII 消化ラムダＤＮＡ断片（０．５
μｇ／レーン）をナイロン膜に転写し、サケ精子ＤＮＡ
でプレハイブリダイゼーションを行った。次にこのナイ
ロン膜を各レーンに添って切り、３枚の短冊を用意し
た。各々、非照射コントロール、一定振幅の超音波（２
８ｋＨｚ、〜８Ｗ）照射、および脈動超音波（３８ｋＨ
ｚ、６Ｗ）照射サンプルとして図１に示した核酸検出用
機器内でハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブ
リダイゼーションのプローブには実施例１と同様なもの
を用い、同条件で４分間反応を行い、同条件で洗浄、発
光反応を行った。なお、脈動超音波は、超音波発振子の
印加電圧を６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動
子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発
生した脈動超音波である。その結果を図３に示す。図３
において、レーン１は非照射コントロール、レーン２は
連続波超音波照射サンプルおよびレーン３は脈動超音波
照射サンプルを示す。レーン２および３では矢印で示し
た２４ｋｂと４．４ｋｂの断片が明確にバンドとして検
出され、非照射コントロールと比べ、感度が向上してい
ることがかわった。
ングへの応用 サザーンブロティングへの脈動超音波の効果の検討は、
アガロースゲルからＤＮＡを転写したナイロン膜を用い
て行った。常法に従い、アガロースゲル（０．７％）上
で電気泳動したHindIII 消化ラムダＤＮＡ断片（０．５
μｇ／レーン）をナイロン膜に転写し、サケ精子ＤＮＡ
でプレハイブリダイゼーションを行った。次にこのナイ
ロン膜を各レーンに添って切り、３枚の短冊を用意し
た。各々、非照射コントロール、一定振幅の超音波（２
８ｋＨｚ、〜８Ｗ）照射、および脈動超音波（３８ｋＨ
ｚ、６Ｗ）照射サンプルとして図１に示した核酸検出用
機器内でハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブ
リダイゼーションのプローブには実施例１と同様なもの
を用い、同条件で４分間反応を行い、同条件で洗浄、発
光反応を行った。なお、脈動超音波は、超音波発振子の
印加電圧を６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動
子の振幅を経時的に変化させる振幅変調方式によって発
生した脈動超音波である。その結果を図３に示す。図３
において、レーン１は非照射コントロール、レーン２は
連続波超音波照射サンプルおよびレーン３は脈動超音波
照射サンプルを示す。レーン２および３では矢印で示し
た２４ｋｂと４．４ｋｂの断片が明確にバンドとして検
出され、非照射コントロールと比べ、感度が向上してい
ることがかわった。
【００３５】実施例３ 脈動超音波の核酸ハイブリダイ
ゼーションのための至適出力 脈動超音波を発生する振幅変調方式には２通りあり、半
波方式と全波方式がある。それぞれの方式で至適出力を
求めた。核酸ハイブリダイゼーションは実施例２と同様
に行ったが、得られたＸ線フィルム上のバンドをゲルス
キャナーで定量した。結果を図４に示す。縦軸はコンピ
ューター画像の濃淡の相対値であり、したがってハイブ
リダイゼーション強度を表す。横軸はワット数を示す。
半波および全波方式ともに６Ｗ近傍でコンピューター画
像の濃淡の相対値（ドット数）が最大値を示し、いずれ
の方式でもほぼ同等の結果が得られた。ハイブリダイゼ
ーションは用いるプローブによって反応温度が定まり
（Ｔｍ−２５℃、通常、６５℃が汎用される）、超音波
を照射しない場合であって、熱を加えると寧ろ、反応条
件は悪くなる。但し、上述の超音波出力、時間ではキャ
ビテーションによる熱発生はほぼ無視できる。
ゼーションのための至適出力 脈動超音波を発生する振幅変調方式には２通りあり、半
波方式と全波方式がある。それぞれの方式で至適出力を
求めた。核酸ハイブリダイゼーションは実施例２と同様
に行ったが、得られたＸ線フィルム上のバンドをゲルス
キャナーで定量した。結果を図４に示す。縦軸はコンピ
ューター画像の濃淡の相対値であり、したがってハイブ
リダイゼーション強度を表す。横軸はワット数を示す。
半波および全波方式ともに６Ｗ近傍でコンピューター画
像の濃淡の相対値（ドット数）が最大値を示し、いずれ
の方式でもほぼ同等の結果が得られた。ハイブリダイゼ
ーションは用いるプローブによって反応温度が定まり
（Ｔｍ−２５℃、通常、６５℃が汎用される）、超音波
を照射しない場合であって、熱を加えると寧ろ、反応条
件は悪くなる。但し、上述の超音波出力、時間ではキャ
ビテーションによる熱発生はほぼ無視できる。
【図１】核酸ハイブリダイゼーション反応のための機器
である。
である。
【図２】ナイロン膜をラムダＤＮＡ溶液に浸漬し、反応
させ、プレハイブリを行った後、超音波によりハイブリ
ダイゼーションを行った結果を示す図である。
させ、プレハイブリを行った後、超音波によりハイブリ
ダイゼーションを行った結果を示す図である。
【図３】脈動超音波を用いてサザーンブロティングを行
った結果を示す電気泳動図に代わる写真である。
った結果を示す電気泳動図に代わる写真である。
【図４】脈動超音波の核酸ハイブリダイゼーションのた
めの至適出力を調べた結果を示す図である。
めの至適出力を調べた結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 29/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (14)
- 【請求項１】 振幅が変調された超音波を照射しなが
ら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは
該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させること
を特徴とする核酸ハイブリダイゼーション反応方法。 - 【請求項２】 振幅が変調された超音波が、超音波発振
子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に
変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調
方式によって発生した脈動超音波である請求項１記載の
核酸ハイブリダイゼーション反応方法。 - 【請求項３】 超音波発振子の印加電圧を５０または６
０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経
時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超
音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である
振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１
０分間照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび
(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核
酸を反応させることを特徴とする核酸ハイブリダイゼー
ション反応方法。 - 【請求項４】 振幅が変調された超音波を照射しなが
ら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは
該ＤＮＡに相補的な配列を有する核酸を反応させ、次い
で生成した反応生成物を測定することを特徴とする試料
中の核酸を検出する方法。 - 【請求項５】 振幅が変調された超音波が、超音波発振
子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に
変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調
方式によって発生した脈動超音波である請求項４記載の
核酸を検出する方法。 - 【請求項６】 超音波発振子の印加電圧を５０または６
０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を経
時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動超
音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波である
振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜１
０分間照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび
(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡに相補的な配列を有する核
酸を反応させ、次いで生成した反応生成物を測定するこ
とを特徴とする試料中の核酸を検出する方法。 - 【請求項７】 水槽および超音波振動子または乾式ホー
ン型振動子、ヒーター、温度制御装置、攪拌子、反応用
プラットホーム、反応容器固定装置および振幅変調回路
を具備する超音波発振器を有する核酸ハイブリダイゼー
ション反応を実施するための機器。 - 【請求項８】 振幅が変調された超音波を照射しなが
ら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは
該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させることを特徴とする
核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法。 - 【請求項９】 振幅が変調された超音波が、超音波発振
子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的に
変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変調
方式によって発生した脈動超音波である請求項８記載の
核酸−タンパク質ハイブリダイゼーション反応方法。 - 【請求項１０】 超音波発振子の印加電圧を５０または
６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を
経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動
超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波であ
る振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜
１０分間照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび
(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ
ることを特徴とする核酸−タンパク質ハイブリダイゼー
ション反応方法。 - 【請求項１１】 振幅が変調された超音波を照射しなが
ら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび(b) 該ＲＮＡまたは
該ＤＮＡ結合タンパク質を反応させ、次いで生成した反
応生成物を測定することを特徴とする試料中の核酸結合
タンパク質を検出する方法。 - 【請求項１２】 振幅が変調された超音波が、超音波発
振子の印加電圧を５０または６０サイクル／秒で脈動的
に変化させ、振動子の振幅を経時的に変化させる振幅変
調方式によって発生した脈動超音波である請求項１１記
載の試料中の核酸結合タンパク質を検出する方法。 - 【請求項１３】 超音波発振子の印加電圧を５０または
６０サイクル／秒で脈動的に変化させ、振動子の振幅を
経時的に変化させる振幅変調方式によって発生した脈動
超音波であって、２０〜４０ＫＨｚ振幅変調超音波であ
る振幅が変調された超音波を電力１〜１０Ｗにて、２〜
１０分間照射しながら、(a) ＲＮＡまたはＤＮＡおよび
(b) 該ＲＮＡまたは該ＤＮＡ結合タンパク質を反応さ
せ、次いで生成した反応生成物を測定することを特徴と
する試料中の核酸結合タンパク質を検出する方法。 - 【請求項１４】 水槽および超音波振動子または乾式ホ
ーン型振動子、ヒーター、温度制御装置、攪拌子、反応
用プラットホーム、反応容器固定装置および振幅変調回
路を具備する超音波発振器を有する核酸ハイブリダイゼ
ーション反応を実施するための機器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26180096A JP3959652B2 (ja) | 1996-10-02 | 1996-10-02 | 超音波を利用する核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26180096A JP3959652B2 (ja) | 1996-10-02 | 1996-10-02 | 超音波を利用する核酸ハイブリダイゼーション反応方法およびそのための装置 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004017062A1 (fr) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Tsinghua University | Procede et dispositif accelerant l'hybridation moleculaire au moyen d'ultrasons |
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| WO2011013123A1 (en) * | 2009-07-28 | 2011-02-03 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Ultrasound assisted immunoassay |
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1996
- 1996-10-02 JP JP26180096A patent/JP3959652B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| WO2004017062A1 (fr) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Tsinghua University | Procede et dispositif accelerant l'hybridation moleculaire au moyen d'ultrasons |
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