JPH09503788A - 治療用送達組成物及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、感染性疾患や遺伝子疾患を遺伝子治療法及びアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他の核酸配列の細胞内送達によって治療するための組成物及び方法に関するものである。本発明は、疾病状態の処置に有効な治療用送達組成物を包含し、該組成物は、核酸配列機能を改変し得る有効量の治療用化合物と次の一般式：ＨＯ(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_b(Ｃ₃Ｈ₆Ｏ)_a(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_bＨ（式中、ａは（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）で表わされる疎水性部分が約750から約15,000、好ましくは約2,250から約15,000、更に好ましくは約3250から約15,000の分子量を有するような整数であり、ｂは(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)で表わされる親水性部分がこの化合物の約１重量％から約50重量％、好ましくは約５％から約20％であるような整数である。）を有する有効量の界面活性非イオン性ブロックコポリマーとの投与可能な混合物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 治療用送達組成物及びその使用方法 技術分野 本発明は、細菌、ウイルス、菌類及び原生動物を殺すか又はその増殖を抑制す る治療用送達(therapeutic delivery)化合物及び該化合物を含む組成物並びにそ の使用方法に関するものである。これらの化合物、組成物及び方法は薬剤及び他 の化合物を細胞内部に送達しそして細胞内生物を制御するのに有効である。 発明の背景 将来の医療や治療法の基礎となる可能性のある多数の新規で且つ潜在的に有用 である技術が開発されつつある。このような技術の例には遺伝子置換、アンチセ ンス遺伝子治療法、トリプレックス遺伝子治療法及びリボザイムに基づく治療法 が含まれる。しかし乍ら、成功するためには、これらの技術には細胞、核及び微 生物膜を通過して治療剤を送達する手段が必要である。 最近の技術や多数の遺伝子の構造及び機能を理解する我々の能力の進歩によっ て一定の遺伝子の活性を選択的に消失させるか又は修正することが可能になって いる。遺伝子活性の改変は多数の方法で達成することができる。例えば、「アン チセンス」化合物として知られる或る種の遺伝子メッセージ又はウイルス配列と 相補的なオリゴヌクレオチドはウイルスに対して阻止効果を有することが示され ている。細胞又はウイルスの標的ＲＮＡメッセージとハイブリダイズするアンチ センス化合物を創製することによって、メッセージからタンパク質への翻訳を妨 げるか又は阻止することができる。このようなやり方で遺伝子活性を調節するこ とができる。 特定の遺伝子を非活性化できることが大きな治療上の利益をもたらす。例えば 、ウイルス遺伝子産生物を捜し出しそして破壊するアンチセンスＲＮＡ及びＤＮ Ａ分子を用いてウイルス疾病と対抗することが理論的に可能である。組織培養で は、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヘルペス−ウイルス、インフルエンザ ウイ ルス及びエイズ（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全ウイルスによる感染を阻 止した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを突然変異腫瘍遺伝子に対してターゲ ッテイングすることも可能である。アンチセンス技術も増殖や発達を調節する可 能性を有している。しかし乍ら、遺伝子治療法が有効に作用するためには、アン チセンス治療化合物が細胞形質膜を通過して細胞質ゾルに送達されなければなら ない。 遺伝子活性はまた、遺伝子治療法として知られる技術でセンスＤＮＡを使用し て修正される。欠陥遺伝子は、欠陥のない「良好な」又は正常な遺伝子を投与す ることによって置換されるか又は補われる。投与された正常な遺伝子は染色体中 に挿入されるか又は細胞外ＤＮＡ中に存在して正常なＲＮＡを産生し、そしてこ れが順次正常な遺伝子産生物になる。このような方法で、遺伝子産生物の産生に おける遺伝子欠陥及び欠損を矯正することができる。更なる遺伝子治療法は細胞 の正常な遺伝的相補体(genetic complement)を増加させる可能性を有している。 例えば、ＨＩＶと闘う１つの方法は細胞をＨＩＶ感染に対して耐性にする遺伝子 を感染者のＴ細胞中に導入することであるということが提案されている。遺伝子 治療法のこの形態はときどき「細胞内免疫化」と呼ばれる。ポリヌクレオチドの ような遺伝物質を哺乳動物に投与して、この投与された核酸配列の遺伝子産生物 に対して免疫応答を誘発させることができる。このような遺伝子ワクチンは次の ようにして免疫応答を誘発する。先ず、核酸配列をヒト又は動物に投与する。次 に、投与された配列が発現してヒト又は動物内で遺伝子産生物を形成する。ヒト 又は動物内部の遺伝子産生物は外来物質として認識され、そしてヒト又は動物の 免疫系は遺伝子産生物に対して免疫学的応答を示す。しかし乍ら、この試みは現 在、細胞膜と核膜の両方を通過する遺伝物質の送達を容易にする効果的な遺伝子 送達系がないため、実現できない。 最後に、遺伝子治療法はインビボでの医薬品送達法として使用することができ る。例えば、治療用化合物をコードする遺伝子を内皮細胞に送達できるとすれば 、これらの遺伝子産生物は血流への流入が容易であろう。現在、遺伝子はエクス ビボ(ex vivo)で細胞に送達されそしてその後動物に再度導入される。 レトロウイルスベクターを使用して遺伝子を単離細胞にエクスビボで送達し、 そしてその後これを患者に注入して戻すことができる。しかし乍ら、レトロウイ ルスベクターは、例えば分裂する細胞にしか遺伝子を送達できないこと、送達さ れる遺伝子が無作為的に組み込まれること、望ましくない遺伝子改変を引き起こ す可能性、及び感染性の野生タイプレトロウイルス体に逆戻りする可能性のよう な幾つかの欠点を有している。アンチセンス遺伝子治療法のもう１つの欠点は、 これがメッセンジャーＲＮＡレベルで有効であることであり、そしてこのことは 、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞質ゾル内の全てか又はかなりの数のｍ ＲＮＡと相互作用する量で導入しなければならないこと及びこのような処置が活 発なｍＲＮＡ合成中にしか有効でないことを意味する。更に、期間中有効である ためには上記オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡの合成中ずっと上記の高い量のレベ ルで維持しなければならない。 新たに開発された「トリプレックスＤＮＡ」技術は遺伝子調節における改良で ある。トリプレックスＤＮＡ技術はデュプレックスＤＮＡの特有の領域と特異的 に結合するオリゴヌクレオチドと化合物を使用し、それによって標的遺伝子を不 活性化する。トリプレックスＤＮＡ技術の利点は、上記結合がｍＲＮＡレベルで はなくてＤＮＡレベルであるので、遺伝子発現を改変するために、上記オリゴヌ クレオチド又は化合物の単一のコピーしか必要でないということである。しかし 乍ら、トリプレックスＤＮＡ技術の欠点は、上記オリゴヌクレオチド又は化合物 が細胞膜だけでなく、微生物感染の治療の場合には微生物膜、又は染色体ＤＮＡ 中に組み込まれた外来ＤＮＡの真核細胞遺伝子機能若しくは発現を改変する場合 には核膜も通過しなければならないことである。 もう１つの生じつつある技術は遺伝子疾患を治療するためにリボザイムを治療 的に使用することに関するものである。リボザイムはハイブリダイズ領域及び酵 素領域からなる触媒ＲＮＡ分子である。リボザイムは将来、核酸配列の標的領域 に特異的に結合するようにされ、該配列から遺伝子産生物への発現又は翻訳を改 変するように上記配列を切断するか又はそうでない場合には酵素的に修飾するこ とができるであろう。 それ故、遺伝子治療法で使用できる遺伝子、ポリヌクレオチド及びアンチセン スオリゴヌクレオチドのような遺伝子物質の改良された送達系の必要性は大きい 。 更に詳細には、遺伝子化合物及び他の薬剤並びに治療用化合物の細胞膜通過輸送 を促進できる界面活性剤特性を有する非毒性組成物の需要がある。 後天性免疫不全症候群又はエイズ、即ち、ヒト免疫不全ウイルス又はＨＩＶと も呼ばれるヒトレトロウイルスであるヒトＴリンパ球志向ウイルスIII（ＨＴＬ Ｖ−III）によって引き起こされると考えられる疾病を有効に治療するために特 に緊急の需要がある。他のレトロウイルスと同様に、ＨＩＶはその遺伝子物質と してリボ核酸即ちＲＮＡを有している。ウイルスが宿主細胞に入ると、逆転写酵 素と呼ばれるウイルス酵素は鋳型としてウイルスＲＮＡを利用して対応するＤＮ Ａ分子を組み立てる。このＤＮＡは細胞核内を移動しそして宿主染色体に入り込 み、そしてそこでウイルス複製の基を作る。 ＨＩＶの場合には、宿主細胞はしばしばＴ4 リンパ球、即ち免疫系で中心的且 つ調節的な役割を有する白血球である。ＨＩＶが１度Ｔ4 細胞内に入ると、この ウイルスはリンパ球が二次感染によって免疫学的に刺激されるまで潜伏したまま で存在することができる。その後、このウイルスは急速に複製して宿主細胞を殺 すか又は無能力にする。こうして生じるＴ4 細胞の枯渇や活性消失によって患者 は、通常は健常者に危害を与えない作用体による「日和見」感染を受け易くなる 。このウイルスは他の多数のメカニズムでも宿主に損傷を与える。 エイズ感染に対する多数の治療法が現在研究されている。これら研究中の治療 法の幾つかは、逆転写酵素が最終的にはウイルスになるウイルスＤＮＡを作るた め、逆転写酵素の阻害に基づいている。この目的で使用される医薬品はＤＮＡ構 成単位を形成する核酸の化学的類似体である。この類似体を感染細胞に供給する と、逆転写酵素はこれを成長中のＤＮＡ鎖に組み入れる。しかし乍ら、この類似 体はその次の構成単位用の正しい結合点を欠いているので、ＤＮＡ鎖は終結する 。短縮ＤＮＡは宿主染色体中に導入されないか又はウイルス複製の基礎を作れな いので、感染の拡大は停止する。ヌクレオチドを模擬することによって作用する と考えられる化合物の１つはアジドチミジン即ちＡＺＴである。しかし乍ら、Ａ ＺＴは重篤な副作用を有することが知られており、エイズ疾病を緩解する有効性 は疑問視されている。ＡＺＴ並びに他の抗ウイルス及び抗微生物医薬品の有効性 は、治療剤を感染部位に送達するための改良された手段及び方法が利用できる場 合、 高めることができよう。 発明の概要 本発明は、細菌感染やＨＩＶ並びに他のＤＮＡ及びＲＮＡウイルスによって引 き起こされる感染（しかし、これらに限定されない）のような疾病状態を治療す るために治療用薬剤をヒト又は動物に送達する方法を含む。本発明は特に、感染 性疾患や遺伝子疾患を遺伝子治療法及びアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他 の核酸配列の細胞内送達によって処置するための組成物及び方法に関するもので ある。 本発明は、疾病状態の処置に有効な治療用送達組成物を包含し、該組成物は、 核酸配列機能を改変し得る有効量の治療用化合物と下記一般式を有する有効量の 界面活性非イオン性ブロックコポリマーとの投与可能な混合物を含む。 ＨＯ(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_b(Ｃ₃Ｈ₆Ｏ)_a(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_bＨ （式中、ａは（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）で表わされる疎水性部分が約750から約15,000、好ま しくは約2250から約15,000、更に好ましくは約3250から約15,000の分子量を有す るような整数であり、そしてｂは(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)で表わされる親水性部分が重量でこ の化合物の約１％から約50％、好ましくは約５％から約20％であるような整数で ある。） 特に有用な組成物は、遺伝子発現及び／又はタンパク質翻訳を改変し得る化合 物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプレックスＤＮＡ化合物、リ ボザイム又は核酸配列機能を改変し得る他の化合物と、上記した非イオン性ブロ ックコポリマーとの混合物である。 本発明の組成物は、局所、経皮、経口、経粘膜、皮下注射、静注、腹腔内注射 及び筋注を含むがこれらに限定されない多数の経路によって投与することができ る。 従って、本発明の１つの目的は治療用医薬品送達ビヒクルを提供することであ る。 本発明のもう１つの目的は、治療剤と混合したとき、１つ以上の治療用核酸配 列機能改変剤の食細胞のような細胞内への送達を促進する組成物を提供すること である。 本発明のもう１つの目的は、細胞内に送達された物質と相乗的に作用する組成 物を提供することである。 本発明の更にもう１つの目的は、核酸配列機能を改変し得る核酸配列及び化合 物の細胞質膜通過移動及び導入を促進する界面活性剤特性を有する非イオン性ブ ロックコポリマーを提供することである。 本発明の更なる目的は、核酸配列及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを非イ オン性ブロックコポリマーと組み合わせて使用して遺伝子疾患及び生理学的疾患 を処置する組成物及び方法を提供することである。 本発明のもう１つの目的は、トリプレックスＤＮＡ化合物を使用して遺伝子発 現を操作するのに有用な組成物及び方法を提供することである。 本発明の更にもう１つの目的はＤＮＡワクチンを提供することである。 本発明の１つの目的は、感染性疾病患者を処置するために使用できる組成物を 提供することである。 本発明の尚もう１つの目的は、ヒト又は動物におけるウイルス感染の処置方法 を提供することである。 本発明のもう１つの目的は、動物とヒトの両方でウイルスの複製を阻止するの に有効な化合物及び方法を提供することである。 本発明のもう１つの目的は、ＨＩＶ並びに他のＲＮＡ及びＤＮＡウイルスの複 製を阻止するのに有効な化合物及び方法を提供することである。 本発明の尚もう１つの目的は、ヒト又は動物における微生物感染の処置方法を 提供することである。 本発明のもう１つの目的は、ヒト又は動物に注入する前に血液製品中のウイル スを不活性化することである。 本発明のこれらの目的及び他の目的、特徴並びに利点は開示した実施態様に関 する以下の詳細な説明及び添付の請求の範囲を考慮すれば明白になるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、ブロックコポリマーを疎水性部分の分子量と親水性部分のパーセント で示す格子図である。 図２は、好ましい治療用送達ブロックコポリマーを疎水性部分の分子量と親水 性部分のパーセントで示す格子図である。 図３は、更に好ましい治療用送達ブロックコポリマーを疎水性部分の分子量と 親水性部分のパーセントで示す格子図である。 詳細な説明 本発明は、非イオン性ブロックコポリマーと核酸配列機能を改変し得る核酸配 列又は化合物との混合物である遺伝子治療組成物、並びに遺伝子発現及び／又は タンパク質翻訳を細胞内で改変するために、その必要のあるヒト又は動物に送達 する方法を包含する。ポリオキシエチレンの割合が低い高分子量界面活性非イオ ン性ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーがＤＮＡや 他の化合物の細胞内への輸送を促進し、そしてその結果疾病治療用のインビボ治 療剤の細胞内への送達に有用であることが、予想せず見い出された。ブロックコ ポリマーは膜の再封を助けるのに特に有用であり、そしてその結果、核酸配列又 は他の化合物が細胞内に導入された細胞の生存パーセントを高めるものと思われ る。驚いたことに、本発明の非イオン性ブロックコポリマー及び核酸配列を含む 組成物は核酸配列単独よりＤＮＡアーゼの分解効果を受け難いことも分かった。 本発明はまた、微生物を殺すか又はその増殖を阻止しそして核酸配列の発現又 は機能を改変する治療用組成物及び方法も包含する。本発明が有効である細菌の 例はマイコバクテリウム種、例えば結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、トリ 型結核菌(Mycobacterium avium)及びらい菌(Mycobacterium leprae)である。本 発明が有効である他の微生物には、トラコーマ クラミジア(Chlamydia trachoma tis)、肺炎クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、リステリア モノシトゲネス(Li steria monocytogenes)、カンジダ アルビカンス(Candida albicans)、クリプト コッカス ネオホルマンス(Cryptococcus neoformans)、トキソプラズマ ゴンデ イ(Toxoplasma gondii)、ニューモシスティス カリニ(Pneumocystis carinii)、 単純ヘルペスウイルス１型、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルスＡ 及びＢ型、並びにＲＳ(respiratory syncytial)ウイルスが含まれるがこれらに 限定されない。 本発明は、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルス、並びにＨＩＶ若しくはヘルペ ス又はそれらの抗原的に関係のある株によって引き起こされる感染を含めて、ヒ ト又は動物において上記ウイルスで引き起こされる感染及び感染性疾病を処置す る治療用組成物及び方法を包含。抗原的に関連する株は、ＨＩＶに特異的な抗体 と交差反応する株である。当該技術分野の熟練者は、抗ＨＩＶ抗体及び分析すべ きウイルス株を使用して標準的なイムノアッセイ試験を行い、陽性の交差反応性 を調べることによってＨＩＶと抗原的に関連するウイルス株を容易に決定するこ とができる。本願明細書に開示した界面活性コポリマーを含む治療用組成物は細 胞内での上記ウイルスの複製を阻止又は抑制するのに有効である。 本発明には、界面活性非イオン性ブロックコポリマー、核酸配列機能を改変し 得る化合物及び抗生物質又は治療剤の混合物を含む、抗微生物剤を送達しそして 疾病状態を処置するのに有用な治療用組成物が包含される。核酸配列機能を改変 し得る化合物の例には、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌク レオチド、トリプレックスＤＮＡ化合物及びリボザイムが含まれる。本発明の非 イオン性コポリマーと共に使用できる薬剤には、リファンピン(rifampin)、イソ ニアジド、エタンブトール、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイ シン、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン(clofazimine)、リ ファブチン(rifabutin)、オフロキサシンやスパルフロキサシンのようなフルオ ロキノロン類、アジスロマイシン(azithromycin)、クラリスロマイシン、ダプソ ン(dapsone)、ドキシサイクリン、シプロフロキサシン、アンピシリン、アムホ テリシンＢ、フルコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン (pyrimethamine)、スルファジアジン、クリンダマイシン、アジスロマイシン(az ithromycin)、パロマイシン(paromycin)、ジクラザリル(diclazaril)、クラリス ロマイシン、アトバクオン(atovaquone)、ペンタミジン、アシクロビル、トリフ ルオロウリジン、ＡＺＴ、ＤＤＩ、ＤＤＣ及び他の抗ウイルスヌクレオシド類似 体、ホスコルナート(fiscornat)、ガンシクロビル、ウイルスプロテアーゼ阻害 剤、アンチセンス及び他の修飾オリゴヌクレオチド並びにリバビリン(ribavirin )が含まれるがこれらに限定されない。 種々の感染性微生物に使用するのに好ましい医薬品を表Ｉに示す。 任意に、抗微生物剤と非イオン性ブロックコポリマーの治療用混合物に界面活 性剤及び低分子量アルコールが添加される。本発明に有用な界面活性剤の例には トゥイーン(Tween)80並びにリン脂質のような脂肪酸、コーレート及びアミノ酸 とのエマルジョンが含まれる。好ましい界面活性剤はトゥイーン80である。界面 活性剤は、約0.1％から約５％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で上記混合物に添加され る。好ましい界面活性剤濃度は約２％である。「約」という用語を本願明細書で 表現する濃度に用いるとき、この用語は記載の濃度の±10パーセントを意味する 。「低分子量アルコール」は２から８個の炭素を有するアルコールを意味する。 本発明に有用な低分子量アルコールの例はエタノールであり、そしてこれは好ま しい低分子量アルコールである。低分子量アルコールは約0.5％から約５％（ｖ ／ｖ）までの範囲の濃度で上記混合物に添加される。好ましい低分子量アルコー ル濃度は約１％から約３％（ｖ／ｖ）の間である。 本発明にはまた、動物又はヒトを免疫化する組成物及び方法、或いはＤＮＡワ クチン接種と称される方法も包含される。免疫化は、発現物中に含有される免疫 化すべき遺伝子産生物をコードする遺伝子を含む組成物を、細胞膜を通過する遺 伝子物質の取込みを促進し助長するブロックコポリマーと組み合わせて投与して 達成される。導入された遺伝子は発現され、その結果抗原遺伝子産生物が産生さ れる。 更に尚、非イオン性ブロックコポリマーとリンホカインのような癌を殺すか、 縮小させるか又は遅滞させるのに有効な化合物をコードする遺伝子とを含む組成 物を、癌の処置のためにヒト又は動物に投与することができる。 本発明は、好ましくは次の一般式を有するエチレンオキシド−プロピレンオキ シド縮合生成物である界面活性コポリマーを包含する。 ＨＯ(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_b(Ｃ₃Ｈ₆Ｏ)_a(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_bＨ （式中、ａは（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）で表わされる疎水性部分が約750から約15,000の分子 量を有するような整数であり、ｂは(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)で表わされる親水性部分がこの化 合物の約１重量％から約50重量％であるような整数である。） 本発明はまた、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他の核酸配列と 、下記一般式： ＨＯ(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_b(Ｃ₃Ｈ₆Ｏ)_a(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_bＨ （式中、ａは（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）で表わされる疎水性部分が約750及び約15,000の分子 量、好ましくは約2250から約15,000、更に好ましくは約3250から約15,000の分子 量を有するような整数であり、ｂは(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)で表わされる親水性部分が重量で この化合物の約１％から約50％、好ましくは約５％から約20％であるような整数 である。）を有する有効量の非イオン性ブロックコポリマーとの投与可能な混合 物を含む、遺伝子発現及び／又はタンパク質翻訳を改変するのに有用な治療用送 達組成物も包含する。本願明細書で使用される混合物の用語は治療剤と非イオン 性ブロックコポリマーの任意の組合せ物を意味し、それらには薬剤の溶液、懸濁 物又はコポリマーミセル中カプセル化物が含まれる。有効量は、ヒト又は動物で 調節しようとしている、１つ以上の遺伝子によって産生される遺伝子産生物の活 性及び／又は量を改変するのに十分な量である。 本発明はまた、有効量の発現ベクター、その発現ベクター中に含まれる免疫化 すべき遺伝子産生物をコードする遺伝子、及び、下記一般式： ＨＯ(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_b(Ｃ₃Ｈ₆Ｏ)_a(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_bＨ （式中、ａは（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）で表わされる疎水性部分が約750及び約15,000の分子 量、好ましくは約2250から約15,000、更に好ましくは約3250から約15,000の分子 量を有するような整数であり、ｂは(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)で表わされる親水性部分が重量で この化合物の約１％から約50％、好ましくは約５％から約20％であるような整数 である。）を有する有効量の非イオン性ブロックコポリマーとの投与可能な混合 物を含む、特定の遺伝子産生物に対して動物又はヒトを免疫化するのに有用な治 療用送達組成物も包含する。有効量は、ヒト又は動物に投与される核酸配列の遺 伝子産生物に対して免疫学的応答を誘発するのに十分な量である。 ブロックコポリマーに関して記載されている分子量及びパーセント範囲は最大 の範囲と考えるべきでありそして上記した範囲内に入る任意の分子集団が本発明 の態様と考えられると理解すべきである。 ブロックコポリマー分子全体は水に難溶性でありそして実質的に非イオン性で ある。この分子の構成部分の化学的性質よりはむしろ、分子の立体配置及び物理 化学的特性が抗感染性活性や治療的送達活性に大いに関与していると思われる。 本発明の組成物には、水溶液、懸濁物又はエマルジョン、例えば水中油型エマル ジョンが含まれるが、これらに限定されない。 ポリマーブロックは、触媒の存在下高温高圧での、エチレンオキシドとプロピ レンオキシドの縮合によって形成される。結合して各コポリマーのポリマー鎖を 形成するモノマー単位の数には統計的ばらつきがある。示した分子量は各調製に おけるコポリマー分子の平均分子量の概数であり、そして使用した測定方法や較 正標準に依存する。プロピレンオキシドとエチレンオキシドのブロックは純粋で なくてもよいと理解すべきである。他の少量の物質は、全体的な物理化学的特性 が実質的に変更されない限り、混合することができる。これら生成物の調製に関 する更に詳細な説明は米国特許第2,674,619号明細書にあり、この全体を引用に より本願明細書に含める。 本発明で使用できるエチレンオキシド−プロピレンオキシド縮合生成物を表II にまとめる。これらの化合物は、本発明を実施するために使用できる化合物の単 なる代表例であり、本発明を実施するために使用できる全ての考えられる化合物 を含むものではないことを理解すべきである。表IIに示したＢＡＳＦの商品名を 有していない高分子量コポリマーはこれまでに合成されたことのない新規組成物 である。 疎水性部分の分子量と親水性部分のパーセントに基づいて本発明に包含される コポリマーの範囲を示しそして選択される非イオン性ブロックコポリマーを示す 格子図は図１のとおりである。これらのポリマーブロックは触媒の存在下でエチ レンオキシドとプロピレンオキシドの高温高圧での縮合によって形成される。結 合して各コポリマーのポリマー鎖を形成するモノマー単位の数には統計的ばらつ きがある。示された分子量は各調製におけるコポリマー分子の平均分子量の概数 である。これらブロックコポリマーの調製に関する更に詳細な説明は米国特許第 2,674,619号明細書にある（「ブロックポリマー界面活性剤の総説(A Review o fBlock Polymer Surfactants)」、Schmolka I.R.、J.Am.Oil Chemist Soc.、54: 110〜116（1977年）及びBlock and Graft Copolymerization、２巻、R.J.Cer esa編集、John Wiley and Sons、ニューヨーク州、1976年も参照）。 図２及び３に示されるコポリマーが治療用送達剤として特に有効であることが 発見された。図２及び３から明らかなように、治療用送達剤として最も有効なコ ポリマーは高分子量でありそして低いパーセントのＰＯＥ、一般的に20％未満の ＰＯＥを有している。 非イオン性ブロックコポリマーは臨界ミセル濃度以上でミセルを形成する。非 イオン性コポリマーは負の溶解度熱係数を有している。冷所では、水分子の動力 学的エネルギーは減少しそして水分子はＰＯＰブロックの酸素と弱い水素結合を 形成する。この疎水性部分の水和作用は低温での溶解を促進する。温度が上昇す ると、「曇り点」に達し、上昇した水の動力学的エネルギーが水素結合を破壊し 、ポリマーが不溶性となり、そしてミセルが形成される。 かくして、それ自体治療剤であるコポリマーは、追加的な別個の治療剤と組み 合わせるか又はそれら治療剤を加えることができる物理構造を形成することがで きる。従って、本発明の非イオン性ブロックコポリマーは治療用医薬品送達ビヒ クルとして使用することができる。治療剤と非イオン性ブロックコポリマーの混 合物は２つの治療剤の相乗作用という利点を有している。更に、特定の治療剤と 共に使用するために特異的な特徴を有するコポリマーを選択することができる。 例えば、疎水性であるＣＲＬ−8131はリファンピンのような疎水性抗生物質用の 優れた担体である。しかし乍ら、明確には疎水性でない他の物質を本発明に従っ て使用することができる。 治療用送達ビヒクルは、本発明の任意の界面活性非イオン性ブロックコポリマ ーを任意の多様な抗生物質剤と組み合わせて使用して調製される。１つの実施態 様では、ＣＲＬ−8131を約３％から約５％の濃度で使用して治療用送達ビヒクル を構築する。ＣＲＬ−8131より親水性のコポリマーを使用して製造した治療用送 達ビヒクルは、通常、より高い濃度（約５％から約10％）のコポリマーが必要で ある。 治療用医薬品送達ビヒクルとしてコポリマーに基づくミセルを使用することは 、ミセルがマクロファージに、すなわち、ＨＩＶ及び他のウイルス感染部位並び にウイルス治療法の主要な標的に容易に累積しそしてそこに長期間存在するので 、特に望ましい。このような治療用コポリマーに基づく治療用組成物の例には、 ２％のトゥイーン80及び１％のエタノールと組み合わせたＣＲＬ−8131、並びに １％のトゥイーン80及び５％のエタノールと組み合わせたＣＲＬ−8142が含まれ る。 核酸配列機能を改変し得る核酸配列又は他の化合物は遺伝子発現を改変し及び ／又は遺伝子産生物の量又は活性を修正するためにヒト又は動物に投与される。 例えば、上記した非イオン性ブロックコポリマーと混合したアンチセンスオリゴ ヌクレオチドから、遺伝子発現及び／又はタンパク質翻訳を改変するか又は調節 する目的でアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するのに有用な組成物が得ら れる。更に、遺伝子のような核酸配列を投与することができ、そしてこれは染色 体中に入り込んで欠陥遺伝子を置換するか又は増加させることができる。或いは 、細胞内に投与された遺伝子は細胞内に存在しそして染色体外要素において発現 することができる。 本発明は、動物又はヒトを免疫化する新規組成物及び方法も提供する。これら 組成物は発現ベクター、発現ベクターに含まれる免疫化すべき遺伝子産生物をコ ードする遺伝子、及び細胞膜を通過して発現ベクターのような遺伝子物質を輸送 するのに有効なブロックコポリマーを含んでいる。動物又はヒトを免疫化する方 法は、コポリマー組成物を含む発現ベクターを動物又はヒトに投与することを含 んでいる。好ましい投与態様は腹腔内注射によるものである。本発明のこの態様 は抗原性遺伝子産生物を発現し得る遺伝子配列をインビボかヒト又は動物への再 導入を伴うエクスビボかのどちらかでヒト又は動物細胞に直接送達する手段を提 供する。抗原性遺伝子は１度細胞内に導入されると、該遺伝子の産生物を産生し て、導入された遺伝子産生物に対するヒト又は動物による免疫応答を誘発しそし て維持する。 以下の特定の実施例は、遺伝子治療法に有用な本発明の組成物及び方法、並び に遺伝子媒介免疫化に有用な本発明の組成物及び方法のような本発明の種々の態 様を説明する。他の実施態様や使用は当該技術分野の熟練者には明白でありそし て本発明はこれらの特定の説明用の実施例に限定されないと理解すべきである。 実施例Ｉ 治療用送達ビヒクルはＣＲＬ−8131のような任意の界面活性非イオン性ブロッ クコポリマーを、核酸配列機能を改変し得る多様な任意の化合物と組み合わせて 調製される。ＣＲＬ−8131に関しては、治療用ビヒクルを構築するためには容量 当たり３〜５重量パーセントの濃度が望ましい。一層親水性のコポリマーに関し ては容量当たり５〜10重量パーセントが望ましい。 300ミリグラムのＣＲＬ−8131を10mlの0.9％ＮaＣlに加え、そしてこの混合物 を澄明溶液が形成されるまで２〜４℃の温度で貯蔵して可溶化する。核酸遺伝子 機能を改変し得る適量の化合物を上記混合物に添加し、そして温度を５℃以上に 上昇させることによってコポリマーと化合物との会合ミセルを形成させ、そして このミセル懸濁物を平衡化させる。この平衡化した懸濁物は投与に適している。 例えば、マツクラ（Matsukura）M.等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7706 〜7710（1987年）（これは全文を引用により本願明細書に含める）によって開示 されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の１つのような配列をコポリマーと 組み合わせてミセル組成物を形成させる。 簡単に言えば、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＧ−３’を有するＨＩ Ｖのａｒｔ／ｔｒｓ遺伝子の領域に相補的な配列のホスホロチオエート又はメチ ルホスホネート誘導体をマツクラ等の方法に従って調製する。300ミリグラムの ＣＲＬ−8131を10mlの0.9％NaＣlに加え、そしてこの混合物を澄明溶液が形成さ れるまで２〜４℃の温度で貯蔵して可溶化する。その後所望のアンチセンスオリ ゴヌクレオチドを上記コポリマー溶液と混合して、ＨＩＶウイルス感染患者に投 与したときウイルス活性を阻害するのに有効な濃度を得る。一般的には、アンチ センス化合物の有効量は、最終的な血中濃度が１μＭから100μＭの範囲にある ような濃度であるが、特定のアンチセンス化合物に関してはアンチセンス化合物 の有効量がこの範囲外の他の有効量であることもある。当該技術分野の熟練者は マツクラ等のインビボ試験に従って任意の特定のアンチセンスオリゴヌクレオチ ドの相対的有効性を容易に試験することができる。 平均的なヒトは約6.25リットルの血液を有している。それ故、１mlの注射を投 与するときには組成物中に約６mＭから600mＭのオリゴヌクレオチド濃度が必要 である。より低い濃度のオリゴヌクレオチド組成物はより大きな容量で使用する ことができる。 実施例II 実施例Ｉの抗感染性アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、ウイルス活性 を低下させるのに有効な任意の経路でＨＩＶ患者に投与される。好ましい投与経 路は静注によるものである。このアンチセンス組成物は１日に複数回投与して、 有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを確実に維持することができる。 実施例III 遺伝子の欠陥又は欠失の影響を受けている動物又はヒトを処置するための遺伝 子治療組成物は、ＣＲＬ−8131のようなコポリマーを欠陥遺伝子の正常なコピー と組み合わせることによって製造される。例えば、アデノシンデアミナーゼ（Ａ ＤＡ）欠乏症を患っている患者のためには、アデノシンデアミナーゼ遺伝子の正 常なコピーを含有する遺伝子治療組成物が製造される。この遺伝子治療組成物は 、実施例Ｉで上記したようにして調製したコポリマーを所望の遺伝子と混合し、 ヒト又は動物から血液を取り出し、血液細胞をＡＤＡ遺伝子含有組成物でトラン スフェクトし、そしてトランスフェクトした血液細胞をヒト又は動物に再度導入 する。導入された遺伝子はインビボで発現し、元の遺伝子欠乏症の影響を緩和す る。 実施例ＩＶ 同様に、実施例IIIの遺伝子治療組成物を単離したＴリンパ球と組み合わせて ＡＤＡ遺伝子を含有するＴリンパ球を形成させる。ＡＤＡ遺伝子を含有するＴリ ンパ球はその後、例えば注射によって、アデノシンデアミナーゼ欠乏症を患って いる患者に投与される。投与された細胞はＡＤＡを発現しそしてアデノシンデア ミナーゼを産生し、その結果患者の酵素供給を増加させそして欠乏症を治す。 実施例Ｖ ＤＮＡワクチン接種は、宿主に導入される遺伝子が宿主動物によって異物とし て認識される抗原性遺伝子産生物を発現し、その結果免疫応答を誘発することを 除いて、実施例III又はIＶの遺伝子治療法について記載したのと本質的に同様に して実施する。 実施例ＶＩ コポリマーＣＲＬ−8131及びヘルペス単純ウイルス１型のgＤ遺伝子を含有す る発現ベクターを含む組成物をトランスフェクション実験で使用した。ＤＮＡト ランスフェクションは、通常、標準的な塩化カルシウム及びＤＥＡＥデキストラ ン沈殿技術を使用して実施される。ＤＥＡＥデキストランは細胞膜を粗くするた めに使用されそしてカルシウムはＤＮＡを細胞表面に沈殿させるために使用され 、細胞内へのＤＮＡ取込みが促進される。しかし乍ら、この方法は一般的には細 胞に対して毒性であり、そしてかなりの細胞死亡率を生じる。 塩化カルシウムの代わりに本発明のブロックコポリマーを使用する新規トラン スフェクション系が発見された。実際、驚いたことに、コポリマー助長トランス フェクションはＤＥＡＥデキストランの不存在下であっても起こることが発見さ れた。 Ｖero細胞をＤＥＡＥデキストラン中で30秒間インキュベートした。ＤＥＡＥ デキストランを除去した直後に、コポリマーと、ヘルペス単純ウイルス１型の糖 タンパク質gＤ ＤＮＡを含有する発現ベクターとの混合物をＶero細胞に加えた 。40％までの細胞がgＤ遺伝子で効果的にトランスフェクトされたことが分かっ た。 驚いたことに、４回の実験のうち２回では、ＤＥＡＥデキストランインキュベ ーション段階を省略してでさえ、コポリマーは40％未満の有効性でＶero細胞を トランスフェクトすることができた。 実施例ＶII 他の試験によっても、ブロックコポリマーがインビボで細胞膜を通過して遺伝 子物質を輸送するのに有効であることが証明された。コポリマーと一緒にヘルペ ス単純ウイルス１型のgＤ遺伝子を含有する発現ベクターを２週間毎にウサギに 腹腔内注射したとき、ＤＮＡワクチンで誘発される免疫化が成功した。血清を集 めそして抗gＤ抗体の存在について試験した。低い値の抗gＤ抗体がこのやり方で 接種して４週後に検出された。これらの結果は、コポリマー送達ビヒクルと共に 腹腔内投与された遺伝子物質がインビボで細胞によって取り込まれそして発現し て免疫応答を引き出すのに十分な量の遺伝子産生物を生じさせることを証明して いる。 実施例ＶIII ＤＮアーゼ保護実験。 ５種の化合物（ＣＲＬ 1122、3362、3632、9352及び8 131）を実験で使用して保護の程度を試験した。ＤＮＡを化合物と４℃で混合し そして15分後、37℃でＤＮアーゼＩ（10mg／ml溶液１μl）を加えた。37℃でイ ンキュベーションして30分後に、ＤＮアーゼＩはプロテイナーゼＫ（10mg／ml溶 液３μl）で処理して除去した。対照は、非イオン性ブロックコポリマー不存在 下のＤＮアーゼ１及びＤＮアーゼＩ処理をしないＤＮＡ単独であった。 ＤＮＡは、非イオン性ブロックコポリマーが存在する全ての試料でＤＮアーゼ Ｉ分解から保護された。ＤＮＡの最良の保護はＣＲＬ−3362及び8131で達成され た。ＤＮＡコポリマー組成物は水平アガロース電気泳動で移動せず、ウェル内に 留まった（臭化エチジウムで染色）。ＤＮアーゼＩの作用に対する効果的な保護 は１容量のＤＮＡ溶液（１μg／ml）対５容量の非イオン性ブロックコポリマー （30μg／ml）の溶液中で達成された。概算保護量は実験間で変動しそして総Ｄ ＮＡの15〜40％以内であると概算された。 追加的な実験によって、ＤＮＡ−コポリマー化合物がカルシウム法では大腸菌 のコンピテント細胞を形質転換しないことが示された。フェノールもＤＮＡから 分離させて非イオン性ブロックコポリマーを溶解しなかった。ＮＢＣに結合した ＤＮＡは５容量のイソプロピルアルコールを添加して沈殿させることができる。 実施例ＩＸ トランスフェクション実験。 ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子及び関係 のある他の遺伝子の一時的な発現に関する典型的なトランスフェクション実験は 以下の方法によった。ＣＯＳ（アフリカザルの腎臓細胞；ＣＶ１）のような細胞 を６ウェルプレートに接種した。細胞が50〜80％の集密（未だ対数増殖期）にな ったときトランスフェクションを実施する。細胞は先ずＰＢＳ緩衝液で洗浄し、 これらをＤＥＡＥ−デキストラン溶液（500mg／ml）0.5mlと共に１〜２分間イン キュベートし、この溶液を吸引し、そしてＤＮＡ沈殿物を細胞に加える。トラン スフェクションすべきＤＮＡを制御されたｐＨ条件で室温で30分間ＣaＣl₂と混 合して微細沈殿を形成させる。この溶液を増殖培地（ＤＭＥＭ）１mlと混合し、 そして37℃で４時間細胞上に置く。この時点で、15％のグリセリンを用いて細胞 にショックを与え、そしてその後ＰＢＳで洗浄する。この浸透圧ショックはＣa Ｃl₂−ＤＮＡ沈殿の細胞内への取込みを促進する。その後、細胞を再度ＰＢＳで 洗浄し、そして増殖培地を用いて37℃で48時間インキュベートする。 遺伝子発現は殆どの場合、間接的免疫蛍光を使用して、発現されたタンパク質 に対して特異的なモノクローナル抗体を使用して検出される。発現したタンパク 質は放射性トレーサーで標識しそして免疫沈降させるか又はウエスターン法で検 出することもできる。 25μlのＤＮＡ（７μg）と25μlの非イオン性ブロックコポリマー(30μg／ml) を使用した。更に、非イオン性ブロックコポリマーをＤＮＡと氷上で混合した。 そして混合物を細胞に添加してもそれらを別々に添加した（先ずＤＮＡをそして ２番目に非イオン性ブロックコポリマーを添加した）ときと同様な結果が得られ た。 コポリマー 1183、1187、8131、1235、8950ＡＱ及び1190ＡＱ (ＡＱは非イオ ン性ブロックコポリマーが1：10に希釈されそして25μlが使用されたことを示す )。典型的な結果は次のとおりである。ＤＮＡ単独、デキストラン単独、コポリ マー単独、及びＤＮＡ＋デキストランによるトランスフェクションは0.2％未満 のトランスフェクションで無視できるものであった。対照的に、ＤＮＡ＋デキス トラン＋グリセリンの陽性対照は２％のトランスフェクションを示したが、一方 種々のコポリマー＋ＤＮＡは表IIIに示したように、ＤＮＡの細胞内トランスフ ェクションで対照より2.5倍まで良好に成功した。 1187では、軽い毒性を除いてコポリマーに関連した毒性はなかった。他のもの は特にグリセリン処理後に毒性であった。 上記は本発明の単に好ましい実施態様に関するものにすぎず、添付の請求の範 囲に記載された本発明の精神及び範囲から離れることなく多数の修正や変更をす ることができると理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アラーディーン，ハミードサルタン，エ ス. アメリカ合衆国，30202 ジョージア，ア ルファレッタ，バターカップ トレイス 810番地 (72)発明者 コウソウラス，コンスタンチン，ジー. アメリカ合衆国，70810 ルイジアナ，バ トン ルージュ，ノース マートル レイ ク アベニュー 10543番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非イオン性ブロックコポリマーと混合した核酸機能を改変し得る化合物を 含むヒト又は動物を処置するための治療用組成物であって、前記ブロックコポリ マーは次式を有する該治療用組成物。 ＨＯ(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_b(Ｃ₃Ｈ₆Ｏ)_a(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_bＨ （式中、前記コポリマーのポリオキシプロピレン部分の分子量は約750から約15, 000であり、前記コポリマーのポリオキシエチレン部分の分子量は前記コポリマ ーの約１％から約50％である。） ２．前記コポリマーのポリオキシプロピレン部分の分子量が約2,250から約15, 000であり、前記コポリマーのポリオキシエチレン部分の分子量が前記コポリマ ーの約５％から約20％である請求項１に記載の組成物。 ３．前記コポリマーのポリオキシプロピレン部分の分子量が約3,250から約15, 000であり、前記コポリマーのポリオキシエチレン部分の分子量が前記コポリマ ーの約５％から約20％である請求項１に記載の組成物。 ４．前記コポリマーがＣＲＬ−8131又はＣＲＬ−8142である請求項１に記載の 組成物。 ５．前記の核酸配列機能を改変し得る化合物が、遺伝子、オリゴヌクレオチド 、アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプレックスＤＮＡ化合物及びリボザイ ムからなる群から選択される請求項１に記載の組成物。 ６．約0.1重量％から約５重量％の界面活性剤と約0.5容量％から約５容量％の 低分子量アルコールを更に含む請求項７に記載の組成物。 ７．前記界面活性剤がトゥイーン80であり、前記アルコールがエタノールであ る請求項６に記載の組成物。 ８．発現ベクターを更に含み、前記の核酸配列機能を改変し得る化合物が該発 現ベクターに含まれる核酸配列であり、該発現ベクターは核酸配列を発現するこ とができる請求項７に記載の組成物。 ９．非イオン性ブロックコポリマーと混合した核酸機能を改変し得る化合物を 含む組成物をヒト又は動物に投与する段階を含む、核酸配列機能を改変し得る化 合物をヒト又は動物に送達する方法であって、前記ブロックコポリマーは次式を 有する該方法。 ＨＯ(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_b(Ｃ₃Ｈ₆Ｏ)_a(Ｃ₂Ｈ₄Ｏ)_bＨ （式中、前記コポリマーのポリオキシプロピレン部分の分子量は約750から約15, 000であり、前記コポリマーのポリオキシエチレン部分の分子量は前記コポリマ ーの約１％から約50％である。） １０．前記コポリマーのポリオキシプロピレン部分の分子量が約2,250から約1 5,000であり、前記コポリマーのポリオキシエチレン部分の分子量が前記コポリ マーの約５％から約20％である請求項９に記載の方法。 １１．前記コポリマーのポリオキシプロピレン部分の分子量が約3,250から約1 5,000であり、前記コポリマーのポリオキシエチレン部分の分子量がコポリマー 前記の約５％から約20％である請求項９に記載の方法。 １２．前記コポリマーがＣＲＬ−8131又はＣＲＬ−8142である請求項９に記載 の方法。 １３．前記の核酸配列機能を改変し得る化合物が、遺伝子、オリゴヌクレオチ ド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプレックスＤＮＡ化合物及びリボザ イムからなる群から選択される請求項９に記載の方法。 １４．約0.1重量％から約５重量％の界面活性剤と約0.5容量％から約５容量％ の低分子量アルコールを更に含む請求項９に記載の方法。 １５．前記界面活性剤がトゥイーン80であり、前記アルコールがエタノールで ある請求項１４に記載の方法。 １６．発現ベクターを更に含み、前記の核酸配列機能を改変し得る化合物が該 発現ベクターに含まれる核酸配列であり、該発現ベクターは核酸配列を発現する ことができる請求項９に記載の方法。