JPH099971A - 新規な選択マーカー遺伝子ならびにリゾムコール・プシルスの形質転換系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ロイシン生合成系に関与する酵素をコードす
る新規な選択マーカー遺伝子、該遺伝子をベクターＤＮ
Ａに挿入してなる形質転換用プラスミド、該遺伝子及び
タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えプラスミ
ド、該組み換えプラスミドを用いて形質転換したリゾム
コール・プシルス、ならびに該リゾムコール・プシルス
を培地に培養することにより、タンパク質を製造する方
法。 【効果】 本発明によれば、リゾムコール・プシルスを
遺伝子工学上の宿主細胞として利用することが可能にな
り、また、この形質転換系によって得られた形質転換体
を利用することにより、本菌自身の生産する各種有用タ
ンパク質の収量を上げることが可能となり、また、異種
の有用なタンパク質やペプチドの効率的な生産が期待さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、形質転換株の識別の指
標となりうるロイシン生合成系に関与する酵素をコード
する新規な選択マーカー遺伝子、該遺伝子をベクターＤ
ＮＡに挿入してなる新規な形質転換用プラスミド、該遺
伝子及びタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換え
プラスミド、該組み換えプラスミドにて形質転換したリ
ゾムコール・プシルス、該リゾムコール・プシルスによ
るタンパク質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糸状菌は、デンプン、タンパク質、脂
質、セルロース等を分解する各種酵素をはじめとする有
用なタンパク質を菌体外に多量に分泌していることが知
られており、古くからこれら有用酵素の生産菌として工
業的に利用されてきた。近年、このような糸状菌のタン
パク質分泌能力が注目され、遺伝子工学的手法によっ
て、産業上有用なタンパク質をコードする外来遺伝子を
糸状菌の菌体に導入することにより、異種のタンパク質
を菌体外に分泌・生産するような菌株を造成するとい
う、いわゆる菌株の分子育種の試みがなされるようにな
った。しかしながら、大腸菌などの細菌や酵母と異なり
糸状菌においては、自立複製型のプラスミドがほとんど
知られておらず、糸状菌を形質転換させ得るようなプラ
スミドや手法は種ごとに異なっている。さらに、多くの
糸状菌が胞子や菌糸などが多核細胞であるため、形質転
換細胞の単離が困難である等の理由により、糸状菌の高
い利用価値にも関わらず、分子育種のための手法として
の形質転換技術の開発は遅れている。

【０００３】一方、真菌の接合菌に属するリゾムコール
・プシルスRhizomucor pusillus(旧名 ムコール・プシ
ルスMucor pusillus)は、チーズ製造の際に凝乳酵素と
して用いる仔牛レンネットの代替酵素の生産菌として発
見された。現在では、リゾムコール・プシルスの生産す
るムコールレンネット(以下、MR)が凝乳酵素のかなりの
部分を占めるようになった。このように、リゾムコール
・プシルスは永く食品用の凝乳酵素の生産菌として使用
されてきたために、菌自体の安全性は広く認知されてい
る。また、ある種の菌は菌体外に強力な非特異的タンパ
ク質分解活性を持ったプロテアーゼを分泌するために、
生産された異種タンパク質が自身のプロテアーゼによっ
て分解されるという問題が生じた。これに対し、リゾム
コール・プシルスは、菌体外タンパク質中の非特異的タ
ンパク質分解活性が低いことが知られている。上記の理
由から、リゾムコール・プシルスは異種の有用なタンパ
ク質生産のための宿主としても優れた菌株であるといえ
る。

【０００４】糸状菌の形質転換を行った例としては、基
礎的な分子生物学の研究に重要なアスペルギルス・ニジ
ュランス [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1470 (1
984)] 、ノイロスポーラ・クラッサ [Mol. Cel. Biol.,
4, 117 (1984)] 、発酵工業や産業用酵素生産に重要な
アスペルギルス・オリゼ [Agrc. Biol. Chem., 51, 323
(1987)] 、トリコデルマ・リーセイ[Gene, 61, 155,
(1987)]、接合菌類としてはリゾプス・ニベウス[Curr.
Genet., 19, 221 (1991)]、ムコール・シルシネロイデ
ス[Carlsberg Res. Commun., 49, 691 (1984)]などが知
られている。

【０００５】一般に、プラスミドを形質導入し発現させ
るためには、形質転換株のみを識別できる選択マーカー
をプラスミドに組み込むことが必要である。その方法と
しては、(i) アミノ酸あるいは核酸要求性の相補、(ii)
ポジティブ選択マーカーとして、抗生物質などに対する
耐性遺伝子を利用する等が挙げられる。しかし、(ii)に
ついては、一般に接合菌は、子のう菌類等に比べて薬剤
に対して耐性であると言われており、形質転換体の選択
の際にバックグラウンドが高くなるので、より明瞭な形
質転換体の選択のためには(i) が好ましい。(i) の方法
では、あらかじめアミノ酸や核酸要求性変異株とその変
異を相補する遺伝子を取得することが必要である。一般
に糸状菌では細菌や、酵母などに比べて栄養要求性変異
株の取得が難しい。特に接合菌類では、菌糸に隔壁がな
く、胞子のう胞子が多核であるためにさらに取得が難し
い。

【０００６】栄養要求性形質転換マーカーとして現在ま
でに報告があった例として、アルギニン合成系のargB、
ロイシン合成系のleuA、トリプトファン合成系のtrpC、
ピリミジン合成系のpyrG等が挙げられる。これらマーカ
ー遺伝子には、種を越えて栄養要求性変異を相補しうる
ものもあるが、形質転換の際の形質転換頻度が極端に低
かったり、宿主染色体上に多コピーに挿入されてしまう
という理由から、宿主自身のマーカー遺伝子をクローニ
ングし、使用するのがより好ましい。これまで、リゾム
コール・プシルスと近縁であるムコール・シルシネロイ
デスにおいては、ロイシン要求性変異を相補するプラス
ミドが取得され、プラスミド上にのっている遺伝子が、
ロイシン生合成系のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ
をコードしていることが明らかになっている[Gene, 84,
335 (1989)]。

【０００７】しかしながら、リゾムコール・プシルス
は、前述の如く、遺伝子工学的手法により異種のタンパ
ク質を菌体外に分泌・生産する宿主として、また凝乳酵
素の生産菌として産業上有用でありながら、それの形質
転換系の確立、すなわちそのアミノ酸要求性変異株、な
らびにアミノ酸要求性変異を相補するプラスミドの取得
には至っていないのが現状である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、リゾムコール・プシルスのための形質転換系、
すなわち形質転換株のみを識別できる選択マーカー遺伝
子、ならびに該遺伝子をベクターＤＮＡに挿入してなる
形質転換用プラスミド、該遺伝子及びタンパク質をコー
ドする遺伝子を含む組み換えプラスミドを提供すること
にある。本発明のさらなる課題は、上記組み換えプラス
ミドを用いて形質転換したリゾムコール・プシルス、な
らびに該リゾムコール・プシルスを培地に培養すること
により、タンパク質を製造する方法を提供することにあ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、栄養要求性変異株
の選択マーカー遺伝子として機能しうるロイシン生合成
系遺伝子を新規にクローニングし、これを組み込んだプ
ラスミドにてリゾムコール・プシルスのための形質転換
系を確立することに成功し、本発明を完成させるに到っ
た。

【００１０】すなわち、本発明は、実質的に配列番号１
の塩基配列を有することを特徴とするロイシン生合成系
に関与する酵素をコードする新規な選択マーカー遺伝子
である。本発明はまた、上記の選択マーカー遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入してなることを特徴とする新規な形
質転換用プラスミドである。本発明はまた、上記の選択
マーカー遺伝子及びタンパク質をコードする遺伝子を含
む組み換えプラスミドである。本発明また、タンパク質
が、同種タンパク質である上記の組み換えプラスミドで
ある。あるいは、本発明はまた、タンパク質が、異種タ
ンパク質である上記の組み換えプラスミドである。さら
に、本発明は、上記の組み換えプラスミドにて形質転換
したリゾムコール・プシルス（Rhizomucor pusillus)で
ある。さらにまた、本発明は、上記のリゾムコール・プ
シルスを培地に培養し、培養物からタンパク質を採取す
ることを特徴とするタンパク質の製造法である。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。 〔１〕 リゾムコール・プシルスのロイシン要求性変異
株の取得 リゾムコール・プシルスのロイシン要求性変異株の取得
については、Gene, 37, 207 (1985)記載のアスペルギル
ス・ニガーのアミノ酸要求性変異株の取得方法を改良し
て行うことができる。すなわち、ＵＶ，ＮＴＧ等を用い
てカビの胞子を生存率が数％になるように変異処理し、
それをアミノ酸を含まない液体最小培地で振とう培養
し、アミノ酸要求性を持たない胞子を出芽させ、出芽し
ない胞子を濾別するという方法である。濾別された未出
芽胞子をさらに最小培地で振とう培養し、濾過を繰り返
すことで生育にアミノ酸を要求する胞子を完全に分離す
ることが出来る。

【００１２】〔２〕 選択マーカー遺伝子の単離・同定 (1) ムコール・シルシネロイデスのイソプロピルリン
ゴ酸イソメラーゼ遺伝子のクローニング リゾムコール・プシルスからロイシン生合成系のイソプ
ロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードしている遺伝子を
クローニングするにあたり、公知のムコール・シルシネ
ロイデスのイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ遺伝子配
列 [Gene, 84, 335 (1989)]がプローブとして利用でき
る。まず、上記の遺伝子配列をもとにして例えばＰＣＲ
法を用いてムコール・シルシネロイデスの染色体ＤＮＡ
から該遺伝子をクローニングする。クローニングしたム
コール・シルシネロイデスのイソプロピルリンゴ酸イソ
メラーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子が、リゾムコール
・プシルスの染色体ＤＮＡに存在するかどうかは、ムコ
ール・シルシネロイデスのイソプロピルリンゴ酸イソメ
ラーゼ遺伝子をプローブにしてリゾムコール・プシルス
染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーションを
行い、そのシグナルの強度から知ることが出来る。

【００１３】(2) リゾムコール・プシルス染色体ＤＮ
Ａライブラリーの作製 リゾムコール・プシルスからロイシン生合成系のイソプ
ロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードする遺伝子を含む
染色体ＤＮＡを抽出する方法としては、公知のいずれの
方法もが使用できる。その例としては、Nucl. Acids Re
s., 14, 6 (1986)が挙げられる。

【００１４】その際、リゾムコール・プシルスとして、
（財）発酵研究所（ＩＦＯ）から入手可能なＩＦＯ４５
７８株、Faculty of Engineering, Hiroshima Universi
ty,Hiroshima, Japan から入手可能なＨＵＴ１１８６
等が利用できる。リゾムコール・プシルスを使用する際
には、例えばＹＰＤ液体培地 [1% Yeast extract/2%Bac
to peptone （以上、Difco 社製)/2% ブドウ糖] (pH4.
5) で培養したのを使用することができる。

【００１５】得られた染色体ＤＮＡは、例えばEcoRI と
BamHI で切断し、例えばpUC19 のEcoRI とBamHI 切断部
位に連結した後、大腸菌を形質転換することにより染色
体ＤＮＡライブラリーを作製することができる。

【００１６】使用し得るベクターとしては、大腸菌で自
立複製可能で選択マーカーを持つベクターであればいず
れでもよく、具体的には、プラスミドpUC19 以外に、pU
C18、pUC118、pUC119、pBR322等が挙げられる。ＤＮＡ
の制限酵素による処理は、BamHI の場合は、6mM MgCl₂
／6mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5）／60mM NaCl ／1mM ジ
チオスレイトール／50μg/ml BSA中で行い、EcoRI の場
合は、上記反応液のトリス塩酸緩衝液を100mM にした反
応液中で行う。pUC19 の切断は、10ngのpUC19 を上記反
応液中で37℃、1 時間、BamHI, EcoRIを10ユニット用い
て行う。染色体ＤＮＡ断片とpUC19 のライゲーション
は、30mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0）／7mM MgCl₂ ／1.2m
M EDTA／0.2mM ATP ／1OmM ジチオスレイトール／50mg
/ml BSA 中で、T4リガーゼ0.1 ユニットを用いて行う。

【００１７】(3) クローンの選抜 上記のようにして得られたプラスミドからイソプロピル
リンゴ酸イソメラーゼをコードしている遺伝子断片を含
むベクタープラスミドを選択するには、微生物、例えば
大腸菌に上記のプラスミドを導入して得られる形質転換
体を適当な手段により選抜すればよい。選択する方法と
しては、作成したライブラリーを保持する大腸菌のコロ
ニーをメンブランにトランスファーし、(1) でクローニ
ングしたムコール・シルシネロイデスのイソプロピルリ
ンゴ酸イソメラーゼ遺伝子をプローブとして、先に行っ
た染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション
でシグナルが検出された条件をもとにコロニーハイブリ
ダイゼーションを行う。このようにしてベクタープラス
ミドpUC19 にイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコー
ドする遺伝子が組み込まれたプラスミド（pRP1, pRP2,
pRP3, pRP4, pRP5) を有する形質転換体を得ることがで
きる。pRP1を用いて形質転換した大腸菌Ｋ１２株は、
は、E.coli K12 (pRP1) と命名し、工業技術院生命工学
研究所に平成７年６月１日に寄託されている（寄託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４９６７）。

【００１８】(4) 目的遺伝子（選択マーカー遺伝子）
の取得 上記のようにして得られるプラスミド（pRP1, pRP2, pR
P3, pRP4, pRP5) は、ベクタープラスミドpUC19 にリゾ
ムコール・プシルス染色体由来の4.4kb のEcoRI-BamHI
断片（イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ遺伝子）が挿
入されたものである。

【００１９】(5) 目的遺伝子（選択マーカー遺伝子）
の解析 上記の約4.4kb のＤＮＡ断片の塩基配列は、例えばエキ
ソヌクレアーゼを用いてデレーションシリーズを作成
し、ダイデオキシ法によって決定する（配列番号１）。
これまでにリゾムコール・プシルスのイソプロピルリン
ゴ酸イソメラーゼ遺伝子として報告がないことから、決
定された遺伝子配列を有する遺伝子は新規である。

【００２０】本発明における選択マーカー遺伝子の有す
る塩基配列は、配列番号１の塩基配列のほか、選択マー
カー遺伝子がコードするイソプロピルリンゴ酸イソメラ
ーゼがその活性を失うことない限り、配列番号１の塩基
配列の１もしくは複数の塩基が、付加、欠失もしくは置
換されていてもよい。

【００２１】〔３〕 組み換えプラスミドの構築 リゾムコール・プシルスを形質転換するためのプラスミ
ドは、上記で得られる選択マーカー遺伝子を、発現を所
望するタンパク質をコードする遺伝子と発現に必要なプ
ロモーターＤＮＡを含むプラスミドにライゲートするこ
とにより構築できる。タンパク質をコードする遺伝子の
発現については、pUC19 等にのっているプロモーターは
糸状菌では働かないので、一般の異種遺伝子発現用プロ
モーターを新たにつなげる必要がある。当該プロモータ
ーとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、エ
ノエノラーゼ等の解糖系酵素遺伝子、オルニチンカルバ
モイルトランスフェラーゼ、トリプトファンシンターゼ
等のアミノ酸合成系遺伝子、α−アミラーゼ、グルコア
ミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アセ
トアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子、あるいはナイト
レートレダクターゼ、オロチジン─５’−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酸
化還元酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。以上の
遺伝子は、糸状菌内で機能すれば特に限定されないが、
一般には糸状菌由来のものが用いられ、好ましくは、リ
ゾムコールプシルスのレンニン生産性遺伝子のプロモー
ターが挙げられる。

【００２２】プラスミドに挿入させ、発現させ得るタン
パク質は、同種タンパク質としてはムコールレンニン、
異種タンパク質としては、凝乳酵素である仔牛由来キモ
シン、他の動物、微生物由来のプロテアーゼ、アミラー
ゼ、セルラーゼ、リパーゼ等が例示される。

【００２３】具体的には、リゾムコール・プシルスにム
コールレンニンを発現させるプラスミド（pRP11)は、
[Nucl. Acids Res., 14, 6 (1986)] に記載されるムコ
ールレンニン生産性遺伝子を含むプラスミド(pCT113)と
pUC19 の両プラスミドを HindIII消化し、ライゲートす
ることにより得られたプラスミド（pFR005) のEcoRI 、
BamHI 消化部位にpRP1よりEcoRI 、BamHI 消化により得
られた断片をライゲートすることにより構築できる。

【００２４】〔４〕リゾムコール・プシルスの形質転換 上記で得られた組み換えプラスミドを用い、〔１〕で確
立したロイシン生合成系のイソプロピルリンゴ酸イソメ
ラーゼを欠損する変異株へ形質転換する方法としては、
糸状菌において一般に用いられている方法で可能であ
る。すなわち、細胞壁分解酵素によってプロトプラスト
化された菌体にマーカー遺伝子がのったベクターを添加
し、塩化カルシウムとポリエチレングリコール存在下で
プロトプラスト融合を起こさせてベクターＤＮＡを菌体
に取り込ませる。具体的には、フィコマイセス・プラケ
スリーアヌスで用いられているMol.Gen.Genet., 212, 1
20 (1988) 記載の方法を改良して用いる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何等限定す
るものではない。

【００２６】〔実施例１〕 〔１〕生育にロイシンを要求する変異株の取得 スクリーニングによってＭＲを生産する菌として単離さ
れたリゾムコール・プシルスＦ２７株と、ＩＦＯ４５７
８（＋）株をポテト・デキストロース寒天培地(Difco)
上に生育させ、37℃で３日から７日保温し、胞子を形成
させた。これらの胞子をスプレッダーを用いて、数mlの
0.01% トリオキシエチレン(80)ソルビタンモノラウレー
ト溶液（和光純薬工業社製）に懸濁し、懸濁液を3G2ガ
ラスフィルターで濾過し、胞子数をカウントした。それ
ぞれ２株の胞子懸濁液をガラスシャーレ中で撹拌しなが
らUVを照射し、死滅率を99%とした。UV照射後の胞子を
終濃度100 μg/mlのカザミノ酸または核酸を添加したポ
テト・デキストロース寒天培地にまいて、暗所で37℃７
日培養し、胞子を形成させた。0.01% トリオキシエチレ
ン(80)ソルビタンモノラウレート溶液でUVによる変異が
固定された株を含む胞子を回収し、数本のフラスコに入
れた50mlのYNB液体培地〔0.5% イースト・ナイトロジェ
ンベース w/oアミノ酸・硫酸アンモニウム（Difco社
製）／1.5% 硫酸アンモニウム／1.5% グルタミン酸ナト
リウム／10% グルコース (pH4.5)〕に分けて植菌し、37
℃、数時間振とう培養した。生育した菌糸を3G1ガラス
フィルターで濾過し、未出芽の胞子を集めた。その胞子
を同様にYNB液体培地に接種して37℃で振とう培養し、
数時間後に未出芽胞子を再び濾別し、菌糸の生育が見ら
れなくなるまで濾過・培養を繰り返した。最終的に得ら
れた胞子を数枚の、終濃度100 μg/mlのカザミノ酸また
は核酸を添加したYNB寒天培地(pH3.2)にまき、37℃、７
日間培養し、胞子を形成させた。生育したセクターの胞
子をピックアップし、各種アミノ酸・核酸を補ったYNB
寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地にそれぞれス
トリークして、各種培地での生育の可否を見た。このよ
うにして各種アミノ酸または核酸を生育に要求する変異
株を取得することが出来る。

【００２７】上記のような方法で、アミノ酸としてロイ
シンを要求する変異株がＦ２７から７株、ＩＦＯ４５７
８株より７株得られた。得られたロイシン要求性株の菌
体内イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を既知の方
法[Meth. Enzymol., 17A, 106 (1970)]で測定した。す
なわち、ロイシン要求性変異株と、対照のために親株で
あるＩＦＯ４５７８株を終濃度100 μg/mlのロイシンを
添加したYNB液体培地の100mlに接種し、37℃、24時間培
養する。菌体を3G1ガラスフィルターで集め、生理食塩
水で洗浄後、水分をとり、菌体1gあたり10mlの0.1M リ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し、超音波処理で菌
体を破壊した。15000rpm 10分間遠心し、上清を集め
た。5mgのプロタミン硫酸塩を添加し、15000rpm、10分
間遠心し、上清をとった。さらに上清の硫安分画を行
い、35〜65%の硫安沈殿画分を同リン酸緩衝液1mlにとか
し、活性測定に用いた。基質は0.1Mのβ- イソプロピル
リンゴ酸（和光純薬工業社製）を用い、反応は0.1M リ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中で、37℃、５分間行っ
た。反応液の組成は以下の通りである。 0.1M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0) 490 μl 0.1M β−イソプロピルリンゴ酸溶液 10 μl 細胞抽出液 100 μl

【００２８】反応の経過は、反応前と後の235nmの紫外
線吸光度を測定し、比較することでわかる。すなわち、
イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ活性を持つ野生株
は、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼの逆反応によっ
てβ−イソプロピルリンゴ酸から生じるジメチルシトラ
コン酸によるＵＶ吸収の増加が見られ、活性のない変異
株では、β−イソプロピルリンゴ酸は速やかに代謝され
るために、ＵＶ吸収の減少が見られる。このようにし
て、Ｆ２７から得られたロイシン要求性変異株７株の中
からロイシン生合成系のイソプロピルリンゴ酸イソメラ
ーゼを欠損する変異株を１株見いだし、菌株名をF-1株
とした。また、ＩＦＯ４５７８から得たロイシン要求性
株７株からも同様に１株見いだし、B49-7株とした。

【００２９】〔２〕選択マーカー遺伝子のクローニング (1) ムコール・シルシネロイデスのイソプロピルリンゴ
酸イソメラーゼのクローニング ムコール・シルシネロイデスＣＢＳ２７７．４９株よ
り、公知の方法[Carlsberg Res. Commun., 49, 691 (19
84)]で染色体ＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応のための上
流プライマーとして、 Prim.-1; 5'-ACGTACCTGCAGGATGGGACAAGG-3' 下流プライマーとして、 Prim.-2; 5'-ACGTACCTGCAGTAGCTGTTGATGT-3' をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン・バイオ
サーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反応は、Gene A
mp^TM Kit（パーキンエルマージャパン社製）を用い、サ
ーマルサイクラー（ＤＮＡ増幅装置）により行った。

【００３０】 反応溶液の組成は以下の通りである。 H₂O 74.0 μl (10×) Reaction buffer 10.0 μl dNTPs, Mix., 2.5mM 4.0 μl 上流プライマー Prim.-1 20μM 5.0 μl 下流プライマー Prim.-2 20μM 5.0 μl ムコール・シルシネロイデス染色体ＤＮＡ 1mg/ml 1.0 μl AmpliTaq^TMDNA ポリメラーゼ 1.0 μl

【００３１】ポリメラーゼ連鎖反応の条件は、以下の通
りである。 94℃ 1.0分 55℃ 1.0分 72℃ 5.0分 この条件で反応を５０サイクル行った後、さらに72℃で
５分間インキュベートした。

【００３２】反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動し、
増幅された約4.4kbのＤＮＡ断片をゲルから単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素PstI（宝酒造製 以
下、制限酵素は全て宝酒造製）で処理し、同じく同制限
酵素で処理したpUC19にクローニングし、pMC1を得た
（図１）。このクローニングされた遺伝子断片の制限酵
素の消化パターンは、既知のムコール・シルシネロイデ
スのイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ遺伝子[Gene, 8
4, 335 (1989)]と一致した。

【００３３】次にムコール・シルシネロイデスのイソプ
ロピルリンゴ酸イソメラーゼ遺伝子をプローブとしたリ
ゾムコール・プシルス染色体ＤＮＡのサザンハイブリダ
イゼーションを行った。リゾムコール・プシルスＩＦＯ
４５７８株の染色体ＤＮＡを既知の方法 [Nucl. Acids
Res., 14, 6 (1986)] で抽出し、各種制限酵素で消化
後、0.8%アガロースゲルで電気泳動し、アマシャム社製
のナイロンメンブランフィルターHybond N ⁺ に添付のプ
ロトコールに従って、同メンブランにトランスファーし
た。

【００３４】pMC1 を制限酵素HindIIIで消化し、1%アガ
ロースゲルで電気泳動し、イソプロピルリンゴ酸イソメ
ラーゼの構造遺伝子を含む約1.9kb断片を単離・精製し
た（図１）。

【００３５】次に、この断片をBcaBEST ^TMランダムプラ
イマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社製）とα−³²
P dCTP（アマシャム社製）を用いて放射ラベルし、これ
をプローブとしてアマシャム社のプロトコールに従って
サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ハ
イブリダイゼーションを42℃、40%ホルムアミド存在下
で行い、ハイブリダイゼーション後のメンブランの洗浄
を0.1 ×SSC、室温で行うという条件で、フィルム上に
強いシグナルが検出された。さらに、リゾムコール・プ
シルスの染色体ＤＮＡを制限酵素EcoRI, BamHIの両酵素
で消化したものについては、約4.4kbに一本のシグナル
が検出された。

【００３６】(2) リゾムコールプシルス染色体ＤＮＡラ
イブラリーの作成とコロニーハイブリダイゼーション リゾムコール・プシルスＩＦＯ４５７８株の染色体ＤＮ
Ａの100 μg を制限酵素EcoRIとBamHIの両酵素の300Uで
37℃、12時間反応させた。反応後、0.8%アガロースゲル
で電気泳動し、約4.4kb付近のＤＮＡバンドをエレクト
ロ・エリューション法で単離・精製した。得られたＤＮ
Ａフラグメントの一部を制限酵素EcoRIとBamHIの両酵素
で消化した100ngのpUC19と混合し、ＤＮＡライゲーショ
ンキット Ver.2（宝酒造製）を用い、添付のプロトコー
ルに従ってライゲーション反応を行った。16℃、12時間
ライゲーション反応を行い、反応液の一部を大腸菌K-12
株 JM109コンピタントセル（宝酒造製）に加え、添付の
プロトコールに従って形質転換を行い、アンピシリン添
加のLB寒天培地上にpUC19プラスミド上に外来ＤＮＡの
インサートを持つ約1000株の形質転換体を取得する事が
出来、これをリゾムコール・プシルス染色体ＤＮＡのサ
ブライブラリーとした。

【００３７】次に、リゾムコール・プシルス染色体ＤＮ
Ａのサブライブラリーである約1000個の大腸菌コロニー
を１株ずつ数枚のアンピシリン添加のLB寒天培地上に植
菌してならびかえ、37℃、12時間培養してコロニーを形
成させた。寒天培地上のコロニーをナイロンメンブラン
フィルター Hybond N⁺ （アマシャム社製）に、添付の
プロトコールに従って菌体のトランスファー、メンブラ
ン上の溶菌、ＤＮＡの固定を行った。

【００３８】コロニーハイブリダイゼーションは、以下
の条件で行った。ＤＮＡが固定されたメンブランは、ハ
イブリダイゼーション溶液（6 ×SSC／5×デンハルト溶
液／0.5％ドデシル硫酸ナトリウム／40％ホルムアミド
／0.01M EDTA／100 μg/ml Yeast tRNA）中で、まず42
℃、２時間のプレハイブリダイゼーションを行い、その
後、ハイブリダイゼーション溶液に先に放射ラベルした
pMC1の制限酵素HindIII消化の約1.9kb断片をプローブと
して加え（5〜10ng/ml）、37℃、12時間ハイブリダイゼ
ーションを行った。反応後の洗浄は、まず、2 ×SSC／
0.1％SDS溶液中、室温、１時間行い、続いて0.1 ×SSC
／0.1%SDS溶液中、室温、１時間行った。その後、Ｘ線
フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行ったとこ
ろ、フィルム上に５個の強いシグナルが検出された。そ
れらのシグナルに相当するコロニー５株をマスタープレ
ートからピックアップし、200mlのLB液体培地 [1% Tryp
tone／0.5% Bacto peptone（Difco社製）／0.5%NaCl]
で培養し、アルカリ法でプラスミドＤＮＡを回収し、塩
化セシウム密度勾配遠心で精製し、100ng/μl の濃度に
なるようにTE緩衝液 [10mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0)／
1mMEDTA] に溶解した。これら５株のプラスミド名をpRP
1, pRP2, pRP3, pRP4, pRP5とし、以下に示すロイシン
生合成系のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼを欠損す
る変異株の形質転換実験で選択マーカー遺伝子として使
用した。

【００３９】(3) プラスミドによるリゾムコール・プシ
ルスの形質転換 ロイシン生合成系のイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ
を欠損する変異株であるF-1 株とB49-7株をポテト・デ
キストロース寒天培地上で37℃、７日間培養し、胞子を
形成させた。これらのプレートから、0.01% トリオキシ
エチレン(80)ソルビタンモノラウレート溶液数mlにスプ
レッダーを用いて胞子を分散させ、3G2ガラスフィルタ
ーで菌糸を取り除き、胞子数をカウントした。胞子懸濁
液から胞子数3 ×10⁸ 個を500ml坂口フラスコ中の50ml
のYPD液体培地 [1% Yeast extract／2% Bact peptone
(Difco社製)／2% グルコース (pH4.5)] に接種し、30℃
で９〜11時間振とう培養した。この際に培養液の一部を
サンプリングし、顕微鏡で菌の生育を観察し、胞子がス
ウェリング（膨張）を終了し、培養中の全ての胞子につ
いて菌糸の出芽がほぼ同時におきていることを確認する
必要がある。菌糸の出芽と成長が同調していないと、後
のプロトプラストの作成の際に、形質転換可能なプロト
プラストの収量の低下を引き起こすことがわかった。形
質転換可能なプロトプラストの調節に好適な細胞を得る
ためには、培養温度の維持と培養時間の調節がきわめて
重要であった。培養液を1500rpm、５分間遠心して出芽
してすぐの若い菌糸を集めた。この菌体を20mlの0.5M
ソルビトール溶液に再び懸濁し、遠心、洗浄を二回繰り
返した。この洗浄菌体を1500rpm、５分間遠心し、５ml
のプロトプラスト化緩衝液 [0.5M ソルビトール／10mM
リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.7)]に懸濁した。

【００４０】この懸濁液に、同プロトプラスト化緩衝液
に溶解した溶菌酵素溶液 [100mg/mlノボザイム２３４
(ノボ・ノルディスク社製）／60mg/ml キチナーゼ（シ
グマ社製）／60mg/ml キトサナーゼ（和光純薬工業社
製）] ５mlを添加し、30℃、４時間緩やかに振とうし
た。この反応液を3G2ガラスフィルターで濾過し、フィ
ルターを0.5M ソルビトール溶液10mlで洗浄した後、濾
液を1500rpm、５分間遠心し、0.5Mソルビトール溶液 20
mlで沈殿物を２回洗浄した後、1500rpm、５分間遠心
し、形質転換緩衝液 [0.5M ソルビトール／25mM CaCl₂
／10mM トリス塩酸緩衝液(pH7.6)]に、プロトプラスト
濃度が1 ×10⁸/mlになるように懸濁し、プロトプラスト
溶液とした。

【００４１】プロトプラスト溶液の200 μl に、コロニ
ーハイブリダイゼーションによってクローニングした５
株のプラスミド溶液（100ng/μl ）10μl あるいは対照
として同濃度のpUC19プラスミドを10μl 加え混合後、
氷上に30分間静置した。さらに2.5mlのＰＥＧ溶液 [40%
PEG4000／25mM CaCl₂ ／10mM トリス塩酸緩衝液(pH7.
6)]を添加し混合後、室温に30分間静置した。

【００４２】この溶液に20mlの形質転換緩衝液を添加し
て混合後、1500rpm、５分間遠心し、同緩衝液5mlに再懸
濁した。この懸濁液1mlを、10mlの１％寒天と0.5M ソル
ビトールを含むYNB培地(pH3.2)からなるプレート上にの
せ、さらにあらかじめ48℃に保温しておいた１％寒天と
0.5M ソルビトールを含むYNB培地(pH3.2)10ml を重層
し、混合後固化させた。

【００４３】このプレートを37℃で４日程度保温する
と、F-1、B49-7両株のプロトプラストにpRP1, pRP2, pR
P3, pRP4, pRP5プラスミドを添加したサンプルはいずれ
もプレート上に幾つかのセクターが出現するが、pUC19
プラスミドを加えたサンプルに生育は見られなかった。
このうちF-1、B49-7両株にpRP1を加えて出現したセクタ
ーの５株をYNB寒天培地(pH4.5)に植え継ぎ、胞子を20%
グリセロールに懸濁して、これらをプラスミドpRP1によ
る形質転換体として−80℃で凍結保存した。

【００４４】さらにこれらのF-1、B49-7両株から得た形
質転換体５株をポテト・デキストロース寒天培地で選択
圧のない条件で植え継いで単胞子分離を繰り返した後、
再度YNB寒天培寒天培地で生育をみたが、４回の単胞子
分離の後も安定に形質を保持していた。

【００４５】次に、B49-7株のpRP1による形質転換体の
染色体ＤＮＡ上に挿入されていると思われる、pRP1プラ
スミドＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションによって
検出した。B49-7株のpRP1による形質転換体５株と親株
であるＩＦＯ４５７８株より公知の方法 [Nucl. Acids
Res., 14, 6 (1986)] で染色体ＤＮＡを抽出し、このＤ
ＮＡを制限酵素EcoRI、BamHIの両酵素で消化した。これ
を0.8%アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラ
ンフィルター Hybond N ⁺ （アマシャム社製）に添付の
プロトコールに従ってトランスファーし、BcaBEST ^TMラ
ンダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社
製）を用い、α−³²P dCTP（アマシャム社製）で放射ラ
ベルしたpUC19プラスミドをプローブとして、固定化し
た染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーション
を行った。その結果、形質転換体５株いずれにおいても
用いたＤＮＡプローブとハイブリダイズするpUC19プラ
スミドの全長に相当する約2.6kbのバンドが検出された
のに対し、親株のＩＦＯ４５７８においては検出されな
かった。これらの結果は形質転換体において、プラスミ
ドpRP1が導入され、その結果pRP1に含まれる遺伝子が発
現し、その遺伝子産物がロイシン生合成系のイソプロピ
ルリンゴ酸イソメラーゼの欠損を補ったために、アミノ
酸を含まない培地での生育が可能になったことを示す。
また、pUC19プラスミドでは形質転換体が得られないこ
とから、pUC19自身がコードしている遺伝子の産物には
変異を相補しうるものはなく、pUC19にクローニングさ
れた遺伝子断片中の遺伝子が変異の相補に関与している
ことを示している。

【００４６】(4) pRP1プラスミドに含まれる約4.4kb遺
伝子断片の全塩基配列の決定 pRP1（図２）は、以下に示す数種類に制限酵素で消化し
た後、1％アガロースゲルで電気泳動した。これから以
下に示す大きさのバンドを回収し、回収した断片と同じ
制限酵素で消化したプラスミドpBluescript II KS
⁺ （東洋紡績社製）にサブクローニングした。 PstI; 約 1.7, 1.3, 0.6kbの３つの断片（それぞれプラ
スミドpP1, pP2, pP3とした） SalI; 約 1.4, 1.0kbの２つの断片（それぞれプラスミ
ドpS1, pS2とした） EcoRI, SalI; 約 1.9kbの断片（プラスミドpES1とし
た）

【００４７】以上に示した計６断片をサブクローニング
したプラスミド６種類のＤＮＡをアルカリ法で抽出し
た。これをキロシーケンス用ＤＮＡデレーションキット
（宝酒造製）を用いてサブクローニングした断片の両方
向からデレーションされるような制限酵素でプラスミド
を消化した後、キット添付のプロトコールに従って、そ
れぞれのプラスミドについて両末端からデレーションシ
リーズを作成した。デレーション反応後のプラスミド
は、平滑末端化後、分子内ライゲーションさせ、大腸菌
K-12株JM109コンピタントセルに形質転換させ、それぞ
れのプラスミドについて片方向50株ずつのクローンを任
意に選んでプラスミドＤＮＡをアルカリ法で抽出した。
一回のダイデオキシポリメラーゼ反応では、末端から約
200bpの解析が限界であるので、そのプラスミドをイン
サートの両側で切断する制限酵素、例えばBssHIIで消化
し、アガロースゲルで電気泳動してインサートの末端か
ら約200bpずつデレーションされ、例えば1.7kbのインサ
ートの場合には1500b、1300b、1100b、900b、700b、500
b、300b、100bの断片が生じるようなクローンを選択し
た。

【００４８】これら選択されたクローンをBcaBEST ^TMダ
イデオキシＤＮＡシーケンシングキット（宝酒造製）と
α−³²P dCTP（アマシャム社製）を用い、キット添付の
プロトコールに従ってポリメラーゼ反応を行い、変性ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動した後、Ｘ線フィルム
でオートラジオグラフィーを行い、遺伝子配列の解析を
行った。その結果、4388bpからなる遺伝子の全塩基配列
が決定された（図２、配列番号１）。この塩基配列か
ら、この遺伝子は新規な遺伝子であることがわかった。

【００４９】〔３〕リゾムコール・プシルスのレンニン
生産性増強株の取得 リゾムコール・プシルスへ、既にクローニングされてい
るレンニン遺伝子を新たに導入し遺伝子投与効果による
レンニン生産性増強株の取得を行った。まずリゾムコー
ル・プシルス・レンニン遺伝子を含むプラスミドpCT113
[Nucl. Acids Res., 14, 6 (1986)] を制限酵素HindII
Iで消化し、1.0%アガロースゲルで電気泳動し、レンニ
ン遺伝子を含む約4.4kbの断片を単離・精製した。制限
酵素HindIIIで消化しアルカリフォスファターゼ処理を
したpUC18にこの断片をクローニングし、これをpFR005
とした（図３）。次に、pRP1をEcoRI、BamHIの両酵素で
消化し、1.0%アガロースゲルで電気泳動後、約4.4kbの
断片を単離、精製し、この断片を制限酵素EcoRI、BamHI
の両酵素で処理したpFR005と混合し、ライゲーションキ
ット Ver.2（宝酒造製）を使用してライゲーションを行
い、プラスミドpRP11を得た（図４）。

【００５０】このpRP11を用いて、上記の方法でリゾム
コール・プシルスB49-7株を形質転換した。選択培地に
生育してきた形質転換体５株を任意に選択し、それぞれ
YNB寒天培地(pH4.5)で単胞子分離をして植え継いでから
胞子を回収し、試験管に入れたふすま培地 [小麦ふすま
1g／H₂O 0.8g／0.01g 硫酸アンモニウム] 1.8gに接種
し、加湿培養器で37℃、５日間培養した。また、同条件
で親株であるＩＦＯ４５７８株も培養した。

【００５１】培養後の試験管にふすまの重量の10倍の蒸
留水を加えて、４℃に一晩おいてレンニンを抽出する。
抽出液を軽く混合してから上清をとり、ポアサイズ0.45
μmのフィルターで濾過して菌体や培地成分を取り除い
た後、一部を−80℃に凍結保存する。

【００５２】この培養抽出液の10μl をSDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動し、分画されたタンパク質をニト
ロセルロースフィルターにトランスファーし、ウサギ抗
リゾムコール・プシルスレンニン血清でウエスタンブロ
ッティングを行った。解析の結果、抗体と反応するタン
パクの量はバンドのシグナル強度から親株であるＩＦＯ
４５７８より明らかにpRP11形質転換体の培養抽出液の
方が多く、２〜５倍のレンニンを生産していることがわ
かった。

【００５３】また、培養抽出液中の酵素の凝乳活性を定
量的に観測できるスキムミルク・アガロースプレートを
用いた既知の凝乳活性の検出方法 [Anal. Biochem., 14
6, 353 (1985)]を行った。その結果、プレート上に凝乳
によって形成されるハローの大きさや濃度からもpRP11
形質転換体の培養抽出液の凝乳活性が親株の２〜５倍に
なっていることがわかった。

【００５４】

【発明の効果】本発明を利用することにより、リゾムコ
ール・プシルスを遺伝子工学上の宿主細胞として利用す
ることが可能になり、また、この形質転換系によって得
られた形質転換体を利用することにより、本菌自身の生
産する各種有用タンパク質の収量を上げることが可能と
なり、また、異種の有用なタンパク質やペプチドの効率
的な生産が期待される。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：4388 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAATTCGCTC TACCCACTGC CAAACGATCA GAAAGAGTTA GACCGATTAC GCGTGTTCTA 60 CTATCTTTTG CGCTGGGCGT TTGGAGGGTA ATCAGCTCTA GTGCTGCCGC TGCTGCTGCT 120 GCGGACAAAT TTATGCTAAA GATATATACC TAGACTTATC ACTGCCCCAG TTGAACCGAA 180 ACTGCGCAAA GGCATACATG TGCTCAACGT AGGAGCTGGT CCAGGAATTT GGGTACGTTT 240 CAAAGCCAAG CAACAACAGC AACGTCAAGG ATTGCAATTG ATGATAAAAT GAAATTTCAA 300 ATCTTAGATC GGCCATCCGG TCATTGATAT GGCGCTAGAT TACAGTCGCT CCAAATTTGT 360 CACTGTAGAT ATCGCAGATC TCCTGCCATA TGATTTGTTA CCTCACATTC GCCACAAATT 420 ATCACCGCAA GCATCTGTCG TATCAGAATA TCTGCACCAG GAGAATAATG AGCAGTCGCA 480 ACAGCGGCAG CAAGCAACGT CCGAGACTAC GTCGTCAAGT AGCGCGTTTG AAGTAGAATC 540 TGGTGATCGT ATCGGTCAAC CTATGGGCAG GAACCACGAC GGGTTCACAC CAGTTCACCC 600 GGCCGTCCAA GAAATGCATG AAAAGCAGCA ACAGCAACAA TCATCTGAAT CTGCAGTCGA 660 TAATACCCTG AAACCGCCAC CGCCACTGTC AATAGATATA ACAACAACAC CACCAACGCG 720 CCGTGTATTT AAAAATCTTG ATGCATACAT AATGAACACT CAAGAGCAAC CACTCCCATT 780 CCCTGACAAC ACCTTTGATT TTGTTACGAT GCAACTTGTC ACAACTTCGT TTCGACGCGA 840 AAACTGGCCG AGCGTCATTC TTGAACTTGT GCGAGTAACG AAGCCTGGAG GATACATCCA 900 GCTGCTAGAT GTTGATTACC ACATCCAACC GCTAGGTCCT ATCGGACAAG CGTGGGAAGA 960 CGACAGTGAG TGTACAATAA TTGAGCTAGA ATCTGTTCTG TGACGCCCTG ATGTGTGTAT 1020 ATTTGTCACA TATAGTTTTG GAGAAAGTAG AGACAGAAAT GGGTCTAGCA CCTGGCATAT 1080 CTCGGCATTT TAAGTGGATA CTCGAATCGT TGGGCCTGGA AAACGTTCGA GATCGGAGGG 1140 TATCCATGCC AATTGGAGAA TGGGGTCTCG ATATCGGTAT CTTGTGGCAG CAAAACGTTG 1200 AAGCATTCGT GGAAGCGACG AGACCACTTG TTAGCCAAGG AACGCACGTA ACTCTAGAAG 1260 AATTAAAGGA GAGGTGGGCC AAGGTGATGG AAGAGCTGCA GGTTGTCAAG GCATTCAACA 1320 ATATTCATGC GGCGTGGGCT CGCAAACCGC GGGGAGGAGA CTTTGAACCT AACCGTGCTG 1380 TCTTTGATCA TCTACCAGAC CTAGCGCCAC CCTGCAGATG ATGGTCCTCA TTGATATATA 1440 CATATATATA TATATATATA TATATATATT ATGCTTTTTA CATATGTGTG TACAATTTTT 1480 AAGTATATCC ACTTCAGTTT TTTACCCAAC CATCTGGCAT CCAAAAAAAC AAATGCAGAT 1560 CAGGGCGAAC GGCGTTTTTG CGGGGAAAAT TTTCAACCGC GCTTGTCAGC GAAACAAGAT 1620 GGACATGTCC AATAATATTC CACAGTTCAT TTTGAGTCAC GACAGCAGAA AGGAGATATA 1680 TACTTTTTAA GTTTCTGTTT CAGCTACTTC TTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTTTCTCTTA 1740 AACCCCCTCC TCTTTCACTT AATGGGACGC ACGCTATACG ACAAAGTTTG GGACGACCAC 1800 GTCGTTGACC AACAAGAAGA CGGAACCTGC TTGATCTATA TCGACAGGCA TCTCGTGCAC 1860 GAAGTCACTA GTCCGCAGGC CTTTGAAGGT CTTCGCAACG CTGGTCGCAA GGTCCGTCGT 1920 CCGGACTGTA CCTTGGCAAC CGTCGACCAC AATATTCCCA CCACCCCACG CAAAAATTTC 1980 AAGAATGTGT CGACGTTTAT CCAAGAAGCC GACTCTCGTA CGCAGTGCGA GACGCTGGAA 2040 CACAACGTCA AGGAGTTTGG CCTGACATAC TTTGGCATGG ACGACAGCCG TCAAGGTATC 2100 GTGCACGTCA TTGGTCCTGA GCAAGGTTTC ACACTTCCCG GCTGCACTGT TAACTGCGGT 2160 GATTCGCACA CTTCTACCCA TGGTGCGTTT GGCGCTCTCG CATTCGGTAT CGGTACCTCT 2200 GAAGTAGAGC ATGTTTTGGC AACACAGACC CTCTTGCAAA AGAAGAGCAA GAACATGCGT 2280 GTCAAGGTCG ATGGCAAGTT GGCTCCCGGT GTGACCAGCA AGGATATCGT TCTGCACATC 2340 ATCGGTGTTA TCGGCACGGC TGGCGGCACG GGCTGCGTTA TTGAGTTTTG TGGATCAGCG 2400 TTCGAGCAAA TGTCAATGGA AGCTAGAATG TCCGTCTGCA ACATGTCTAT CGAAGCGGGT 2460 GCGCGTGCAG GCATGATTGC CCCTGATGAG ACTACATTCG AGTATATCCG TGGCCGACCT 2520 CTTGCACCAA CCGGCGCCGA GTGGGACAAA GCTGTCGAGT ACTGGCGATC TCTGCGCTCA 2580 GATCCCGACG CAAAGTACGA CGTGGATGTA TTTATCGACG CTGCTGACAT TGCACCTACC 2640 TTGACCTGGG GTACCAGTCC TCAGGATGTT GTTGCCATCA CCGGCACTAC CCCTGATCCC 2700 TCTACTGTCT CTGATCCTAT CCGTCGTCAG GCTATGGAGC GTGCTTTGGA TTACATCGGC 2760 TTGAAGCCCA ATACCCCTAT GCAGGAAGTC AAGATTGACA AGGTGTTCAT TGGAAGCTGC 2820 ACTAACTCTC GCATTGAAGA CTTGCGCGCA GCAGCAGCTA TCGCCAAGGG CCGCCACGTT 2880 GCTGACTGGG TGTATGCTAT GGTTGTCCCT GGATCTGGCC TTGTCAAGAA GCAAGCTGAG 2940 CAGGAAGGAT TGGACAGAAT TTTCAAGGAA GCTGGATTCG ACTGGCGCGA GGCAGGCTGT 3000 TCAATGTGTC TTGGTATGAA CCCTGATCAA CTGAAGCCTG GTGAGCGCTG TGCCAGTACA 3060 AGCAACCGTA ACTTTGAGGG TCGACAAGGC GCTGGAGGTC GTACTCACTT GATGAGCCCT 3120 GCCATGGCTG CTGCAGCAGC TGTCACTGGC TACTTCACCG ATGTTCGCAA ACTGACCCCC 3180 GCGCAGCAGG ACCGTCCTGC TTCTCCCACA CCCAAGAAGA TCGAGACCGA GCTGGAACCT 3240 CCAGTGGAAG ACCACGCCAA GGCTGCCGAC CAAGCTGACA TTGTTACCGA TGCTCCTGCC 3300 ACCGGTGCCA GCCCACCGAG CCCAGCACCC TCAGACGCGG CTGGTATGCC CAAGTTTACG 3360 ACTTTGCGCG GCTATGCAGC CCCGCTCGAC ATTGCCAACG TTGATACGGA TATGATTATT 3420 CCCAAGCAGT TCTTGAAGAC CATCAAGCGC ACCGGTCTCG GCACTGCTCT CTTCTACAAT 3480 ATCCGATTTG ATGGTGCCAC TGGCGAGGAG AACCCCGACT TTGTGCTGAA CCAGGAACCT 3540 TACCGCCAAT CTCGCATTCT TGTCTGCACC GGTCCCAACT TTGGATGCGG TAGCTCCCGC 3600 GAACACGCGC CCTGGGCATT CAACGACTTT GGCATCCGAT CGATCATTGC ACCTAGCTTT 3660 GCTGATATCT TTTTCAACAA CTGCTTCAAG AACGGTATGC TTCCCATCAC GTTGCCCCAA 3720 GACAAGGTCG AGATGTTGGC CGAGCACGCC AAGCAAAAGG CCGAACTCGA GGTCGATCTG 3780 GTCAACCAAG TCGTGCGCTA CCCTGGAGGC GAAGTACCCT TCGATGTCGA GCCTTTCCGC 3840 AAACACTGCC TCGTGAACGG TTTGGACGAT ATTGGTTTGA CGATGCAAAA GGCTGATCTC 3900 ATCGAGGCAT TCGAGGCAAA GCGGTCACAG ACCTGGCCCT GGTTGGATGG CAAGGATTAT 3960 GCCGGCAAGG CTACAAAGTT TACGCCCGTC GCAACAAACA CTGCAAAGAA GCAAAAGCTT 4020 GATTGGTAAA ATACAACTAA TTCCCATGTA ATTTTTTTTC CTTTTAAACA AAACAACAAA 4080 ATATACACAA GTTTTATTGT TTTCTTGTAA AATCAGACAT TGTAATTTTC AAAGGTATAA 4140 AAATTTTGCG AATGGTGTGT GTGTTTTTGA GTGTATATGT AGTGAAAAGC TATGACACAA 4200 GTAAAGGTAA AGAGAAAGAA AGAAAGAAAG GGCTTGCGGG TTGGTTTGTT TGTTAATTTA 4260 CTCAGTGCGC CAGAGGGAGT GAGCAGCATC GGGAGTCCAG GTAGGGTTGG AGGTGTGACC 4320 TTGGAGGCAG ACGTAGGTGC GGCCGTGGTA AGAGACGCGG TGCCAGCGGC GTAGGTGCTA 4380 CGGGATCC 4388

【図面の簡単な説明】

【図１】 ムコール・シルシネロイデスのイソプロピル
リンゴ酸イソメラーゼ遺伝子を有するプラスミドpMC1の
構造を示す。

【図２】 リゾムコール・プシルスのイソプロピルリン
ゴ酸イソメラーゼ遺伝子を有するプラスミドpRP1の構
造、ならびにリゾムコール・プシルスのイソプロピルリ
ンゴ酸イソメラーゼ遺伝子コード領域の制限酵素地図を
示す。

【図３】 ムコールレンニン生産性遺伝子を有するプラ
スミドpFR005の構築方法を示す。

【図４】 リゾムコール・プシルスにムコールレンニン
発現させるプラスミドpRP11 の構築方法を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に配列番号１の塩基配列を有する
   ことを特徴とするロイシン生合成系に関与する酵素をコ
   ードする新規な選択マーカー遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載の選択マーカー遺伝子をベ
   クターＤＮＡに挿入してなることを特徴とする新規な形
   質転換用プラスミド。
3. 【請求項３】 請求項１記載の選択マーカー遺伝子及び
   タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えプラスミ
   ド。
4. 【請求項４】 タンパク質が、同種タンパク質である請
   求項３記載の組み換えプラスミド。
5. 【請求項５】 タンパク質が、異種タンパク質である請
   求項３記載の組み換えプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項３〜５いずれかに記載の組み換え
   プラスミドにて形質転換したリゾムコール・プシルス
   （Rhizomucor pusillus)。
7. 【請求項７】 請求項６記載のリゾムコール・プシルス
   を培地に培養し、培養物からタンパク質を採取すること
   を特徴とするタンパク質の製造法。