JPH0968525A - 核酸分子の分析方法及び装置 - Google Patents
核酸分子の分析方法及び装置Info
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Abstract
法では、泳動板の作成→電気泳動→染色等の非常に手間
のかかる工程が必要となり、また、超遠心法による分析
は巨大分子の分離にしか適用できず、液体クロマトグラ
フィーは非常に小さい分子しか適用できなかった。 【解決手段】 核酸分子を含む試料液を、試料液と同容
量の例えばイソプロパノールと混合操作して、核酸分子
を不溶化させる。その不溶化核酸分子の溶液を反応部1
に入れ、送液ポンプ2を作動させ、フローセル3に溶液
を導入する。フローセル3に光源4からの光を照射し
て、不溶化核酸分子からの散乱光を側方散乱光センサ6
および後方散乱光センサ7で検出する。
Description
等を分析する方法および装置に関する。なお、本発明
は、塩基配列決定など核酸分子の大きさ等を調べるあら
ゆる分野に利用できる。
で、タンパク質と結合した状態で細胞中に見いだされ
る。特にDNAは、遺伝情報の貯蔵庫、細胞内でのタン
パク質合成の鋳型(テンプレート)の機能を有し、従来
よりその分子の大きさ等が分析されていた。これまで主
に行われていたのは、電気泳動による分析である。この
方法による分析を行うためには、先ず泳動板の作成から
始める必要がある。ゲルとして例えばポリアクリルアミ
ドゲルを用いる場合は、一対のガラス板の間にポリアク
リルアミド、少量の架橋剤、触媒を入れて重合を行い、
泳動板(ゲル板)を作る。泳動板完成後、核酸溶液を泳
動板に付し、電極槽を設置して泳動板に高電圧を印加す
る。高電圧印加により、核酸は分子量の大きさに応じた
異なる速度で泳動がされ、泳動マップを染色等して分子
量の大きさを検出する。
子が巨大である場合(分子量60万以上)には、超遠心
法による分離・定量を、核酸分子が非常に小さい場合
(分子量3万以下)には、液体クロマトグラフィーによ
る分離・定量が行われていた。
手法のうち電気泳動法では、泳動板の作成→電気泳動→
染色等の非常に手間のかかる工程が必要となり、迅速に
核酸分子の大きさを決定できなかった。また、超遠心法
による分析は巨大分子の分離にしか適用できず、液体ク
ロマトグラフィーによる分析は非常に小さい分子の分離
しか適用できなかった。
規な方法で核酸分子の大きさ等を分析する方法および装
置を提供することを目的とする。
決するため、散乱分光法により核酸分子の大きさ等を分
析する。すなわち、本発明は、核酸分子を不溶化した
後、該不溶化核酸分子に光を照射してその散乱光を測定
することからなる核酸分子の分析方法を提供する。
いずれであってもよく、そのDNA等も、生体由来の試
料(たとえば、動物由来の組織、血液、髄液、唾液、
乳、尿、糞便等または植物由来の根、茎、葉、花、実
等)、環境試料(土壌、水等)または食品(肉、牛乳、
卵等)等に含まれるウィルス、細菌、細胞等あらゆるも
のから採取されるものを含む。
パノール、ポリエチレングリコール、エタノールなどを
共存させて行う。不溶化させる溶液は、上記のものに限
定されず、核酸分子の沈殿物を作るものならば何でもよ
い。不溶化工程は、上記試料に直接不溶化のための溶液
を加えてもよいが、夾雑物が多い場合、試料中の夾雑物
を除去し、DNA等を分離・精製してから行うのが好ま
しい。DNA等の分離・精製は、一般的には酵素や界面
活性剤による試料の処理後、フェノール・クロロホルム
による抽出により行われる。不溶化により、核酸分子は
その大きさに応じて沈殿物のサイズが異なり、その沈殿
物のサイズを計測すれば核酸分子の大きさがわかる。な
お、生成する不溶化核酸分子の直径は、50nm〜20
0nm前後である。
ルに入れ、光を照射して行う。試料セルは静止セルタイ
プ、フローセルタイプのいずれでも良いが、連続測定の
ためにはフローセルタイプが好ましい。光源は、半導体
レーザー、ガスレーザー、水銀ランプ、タングステンラ
ンプなど紫外・可視領域の波長を持つものを用いる。検
出器は、例えば、光電管、シリコンホトセルなどを、散
乱光測定位置(側方、後方等)に配置したもの、複数の
素子をリング状に並べた検出素子などを用いることがで
きるが、これらに限定されない。検出する散乱光は、側
方、後方等に限定されず、全方位を検出してもよい。全
方位散乱光を検出する場合は、試料セルの周囲に積分球
などを配設して、散乱光を集める。
酸分子を不溶化する反応部と、該反応部の不溶化核酸分
子を試料セルに送る送液ポンプと、試料セルに送られた
不溶化核酸分子に光を照射する光源部と、試料セルから
の散乱光を検出する検出部とからなる。
いて説明する。図1が本発明の方法を実施する装置の一
例で、図中1が反応部、3がフローセルである。この反
応部1は、上部が開放された漏斗状の容器からなり、こ
の中に核酸分子を含む試料溶液、核酸分子を不溶化させ
る溶液を入れ、核酸分子を不溶化(沈殿化)させる。な
お、反応部1には、既に別の容器で核酸分子を不溶化さ
せてから、その液を入れてもよい。不溶化は例えば、試
料溶液と同容量のイソプロパノールを混合操作すること
により行う。混合操作は、撹拌棒を容器に入れモータ等
で回転させたり、マグネチックスターラーなどで行う。
ための送液配管S1 が挿入されており、配管S1 はフロ
ーセル3の入口に接続される。また、フローセル3の出
口には、不溶化核酸分子を回収するための回収配管S2
が接続されており、この配管S2 も反応部1に挿入され
ている。したがって、不溶化核酸分子は、反応部1とフ
ローセル3間を循環することになる。なお、この循環は
送液ポンプ2により行われる。
材料からなり、このフローセル3の一面側には、光源4
が配置される。この光源4は、例えば半導体レーザから
なり、集光レンズ5により集光されてフローセル3に照
射される。フローセル3の側方および後方には、側方散
乱光センサ6および後方散乱光センサ7が配設されてお
り、フローセル3中の不溶化核酸分子により生じる側方
散乱光および後方散乱光が検出される。側方散乱光セン
サ6および後方散乱光センサ7の出力は、アンプおよび
A/D変換器8、インターフェース9を介してコンピュ
ータ10に取り込まれる。コンピュータ10では、核酸
分子の大きさが算出される。
の様に行う。先ず、核酸分子を不溶化するため、試料液
と同容量のイソプロパノールを混合操作する。次いで、
不溶化核酸分子の溶液を反応部1に入れ、送液ポンプ2
を作動させる。溶液はフローセル3に導入され、光源4
からの光が照射されて側方散乱光センサ6および後方散
乱光センサ7で側方散乱光および後方散乱光が検出され
る。
強度と散乱断面積の積に比例し、散乱断面積は不溶化核
酸分子の直径に比例する。従って、照射光強度が一定で
あれば、散乱光強度から不溶性核酸分子の直径が推定で
きる。すなわち、予め核酸分子の大きさ(直径等)の分
かっている標準試料を用いて、核酸分子の大きさ対不溶
性核酸分子の直径の検量線を作成しておけば、この検量
線から核酸分子の大きさが求まる。この核酸分子の大き
さの算出はコンピュータ10で行われる。
在すれば、出力はその加算されたものになるので、試料
液は十分に希釈したものを使用する。また、散乱光強度
は送液されるサンプルについて逐次測定し、散乱光強度
(又は核酸分子の大きさ)のヒストグラムを作成する。
・手間を取らせずに、迅速に核酸分子の大きさを分析で
きるとともに、その分析できる大きさも超遠心法等のよ
うに限定されない。
Claims (2)
- 【請求項1】 核酸分子を不溶化した後、該不溶化核酸
分子に光を照射してその散乱光を測定することからなる
核酸分子の分析方法。 - 【請求項2】 核酸分子を不溶化する反応部と、該反応
部の不溶化核酸分子を試料セルに送る送液ポンプと、試
料セルに送られた不溶化核酸分子に光を照射する光源部
と、試料セルからの散乱光を検出する検出部とからなる
核酸分子の分析装置。
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Cole et al. | The Use of Ethidium Bromide in Detecting Banded DNA in Cesium Chloride-Polyacrylamide Gels |
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