JPH09509573A

JPH09509573A - Ｐｏｍｃ▲下７６−１０３▼を利用して結腸細胞の増殖を刺激する方法

Info

Publication number: JPH09509573A
Application number: JP7522458A
Authority: JP
Inventors: ナイス，エドワード，シー; ジェイムズ，アール; シンプソン，アール; バージェス，アントニー，ダブリュ; ホワイトヘッド，ロバート，エイチ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1997-09-30
Also published as: US5547940A; CA2184176A1; AU689560B2; WO1995023214A1; EP0785990A1; AU1969095A; EP0785990A4

Abstract

(57)【要約】本発明は既知のペプチドＰＯＭＣ_76-103を、結腸細胞増殖を刺激するためにいかに利用可能であるかを記載する。前記ペプチドは、単体、もしくは、他の細胞増殖刺激剤との併用で使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】ＰＯＭＣ_76-103を利用して結腸細胞の増殖を刺激する方法関連出願本出願は、１９９２年３月１６日出願の米国特許出願第８５１，７３２号の一部継続出願である、１９９３年３月１６日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２４９２号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、腸細胞や結腸陰窩細胞などの、細胞増殖の刺激物質として有効な因子に関する。詳しくは、本発明は、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に示されるアミノ酸配列を有する前記ペプチドと、その利用方法に関する。背景および従来技術標的化細胞集団および亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に対するその効果の分析を通じて、多数の細胞産生物が同定されている。このような産生物には、成長因子、サイトカイン等を含む多血（ｐｌｅｔｈｏｒａ）の物質が含まれる。これらの物質は、極めて強力であって、正常細胞によっては非常に僅かしか産生されない。現在の分子生物学の主要な目的の一つは、その概略を上述した種々の物質を産出する遺伝子の同定とそのクローン化である。エリトロポエチン（米国特許第４，７０３，００８号参照）やインターロイキン７（米国特許第４，９６５，１９５号参照）等の物質のこのような遺伝子は既に同定されてはいるが、それに関連する遺伝物質は、常に入手可能とは限られず、あるいは、当該技術において望まれているほど迅速には入手可能ではない。このような場合、十分な量のこの問題の物質を入手するための重要な手段は、この所望の産生物を産生する細胞ラインの同定と単離によるものである。それらを産生した細胞ラインを通じて最初に同定されたタンパク様細胞産生物の具体例は、”顆粒球コロニー刺激因子”又は”Ｇ−ＣＳＦ”（米国特許第４，８３３，１２７号参照）とインターロイキン−３（米国特許第４，６５８，０１８号参照）である。後者の特許が特に興味深い。というのは、ここでは、前記因子が、分子量や、等電点などのパラメータにおいて完全に特徴付けられてはいないが、その機能特性は明白に定義されているからである。生物学上の関連性を有する因子と、その細胞ラインからの単離に対するこのアプローチの別の例は、ゴルデ他の米国特許第４，４３８，０３２号に見られる。もちろん、当業者にとって、ハイブリドーマ細胞ラインによって産生される多数のモノクローナル抗体も周知であろう。しばしば、これらのタンパク質の最も関連性の高い特徴は、その特異性であり、これのみによってそれらを同定することができる。細胞成長の形成に関連する多数の因子が既に同定されてはいるが、これらの様々な細胞の多様性は、特定の標的を有する、即ち、特定の細胞種を刺激する因子の同定と特徴付けに対する研究を続ける必要性を示している。１つの成熟組織の種々の細胞タイプは、”自発的（ｓｕａｓｐｏｎｔｅ）” に現れるものではなく、むしろ、それらは、自己更生し、複数の種類の成熟細胞に分化する能力を有する前駆体細胞から進化する。これらの前駆体細胞は、一般に”幹細胞”と称され、これらは、細胞の進化に関する研究の分野にとって重要な資源である。基礎研究に対する幹細胞の重要性は、ツカモト他の米国特許第５，０６１，６２０号に見られ、これは、造血幹細胞の単離と維持とに関する。ＩＭＤＭやＲＰＭＩを含む様々な媒体が、これらの幹細胞を維持するのに使用可能な成長媒体として記載されている。結腸粘膜に進化する幹細胞は、結腸陰窩細胞、又は、その集団としても言及されている。これらの細胞を混合培地から単離することは可能であったが、その培養は困難であった。この点に関して、ここに参考文献として添付し、以下”ＩｎＶｉｔｒｏ”と称する、ホワイトヘッド他のＶｉｔｒｏＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ２３（６）：４３６−４４２（１９８７）を参照。ここに記載された方法は、とりわけ、陰窩細胞の培地の寿命を長引かせるために、コラーゲン・ゲルと、ウシ大動脈細胞のフィーダ層とを必要とする。この方法は複雑であり、結腸陰窩細胞の培養のために完全に満足できるものではない。腫瘍細胞は、その正常な対応物の刺激因子を大量に製造する細胞ライン源であることが多い。前に引用した特許文献において、例えば、Ｇ−ＣＳＦとＩＬ−３との産生体として同定された細胞ラインが、腫瘍性物質から単離された。結腸腫瘍から派生し、結腸陰窩細胞にその起源を遡ることが可能な細胞ラインが、例えば、その開示内容をここに参考文献として添付するホワイトヘッド他、ＪＮＣＩ７４（４）：７５９−７６２（１９８５）から知られており、これは、その起源が結腸陰窩細胞に遡る細胞ラインＬＩＭ１２１５を記載している。しかしながら、すべての細胞ラインが関連する因子を産生するとは限らず、どの細胞ラインが刺激因子を産生するかについて、なんら保証や決まったパターンは存在しない。以前の研究により、それ以外の方法によっては従来技術によって認識されない膜関連因子を産出し、結腸陰窩細胞上において分裂促進因子（ｍｉｔｏｇｅｎ）として作用する細胞ラインが作り出された。この因子は、それがＤＮＡ合成と、標的化細胞（即ち、結腸陰窩細胞）の増殖を刺激する意味において、分裂促進因子として作用する。前記因子を、産出細胞によって成長培地中に分泌し、結腸陰窩細胞の増殖を刺激する調整培地を作った。この分裂促進因子と、それを産生する細胞ライン、そしてその利用方法とが、本出願の親出願および祖親出願の課題であった。これらの２つの出願は、図５と、例８とにおいて、粗製下垂体物質” Ａ２”の使用を開示している。この物質は、ウシの下垂体の抽出物であり、これは、結腸癌細胞ラインＬＩＭ１２１５の潜在的クロノゲン（ｃｌｏｎｏｇｅｎ）である。例えば、ホワイトヘッド他のＪ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓ．７４：７５９−７６５（１９８５）参照。その示されたフラクションは、粗製である。しかし、下垂体抽出物は更に研究され、驚くべきことに、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のアミノ酸配列からなるペプチドは、結腸癌細胞の増殖の強力な刺激物質であることが判った。前記ペプチドのこの側面が、ここに記載される発明の基礎となっている。図面の簡単な説明図１は、ＬＩＭ２５３７からの分裂促進因子の存在下において培養した場合における、ヒトの結腸陰窩細胞への放射ラベル化チミジンの導入を示し、図２は、ＬＩＭ２５３７分裂促進因子を含む様々の濃度の調整培地でのネズミの結腸陰窩細胞の刺激を示し、図３は、分裂促進因子の存在下においてネズミの結腸陰窩細胞の刺激を一定時間にわたって研究したときに得られた結果を示し、図４は、ヒトの結腸陰窩細胞の、様々な濃度のＬＩＭ２５３７分裂促進因子に対する経時反応を示し、図５は、コロニー形成アッセイからのデータを示し、図６は、ＬＩＭ２４３７硫酸アンモニウム沈澱物と、様々の濃度での凍結ＬＩＭ２５３７調整培地との比較を示し、図７は、ＬＩＭ２５３７調整培地、燐酸塩緩衝液化塩水中で再懸濁された硫酸アンモニウム沈澱物、及びＴｒｉｓ緩衝液の添加から得られたデータを示し、図８は、結腸陰窩細胞ラインと種々の成長因子からの多数の調整培地が、寒天アッセイにおいてＬＩＭ２４０５細胞のコロニー形成を誘発する能力を比較するものであり、ここには本発明のペプチドであるＡ２も含まれる、図９は、ＬＩＭ２５３１の成長因子を含む調整培地と、成長因子ＥＧＦ及びＦＧＦとの比較を示し、図１０は、ＬＩＭ２５３７の調整培地と、調整培地を含む代表的成長因子との比較を示し、図１１は、本発明のペプチドを得る純化プロトコルの要約であり、図１２は、縮小したＣＭセファロースＦａｓｔＦｌｏｗカラムへの抽出物の適用後に得られた結果を示し、図１３は、前記活性フラクションのクロマトグラム（図１３Ａ．ａ）と、ＬＩＭ１２１５細胞の分裂促進活動アッセイの結果（図１３Ｂ）とを示し、図１４は、二次微分吸光分析によって得られた結果を示し、図１５は、前記ペプチドを分析した時に得られたＰＴＨアミノ酸のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示し、図１６Ａは、合成（ＰＯＭＣ）_76-103、結腸細胞ラインＬＩＭ１２１５上で分裂促進因子として使用したアッセイの結果を示し、図１６Ｂは、１６Ａで使用したのと同じアッセイを使用し、但し、外皮成長因子（ＥＧＦ）を使用して得られた結果を示す。好適実施例の詳細な説明例１ヒトの結腸組織サンプルから採取されたパイオプシーから前記細胞ラインＬＩＭ２５３７を定着（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）した。直腸中の結腸癌に隣接するポリープが、過剰な数の神経繊維と血管とが観察されたという意味において普通でない特徴を有していることが観察された。前記ポリープの一部を使用して、ここにその開示内容を参考文献として添付する前述のホワイトヘッド他のＪＮＣＩに記載されているプロトコルに従って培地を構成した。培地中での約２カ月のゆっくりとした発育後、小さな細胞変異体が前記培地中において、他のすべての細胞よりも大きく成長していることが観察された。これらの細胞を植え継ぎ（継代化：ｐａｓｓａｇｅｄ）、低い継代化レベルで液体Ｎ₂中に保管した。更に、これらは、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０でも成長可能であり、後の植え継ぎのために、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して収穫可能である。細胞は、多数の丸い細胞が緩やかに付着した状態、または、培地中で浮遊した状態の小さなスピンドル形状の細胞として成長した。クローンも、標準技術を使用して半固体寒天中で成長した。細胞の濃度が増加するにつれてクローン化効率が顕著に増加し、自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）効果を示した。研究によれば、前記細胞はヌードマウスにおいて異種移植片として容易に成長し、１９日以内に感触可能な腫瘍を形成することが示された。これらの細胞は、約５５−６０の染色体を有する異数体である。これらは、抗ケラチンモノクローナル抗体ＬＥ−６１によって染色され、これらが上皮由来であることを示している。これらは、抗ムチン抗体や、アミノペプチダーゼＮ以外の刷子縁マーカ（ｂｒｕｓｈｂｏｒｄｅｒｍａｒｋｅｒｓ）に対する抗体によっては染色されない。上述した培地から１つの細胞ラインを樹立し、これをＬＩＭ２５３７と命名した。この細胞ラインの寄託をブタペスト条約に基づいて行った。例２前に観察された自己分泌効果は、前記細胞によって１つの因子が産生され、前記培地中に分泌されたことを示唆している。従って、調整培地を準備し、これを、下記のようにその後のテストに使用した。ＬＩＭ２５３７のサンプルを、上述した培養プロトコルに従って７５％の集合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）にまで成長させた。その後、培地を２％の胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０に交換し、その後、３７℃で４８時間培養した。培地を収集し、０．２２μの殺菌フィルタで濾過し、テストまで −７０℃で保管した。例３例２で記載した調整培地の結腸陰窩細胞に対する効果を、テストした。正常な結腸粘膜片を、洗浄し、燐酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）中の次亜塩素酸ナトリウムの０．１％溶液中で、室温で２０分間浸漬することによって殺菌した。次に、結腸陰窩細胞を、ホワイトヘッド他，ＩｎＶｉｔｒｏ２３：４３６−４４２（１９８７）に記載されているように、３ｍＭのＥＤＴＡと０．５ｍＭのＤＴＴとを含有する溶液を使用して単離した。前記粘膜を室温で９０分間培養し、ＥＤＴＡ混合物を除去し、次にＰＢＳを添加した。その結果得られた混合物を、次に、激しく攪拌し、陰窩を残りの組織から単離した。この工程を、陰窩の量が減少するまで繰り返した。その結果得られた陰窩の懸濁物を、穏やかな遠心分離にかけ、陰窩を、５％の胎児ウシ血清を添加したＰＲＭＩ１６４０中に懸濁させた。陰窩濃度を、ｍｌ当り３００の陰窩に調節し、その懸濁物を、１ｍｌの容積の２４のウェル培地皿に分割した。上述したＬＩＭ２５３７培地を、解凍し、２．５％から２０％（ｖ／ｖ）の濃度でラベル化したウェルに添加し、その後、３７℃で４８時間培養した。次に、これらのウェルに対して、ウェル当り１μキューリーの濃度で、トリチウム化チミジンを添加し、更に６時間、培養を継続した。これらの細胞のＤＮＡを、商用収集装置を使用してガラス繊維紙上に収集し、その後、これらの紙を液体シンチレーション・バイアル瓶中に入れて、これにシンチレーション流体を添加した。バイアル瓶を、液体シンチレーションカウンタで計数し、チューブのバックグラウンドの少なくとも２倍に等しいトリチウム化チミジンの導入が、バックグラウンド活動を示すものであるとした。その得られた結果を、図１に示す。これらのデータから、前記調整培地が、濃度依存的に、結腸陰窩細胞の増殖を刺激する因子を有していることが明らかである。例４例３に記載した実験は、ヒトの陰窩細胞に関するものであった。新生のマウスと成体のマウスとの両方を使用し、平行して実験を行った。これらのマウスから結腸を取り出し、長手方向に切開して、その内容物を取り除き、次に、これらの結腸を、例３において記載したものと同じ工程に従ってＰＢＳ中で洗浄した。図２はこれらの結果を示す。新生と成体との両方の結腸陰窩細胞においても、類似のデータが得られたことが判る。例５例４において行ったのと同じ結腸陰窩細胞刺激アッセイを、再び行った。但し、ここでは収集を４８時間後に行った。図３はこれらの結果を示しており、刺激の程度はアッセイによって、特に培地の最適濃度との関係において、異なるものの、この培地が結腸陰窩細胞においてＤＮＡの合成を刺激したことが示されている。例６別のセットの実験において、ヒトの結腸陰窩細胞を、様々な成長因子とともに、ＬＩＭ２５３７からの調整培地でテストした。テストされた成長因子の内のいくつかは、表皮成長因子（”ＥＧＦ”）、線維芽成長因子（”ＦＧＦ”）、インターロイキン６（”ＩＬ−６”）、血小板由来成長因子（”ＰＤＧＦ”）、胃腸ペプチド”ＰＰＰ”及びグルカゴンが含まれていた。これらの因子のいずれも、ネズミの結腸陰窩細胞上でテストしたとき、前記ＬＩＭ２５３７調整培地に対するなんの相乗作用をも示さなかった。例７ヒトの結腸陰窩細胞の様々な濃度における経時反応も調べた。図４は、これらの結果を要約しており、これらの結果は、前述したチミジン導入アッセイを使用して得られたものである。その濃度によって、刺激は培養の第２日目または第３日目に最大となった。但し、濃度のいかんに拘らず、陰窩細胞は、調整培地によって刺激された。例８種々の因子を使用したコロニー形成を研究した。細胞ラインＬＩＭ１２１５の細胞を、ホワイトヘッド他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．４６：８５８−８６３（１９９０）に従って、半固体寒天（０．３％）中でクローン化した。簡単に説明すると、前記細胞を、トリプシン処理し、５％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で再懸濁した。前記懸濁液中の細胞を、計数し、次に、１ｍｌ当り１０⁴ の細胞の濃度で、１０％のＦＣＳ（４０℃）を添加したＲＰＭＩ１６４０中の０．３％の寒天の混合物中で再懸濁させた。この混合物を、３５ｍｍ²の皿中に１．５ｖｏｌｕｍｅｓでプレート化し、ここでセットさせた。次に、これらのプレートを、５％のＣＯ₂と１００％の湿度中で１４日間、３７℃で培養した。これらのプレートに、０．１％のクリスタルバイオレットの溶液を添加すると、４０以上の細胞のコロニーが計数された。調整培地を、結腸癌細胞ラインの集約的単層（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）を、５％のＦＣＳを添加した新しいＲＰＭＩ１６４０で４８時間培養することによって準備した。次に、培地を除去し、濾過によって殺菌し、１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で前記寒天プレートに添加した。基本線維芽成長因子（”ｂＦＧＦ”）と、”Ａ２”と称する粗製下垂体フラクションもテストした。これらの物質は、既に以前において、結腸陰窩成長因子であることが示されていたものである。前述のホワイトヘッドを参照。これらの実験の結果は、図５に示されている。ＬＩＭ２５３７から得られた調整培地が、他の物質と比較してはるかに優れていることに注目されたい。例９更に別の実験において、ヒト結腸陰窩細胞を、ＬＩＭ２５３７調整培地の硫酸アンモニウム沈澱物（”ＡＳＰ”）と組み合わせた。ヒト陰窩を、ホワイトヘッド他、ＩｎＶｉｔｒｏ２３：４３６−４４２（１９８７）に従って、３ｍＭのＥＤＴＡと０．５ｍＭのＤＴＴとを使用して結腸粘膜から単離した。これらの陰窩細胞を、２％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁し、次に、その濃度を１ｍｌ当り２００の陰窩に調節した。この陰窩懸濁液を、１ｍｌの容積の２４のウェル・プレートに分割した。１００ｍｌの調整培地が、ＬＩＭ２５３７の４８時間の培養によって準備され、遠心分離によって透明化し、これに、硫酸アンモニウムを、３０％（ｗ／ｖ）の最終濃度にまで添加した。この混合物を、４℃で一晩放置し、次に、遠心分離にかけた。その上清を廃棄し、そのペレットを、１０ｍｌの燐酸緩衝化塩水（０．１Ｍ）中で再懸濁させた。この再溶解させた懸濁物を、その濃度を２％から始めて２倍化してゆく希釈率で添加した。ＬＩＭ２５３７調整培地も、その安定性を調べるために、４８時間の凍結後にテストした。陰窩を、３７℃で４８時間培養し、次に、³Ｈ−チミジンをｍｌ当り１μ／Ｃｉの最終濃度で添加することによってラベル化した。プレートを６時間再培養し、その細胞を、ガラス繊維フィルタマット上に収集した。導入された放射能量を、液体シンチレーションカウンタで測定した。図６に示す結果において、前記沈降物（”ＡＳＰ”）が左側から右側の第１の４つのカラムに示され、凍結物（”ＦＺ”）が左側から右側のカラム５−７に示されている。コントロール実験も図示されている。ここでも、前記因子の作用が明らかである。例１０ＬＩＭ２５３７調節培地と、ＰＢＳ中で再溶解された前記沈降物と、ＴＲＩＳ中で再溶解された沈降物との比較を行った。成体マウスの結腸陰窩細胞を結腸粘膜から単離し、２％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で、１ウェル当り２００陰窩で２４のウェル・プレートにプレート化した。調整培地を、５，１０及び２０％の濃度で添加し、沈降後、硫酸アンモニウムを添加した。この沈降物を、燐酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）中で再溶解するか、もしくは、２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ７．２）を含有するＰＢＳ中で再溶解した。図７は、これらの結果を示しており、前記ＴＲＩＳ溶液が明白に最善の結果を示している。Ｙ軸には、コントロール値が示されている。例１１前記ＬＩＭ２５３７調整培地の、他の結腸癌細胞ライン、即ち、ホワイトヘッド他、（１９８５）と、ホワイトヘッド他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７０：２２７−２３６（１９２）にそれぞれ記載されている、ＬＩＭ１２１５及びＬＩＭ２４０５のコロニー形成を刺激する能力をテストした。前記細胞を、それぞれ、１００００細胞／ｍｌ（ＬＩＭ２４０５）の最終濃度でプレート化した。種々の細胞ラインからの調整培地をテストし、そのデータを図８に示す。更に、Ａ２とＥＧＦともテストした。他の因子と比較してＬＩＭ２５３７が優れていることが明白である。例１２ＬＩＭ２５３７からの調整培地を、正常なマウスとヒトの結腸粘膜陰窩細胞を使用したアッセイでテストした。マウスの結腸を切開し、流水で洗浄して便物質を除去し、表面を０．４％の次亜塩素酸ナトリウムを使用して汚染除去した。ヒト結腸粘膜を結腸切除標本から得、一見して正常な組織を、腫瘍から離間した部位から採取した。ヒト組織を、ネズミのサンプルを洗浄したのと同じ要領で洗浄した。陰窩を前述したようにして単離し、次に、これらの陰窩を、２％の胎児ウシ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０中で細胞当り３００陰窩の濃度で、ラット尻尾のコラーゲンでコーティングした２４のウェル・プレートに１ｍｌで分割した。テストしたすべての因子を、０．１ｍｌの容量に添加してウェルを３倍にし、その後、３７℃で４４時間培養した。ウェルを１μキューリー／ｍｌ（最終濃度）の³Ｈ−チミジンで４時間ラベル化した。この工程の後、前記ウェルの内容物を溶解し、ホワイトヘッド他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４６：８５８− ８６３（１９９０）に従って、ベータ線カウンタで計数する前に、ガラス繊維フィルタ上に収集した。前記因子、ＥＤＦ，ｂ−ＦＧＦ，ＫＧＦＳＣＦ（表皮成長因子、基礎線維芽成長因子、角膜実質細胞成長因子、及び幹細胞因子）を、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βと同様に、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲で使用した。これらの結果を、図９及び１０に示す。図９は、³Ｈ−チミジンの陰窩細胞への取込測定を示している。ＬＩＭ２５３７からの前記調整培地は、ＥＧＦやＦＧＦと異なり、³Ｈ−チミジンの摂取を引き起こした。同様に、ＬＩＭ２４０５調整培地は、摂取を刺激しなかった。その結果は図示されていないが、前述したその他の因子も、細胞ラインＬＩＭ１２１５，ＬＩＭ１８３９，ＬＩＭ２０９７，ＬＩＭ２４１５及びＬＩＭ２４０８からの調整培地と同様にテストした。ＬＩＭ２４０８を除いて、いずれもなんの活性化も示さなかった。これに対して、ＬＩＭ２４０８は、いくらかの活性化を示したが、これは、ＬＩＭ２５３７によって示されたものとは比較にならなかった。上述の諸実験は、細胞ラインＬＩＭ２５３７が、結腸陰窩細胞に対して明らかに分裂促進性を有していることを示すものである。更なる研究によって、この因子が熱に対して不安定で、６〜８のｐＨ範囲においてのみ安定していることが判った。更に、前記調整培地のサンプルを、３０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、上清と膜含有ペレットを形成した。前記活性の大半がこのペレット内に見られ、これは、前記因子が膜に関連していることを示している。前記ペレット状物質の電子マイクログラフによって、小嚢の存在が確認された。例１３ウシ下垂体の前記Ａ２フラクション（図１１）とその製造方法については、ここにその開示内容の全体を参考文献として添付するスミス他Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ１１９：３２０−３２６（１９９３）と、スミス他、ＢＢＲＣ１１９：３１１−３１８（１９８４）等によって既に開示されている。これらのプロトコルに従って作られたＡ２の製造に加えて、新鮮なウシの下垂体の１５０ｇのサンプルの抽出物を、燐酸塩−クエン酸塩緩衝液（４容量、ｐＨ４．０）中で均質化し、その上清を、１００００ｇの遠心分離によって清澄化した。その結果得られた抽出物を、５ＭＮａＯＨでｐＨ８．０に調節し、４℃で、５０ｍｌ／分の流速で、ＤＥＡＥセファローズｆａｓｔｆｌｏｗカラム（３００ｘ５０ｍｍＩ．Ｄ．）上に装填した。ブレークスルー・フラクションは、前述した例および図５に示すように、ＬＩＭ１２１５分裂促進活性を有していた。このフラクションを、１ＭのＨＣｌでｐＨ５．０に調節し、ＣＭセファローズＦａｓｔＦｌｏｗカラムに適用した。このカラムを、２０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）（２４０ｍｌのフラクション）中の０．１及び０．３５ＭのＮａＣｌによって、５０ｍｌ／分の流速で、段階的に溶離した。蒸留水と１：３に希釈した前記活性０．３５Ｍのフラクションの部分標本（ａｌｉｑｕｏｔ）を、１ＭのＨＣｌを滴下添加することによってｐＨ５．０に調整し、濃縮し、更に、図１２に結果を示す縮小寸法（即ち、１００ｘ１０ｍＭＩ．Ｄ．）の別のＣＭセファローズＦａｓｔＦｌｏｗカラム上で、２ｍｌ／分の流速でのグラジエント溶離（１０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ５．０）と、０．４ＭのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液との間の２５分間のリニア・グラジエント部分と、更にそれに続いて１５分間、０．４ＭのＮａＣｌ緩衝液で等量溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃｅｌｕｔｉｏｎ）した）と、その後の０．４ＭのＮａＣｌ緩衝液との、）により純化した。例１４上述の例１３において得たピーク活性フラクション（ＰＯＯＬ１）の部分標本（１ｍｌ）を、ＢｒｏｗｎｌｅｅＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ３００逆相ＨＰＬＣカラム（３０ｘ２．１ｍｍＩ．Ｄ．）上に装填し、このカラムを、第１溶剤としての０．１５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と、第２溶剤としての、０．１２５％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを含む６０％のアセトニトリル水溶液との間の６０分間のリニアグラジエントにて、１００ｕｌ／ｍｉｎの流速で溶離した。カラム温度は４５℃であった。クロマトグラム（２１５ｎｍ）を、ＬＩＭ１２５１細胞上の対応する分裂促進活性とともに、図１３Ａ及び１３Ｂに示す。分裂促進活性の大きなピークを示しているフラクション２１は、２０．９分での紫外線吸収ピークと一致している。二次微分吸光分析によって、図１４に示すように、アミノ酸の最小特性からトリプトファン残基が、２９０±２ｎｍにおいて同定された。例１５例１４に記載したピークの部分標本を、ポリブレンをキャリアに使用して、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ− ｔｅｍｓＭｏｄｅｌ４７０Ａガス・フェーズ・シーケンサのサンプルディスクに直接に使用した。配列決定を行い、これによって次の配列が明らかとなった。最初の産生量は１１４ピコモルであった。この物質は、ナカニシ他，Ｎａｔｕｒｅ２７８：４２３−４２７（１９７９）に記載されているように、ウシプロ−オピオメラノコルチン（ｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ））（ＰＯＭＣ）_76-103に対応するアミノ酸の２８アミノ酸残基ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）に対応している。これに対して、前記配列は、Ｙ₃ＭＳＨ（フェンガー他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５０：７８１−７８８（１９８８）；ベイトマン他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２２１３０−２２１３６）として知られているペプチドのリジンＮ−末端延長形状と同等である。前記最初の６回のサイクルにおいて生成されたＰＴＨアミノ酸のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示すクロマトグラフが、対応のＰＴＨアミノ酸標準とともに図１５に示されている。例１６前記Ａ２ペプチドの（ＰＯＭＣ）_76-103による同定は、位置１６のアミノ酸がＡｓｎであることを示唆している。これは潜在的なグリコシル化サイトである。グリコシル化が活性に必要であるか否かを調べ、かつ、Ａ２において観察される活性がなんらかの特徴付けられていない成分によるものではなく、前記ペプチドによるものであるかどうかを調べるために、合成（ＰＯＭＣ）_76-103使用して追加の実験を行った。前記物質を、公知の技術を使用して合成し、次に、これを、ここにその全部を参考文献として添付するナイス他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４４２５−１４４３０（１９９１）に従って、ＬＩＭ１２１５細胞上における分裂促進アッセイに使用した。前記合成ペプチドを、前記アッセイにおいてＥＧＦと比較した。その結果を、図１６Ａ（合成ペプチド）と１６Ｂ（ＥＧＦ）に示す。前記合成ペプチドは、約３倍（ＥＣ₅₀：約７５ｐＭ）の刺激指数を示し、生物学的に活性であることが観察された。ＥＧＦも、この範囲（ＥＣ₅₀：５０ｐＭ）では活性であるが、但し、これは８倍の刺激によるものである。類似のＥＣ₅₀値は、（ＰＯＭＣ）_76-103とＥＧＦとが、その標的、即ち、結腸細胞、に対する効果において、同じ強度であると見なすことができることを示している。例１７ＰＯＭＣ_76-103単体の効果と、これを表皮成長因子（ＥＧＦ）と組み合わせた場合の効果とを調べた。前記ペプチドと組換えヒトＥＧＦ（”ｒｈＥＧＦ”）とを、前述したコロニー形成アッセイにおいて、それぞれ単独でテストし、更に、組み合わせてテストした。その結果は、以下に要約する通りである。ＬＩＭ１２１５コロニー刺激活動この効果は予想外のものであり、これは追加効果を遥かに越えるものである。ここに記載し、例１３−１７によって例示した本発明は、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に示されたアミノ酸配列を有するペプチドを投与することによって、結腸や腸細胞などの或る種の細胞の増殖を刺激する方法に関するものであることが理解されるであろう。このペプチドは、ウシの下垂体抽出物に由来するものであり、既に指摘したように、公知である。しかしながら、これが細胞増殖刺激作用を有することは驚くべきことである。下垂体抽出物を結腸細胞の刺激と結び付けて考える者はいないであろう。更に、このペプチドの結腸細胞に対する効果は、他の既に知られている結腸細胞刺激因子（ＥＧＦ及びｂＦＧＦ）や、その混合物のいずれよりも大きなものである。従って、ＰＯＭＣ_76-103が結腸細胞に対して優れた細胞増殖刺激作用を有するという事実が驚くべきものであると明言することができる。従って、本発明の一態様は、前記ペプチドＰＯＭＣ_76-103（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１）を細胞に適用することによって、結腸や腸の細胞のような細胞の増殖を刺激する方法に関する。この適用は、生体外の適用、又は生体内の適用のいずれであってもよい。後者の場合、本発明のペプチドは、ＡＣＴＨ分子から派生するものであり、ＡＣＴＨによる生体内療法は周知であることから、この適用方法は適切である。前記ペプチドを使用した処置のための本発明による治療様式は、単純に、前記ペプチドの有効量を、それを必要とする対象体に投与するという形態を採る。この有効量は可変である、但し、ディエム（ｄｉｅｍ）当り２回の投与が行われる場合においては約．１ｕｇ〜約１．５ｕｇの一投与分が好ましい。特に好ましい態様は、対象体が、ここでも１日につき２回の使用に分割して、ディエム当り約．２５ｕｇ〜約２．０ｕｇの投与を受ける態様である。生体内投与の場合、前記ペプチドを、細胞増殖が望まれる部位を標的化して行われることが望ましい。この標的化は、例えば、前記ペプチドを、結腸細胞特異性モノクローナル抗体などの標的化物質に複合化することによって達成可能である。モノクローナル抗体の一具体例は、ＡｍｅｒｉｃａＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８７７９としてブダペスト条約下で寄託されているＡ３３である。その最初の寄託は、１９８５年４月５日に行われた。前記ペプチドの抗体への複合化は、ここで繰り返す必要のない公知技術を使用して行うことができる。前記ペプチドは、単独、又は、上述したタイプの複合物として、結腸細胞および／又は他の細胞を刺激する、その他の薬剤と共に対象体に投与することができる。このような薬剤の具体例は、ＥＧＦや、ｂＦＧＦ等のＦＧＦや、インターロイキン・ファミリーのメンバー、特に、血小板などの種類の細胞の増殖を刺激するインターロイキンを含む成長因子である。特に、インターロイキン６は、巨核球刺激活動を示すことが知られている。前述したペプチド及び／又はこれを含む試薬の投与は、細胞増殖が必要な、また、細胞増殖の速度を刺激することが望ましい全ての結腸障害の治療に有効である。このような状態の非限定的具体例は、結腸潰瘍、感染によって引き起こされた組織外傷、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられるが、当業者においては、前述した広範囲の規定に含まれるその他のものも周知であろう。本発明には、更に、実質的にここに記載したペプチドと、第２の細胞増殖刺激剤とからなる試薬も含まれる。このような試薬は、”１ポット”として構成したり、あるいは、例えば、前記２種類の薬剤が別々に保管され、投与される時に混合される場合には、薬剤キットとして構成することができる。このようなキットは、それぞれが本発明のキットの１つの特徴構成を収納する２つ又はそれ以上の容器手段と、このキットのすべての部材を収納する１つのより大型の容器手段とによって特徴付けられる。１つの固有の（ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ）ペプチドを、結腸細胞の増殖を刺激するのに利用可能であるという認識は、過剰な細胞増殖によって特徴づけられる結腸の障害が、前記ペプチドが自己分泌成長因子として作用する状況に関連しているかもしれないということを示唆するものである。従って、本発明においては、更に、過剰細胞増殖によって特徴づけられる結腸のこのような自己分泌障害を、抗体、モノクローナル抗体、あるいは、前記ペプチドに対して特異的な結合抗体フラグメント等の、前記ペプチドの特異的インヒビタを投与することによって治療する方法も考慮される。本発明のその他の特徴は、当業者にとって明白であろう。従って、これらはここで繰り返す必要がない。ここに使用された用語や表現は、記載のためのものであって、限定のためのものではなく、従って、このような用語や表現を使用するに当たって、図示され記載された特徴構成の均等物またはその一部を除外する意図はなく、本発明の範囲内において様々な改変構成が可能であると理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年３月２１日【補正内容】請求の範囲：１．結腸細胞の増殖を刺激するための生体外方法であって、前記結腸細胞に対して、実質的に配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１を有するペプチドからなる組成物を投与する工程を有し、前記組成物が結腸細胞増殖を刺激するのに有効な量投与される方法。２．結腸細胞の増殖を刺激するための生体外方法であって、前記結腸細胞に対して、実質的に配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１を有するペプチドからなる組成物と成長因子とを投与する工程を有し、前記組成物が結腸細胞増殖を刺激するのに有効な量投与される方法。３．請求項２の方法であって、前記成長因子はＥＧＦ又はＦＧＦである。４．請求項２の方法であって、前記成長因子はインターロイキンである。５．請求項４の方法であって、前記インターロイキンは血小板の増殖を刺激する。６．請求項２の方法であって、前記成長因子はＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦである。７．結腸細胞の増殖を刺激するための方法であって、それを必要とする対象体に対して、実質的に配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１を有するペプチドからなる組成物を投与する工程を有し、前記組成物が結腸細胞増殖を刺激するのに有効な量投与される方法。８．請求項７の方法であって、前記対象体は化学療法患者である。９．請求項７の方法であって、前記ペプチドは、１日につき約０．１ｍｇ〜約２．５ｍｇの範囲の量投与される。１０．結腸細胞の増殖を刺激するための方法であって、それを必要とする対象体に対して、実質的に配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１を有するペプチドからなる組成物と成長因子とを投与する工程を有し、前記組成物が結腸細胞増殖を刺激するのに有効な量投与される方法。１１．請求項１０の方法であって、前記対象体は化学療法患者である。１２．請求項１０の方法であって、前記成長因子はＥＧＦまたはＦＧＦである。１３．請求項１０の方法であって、前記成長因子はインターロイキンである。１４．請求項１３の方法であって、前記インターロイキンは血小板の増殖を刺激する。１５．請求項１０の方法であって、前記成長因子はＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦである。１６．結腸細胞の増殖を刺激するための生体外方法であって、前記結腸細胞に対して、実質的に配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のアミノ酸配列を有するペプチドからなる組成物と、結腸細胞に特異的に結合する抗体とを、細胞増殖を刺激するのに有効な量投与する工程を有する方法。１７．請求項１６の方法であって、前記抗体はモノクローナル抗体Ａ３３である。１８．結腸細胞の増殖を刺激することによって結腸障害を治療する方法であって、それを必要とする対象体に対して、実質的に配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のアミノ酸配列からなるペプチドを、結腸細胞の増殖を刺激するのに十分な量投与する工程を有する方法。１９．請求項１８の方法であって、前記障害は結腸潰瘍である。２０．請求項１８の方法であって、前記障害は感染関連組織外傷である。２１．請求項１８の方法であって、前記障害はクローン病である。２２．請求項１８の方法であって、前記ペプチドは、１日につき約．１ｍｇ〜約２．５ｍｇの範囲の量投与される。２３．請求項１８の方法であって、前記ペプチドを、このペプチドと、結腸細胞に特異的に結合する抗体との複合物として投与する。２４．請求項２３の方法であって、前記抗体は、モノクローナル抗体Ａ３３である。２５．細胞増殖を刺激するのに有効な治療用試薬であって、以下のものを細胞増殖刺激量有する、（ｉ）配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のアミノ酸配列を有するペプチドと、（ｉｉ）細胞増殖刺激剤。２６．請求項２５の試薬であって、前記剤はコロニー刺激因子である。２７．請求項２６の試薬であって、前記コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦである。２８．請求項２６の試薬であって、前記第２細胞増殖刺激剤は、成長因子である。２９．請求項２８の試薬であって、前記成長因子はＥＦＧ又はＦＧＦである。３０．請求項２６の試薬であって、前記第２細胞増殖刺激剤はインターロイキンである。３１．請求項３０の試薬であって、前記インターロイキンは血小板増殖刺激インターロイキンである。３２．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のアミノ酸配列からなるペプチドの過剰自己分泌産出によって特徴づけられる状態を治療する方法であって、それを必要とする対象体に対して、前記ペプチドに対するインヒビタを、それによって引き起こされる過剰細胞増殖を阻止するのに十分な量投与する工程を有する方法。３３．請求項３１の方法であって、前記インヒビタは抗体である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジェイムズ，アールオーストラリア国ヴィクトリア 3050 パークヴィル（無番地）ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者シンプソン，アールオーストラリア国ヴィクトリア 3050 パークヴィル（無番地）ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者バージェス，アントニー，ダブリュオーストラリア国ヴィクトリア 3050 パークヴィル（無番地）ロイヤル・メルボルン・ホスピタル (72)発明者ホワイトヘッド，ロバート，エイチオーストラリア国ヴィクトリア 3129 ボックス・ヒル・ノーススプリングフィールド・ロード 52

Claims

【特許請求の範囲】１．結腸細胞の増殖を刺激する方法であって、前記結腸細胞に対して、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：）１のアミノ酸配列からなるペプチドの細胞増殖刺激量を投与する工程を有する方法。２．請求項１の方法であって、前記ペプチドを、細胞の生体外培地に投与する方法。３．請求項１の方法であって、前記ペプチドは、結腸細胞の増殖を必要とする対象体に投与される。４．請求項１の方法であって、前記対象体は化学療法患者である。５．請求項２の方法であって、更に、前記対象体に対して、第２の細胞増殖刺激剤を投与する工程を有し、前記刺激剤は非結腸細胞を刺激する。６．請求項５の方法であって、前記第２剤はコロニー刺激因子である。７．請求項６の方法であって、前記コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ −ＣＳＦである。８．請求項５の方法であって、前記第２剤は成長因子である。９．請求項８の方法であって、前記成長因子はＥＧＦ又はＦＧＦである。１０．請求項５の方法であって、前記第２剤はインターロイキンである。１１．請求項１０の方法であって、前記インターロイキンは血小板増殖刺激インターロイキンである。１２．請求項３の方法であって、前記ペプチドは、１日につき約．１ｍｇ〜約２．５ｍｇの範囲の量投与される。１３．請求項３の方法であって、前記ペプチドは、このペプチドと、結腸細胞に特異的に結合する抗体との複合物として投与される。１４．請求項１３の方法であって、前記抗体はモノクローナル抗体Ａ３３である。１５．結腸細胞の増殖を必要とする結腸障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象体に対して、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に記載のペプチドを、結腸細胞の増殖を刺激するのに十分な量だけ投与する工程を有する方法。１６．請求項１５の方法であって、前記障害は結腸潰瘍である。１７．請求項１５の方法であって、前記障害は感染関連組織外傷である。１８．請求項１５の方法であって、前記障害はクローン病である。１９．請求項１５の方法であって、前記ペプチドは、１日につき約．１ｍｇ〜約２．５ｍｇの範囲の量投与される。２０．請求項１５の方法であって、前記ペプチドを、このペプチドと、結腸細胞に特異的に結合する抗体との複合物として投与する。２１．請求項２０の方法であって、前記抗体は、モノクローナル抗体Ａ３３である。２２．細胞増殖を刺激するのに有効な治療試薬であって、以下のものを細胞増殖刺激量だけ有する、（ｉ）配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のアミノ酸配列を有するペプチドと、（ｉｉ）第２の細胞増殖刺激剤。２３．請求項２２の試薬であって、前記剤はコロニー刺激因子である。２４．請求項２３の試薬であって、前記コロニー刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦである。２５．請求項２３の試薬であって、前記第２細胞増殖刺激剤は成長因子である。２６．請求項２５の試薬であって、前記成長因子はＥＧＦ又はＦＧＦである。２７．請求項２３の試薬であって、前記第２細胞増殖刺激剤はインターロイキンである。２８．請求項２７の試薬であって、前記インターロイキンは血小板増殖刺激インターロイキンである。２９．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のアミノ酸配列からなるペプチドの過剰自己分泌産出によって特徴づけられる状態を治療する方法であって、それを必要とする対象体に対して、前記ペプチドに対するインヒビタを、それによって引き起こされる過剰細胞増殖を阻止するのに十分な量投与する工程を有する方法。３０．請求項２９の方法であって、前記インヒビタは抗体である。