JPH09510710A - ＮＦ−κΒ活性のプロテアソーム調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 動物の細胞をある種のプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、動物内のＮＦ−κＢの活性を調節する方法が本発明により開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＦ−κＢ活性のプロテアソーム調節 発明の背景 １．発明の利用分野 本発明はプロテアソーム機能又はユビキチン結合の阻害剤を利用してＮＦ−κ Ｂの細胞含有量及び活性を抑制する方法に関する。 ２．関連技術の説明 転写因子であるＮＦ−κＢ、及びこれと関連してタンパク質複合体を形成する その他の構成要素は、免疫応答又は炎症反応に関わる非常に多様な遺伝子群の調 節を行うにあたって中心的な役割を担っている（Grilli et al.，International Review of Cytology 143：1-62 (1993)参照）。例えばＮＦ−κＢは、軽鎖Ｉｇ −κ免疫グロブリン遺伝子、ＩＬ−２受容体α鎖遺伝子、Ｔ細胞受容体β鎖遺伝 子、及びＩ又はII型の主要組織適合性遺伝子のような数多くの免疫応答遺伝子の 発現に対して必要とされる。更にＮＦ−κＢは、炎症反応に関連する多くの遺伝 子、例えばＴＮＦ−α遺伝子及び細胞接着性遺伝子、Ｅ−セレクチン、Ｉ−ｃａ ｍ、ならびにＶ−ｃａｍなどの遺伝子にとって必要であることが判明している。 ＮＦ−κＢはまた、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、及びＩＦＮ−βなどの非 常に多くのサイトカイン遺伝子の発現に関しても必要とされる因子である。最後 にＮＦ−ＫＢは、ヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の発現に際しても必須の因 子である。 サイトゾルには、ＡＴＰを必要とし、細胞のタンパク質の、小ポリペプチドで あるユビキチン（「Ｕｂ」）への共有結合に関与している、可溶性のタンパク質 分解経路が存在する（Hershko et al.，A．Rev．Biochem．61：761-807(1992)、 及び Rechsteiner et al.，A.Rev．Cell．Biol．3：1-30(1987)参照）。その後 この結合タンパク質は、プロテアソームと呼ばれる、２０Ｓ分解粒子を含む２６ Ｓタンパク質分解性複合体によって加水分解される（Goldberg，Eur．J．Bioche m．203：9-23(1992)、及びGoldberg et al.，Nature 357：375-379(1992)参照） 。この多成分からなる系は、異常性の高いタンパク質及び短命の調節タンパク質 の分解を選択的に触媒することがわかっている。しかしながらこの系はまた、 成熟した網状赤血球内のほとんどのタンパク質の分解に対して（Boches et al. ，Science 215：978-980(1982)、及びSpenser et al.，J．Biol．Chem．257：14 122-14127(1985)参照）、増殖した繊維芽細胞内のほとんどのタンパク質分解に 対して（Ciechanover et al.，Cell 37：57-66(1984)、及びGronostajski et al .，J．Biol．Chem．260：3344-3349(1985)参照）、さらに、萎縮した骨格筋内の ほとんどのタンパク質分解に対して作用することが明らかになっている。 多くのタンパク質分解において、第１段階では、ＡＴＰを必要とする過程によ り、Ｕｂにそれらのタンパク質が結合する。続いてこのユビキチンが結合したタ ンパク質は、上述のような、２６Ｓプロテアソーム複合体として知られるＡＴＰ 依存性のタンパク分解複合体によって分解される。 ２６Ｓプロテアソーム複合体の精密な特徴については明らかではないが、１０ ００〜１５００ｋＤａ（２６Ｓ）の複合体は、ＣＦ−１、ＣＦ−２及びＣＦ−３ と呼ばれる三つの成分のＡＴＰ依存性の会合により、エネルギー枯渇状態の網状 赤血球の抽出物中に生成される（Ganoth，D．etal.，J．Biol．Chem．263：1241 2-12419(1988)参照）。プロテアソームと呼ばれる、真核細胞の細胞質及び核内 に存在している大きな多量体のプロテアーゼ（〜７００ｋＤａ）が、一成分（Ｃ Ｆ−３）である（Driscoll et al.，J．Biol．Chem．265：4789-4792(1992)、Ey tan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86：7751-7755(1989)、Orlowski，Bi ochemistry 29：10289-10297(1990)、及びRivett，Arch．Biochem．Biophys．26 8:1-8(1989)参照）。 プロテアソームは、ユビキチン依存性の細胞内タンパク質分解経路に必要な、 大きな２６Ｓのマルチサブユニットの細胞質粒子の触媒中心を形成していると考 えられる。（Driscoll et al.，J．Biol．Chem．265：4789-4692(1990)、Eytan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86：7751-7755(1989)、Hough et al. ，Biochemistry 262：8303-8313(1987)、McGuire et al.，Biochem．Biophys．A cta 967：195-203(1988)、Rechsteiner et al.，A．Rev．Cell．Biol．3：1-30( 1987)、Waxman et al.，J.Biol．Chem．262：2451-2457(1987)参照）。プロテア ソームはそれ自体ではユビキチンが結合したタンパク質を分解することはできな いが、２６Ｓプロテアソーム複合体のタンパク分解活性のほとんどはプロ テアソームによるものである。 ユビキチンが結合したタンパク質の分解に関与し、プロテアソームと複合体を 形成し、２６Ｓプロテアソーム複合体の一部であると考えられるＡＴＰ依存性プ ロテアーゼがもう一つ存在する。それは、ユビキチンに結合したタンパク質を急 速に分解する。このプロテアーゼはマルチパイン（multipain）と呼ばれるもの で筋肉内に見いだされ、ＡＴＰ−ユビキチン依存性の経路において必須の役割を 果たしている。 インビトロでマルチパインとプロテアソームとで形成される複合体は、網状赤 血球及び筋肉から単離された１５００ｋＤａのＵｂ−結合体、即ち分解酵素であ る２６Ｓタンパク分解複合体と非常に似ているか又は同一である。この複合体は 特徴的な２０〜３０ｋＤａのプロテアソームサブユニットと、マルチパイン中に 見出される６個の大きなポリペプチドを含む、多数のより大きなサブユニットと を含有している。形成された複合体には、４０〜１５０ｋＤａのポリペプチドが 少なくとも１０〜１２個含まれている。 プロテアソームのタンパク質分解活性を阻害するプロテアソームの４０ｋＤａ の調節タンパク質が、網状赤血球より精製されており、ＡＴＰ−結合性タンパク 質であることが示されている。そして、その放出により、タンパク分解が活性化 される。２５０ｋＤａの多量体（マルチマー）として存在している単離された調 節タンパク質はかなり不安定（４２℃において）である。それはＡＴＰ、又は非 加水分解性のＡＴＰアナログを加えることによって安定化することができるが、 精製された調節タンパク質はプロテアソーム作用を抑制するためにＡＴＰを必要 とせず、ＡＴＰａｓｅ活性を欠如している。この調節タンパク質は１５００ｋＤ ａのタンパク質分解性複合体の必須の構成要素に対応することがわかっている。 多くの特徴から、この調節タンパク質がＣＦ−２と同一であることが示されてい る。これらの発見は、この調節タンパク質が２６Ｓのプロテアソーム複合体のＡ ＴＰ依存性機構に関与していることを示唆している。 またサイトゾルには、内因的に合成された細胞性又はウイルス性タンパク質か ら抗原性のある粒子を生じる系もある（Moore et al.，Cell 54：777-785(1988) 、Morrison et al.，J．Exp．Med．163：903-921(1986)、Powis et al.，Nat ure 354：529-531(1991)、Spies et al.，Nature 351：323-324(1991)、Townsen d et al.，Cell 42 457-467(1985)、Townsend et al.，Nature 324：575-577(19 86)、Monaco et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．79:3001-3005(1982)、Mo naco，Immun．Today 13：173-179(1992)、Yewdell et al.，Adv．Immun．52：1- 123(1992)、Townsend et al.，J．Exp．Med．168：1211-1224(1988)参照）。間 接的な証拠により、プロテアソームに非常に似ており、そしてプロテアソームに おそらく同一であるタンパク質分解性粒子の役割が示唆されている（Goldberg e t al.，Nature 357：375-379(1992)、Monaco，Immun．Today 13：173-179(1992) 、Parham，Nature 348：674-675(1990)、Yang et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．U.S.A．89：4928-4932(1992)、Brown et al.，Nature 353：355-357(1991)参 照）。プロテアソームは、ＭＨＣクラスＩ抗原分子の細胞質におけるプロセシン グを担うことが示されている。。 ２０Ｓのプロテアソームは２０〜３０ｋＤａの異なる１５個のサブユニットか ら構成される。それは、疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸の カルボキシル基側において特異的切断を行う少なくとも３個の異なるペプチダー ゼを含んでいる（Goldberg et al.，Nature 357：375-379(1992)、Goldberg，Eu r．J．Biochem．203：9-23(1992)、Orlowski，Biochemistry 29：10289-10297(1 990)、Rivett et al.，Archs．Biochem．Biophys．218：１(1989)、Rivett et a l.，J．Biol．Chem．264：12,215-12,219(1989)、Tanaka et al.，New Biol．4 ：1-11(1992)参照）。これらのペプチダーゼはキモトリプシン様ペプチダーゼ、 トリプシン様ペプチダーゼ、及びペプチジルグルタミルペプチダーゼと呼ばれて いる。これらの活性がどのサブユニットによるものであるのかは不明であるが、 いくつかのｃＤＮＡコーディングサブユニットがクローニングされている（Tana ka et al.，New Biol．4：1-11(1992)参照）。 最近の研究では２０Ｓのプロテアソームが、その大きさ及びサブユニット組成 に関して、ＭＨＣが結合したＬＭＰ粒子と類似することが判明している（Drisco ll et al.，Cell 68：823(1992)、Goldberg et al.，Nature 357：375-379(1992 )、Matthews et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86：2586(1989)、Monaco et al.，Human Immunology 15：416(1986)、Parham，Nature 348：674-675 (1990)、Martinez et al.，Nature 353：664(1991)、Oritz-Navarette et al.， Nature 353：662(1991)、Glynne et al.，Nature 353：357(1991)、Kelly et al .，Nature 353：667(1991)、Monaco et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．7 9：3001(1982)、Brown et al.，Nature 353：355(1991)、Goldberg，Eur．J．Bi ochem．203：9-23(1992)、Tanaka et al.，New Biol．4：1-11(1992)参照）。 このプロテアソームのペプチダーゼを阻害する種々の阻害剤が報告されている （Dick et al.，Biochemistry 30：2725-2734(1991)、Goldberg et al.,Nature 357：375-379(1992)、Goldberg Eur．J．Biochem．203：9-23(1992)、Orlowski ，Biochemistry 29：10289-10297(1990)、Rivett et al.，Archs．Biochem．Bio phys．218：１(1989)、Rivett et al.，J．Biol．Chem．264：12,215-12,219(19 89)、Tanaka et al.，New Biol．4：1-11(1992)参照）。これらには、既知であ るキモトリプシン様プロテアーゼ及びトリプシン様プロテアーゼの阻害剤ととも に、チオール（即ちシステイン）及びセリンのプロテアーゼの阻害剤が含まれる 。また、プロテアソーム活性を阻害する内因性阻害剤もいくつか単離されている 。これらには、ヒトの赤血球から単離された２４０ｋＤａの阻害剤及び２００ｋ Ｄａの阻害剤（Murakami et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83：7588-75 92(1986)、及びLi et al.，Biochemistry 30：9709-9715(1991)参照）、及び精 製されたＣＦ−２（Goldberg Eur．J．Biochem．203：9-23(1992)参照）が含ま れている。当初放線菌類から単離された抗生物質である阻害剤（Aoyagi et al. ，Proteases and Biological Control,Cold Spring Harbor Laboratory Press， pp．429-454(1975)参照）の他に、例えばシマン（Siman）らによって開示された キモトリプシン様プロテアーゼの阻害剤（WO 91/13904参照）のような種々のペ プチドアルデヒド類が合成されている。 新規な分子を入手し、それらの阻害活性を試験することもできる。前記の文献 で示されているように、ある特定のプロテアーゼの阻害剤を入手するための種々 の方法が当技術分野で知られている。ペプチダーゼアッセイを用いて、化合物又 は抽出物のライブラリーを、阻害剤についてスクリーニングすることができる。 また、ペプチド及びペプチドによく似た分子を、プロテアーゼの基質について知 られている特徴に基づいて設計することもできる。例えば、プロテアーゼの触媒 部位と相互作用する可能性が高い基質のアナログを合成することが可能である（ 例えば、Siman et al.，WO91/13904及び、Powers et al.，in Proteinase Inhi bitors，Barrett et al．(eds)、Elsevier，pp．55-152(1986)を参照）。阻害剤 は、プロテアソームのキモトリプシン様活性を抑制するＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌ ｅｕ−Ｈ（Orlowski，Biochemistry 29：10289-10297(1990)、さらにKennedy an d Schultz，Biochemistry 19：349(1979)も参照）のような触媒の遷移状態にあ る安定なアナログ（遷移状態のアナログ阻害剤）であってもよい。 文献で報告されている種々の天然のプロテアーゼ阻害剤及び化学的なプロテア ーゼ阻害剤、又はそれらの阻害剤によく似た分子には、α−ジケトン又はα−ケ トエステル、ペプチドクロロメチルケトン類、イソクマリン類、ペプチドスルホ ニルフロライド類、ペプチジルボロネート類、ペプチドエポキサイド類、及びペ プチジルジアゾメタン類が含まれる（Angelastro et al.，J．Med Chem．33：11 -13(1990)、Bey et al.，EPO 363,284、Bey et al.，EPO 364,344、Grubb et al .，WO 88/10266、Higuchi et al.，EPO 393,457、Ewoldt et al.，Molecular Im munology 29(6)：713-721(1992)、Hernandez et al.，Journal of Medicinal Ch emistry 35(6)：1121-1129(1992)、Vlasak et al.，Journal of Virology 63(5) ：2056-2062(1989)、Hudig et al.，Journal of Immunology 147(4)：1360-1368 (1991)、Odakc et al.，Biochemistry 30(8)：2217-2227(1991)、Vijayalakshmi et al.，Biochemistry 30(8)：2175-2183(1991)、Kam et al.，Thrombosis and Haemostasis 64(1)：133-137(1990)、Powers et al.，Journal of Cellular Bi ochemistry 39(1)：33-46(1989)、Powers et al.，Proteinase Inhibitors，Bar rettoet al.，Eds.，Elsevier，pp．55-152(1986)、Powers et al.，Biochemist ry 29(12)：3108-3118(1990)、Oweida et al.，Thrombosis Research 58(2)：39 1-397(1990)、Hudig et al.，Molecular Immunology 26(8)：793-798(1989)、Or lowski et al.，Archives of Biochemistry and Biophysics 269(1)：125-136(1 989)、Zunino et al.，Biochimica et Biophysica Acta．967(3)：331-340(1988 )、Kam et al.，Biochemistry 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のペプチドα−ケトエステル阻害剤のうち、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃｏ ｏＥｔが、最も強いキモトリプシン様活性の阻害剤であり、Ｋｉ値は５３μＭで あった。このような化合物は多く存在する。 文献に記載されているこの他のトリペプチドとしては、ＡＣ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ｌｅｕ−Ｈ、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＯＲ、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｎｌｅ−ＯＲ、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＲ、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ａｒｇ−Ｈ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ、Ｚ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ− Ｈ、及びＺ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅが挙げられる。ここでＯＲは、元のアミノ 酸残基のカルボニル基に結合するエステル基を示している。 1991年5月13日に提出された米国特許出願番号07/699,184においてゴールドバ ー グ（Goldberg）は、重症の体重の減少、及び陰性の窒素バランスが起こっている ような状態、即ち疾病にかかった状態で起こる過度のタンパク質分解に対して、 ＡＴＰ−ユビキチン−依存性の過程が働くことが示されたことを開示している。 亢進または増強されたタンパク質分解を阻害する方法、この過程の阻害剤を検出 する方法、マルチパイン及びプロテアソームの阻害剤についても開示されている 。 1993年2月10日に出願された米国特許出願番号08/016,066において、ゴールド バーグ（Goldberg）は、主要組織適合性複合体クラスＩ分子による提示のための 抗原のプロセシングを阻害する方法及び薬物を開示している。特にＡＴＰ−ユビ キチン−依存性のタンパク質分解経路の阻害剤、すなわちＭＨＣ−Ｉ抗原の提示 を阻害する阻害剤が記述されている。これらの方法及び薬物は自己免疫疾患を治 療する目的で、又は臓器や組織の移植による拒絶反応を抑制する目的で用いるこ とができる。Michalek et al.，Nature 363:552-554(1993)も参照のこと。 Tsubuki et al.，Biochem．and Biophys．Res．Commun．196(3)：1195-1201(1 993)には、トリペプチドアルデヒドプロテアーゼ阻害剤であるベンジルオキシカ ルボニル（Ｚ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ロイシンアルデヒドが、最適濃度３０ｎＭで ＰＣ１２細胞における神経突起の生長を促すことが開示されている。以下に列挙 する合成ペプチドについても記述されている。Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈ 、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈ、Ｚ−Ｌ ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌ ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｈ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ、Ｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｌｅｕ−Ｈ、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ ．ｓｃ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ．ｏｌ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｄ ｎｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ、Ｄｎｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨ₂ Ｃｌ、及びロイペプチン。 シマン（Siman）ら（WO 91/13904）は、キモトリプシン様のプロテアーゼとそ の阻害剤を開示している。この阻害剤は一般式Ｒ−Ａ４−Ａ３−Ａ２−Ｙで示さ れる。ここで、 Ｒは、水素又はＮ−末端の保護基であり、 Ａ４は、共有結合をする一個のアミノ酸又は一個のペプチドであり、 Ａ３は、共有結合をする一個のＤ−アミノ酸、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、又 はＶａｌの保存アミノ酸置換体であり、 Ａ２は、一個の疎水性アミノ酸もしくはリジン、又はそれらの保存アミノ酸 置換体、又はＡ４が少なくとも二個のアミノ酸からなる場合にはＡ２はいかなる アミノ酸でもよく、 Ｙは、前記プロテアーゼの活性部位と反応する基である。 パワーズ（Powers）（WO 92/12140）はペプチドのケトアミド類、ケト酸類、 及びケトエステル類、及びセリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼの阻 害におけるそれらの使用を開示している。 バーツス（Bartus）ら（WO 92/1850）は、カルパイン阻害剤化合物群及びそれ らを含んでなる薬学的組成物の利用について記述している。これらの化合物の一 つの利用形態は、患者であるヒトにおける神経変性の病変を治療することにある 。この文献にはこの他の利用形態も記載されており、更に例えばペプチドケトア ミド類、ペプチドケト酸類、及びペプチドケトエステル類などのカルパイン阻害 剤化合物を含む薬学的組成物も開示されている。 発明の概要 本発明はＮＦ−κＢの細胞含有量及び活性を抑制する方法に関する。 好ましい態様において、本発明は、動物の細胞をプロテアソーム機能又はユビ キチン結合の阻害剤と作用させてその動物におけるＮＦ−κＢの細胞含有量及び 活性を抑制する方法に関する。 更に特定すると本発明は、動物の細胞をプロテアソーム機能又はユビキチン結 合の阻害剤であって、次の一般式（１）で示される阻害剤と接触させることによ り、前記動物におけるＮＦ−κＢの細胞含有量及び活性を抑制する方法を提供す る。 ここで、 Ｐは、アミノ基の保護基であり、 に選択され、 選択され、 Ｒは、水素、アルキル基、アシル基、又はカルボキシル基であり、 Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は、水素、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル 基、アルキニル基、アリル基、及び−ＣＨ₂−Ｒ⁵（ここでＲ⁵は、アリル基、ア ラルキル基、アルカリル基、シクロアルキル基、又は−Ｙ−Ｒ⁶であって、この Ｙはカルコゲン、そしてＲ⁶はアルキル基である。）からなる群よりそれぞれ独 立に選択され、そして Ａは、０又は１である。 なお、ここで述べた「動物」は、哺乳動物であることが好ましい。これらの用 語はいずれもヒトを含むと解釈される。 図面の簡単な説明 図１は、インビトロでｐ６０Ｔｔｈ前駆体をｐ５０にタンパク質分解する際に はＡＴＰが必要であることを示している。 図２は、活性ＮＦ−κＢの生成におけるユビキチンとプロテアソームの役割を 示す図である。 図３は、プロテアソームが枯渇した抽出物、及びプロテアソームが豊富な抽出 物におけるｐ１０５／ｐ６０Ｔｔｈのプロセシング（タンパク質分解）を示す図 である。 図４は、プロテアソームの免疫抑制がＮＦ−κＢのプロセシングを阻害するこ とを示している。 図５は、精製したプロテアソームがｐ６０Ｔｔｈのプロセシングを促進するこ とを示している。 図６は、ｐ６０Ｔｔh前駆体であるタンパク質がユビキチン化されていること を示している。 図７は、ユビキチンがＮＦ−κＢのプロセシングに必要であることを示してい る。 図８は、サツカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でのｐ１ ０５のプロセシングにプロテアソームが必要であることを示している。 図９は、プロテアソームの特異的阻害剤がインビボでのｐ１０５のプロセシン グを遮断することを示している。 図１０は、プロテアソームの特異的阻害剤がＮＦ−κＢの活性を抑制すること を示している。 好ましい態様の説明 ＮＦ−κＢはサイトゾル中においては、抑制タンパク質であるＩκＢと複合体 を形成して不活性型で存在している。ＮＦ−κＢが活性型になってその作用が発 揮されるためには、ＮＦ−κＢは細胞核の中に入る必要がある。しかしながらこ の複合体のＩκＢ部位を解離しなくては核内に移行することはできない。このＩ κＢ部位の解離を当業者は、ＮＦ−κＢの活性化、又はＮＦ−κＢのプロセシン グと呼んでいる。ある種の疾患では、ＮＦ−κＢの作用の正常な働きが患者の健 康にとって有害なものとなりうる。例えば前述したように、ＮＦ−κＢはヒトの 免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の発現に際して必須の因子である。従って、そのよ うな疾病を病んでいる患者ではＮＦ−κＢの活性化を抑える過程が治療上有効と なるはずである。本発明の実施に用いられる阻害剤はこの活性を抑制することが できる。このようにＮＦ−κＢの活性化又は生成を遮断することが、さまざまな 医学分野、例えば炎症、敗血症、ＡＩＤＳなどの疾患において重要な応用性を持 つに違いない。 更に特定すると、ＮＦ−κＢの活性は高度に調節されている（Grilli et al. ，International Review of Cytology 143：1-62(1993)、及びBeg et al.，Gene s and Development 7：2064-2070(1993)参照）。ＮＦ−κＢは二つのサブユニッ トからなる。それはｐ５０と、ｒｅｌ遺伝子ファミリーのもう一つのメンバー、 例えばｐ６５（ＲｅｌＡとしても知られている）である。大部分の細胞において ｐ５０とｐ６５とは、細胞質中にＩκＢに結合した不活性な前駆体の形で存在し ている。そしてＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットは、前駆体タンパク質である１ ０５ｋＤのＮＦ−κＢ₁（ｐ１０５）がタンパク質分解プロセシングされて生成 する。このプロセシングも調節下にある。ｐ１０５におけるＮ−末端の５０ｋＤ の部分の配列は、ｐ６５、及びｒｅｌ遺伝子ファミリーのその他のメンバーの配 列（ｒｅｌ相同ドメイン）と類似している。これに対してｐ１０５におけるＣ− 末端の５５ｋＤ部位は、ＩκＢ−α（ＭＡＤ３としても知られている）に著しく 似ている。重要な点は、プロセシングを受けていないｐ１０５が、ｐ６５及びｒ ｅｌファミリーの他のメンバーと会合して、ｐ６５／ｐ１０５のヘテロダイマー を形成できることである。ｐ１０５のプロセシングによりｐ５０が生成し、それ は転写活性のあるｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーを形成することができる。ｐ１ ０５におけるＣ−末端のＩκＢ−αに相同的な配列はプロセシングで急速に分解 される。 ｐ１０５に類似のもう一つのｒｅｌ関連タンパク質、ＮＦ−κＢ₂（ｐ１００ ）が存在し、これはＤＮＡ結合サブユニットであるｐ５２にプロセシングされる （Neri et al.，Cell 67：1075(1991)、Schmid et al.，Nature 352：733(1991) 、Bours et al.，Molecular and Cellelar Biology 12：685(1992)、Mercurio e t al.，DNA Cell Biology 11：523(1992)参照）。ｐ１００の構造上の特徴及び 調節上の特徴は多くの点でｐ１０５に似ている。また、ｐ１００タンパク質もｐ ６５及びその他のｒｅｌファミリーのメンバーとヘテロダイマーを形成すること ができる。 要約すると、ｐ５０と、多くのｒｅｌファミリータンパク質のうちの一つ、例 えばｐ６５とからなるヘテロダイマーの転写活性は、少なくとも二つの機構で調 節することができる。第一の機構では、このヘテロダイマーがＩκＢ−αと会合 することによって、不活性な三部分からなる細胞質複合体が形成される。第二で は、ｒｅｌファミリーのメンバーがｐ１０５ないしｐ１００と会合することによ って不活性な複合体が形成される。この三部分からなる複合体は、ＩκＢ−αを 分離して破壊することによって活性化される。これに対してｐ６５／ｐ１０５ヘ テロダイマー及びｐ６５／ｐ１００ヘテロダイマーは、それそれｐ１０５及びｐ １００を分解することによって活性化される。 ＩκＢ−αの解離は、極めて多くの細胞外シグナル、例えばリポポリサッカラ イド、ホルボールエステル、ＴＮＦ−α、それにさまざまなサイトカインなどに よって誘導される。その後でＩκＢ−αは急速に破壊される。最近の研究では、 ｐ１０５及びｐ１００のプロセシングも、これらの細胞外シグナルのうちの少な くともいくつかによって誘導されることが示唆されている。ＮＦ−κＢが活性化 されるまでのシグナル変換経路も、ＩκＢ−αの不活性化機構又はｐ１０５／ｐ １００プロセシングの機構もわかっていない。したがって本発明者らは、本発明 を実施する場合に用いられる阻害剤が有効な効果を奏するため機構について、い かなる理論によっても本発明が限定されることを望んでいるわけではない。本発 明者らは、２０Ｓ（コア部分）のプロテアソーム粒子上の疎水性部位を遮断する いくつかの阻害剤での効果についての明確な証拠を得てはいるが、しかし２６Ｓ プロテアソーム複合体の触媒中心を構成する、他の重要な部位がこの粒子に存在 することを認識する必要がある。したがって同様な作用が、プロテアソームの他 の重要な活性を阻害する阻害剤を用いても起こることが予測される。超遠心又は 免疫沈降によってプロテアソーム粒子を除去すると、ＮＦ−κＢの活性化が妨げ られる。この粒子にはこの他にも多くの触媒作用があるが、それらを遮断すれば 、ＮＦ−κＢをプロセシングする能力及び／又はＩκＢを破壊する能力が阻害さ れることも当業者には子測される。また、本発明の方法で用いられる阻害剤によ る効果は、ＮＦ−κＢ及び／又はＩκＢのユビキチン化の阻害によっても達成す ることが可能である。実際には本発明者らは、ユビキチン−複合体がそれらの分 解の際に要求されるということを見いだした。よって特異的なＥ−２ｓ又はＥ− ３ｓがＮＦ−κＢ及び／又はＩκＢのプロセシングで関与している可能性があり 、そこではＥ−１、Ｅ−２、又はＥ−３依存性のＵｂ−複合体の阻害剤がユビキ チン−プロテアソーム経路を遮断することによってＮＦ−κＢの活性化を阻止す ると推測することができる。 ｐ１０５又はｐ１０５を切断したもの（ｐ６０Ｔｔｈ）をインビトロでｐ５０ にプロセシングできることが示されている（Fan et al.，Nature 354：395-398( 1991)参照）。このインビトロにおけるプロセシング反応（例えば、ＡＴＰ／Ｍ ｇ⁺⁺依存性）の要件及び特徴のいくつかから、ユビキチン−仲介型タンパク質分 解経路のＡＴＰ−依存性プロテアーゼ複合体の関与が示唆された（即ちプロテア ソームである。Rechsteiner，1991，Goldberg，Eur．J．Biochem．203：9-23(19 92)、及びHershko et al.，Annu．Rev．Biochem．61：761-807(1992)参照）。し かしながらこの構造体は、タンパク質を完全に分解して小さな酸溶解性のペプチ ドにするのを触媒することがわかっているのみであって、例えばｐ５０ ＮＦ− κＢのような活性タンパク質を生成するために前駆体をプロセシングする能力が あるとは考えられていなかった。 種々の実験手法を用いることで、本発明者らは、プロテアソームがｐ１０５を ｐ５０にプロセシングする過程に実際に必要であることを明らかにした。第一に 、ｐ１０５／ｐ６０Ｔｔｈタンパク質はプロテアソームの活性が枯渇した哺乳動 物細胞の細胞質抽出物中では分解されないことが見出された。しかしながらこの 枯渇状態の抽出物に精製した２６Ｓプロテアソームを加えると、分解プロセシン グ活性が回復する。第二に、プロテアソームの特異的阻害剤は、哺乳動物の細胞 抽出物中、又はインビトロのｐ５０の形成を阻止する。第三に、哺乳動物のｐ１ ０５は、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でｐ５０に インビボで分解され、そしてプロテアソームのキモトリプシン様活性の突然変異 体はｐ１０５のプロセシングを有意に減少させる。ｐ６０Ｔｔｈはインビトロで ユビキチン化され、このユビキチン化はｐ１０５プロセシングにとって欠くこと のできないものである。 上述したように、ｐ５０を形成する間にｐ１０５のＣ末端側の半分（ｐ１０５ Ｃ’）が急速に分解される。そしてｐ１０５Ｃ’の配列はＩκＢの配列に非常に 似ている。ｐ１０５Ｃ’とＩκＢ−αとはその構造及び活性の点で類似している ため、本発明者らは、プロテアソームがＩκＢ−αの不活性化でも関与している のかどうかを決定すべく研究を開始した。ＩκＢ−αはＮＦ−κＢの誘導体に応 答して急速に分解される。そしてこの分解が活性化にとって必要であることが示 されている（Mellits et al.，Nuclein Acids Research 21(22)：5059-5066(19 93)、Henkel et al.，Nature 365：182-185(1993)、及びBeg et al.，Molecular and Cellular Biology 13(6)：3301-3310(1993)参照）。本願の発明者らは、Ｉ κＢ−αの分解とＮＦ−κＢの活性化がプロテアソーム機能又はユビキチン結合 の阻害剤によって実際に阻止されることを明らかにした。 したがってプロテアソームは、ＮＦ−κＢの活性を調節するのになくてはなら ない役割を果たす。第一にプロテアソームは、ｐ１０５、おそびおそらくｐ１０ ０のプロセシングにとって必要である。阻害作用のあるＣ−末端を分解する際に もプロテアソームが必要とされるであろう。第二にプロテアソームは、細胞外の 誘導体に応答して起こるＩκＢ−αの分解にとっても必要であることと考えられ る。 本発明は好ましくは、以下の一般式（１）で示される、プロテアソーム機能又 はユビキチン結合の阻害剤を利用することに関する。 ここで、 Ｐは、アミノ基の保護基であり、 選択され、 選択され、 Ｒは、水素、アルキル基、アシル基、又はカルボキシル基であり、 Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は、水素、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル 基、アルキニル基、アリル基、及び−ＣＨ₂−Ｒ⁵（ここでＲ⁵は、アリル基、ア ラルキル基、アルカリル基、シクロアルキル基、又は−Ｙ−Ｒ⁶−であって、こ のＹはカルコゲン、またＲ⁶はアルキル基である。）からなる群よりそれぞれ独 立に選択され、かつ Ａは、０又は１である。 本発明の好ましい態様において、プロテアソーム阻害剤のＰの部位は次の一般 式（２）で示される。 そしてＲ⁷は、アルキル基、アリル基、アルカリル基、アラルキル基、アルコ キシ基、アリルオキシ基、アルカリルオキシ基、又はアラルコキシ基である。 Ｒ⁷がアルキル基である場合、それは１個〜４個の炭素原子からなるアルキル 基であることが好ましい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基 、又はそれらの異性体である。またＲ⁷がアルカリル基、アラルキル基、アルコ キシ基、アルカリルオキシ基、又はアラルコキシ基である場合には、それらのア ルキル部分も１個〜４個の炭素原子からなるアルキル基であることが好ましい。 Ｒ⁷がアリル基である場合には、６個〜１０個の炭素原子からなるアリル基で あることが好ましい。例えばフェニル基又はナフチル基である。それらは必要に 応じて環が置換されていてもよい。また、Ｒ⁷がアルカリル基、アラルキル基、 アルコキシ基、アルカリルオキシ基、又はアラルコキシ基である場合には、それ らのアリル部分も６個〜１０個の炭素原子からなるアリル基であることが好まし い。 Ｒ⁷は、アルキル基又はアラルコキシ基であることがより好ましいが、最も好 一般式（１）においてＸは、ペプチド結合、又は生物学的利用能を増大させ、 かつ加水分解による代謝を減少させるために、プロテアソーム阻害剤においてペ プチド結合の代用として用いられうる、ペプチド結合と等価の結合（isostere） プロテアソーム阻害剤にこれらの部分が導入されると次のようになる。 例えば、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈが、Ｚ−Ｌｅｕ−ＯＨ及びＨ₂Ｎ−Ｌ ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈを生成するような迅速な加水分解による代謝を受けることが見 出されれば、この反応を抑えるためには等価のハイドロキシエチレン結合を調製 することができる。 本発明の範囲に含まれるこの他の等価の結合は、等価のアザペプチド結合であ る。これはアミノ酸のα−炭素原子を窒素原子で置換することで得られる。次に 式を例示する。 前述したように、一般式（１）におけるＡは０か１のいずれかである。したが ってＡが０である場合には、括弧内のアミノ酸残基は存在しないためこの阻害剤 はトリペプチドである。同様にＡが１の場合には、括弧内に一個のアミノ酸が存 在し、この阻害剤はテトラペプチドである。Ａは０であることが好ましい。 一般式（１）におけるＲ¹及びＲ²は、アルキル基及び−ＣＨ₂−Ｒ⁵からなる群 よりそれぞれ独立に選択されることが好ましい。より好適には、Ｒ¹及びＲ²は、 １個〜４個の炭素原子からなるアルキル基、即ちメチル基、エチル基、プロピル 基、ブチル基、及びそれらの異性体からなる群よりそれぞれ独立に選択される。 なおこの異性体には例えば、イソプロピル基、イソブチル基、sec−ブチル基、 ｔ−ブチル基、又は−ＣＨ₂−Ｒ⁵（ここでＲ⁵は、シクロアルキル基又はナフチ ル基である。）が挙げられる。更に好ましくは、Ｒ¹及びＲ² である。そしてＲ¹及びＲ²の両方がイソブチル基であることが最も好ましい。 ここでのＲ³がアルキル基である場合、それは１個〜４個の炭素原子からなる アルキル基であることが好ましい。例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブ チル基、及びそれらの異性体であって、それらの基は置換されていてもよいし、 置 換されていなくてもよい。 ここでのＲ³がアリル基の場合には、それは例えばフェニル又はナフチル基の ような６個〜１０個の炭素原子からなるアリル基であることが好ましい。なおそ れらの基は置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。 ここでのＲ³が置換されたアルキル基である場合、それは１個〜４個の炭素原 子からなり、６個〜１０個の炭素原子からなる少なくとも一つのアリル基で置換 されているか又は少なくとも一つのシクロアルキル基で置換されているアルキル 基であることが好ましい。なおここでのシクロアルキル基は５個又は６個の炭素 原子を持つものであることが好ましい。そしてこれらの基は置換されていてもよ いし、置換されていなくてもよい。 ここでのＲ³が置換されたアリル基である場合、それは１個〜４個の炭素原子 からなる少なくとも一つのアルキル基で置換されていることが好ましい。これら の基は置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。 ここでのＲ³がシクロアルキル基である場合、それは５個〜６個の炭素原子か らなるシクロアルキル基、たとえばシクロペンチル基又はシクロヘキシル基であ ることが好ましい。これらの基は置換されていてもよいし、置換されていなくて もよい。 ここでのＲ³がシクロアルキル基の置換体である場合、それは６個〜１０個の 炭素原子からなる少なくとも一つのアリル基で置換されているか、又は少なくと も一つのアルキル基、好ましくは１個〜４個の炭素原子を持つアルキル基で置換 されていることが好ましい。これらの基は置換されていてもよいし、置換されて いなくてもよい。 ここでのＲ³が、−Ｙ−Ｒ⁶である場合、このＹはカルコゲン（酸素又は硫黄で あることが好ましく、より好ましいのは硫黄である。）であり、またＲ⁶はアル キル基（１個〜４個の炭素原子からなるアルキル基であることが好ましく、例え ばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及びそれらの異性体である。） である。 前記の一般式でのＲは、水素、アルキル基、アシル基、又はカルボキシル基で ある。 ここでＲがアルキル基である場合には、それは１個〜４個の炭素原子からなる アルキル基であることが好ましい。例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブ チル基、及びそれらの異性体である。 ここでＲがアシル基である場合それは、１個〜４個の炭素原子からなるアルキ ル基部分、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、又はそれらの異 性体のようなアルキル基部分に共有結合するようなカルボニル基部分を有するこ とが好ましい。これらの基は置換されていてもよいし、置換されていなくてもよ い。 ここでのＲがカルボキシル基である場合、構造式［Ｒ⁸］_n−ＣＯＯ−のカルボ キシル基であることが好ましい。ここでのＲ⁸は１個〜４個の炭素原子からなる アルキレン基、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、及 びそれらの異性体である。またｎは、０又は１である。そしてここでの最後のＯ が単結合で１個〜４個の炭素原子からなるアルキル基（この基は置換されていて もよいし、置換されていなくてもよい。）に結合している場合にはエステルが形 成される。 Ｒは水素、アルキル基、又はカルボキシル基であることが好ましいが、水素で あるとより好ましい。 好適なプロテアソーム阻害剤の例には以下の化合物が含まれる。ただしこれら に限定されるわけではない。 ここで 最も好ましくは、プロテアソーム阻害剤は以下に列挙するものである。 本発明は、動物の細胞をプロテアソーム機能又はユビキチン結合の阻害剤と接 触させることにより、その動物におけるＮＦ−κＢの細胞含有量及び活性を抑制 する方法に関する。この方法では、一つ又はそれ以上の可能な段階でＡＴＰ−Ｕ ｂ−依存性経路を遮断することによって（例えば２６Ｓプロテアソーム複合体の 活性を抑制したり、構成要素のうちの一つの活性を抑制することによって）、亢 進したタンパク質分解が阻害される。 薬物候補を、ＡＴＰ−ユビキチン−依存性の分解過程を阻害する能力について 試験する場合、特に有効な手法は、ユビキチン−依存的に分解する短命のタンパ ク質が生産されるような培養細胞で試験することである。この過程の阻害により 、サイトゾル内でタンパク質の蓄積がもたらされる。このタンパク質がサイトゾ ル中に蓄積される程度は、既知の方法を用いて検出することができる。例えばこ の過程の阻害剤候補を短命の酵素を産生する培養細胞に導入し、そしてこの阻害 剤候補の存在下でサイトゾル中にその酵素が蓄積する程度を、阻害剤候補の非存 在下での程度と比較すればよい。阻害剤候補の存在下での酵素の蓄積は、被験阻 害剤候補によるＡＴＰ−ユビキチン−依存性過程の阻害を示している。ユビキチ ン−依存的に分解されるような短命のタンパク質をコードする遺伝子で安定に形 質転換された、例えばＣＯＳ細胞のような培養細胞（例えば大腸菌から得られる 突然変異体のβ−ガラクトシダーゼのような短命の酵素、即ち半減期が約１５分 で、分解がユビキチン−依存性で行われるような酵素）が用いられる（Bachmair ,A．et al.，Science 234：179-186(1986)、Gonda，D.K．et al.，J．Biol．Che m．264：16700-16712(1989)参照）。急速に分解する他の酵素変異体を用いるこ ともできる。このＡＴＰ−ユビキチン−依存性の分解過程を阻害する能力があ ると評価された物質（可能性を持つ阻害剤）が存在するＣＯＳサイトゾル中でβ −ガラクトシダーゼの変異体が蓄積することは、その過程の阻害を示している。 適切な対照としては、同じ条件下で、ただし可能性を持つ阻害剤を存在させない 条件下で培養されているＣＯＳ細胞が用いられる。この手法は、微生物の抽出物 又は化学物質のライブラリーから有効な阻害剤をスクリーニングするのにも用い ることができる。 表I〜IIIには、カテプシンＢ及びカルパインとともに、２０Ｓ及び２６Ｓプロ テアソームの阻害作用を測定する速度論的な実験結果がまとめられている。これ らの表におけるＫ_i値は、酵素及び阻害剤が結合して酵素：阻害剤複合体を形成 する場合に成り立つ式における解離定数であると報告されている。 この物質及びアッセイの条件については表Ｉの下に簡単にまとめて記述されて いる。カルパイン阻害剤Ｉ及びIIとしても知られている、ＭＧ１０１及びＭＧ１ ０２は、カタログ製品としてカルバイオケム（Calbiochem）社から購入した。 表I〜IIIよりわかる重要な点 （１）ペプチド鎖の長さは、２０Ｓのプロテアソームを阻害する能力にとって重 要である。即ち、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｈ（ＭＧ １１４）についての Ｋ_i値、４７ｎＭを、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｈ（ＭＧ １０５；カタログ製品と してカルバイオケム社より入手、表には示していない）についてのＫ_i値、１５ ，０００ｎＭと比較することによりわかる。 （２）２０Ｓプロテアソームを阻害する能力はまた、Ｎ−末端に結合する基の疎 水性が大きくなるにつれて増大する。即ち、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−Ｈ（ ＭＧ １１４）についてのＫ_i値、４７ｎＭを、Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ −Ｈ（ＭＧ １０１）についてのＫ_i値、１４０ｎＭと比較することよりわかる 。 （３）表IIに示された一連の化合物群では、分岐していないアルキル鎖の長さが Ｐ_i位で単調に長くなっており（ＭＧ １１８（水素）、ＭＧ１１１（メチル基 ）、ＭＧ１１９（エチル基）、ＭＧ １１５（ｎ−プロピル基）、及びＭＧ１１ ４（ｎ−ブチル基））、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ−Ｈ（ＭＧ１１５）で阻害 能力は最大となっている。。 （４）２６Ｓのプロテアソームを阻害する阻害剤の能力は常に２０Ｓのプロテア ソームを阻害する能力よりも小さい。その差異は、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｖａ −Ｈ（ＭＧ１１５；Ｋ_i,20S＝２１ｎＭとＫ_i,26S＝７８ｎＭ）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌ ｅｕ−Ｎａｌ−Ｈ（ＭＧ１２１；Ｋ_i,20S＝２５ｎＭとＫ_i,26S＝７０ｎＭ）、及 びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｃ（Ｏ）−ＯＭｅ（ＭＧ１１３；Ｋ_i,20S＝６ ９０ｎＭとＫ_i,26S＝１，３００ｎＭ）で最小である。 （５）調べられたペプチドアルデヒド類は、カテプシンＢ及びカルパインを阻害 する能力のほうが２０Ｓ及び２６Ｓのプロテアソームを阻害する能力よりも高い 。ただし、大きな疎水性のＰ₁残基を持つ二つの阻害剤、即ちＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｐｈｅ−Ｈ及びＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎａｌ−Ｈ（それぞれＭＧ１１０及び ＭＧ１２１）はこれに当てはまらない。 データからもわかるように、ＭＧ１０１は２６ＳのＡＴＰ−依存性プロテアー ゼの阻害剤、及びプロテアソーム（マクロパイン、マルチ触媒性プロテアーゼ） の阻害剤である（表ＩＶ参照）。 これらの阻害剤はインビトロ又はインビボで用いることができる。これらの阻 害剤は、例えば経口投与、静脈注射、筋肉内注射、局所投与、及び点滴を含むい くつかの既知の方法で投与される（Platt et al.，U.S．Patent No．4,510,130 、Badalamente et al.，Proc．Natl.Acad．Sci．U.S.A．86：5983-5987(1989)、 Staubli et al.，Brain Research 444：153-158(1988)参照）。そしてこれらの 阻害剤は、一般的に、生理的に許容される担体（例えば、生理食塩水）とともに 投与される。投与すべき阻害剤の有効量は経験的に決定することができ、またそ れは、用いた特定の阻害剤、個体の条件、及び個体の大きさや体重などを考慮し て決定される。それらは単独で投与してもよいし、又は他の阻害剤もしくは他の 経路の阻害剤と組み合わせて投与してもよい。 表Ｖには、種々のトリペプチドアルデヒド阻害剤を用いることによって２０Ｓ のプロテアソームを阻害した場合のデータがまとめられている。 ここで本発明は、以下の実施例によって説明される。この実施例は本発明を限 定するものではない。 実施例１−３ ペプチジルアルデヒドの調製 ペプチジルＮ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミドは全て、カップリング試薬 である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイド ロクロライドを用いて溶液中で反応させる方法により調製した（Sheehan et al. ，J．Am．Chem．Soc．87：2492-2493(1965)参照）。そのハイドロキシアミドを リチウムアルミニウムハイドライドを用いて還元することでペプチジルアルデヒ ドが生成した（Fehrentz et al.，Synthesis：676-678(1983)、Fehrentz et al. ，Int.J.Peptide Protein Res．26：236-241(1985)参照）。化合物は全てプロト ン核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光によって特徴を確認した。生成物の純度は、薄相ク ロマトグラフィーを用いて、またいくつかについては高速液体クロマトグラフィ ー（ＨＰＬＣ）を用いて確認した。 実施例１ Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ノルバリナールの調製 ａ）Ｂｏｃ−Ｌ−ノルバリンＮ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミド 一部分の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハ イドロクロライド（４４３ｍｇ）を、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ノルバリンジシクロヘキ シルアンモニウム塩（８３８ｍｇ）とＮ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミンハ イドロクロライド（２１５ｍｇ）と１−ハイドロキシベンゾトリアゾールモノハ イドレート（３４０ｍｇ）及びＮ−メチルモルホリン（０．２８ｍｌ）とからな る混合物に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０ｍｌ）中、０℃で添加した。 この混合物を０℃で２時間攪拌した後、室温で４０時間攪拌した。この反応を水 （８０ｍＬ）を用いて停止させし、その混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、３× １００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせたものを１０％の塩化水素（ＨＣｌ） 水溶液、続いて飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ₃）、更に塩水で洗浄して から無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発さ せることによって生成物（５４６ｍｇ）を油状物として得ることができた。 ｂ）Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ノルバリンＮ，０−ジメチルハイド ロキシルアミド Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ノルバリンＮ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミド（５４６ ｍｇ）及びトリフルオロ酢酸（８ｍＬ）をメチレンクロライド（２０ｍＬ）中に 含む溶液を０℃で３時間攪拌した。その溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を真空乾 燥した。このフラスコにＺ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン（７９４ｍｇ）及び１ −ハイドロキシベンゾトリアゾールモノハイドレート（３４０ｍｇ）、Ｎ−メチ ルモルホリン（０．２８ｍＬ）、それにＤＭＦ（２０ｍＬ）を加えた。続いて１ −エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロラ イド（４４２ｍｇ）を０℃で添加した。その混合物を０℃で２時間攪拌した後、 室温で２４時間攪拌した。反応を水（４０ｍＬ）で停止させ、その混合物をＥｔ ＯＡｃ（３×６０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせたものを１０％のＨＣｌ水 溶液、続いて飽和ＮａＨＣＯ₃、更に塩水で洗浄してから無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し 、次に濾過を行った後蒸発させることによって生成物（１．０９ｇ）を白色固体 として得ることができた。 ｃ）Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ノルバリナール Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ノルバリンＮ，０−ジメチルハイドロ キシルアミド（１．０９ｇ）を２０ｍＬの乾燥テトラハイドロフラン（ＴＨＦ） に溶解し０℃に冷却した。リチウムアルミニウムハイドライド（１ＭのＴＨＦ溶 液、３．０５ｍＬ）を添加した後、この混合物を０℃で２５分間攪拌した。硫酸 水素カリウム（４６５ｍｇ）を２０ｍＬの水に溶解した溶液を加えてからその混 合物をＥｔＯＡｃ（３×８０ｍＬ）で抽出した。この有機層を合わせたものを５ ％のＨＣｌ水溶液、続いて飽和ＮａＨＣＯ₃、更に塩水で洗浄してから無水Ｍｇ ＳＯ₄で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発させることによって生成物（４３０ｍ ｇ）を白色固体として得ることができた。 実施例２ Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシナールの調製 ａ）Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン Ｎ，０−ジメチルハイドロキシルア ミド Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン（１ｇ）とＮ，Ｏ−ジメチルハイド ロキシルアミンハイドロクロライド（４２３ｍｇ）と１−ハイドロキシベンゾト リアゾールモノハイドレート（５０９ｍｇ）とＮ−メチルモルホリン（０．４２ ｍＬ）とからなる混合物を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した。１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（６１０ｍ ｇ）を０℃で添加して２時間攪拌した後、室温で４０時間攪拌した。反応を水（ ８０ｍＬ）で停止させ、その混合物をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した 。有機層を合わせたものを１０％のＨＣｌ水溶液、続いて飽和ＮａＨＣＯ₃、更 に塩水で洗浄してから無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発させる ことによって生成物（９２３ｍｇ）を白色固体として得ることができた。 ｂ）Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン Ｎ，Ｏ−ジメチルハイド ロキシルアミド Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン Ｎ，Ｏ−ジメチルハイドロキシル アミド（９２３ｍｇ）及びトリフロロ酢酸（１０ｍＬ）をメチレンクロライド（ ２０ｍＬ）中に含む溶液を０℃で３時間攪拌した。その溶媒を減圧下で蒸発させ 、残渣を真空乾燥した。この生成物の一部分（４８８ｍｇ）を他のフラスコに移 し、Ｚ−Ｌ−ロイシン（４５１ｍｇ）と１−ハイドロキシベンゾトリアゾールモ ノハイドレート（２７６ｍｇ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．２２ｍＬ）、それ にＤＭＦ（１５ｍＬ）を加えた。続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（３５７ｍｇ）０℃で添加した。 その混合物を０℃で２時間攪拌した後、室温で４２時間攪拌した。反応を水（５ ０ｍＬ）で停止させ、その混合物をＥｔＯＡｃ（３×６０ｍＬ）で抽出した。有 機層を合わせたものを１０％のＨＣｌ水溶液、続いて飽和ＮａＨＣＯ₃、更に塩 水で洗浄してから無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発させること によって生成物を白色固体として得ることができた。これをさらにシリカゲルク ロマトグラフィー（ヘキサン／アセトンの８０：２０及び７０：３０の溶出溶媒 ）にかけて精製することで目的とする表記化合物（５４６ｍｇ）が白色固体とし て得られた。 ｃ）Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシナール Ｚ−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−ロイシン Ｎ，Ｏ−ジメチルハイドロ キシルアミド（５４６ｍｇ）を１５ｍＬの乾燥テトラハイドロフラン（ＴＨＦ） に溶解し０℃に冷却した。リチウムアルミニウムハイドライド（１ＭのＴＨＦ溶 液、４．１ｍＬ）を添加した後、この混合物を０℃で３０分間攪拌した。硫酸水 素カリウム（１．３９ｇ）を３０ｍＬの水に溶解した溶液を加えてからその混合 物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。この有機層を合わせたものを５％ のＨＣｌ水溶液、続いて飽和ＮａＨＣＯ₃、更に塩水で洗浄してから無水ＭｇＳ Ｏ₄で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発させることによって生成物（４４６ｍｇ ）を白色固体として得ることができた。さらにこれを、逆相ＨＰＬＣ（水／アセ トニトリルの溶出溶媒）によって精製した。 実施例３ Ｚ−Ｌ−（２−ナフチル）−アラニン−Ｌ−（１−ナフチル）− アラニン−Ｌ−ロイシナールの調製 ａ）Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン Ｎ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミド Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン（２．４７ｇ）とＮ，Ｏ−ジメチルハイドロキシル アミンハイドロクロライド（１．０９ｇ）と１−ハイドロキシベンゾトリアゾー ルモノハイドレート（１．５１ｇ）とＮ−メチルモルホリン（１．２１ｍＬ）と からなる混合物を、ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解した。１−エチル−３−（３−ジ メチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（２．１４ｇ）を０ ℃で添加し、その混合物を０℃で２時間撹拌した後、室温で２２時間攪拌した。 反応を水（１００ｍＬ）で停止させ、その混合物をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ ）で抽出した。有機層を合わせたものを１０％のＨＣｌ水溶液、続いて飽和Ｎａ ＨＣＯ₃、更に塩水で洗浄してから無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次に濾過を行った後 蒸発させることによって生成物（２．５７ｍｇ）を油状物として得ることができ た。 ｂ）Ｂｏｃ−Ｌ−（１−ナフチル）−アラニン−Ｌ−ロイシン Ｎ，Ｏ−ジメチ ルハイドロキシルアミド Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン Ｎ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミド（９８３ ｍｇ）及びトリフロロ酢酸（８ｍＬ）をメチレンクロライド（２０ｍＬ）中に含 む溶液を０℃で３時間攪拌した。その溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を真空乾燥 した。この生成物の一部分（２０８ｍｇ）を他のフラスコに移し、Ｂｏｃ−Ｌ− （１−ナフチル）−アラニン（３７８ｍｇ）及び１−ハイドロキシベンゾトリア ゾールモノハイドレート（１７８ｍｇ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．１５ｍＬ ）、それにＤＭＦ（１０ｍＬ）を加えた。続いて１−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（２４１ｍｇ）を０℃で 添加した。その混合物を０℃で２時間攪拌した後、室温で１７時間攪拌した。反 応を水（２０ｍＬ）で停止させ、その混合物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽 出した。有機層を合わせたものを１０％のＨＣｌ水溶液、続いて飽和のＮａＨＣ Ｏ₃、更に塩水で洗浄してから無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発 させることによって生成物を白色固体（４５９ｍｇ）として得ることができた。 ｃ）Ｚ−Ｌ−（２−ナフチル）−アラニン−Ｌ−（１−ナフチル）−アラニン− Ｌ−ロイシン−Ｎ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミド Ｂｏｃ−Ｌ−（１−ナフチル）−アラニン−Ｌ−ロイシン Ｎ，Ｏ−ジメチル ハイドロキシルアミド（４５９ｍｇ）及びトリフロロ酢酸（５ｍＬ）及びチオア ニソール（２ｍＬ）を０℃で２．５時間攪拌した。その溶媒を蒸発させ、残渣を 真空乾燥した。この生成物の一部分（１８２ｍｇ）を他のフラスコに移し、Ｚ− Ｌ−（２−ナフチル）−アラニン（１７１ｍｇ）、１−ハイドロキシベンゾトリ アゾールモノハイドレート（９９ｍｇ）、Ｎ−メチルモルホリン（０．０８ｍＬ ）、それにＤＭＦ（１０ｍＬ）を加えた。続いて１−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（１１２ｍｇ）を０℃で 添加した。その混合物を０℃で２時間攪拌した後、室温で４１時間攪拌した。反 応を水（２０ｍＬ）で停止させ、その混合物をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽 出した。有機層を合わせたものを１０％のＨＣｌ水溶液、続いて飽和のＮａＨＣ Ｏ₃、更に塩水で洗浄してから無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発 させることによって生成物を白色固体として得ることができた。これをさらにシ リカゲルのクロマトグラフィー（ヘキサン／アセトンの８０：２０及び７０：３ ０の溶出溶媒）にかけて精製することで目的とする表記化合物（３２１ｍｇ）が 得られた。 ｄ）Ｚ−Ｌ−（２−ナフチル）−アラニン−Ｌ−（１−ナフチル）−アラニン− Ｌ−ロイシナール Ｚ−Ｌ−（２−ナフチル）−アラニン−Ｌ−（１−ナフチル）−アラニン−Ｌ −ロイシン−Ｎ，Ｏ−ジメチルハイドロキシルアミド（３２１ｍｇ）を１５ｍＬ の乾燥テトラハイドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、０℃に冷却した。リチウムア ルミニウムハイドライド（１ＭのＴＨＦ溶液、１．７ｍＬ）を添加した後、この 混合物を０℃で３０分間攪拌した。硫酸水素カリウム（０．５９ｇ）を３０ｍＬ の水に溶解した溶液を加えてからその混合物をＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽 出した。この有機層を合わせたものを５％のＨＣｌ水溶液、続いて飽和ＮａＨＣ Ｏ₃、更に塩水で洗浄してから無水ＭｇＳＯ₄で乾燥し、次に濾過を行った後蒸発 させることによって生成物（２７４ｍｇ）を白色固体として得ることができた。 実施例４ インビトロでｐ６０Ｔｔｈ前駆体をｐ５０にするタンパク質分解プロセシングは ＡＴＰを必要とする ｐ６０Ｔｔｈ前駆体（又はｐ１０５）を小麦麦芽の抽出物中に移した。この基 質タンパク質をＨｅＬａ細胞の細胞質の抽出物（Ｓ１００）と、ｐＨ７．５に調 整された１２ｍＭのトリスと６０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのクレアチンホスフェ ート、３．５ｍＭのＭｇＣｌ₂それに１ｍＭのＡＴＰを含有するプロセシング用 緩衝液中にて混合した。３０℃で１時間インキュベートした後、この反応混合液 を抗−ｐ５０Ａｂを用いた免疫沈降反応にかけ、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ によって分離分析した。ＨｅＬａ細胞のＳ１００を添加する前に小麦胚芽抽出物 の中に残っていたＡＴＰを不活性にするために、試料がプロセシングされるアピ ラーゼ中でｐ６０を１０Ｕの酵素と共に３７℃で３０分間インキュベートした。 対照の試料には酵素又はＡＴＰを入れなかった。その結果を図１に示す。 実施例５ プロテアソームが枯渇した抽出物中又はプロテアソームが豊富な抽出物中のｐ１ ０５／ｐ６０Ｔｔｈのプロセシング ＨｅＬａ細胞Ｓ１００を、１００，０００×ｇで６時間遠心分離することによ ってプロテアソームを除去した。プロテアソーム活性がなくなったことはそのプ ロテアソームに特異的な蛍光発生ペプチドアッセイを行って確認した。二つの異 なる枯渇した抽出物［Ｐｒ^-（Ｉ及びII）］から得られた結果が示されている。 ペレットはプロテアソーム活性のほとんどを含んでいる。プロセシング反応を実 施例４に記述したように行い、反応液を抗−ｐ５０Ａｂ又は抗−ｍｙｃペプチド ｍＡｂのいずれかを用いて免疫沈降させた。抗−ｍｙｃ ｍＡｂは、標識したｐ ６０前駆体タンパク質のＮ−末端のｍｙｃ−ペプチドを認識する。これらの結果 を図３に示す。 実施例６ プロテアソームの免疫抑制はＮＦ−κＢのプロセシングを阻害する プロテアソームの特異的な成分に対するモノクローナル抗体（ＭＣＰ２０，２ ９Ｋ）と、ヘマグルチニンに対する対照のＭｃＡｂ（ＨＡ１２ＣＡ５）とを、ペ レットから得られるプロテアソーム活性を用いて再調整したＰｒ^-（II）抽出物 とともにインキュベートした。この免疫複合体を除去し、枯渇状態となった抽出 物を実施例４に記載したようなｐ６０のプロセシング反応で用いた。この結果を 図 ４に示す。 実施例７ ｐ６０Ｔｔｈのプロセシングを促進する精製プロテアソーム 精製された２０／２６Ｓプロテアソーム、又は網状赤血球の溶解物から得られ るプロテアソームの豊富な画分、画分IIを、量を増加させながら、単独で又はＰ ｒ^-（II）抽出物と組み合わせてプロセシング反応（実施例４参照）に加えた。 さらに、プロセシングを、ＡＴＰγＳ、即ちＡＴＰの非−加水分解性アナログに よって阻害した。このアナログはユビキチン化過程は阻害しないがプロテアソー ム機能は阻害する（レーン３〜５参照）。図５参照。 実施例８ ｐ６０Ｔｔｈ前駆体タンパク質がユビキチン化される 本実施例、及び上述した実施例では、プロテアソーム活性を失活した（Ｐｒ^- ）抽出物と共に基質をインキュベートする場合にはしご状のバンドが現れる。ｐ ６０のユビキチン化は、７．５μｇの精製されたユビキチン（ｕｂ）をＰｒ^-（I I）抽出物に加えてプロセシング反応を行った場合によりはっきりと現れる（レ ーン５参照）。図６を参照。 実施例９ ユビキチンはＮＦ−κＢ₁のプロセシングに必須である Ａ．異なる量の網状赤血球画分11（＋／− ７．５μｇのｕｂ）を、プロセシ ング反応（実施例４参照）で基質のｐ６０と共に用いた。画分IIはプロテアソー ム活性は持っているがユビキチンはほとんど持っていない。 Ｂ．ＨｅＬａ細胞Ｓ１００又は画分IIに、ｕｂ鎖の形成を阻害する大腸菌の組 換え野生型ｕｂ又は変異型ｕｂ（Ｌ＞Ｒ４８）を追加した。プロセシング反応は 上述したとおりである。 その結果を図７に示す。 実施例１０ サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるｐ１０５ のプロセシングはプロテアソームを必要とする 野生型（ＰＲＥ１）及びプロテアソーム変異型（ｐｒｅｌ−１）酵母をヒトの ｐ１０５を用いて形質転換した。この形質転換体を２０分間³⁵Ｓ−メチオニン／ システインを用いてパルス処理し、続いて様々な時間で非放射性のメチオニン／ システインを用いてチェイス処理した。抽出物を調整し、その溶解物を抗−ｐ５ ０Ａｂを用いて免疫沈降してから、そのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって 分離した。この結果を図８に示す。 実施例１１ プロテアソームの特異的阻害剤はインビボのｐ１０５のプロセシングを阻害する ＣＯＳ細胞をヒトｐ１０５で形質転換した。その細胞に阻害剤（カルパイン阻 害剤、ＭＧ１０１、及びＭＧ１１５）を５０μＭ分だけ、³⁵Ｓ−メチオニン／シ ステインを添加する１時間前に添加した。典型的に、２０分のパルス−２時間の チェイス処理をし、抗−ｐ５０Ａｂで免疫沈降を行い、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ を行った結果を図９に示す。プロテアソーム特異的阻害剤だけがｐ１０５のプロ セシングを遮断し、非特異的プロテアーゼ阻害剤はその作用をもたない。これら の結果はインビトロで証明された。 実施例１２ プロテアソームの特異的阻害剤はＮＦ−κＢの活性化を阻害する ＨｅＬａ細胞又はＭＧ６３細胞を阻害剤（５０μＭ）を用いて１時間、前処理 した。続いてその細胞を、ＴＮＦ−α（１０００Ｕ／ｍｌ）又はＩＦＮ−γ（１ ０００Ｕ／ｍｌ）で、それぞれ３０分間又は６０分間処理した。細胞抽出物全部 を調製し、電気泳動移動度シフトアッセイを行って分析した。インターフェロン −β遺伝子から得られるＮＦ−κＢ部位を、ＮＦ−κＢの結合活性を試験するた めに用い、またＩＲＦ−１遺伝子から得られるｐＩＲＥ部位をガンマ−活性化因 子（ＧＡＦ）活性を測定するために用いた。この阻害剤は、ＮＦ−κＢの活性化 のみを抑制し、ＧＡＦ誘導には影響を与えない。この結果を図１０に示す。 上記において、特に好ましい態様について記載したが、これらは本発明を限定 するものではないことが理解できるであろう。開示された態様には様々な変更を 加えることができ、またそのような変更は本発明の範囲内にあることが当業者に は明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＢＥ 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 5/06 Ｃ０７Ｋ 5/06 9356−4Ｈ 5/08 5/08 9152−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/99 // Ｃ１２Ｎ 9/99 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マニアーティス トーマス ピー. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ベ ルモント マーシュ ストリート 187 (72)発明者 ランド オリバー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ ュートン モントベール ロード 60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物の細胞をプロテアソーム機能又はユビキチン結合の阻害剤と接触させる ことを含む、該動物におけるＮＦ−κＢの細胞含有量及び活性を抑制する方法。 ２．動物の細胞を、以下の構造のプロテアソーム機能又はユビキチン結合の阻害 剤と接触させることにより、該動物におけるＮＦ−κＢの細胞含有量及び活性を 抑制する方法。 ここで、 Ｐは、アミノ基の保護基であり、 に選択され、 選択され、 Ｒは、水素、アルキル基、アシル基、又はカルボキシル基であり、 Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は、水素、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル 基、アルキニル基、アリル基、及び−ＣＨ₂−Ｒ⁵（ここでＲ⁵は、アリル基、ア ラルキル基、アルカリル基、シクロアルキル基、又は−Ｙ−Ｒ⁶であって、この Ｙはカルコゲン、そしてＲ⁶はアルキル基である。）からなる群よりそれぞれ独 立に選択され、そして Ａは、０又は１である。 ３．Ｐが、 であり、かつＲ¹がアルキル基、アリル基、アルカリル基、アラルキル基、アル コキシ基、アリルオキシ基、アルカリルオキシ基、又はアラルコキシ基である請 求の範囲２の方法。 ４、Ｘ¹、Ｘ²、及びＸ³が、 である、請求の範囲３の方法。 ５．Ａが０であり、かつＢ¹、Ｂ²、及びＢ³が である、請求の範囲４の方法。 ６．Ｒ¹、Ｒ²がアルキル基及び−ＣＨ₂−Ｒ⁵（ここでＲ⁵は、シクロヘキシル基 又はナフチル基である）からなる群よりそれぞれ独立して選択される、請求の範 囲５の方法。 ７．Ｒ¹、Ｒ²がイソブチル基である、請求の範囲６の方法。 ８．プロテアソームの阻害剤が、以下からなる群より選択される、請求の範囲２ の方法。 ここで、 Ｎｌｅ＝ノルロイシン Ｎｖａ＝ノルバリン Ｎａｌ＝ナフチルアラニン。 ９．プロテアソームの阻害剤が、以下からなる群より選択される請求の範囲２の 方法。 および