JP2002501499A - 免疫調節剤の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫抑制疾患患者におけるＴ細胞増殖を増加させる薬剤の製造への、cAMP-依存性プロテインキナーゼA（PKA）を阻害することの可能な幾つかの化合物の使用が記載されている。阻害剤としては、cAMP類似体、リボザイム、アンチセンスDNAおよびPKAのアンカー作用領域に結合するペプチドが挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節剤の用途 本発明は、免疫抑制病(疾患)を処置する製薬剤を製造するために、cAMP依存性 プロテインキナーゼＡタイプＩの機能を無効とするインヒビター（阻害剤）の用 途に関する。 ほ乳類の免疫系は、種々の可能性のある伝染性因子に対して生体を防御するた めに異なる戦略で進化した。侵入者に対して、特定かつ既往の応答を獲得し得る ことが、養子免疫系の特色である。養子免疫系における主なプレーヤーは、Bお よびTリンパ球であり、かつこれらの細胞による抗原の特定の認識は、機能的に 非常に異なっているものの、幾らかの構造的類似性を有する受容体によって達成 される。異なる受容体特性は、限定された数の遺伝子の体細胞再構成（somatic rearrangement）を経て可能とされ、かつクローン分布する。この系における主 要な戦略は、ほとんどの何れも未知な抗原の認識をカバーする非限定的数の特異 性を発生させることである。免疫記憶は、部分的に、特殊な抗原と反応するTお よびB細胞のサブセットのクローン的拡張の結果であり、かつ、生体が同一の抗 原と二度目に遭遇したとき、より早く応答することを可能とする。 細胞増殖は、免疫活性のパラメータとして使用される。クローン選択説によれ ば、抗原に対する暴露は、受容体（レセプター）特異性に対応する個々のＢおよ びＴ細胞の活性化を導く。しかしながら、一定の抗原に親和性を有する細胞の数 は、全細胞数に対して、小さい分率（〜0,001％）である。このため、十分な免 疫応答を生じさせるために活性化細胞が増殖（クローン的拡張）可能であること は極めて重大である。このように、増殖は、 リンパ球の機能および免疫活性化能力を特徴付ける非常に重要なパラメータであ る。インビトロ実験では、抗原受容体複合体（TCR／CD₃）に対する抗体を使用す ることにより単離したTリンパ球の全固体群を活性化することが可能となる。こ れは、T細胞が免疫活性化されて抗原受容体を介してクローン拡張した場合のイ ンビボ状態を模擬しうる。T細胞の増殖は、cAMP信号経路を介して抑制されるこ とが知られている。 サイクリックAMP依存プロテインキナーゼ（PKA）は、全ての細胞中に存在する 酵素である。特定の受容体に結合したホルモンおよび神経伝達物質は、二次メッ センジャー3',5'-環状アデノシンモノフォスフェート（cAMP）の発生を刺激する 。サイクリックAMPは最も一般的でかつ多機能の二次メッセンジャーの一つであ り、PKAに結合することによってその作用を発揮し、かつPKAを活性化する。PKA は、細胞内部の多くの異なるプロテインをリン酸エステル化するセリン／テロミ ンプロテインキナーゼであり、これによってその活性を制御している。PKAが代 謝、増殖、分別および遺伝子転写の調節など莫大な種類の細胞プロセッシングを 調節することが知られている。PKAは４個の異なるサブユニット、すなわち調節 サブユニット（R）二量体、および二個の触媒サブユニット（C）からなる。さら にまた、PKAアイソザイムの二個の主要なクラス、PKAタイプIとPKAタイプII（そ れぞれPKAIとPKAII）がすでに説明されている。PKAIおよびPKAIIは、それらのサ ブユニットR（RIおよびRIIで示される）によって区別される。RIおよびRIIの同 形態は、RIα、RIβ、RIIα、RIIβと呼ばれる。さらに、サブユニットCもまた 、Cα、CβおよびCγと引用される同形態として存在している。異なるサブユニ ッ トは、可能性として18以上の異なる機能の多形態PKA（アイソザイム）を形成す ることができる。 PKAはリンパ球機能の重要な負の調節剤である。本発明者らおよびその他は、C AMPが、T細胞抗原受容体／CD₃複合体（TCR／CD₃）によって誘発されるTリンパ球 の増殖を抑制することを示した。我々は、T細胞がPKAIおよびPKAIIの両方を発現 することを示した。しかしながら、cAMPの抑制効果を達成するには、PKAIの選択 的活性化だけで充分である。加えて、我々は、PKAIIではなくPKAIが、TおよびB 細胞、およびナチュラルキラー細胞上の抗原受容体によって、シグナルを共局在 化し、かつ阻害するために再分布し、さらにTおよびB細胞におけるマイトジェン （有糸分裂誘発性）応答およびNH細胞中における細胞毒性応答を調節することを 証明した。このように、PKAIは、抗原受容体を介して開始するリンパ球機能、た とえばマイトジェン様応答および細胞毒性応答などにおける重要な負の調節剤と しての役割を果たしている。 HIV および一般的変異免疫不全（CIV） 初期および二次免疫不全は、ともに、通性の感染および癌の発生率の増大を誘 引し、かつ世界の全ての地域における罹患および死亡の原因を増大させる。ヒト 免疫不全ビールス（HIV）は、多数の感染および一定の悪性形態（たとえば、リ ンパ腫およびカポジ肉腫）の発生を著しく増大させる重度免疫系機能不全を導く 慢性感染を誘発する。米国内の多くのコミュニティーでは、HIV感染は「若い」 成人の中で、死亡の主要原因である。先進国では、この問題は、さらに大きくな っている。免疫グロブリン(Ig)Ａ不全と並んで、一般的変異免疫不全（CIV）は 原発性免疫不全の最も頻繁なタイプである。この形態の原発性ガンマグロブリン 血症は、寿命の最 初の２年後、重度に減少した血清IgGレベルおよび特に気道におけるバクテリア 感染の再発による免疫不全の発症によって特徴付けられる。 免疫不全における細胞欠陥 T細胞の機能不全は、HIV感染の免疫的特徴である。不完全なリンパ球サイトカ インの産生および刺激に対する損なわれた（損傷）増殖応答は、これらの患者に おける免疫不全の初期徴候であり、CD4+リンパ球数の減衰が観察される前でさえ 明示される。損なわれた抗体合成をともなうB細胞機能不全は、CVI患者の主要な 免疫特性である。しかしながら、CVIにおける免疫異常は、B細胞に限ったもので はなく、たとえば刺激に際する損なわれた増殖応答などのT細胞機能不全をも含 む。CVI患者におけるB細胞が、本質的にかつ必然的に欠陥があるわけではなく、 損なわれたT細胞「ヘルプ」が、これらの患者におけるB細胞欠陥のために重要で ある。T細胞機能不全は、欠損のある抗体産生に必ずしも関係しない患者におい て、一定の臨床的徴候、たとえば増大した肉芽腫の発生および悪化のために重要 である。現在の治療法 抗レトロウイルス治療は、HIV感染患者の処置における主要要素である。しか しながら、効能のある抗レトロウイルスコンビネーション治療は、HIV感染患者 のCD4+およびCD8+リンパ球数を著しく増大させるが、損なわれたT細胞機能は、 実施例１、表１および２Ｂの観察に示されているように、持続しているようにみ える。このように、これらの患者における抗レトロウイルス治療に加えて、免疫 調節剤が必要である。免疫グロブリン置換は、CVI患者の処置おける主要要素で ある。しかしながら、この置換治療は、欠陥のあるTおよびB細胞機能を回復させ ない。さらにまた、 幾らかの臨床併発症、たとえば非チーズ化壊死肉芽腫および持続性ビールス感染 において、より直接的にT細胞機能を内部変化させる治療が必要である。T 細胞機能不全をターゲットとした新規薬剤の治療可能性 損なわれたT細胞機能は、HIV感染およびCVIの双方の良く認識された免疫的特 徴であるが、このT細胞損傷における正確な分子メカニズムは知られていない。 このような内部細胞欠陥に対する治療法は、これらの患者の処置に特に重要であ り、かつHIV感染患者およびCVIを伴う患者における重大な免疫的欠陥を回復する 可能性を有している。 ホフマンら（Aids,Vo17;659-664,1993）およびWO9-3／19766号は、AIDSを有し ていないHIV血清反応陽性個体が、内部細胞cAMPレベルと、HIV血清反応陽性被験 者からの粗末梢血液単核細胞（PBMC）におけるPKA活性とにおいて有意な増大を 示すことを、証明した。T細胞実験は、おそらくT細胞精製法により誘発されるよ り大きい変異性のため、データとして報告されておらず、かつ意味を持つに至っ ていない。彼らの研究は、さらに、2',5'ジデオキシアデノシン（ddAdo）のよう なアデノシン類似体がPBMCにおける細胞内cAMPレベルを下げ、かつ細胞増殖を増 大させることを示した。しかしながら、このような効果は、６ng/mlの範囲の濃 度が有効であり、かつより高い濃度では、抑制されたり、さらにcAMPレベルを阻 害しないというように濃度依存性であった。HIV患者のT細胞サンプルにおいて同 様の効果は示されず、また単なる濃度／応答の関係性も示されなかった。彼らは 実施例において精製したT細胞を使用したが、これらの細胞は健康な血液ドナー から採取され、未成熟 T細胞活性を導く陽性セレクションによって精製されたものであった。 Chu-Chung、YS、GenieserHおよびJastorff,B(WO93)/21929-A)は、cAMPの３価 のリン酸誘導体を使用し、cAMP依存プロテインキナーゼと拮抗させることによっ て癌細胞に適用する処置を示している。 概略すれば、生理的状態での免疫応答および細胞増殖に関するＴ細胞における cAMPレベルの役割は、従来技術では知られていない。さらにまた、生理的状態で のT細胞機能に関するプロテインキナーゼアイソエンザイムの役割、およびcAMP ／PKAIが免疫活性を有するかどうか公知ではない。ホフマンら（上記参照）の結 果は、単核細胞における増大cAMPレベルを示唆したが、T細胞における同様の状 態をサポートする証拠を示していない。このように、cAMPレベルが、精製T細胞 およびHIV＋被験者からの消極的に選択される（活性化されない）T細胞において 増大するかどうか、およびCVIに罹患した患者におけるcAMP／PKA経路と何ら関係 しないのかどうかについては知られていない。 このため、T細胞内のcAMP/PKA経路を妨害するのに好適な化合物を用いて、ビ ールス感染性ヒト免疫不全患者および一般変異性免疫不全患者におけるT細胞免 疫機能を特に増大させ、かつT細胞機能障害を逆転させることが本発明の目的で ある。さらにまた、PKAタイプIの免疫調節剤としての役割が、全てのリンパ球細 胞（T細胞、B細胞、NK細胞）に分配されるので、cAMP/PKA経路の崩壊はＢおよび NK細胞にも関係し得る。 この目的は、本発明の特許請求の範囲によって特徴付けられる。 プロテインキナーゼ依存のcAMPによって達成される効果の崩壊は以下の方法に より行われる。 PKA アイソザイム−特定cAMP拮抗剤 PKAの活性は、インビボで、cAMPにより、Rサブユニットを介して特に調整され る。化学的に変性された拡散cAMPアナログが、cAMPの細胞内レベルを操作するの に使用できる。環状リン酸におけるリンが硫黄に置換した硫黄置換アナログは、 ホスホジエステラーゼによる分解に対して耐性の化合物を生じる。さらにまた、 硫黄置換アナログは、２個の形態を有することができる。即ち硫黄は、アデノシ ン環に対して、赤道位置または軸位置にあってもよい。軸状ジアステオロマー（ Sp-cAMP-亜リン酸チオエステル、Rp-cAMPSおよび誘導体）はcAMP作用薬として機 能するのに対し、赤道ジアステレオマー(Rp-cAMP-亜リン酸チオエステル、Sp-cA MPSおよび誘導体)は、RサブユニットのcAMP結合サイトに競争的に結合するが、 酵素を活性化しない。より詳細な特徴は、Rp-cAMPSは、PKAIアイソザイム（RIα₂ C₂、RIβ₂C₂）の唯一完全拮抗薬として、およびPKAIIアイソザイム（RIα₂C₂、 RIIβ₂C₂）の半作用薬として作用することが証明された。生体細胞に有用なRp-c AMPSの拡散誘導体の例は、Rp-8-Br-cAMPS、Rp-8-Br-モノブチリル-cAMPS、Rp-モ ノブチリル-cAMPS、Rp-8-Cl-cAMPS、Rp-8-(4-クロロフェニル-チオ)-cAMPS、Rp- ピペリジノ-cAMPである。 遺伝子機能ノックアウト方法 PKAの特定アイソザイムによって介在される効果は、酵素複合のサブユニット 生成を抑制することによって、崩壊しうる。これは、mRNAとハイブリッド形成し 、PKAサブユニットの翻訳を遮断する特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを 使用することによって、達成できる。もう一つの方法は、サブユニットの合成を 抑制するため、PKAのサブユニットのためのmRNAを特に認識し、開裂するハンマ ーヘッド型リボザイムを使用することである。 リボザイム リボザイムは、リン酸エステル結合の形成および開裂を触媒するRNA分子であ る。エンドリボヌクレアーゼ活性を有する短オリゴヌクレオチドの発見は、特定 の遺伝子の発現を阻害する重要なツールを、研究者に提供した。ハンマーヘッド ドメインは、遺伝子特異的アンチセンス転写における組み込みのための好適な候 補であり、mRNAにおける標的GUCシーケンスにて、酵素的開裂を誘発し、かつ次 のmRNAプロテインへの翻訳を崩壊する。リボザイムは、細胞にRNAとしてトラン スフェクションされるか、あるいはプロモーターの制御下に細胞内でリボザイム が転写されるミニ遺伝子として導入されうる。さらにまた、リボザイムは、浸透 性を向上させるため、リボース部分の２位にアルキル基を付加して化学的に変性 されてもよく、あるいは、細胞内効果を2-デオキシ-シトシンまたは2-デオキシ- ウラシルで置換することによって、延長してもよい。 特定のシーケンスアンチセンスオリゴヌクレオチド 特定のmRNAsに対してアンチセンスなオリゴヌクレオチドは、DNA／RNAヘテロ 二重鎖におけるRNAに結合し、mRNAのプロテインへの翻訳を、翻訳機構による動 き及び読み取りを阻止することによって阻害する。 硫黄置換アナログは、分解に対してより安定であり、かつ特定の遺伝子のブロッ ク翻訳にトランスフェクションされうる。 アンカーの破壊 一定の副細胞因子座における特定のcAMP-介在効果が、当該副細胞位置で基質 に非常に接近したAキナーゼアンカーリングプロテイン（AKAPs）における両親媒 性ヘリックスドメインとの疎水性相互作用を介して、PKAタイプIIのアンカーリ ングに依存することが示された。22-アミノ酸競争ペプチドによって、リポソー ム介在ペプチド翻訳により導入された相互作用ドメインへのアンカーリングを破 壊することは、PKAタイプIIによって介在されるアイソザイム特異的効果を喪失 することが示された。同様の効果は、現在のところまだ、PKAタイプIでは、示さ れていない。PKA競争ペプチドの例は、 本発明によれば、T細胞免疫応答のcAMP-誘発阻害の崩壊は、PKAタイプI／RIα を無効とすることにより得ることができる。次いで、PKAタイプIRIαに対するハ ンマーヘッド型ヘッドリボザイムを合成し、インビトロで実験し、末梢血液T細 胞のトランスフェクションに続いて、完全に活性のあることが示された。リボザ イム処理の機能的結果は、抗-CD3誘 発増殖として測定され、我々はCAMPへの感度の可逆性を証明した。 PKAタイプIのRIαサブユニットをノックアウトするために設計されたハンマー ヘッド型リボザイムは RIαへのアンチセンスオリゴの例は、 これらのアンチセンスヌクレオチドは、ハンマーヘッド型リボザイムの標的シ ーケンスからなる。 アンカー作用の破壊は、以前にPKAタイプII転座について示されているが、PKA タイプIについては示されていない。PKAタイプIアンカー作用タンパク質のクロ ーニングにより、我々は、血液細胞発現ライブラリーのスクリーニングに際して RIαをプローブとして採用するファーウェスタン技術を用いてきた。さらに、我 々は、酵母の2-ハイブリッドシステムを使用して、相互作用タンパク質を検出し ている。結合ドメインは、欠失性マッピングおよび突然変異分析を特徴としてい る。AMPの可溶性フラグメントの発現を導く競争ペプチドおよびトランスフェク ションベクターが設計された。 本発明者らが行い刊行した前の観察(23)に基づけば、プロテインキナーゼAタ イプI（タイプIIアイソザイムではない）の活性化が、免疫機能のcAMP-依存性阻 害、例えば抗原受容体により誘発されるTおよびB細胞の増殖、または特異的NK細 胞受容体により媒介されるNK細胞毒性を媒介するのに必要かつ充分である。さら に、プロテインキナーゼAタイプIは、TおよびB細胞の活性化およびキャッピング に際して、抗原受容体複合体へ再分布し、かつ該複合体とともに局在化する(3) 。プロテインキナーゼAタイプIのこのアンカー作用は、リンパ球上の受容体によ り媒介される免疫応答の変更における、この特異的アイソザイムの役割を支持し ている。 本発明に関連して本発明者らが行った発見は、HIV感染またはCVIの患者からの Ｔ細胞中ではプロテインキナーゼタイプIの活性化が増大することを示している 。さらに、PKAのこのアイソザイムの活性化は、PKAのタイプIIではなくタイプI アイソザイムを選択的に阻害することにより逆転可能な免疫機能の阻害に導くこ とが実証される。これらの知見に基づいて、本発明は、免疫不全(HIV、CVI)にお けるプロテインキナーゼAタイプIの不適切な活性化を逆転し、これによってT細 胞機能および免疫応答性を快復させることを目的とした化合物の使用と要約する ことができる。添付の実施例は、以下の処方物が全て、プロテインキナーゼAタ イプIのシグナリングと相互作用すること、また、プロテインキナーゼAタイプI の不適切な活性化を標的とし、無効とするために、それらを別個にまたは組み合 わせて使用できることを示す。 プロテインキナーゼAタイプIの阻害剤として作用する処方物／配合物は、以下の 以下の機能を果たす。 １） プロテインキナーゼAタイプI選択的かつ競争的な、cAMPの完全な拮抗剤 を使用して、プロテインキナーゼＡタイプIIではなくプロテインキナーゼAタイ プIのリガンド-依存性活性化が阻害される(実施例１、２)。 ２） アンチセンス（antisense）オリゴヌクレオチドまたはリボザイムを使 用して、プロテインキナーゼAタイプIの機能が、PKAのこのアイソザイムを除去 することにより阻害される(実施例３)。 ３） プロテインキナーゼAタイプIを、抗原受容体複合体でのそのアンカー作 用から立ち退かせる競争ペプチドを使用して、プロテインキナーゼAタイプIの機 能が、T細胞中での免疫機能の阻害に対して関連する抗原受容体複合体の基質か ら活性化酵素を除去することにより阻害される(実施例４)。 従って、本発明によれば、cAMP依存性プロテインキナーゼAタイプIの機能を廃 止させる阻害剤を使用して、免疫抑制疾患を処置するための製剤調製物が製造さ れる。 活性化合物は、処置が必要な患者に、この技術分野で公知の全ての全身的投与 経路で投与される。従って、本発明に係る薬剤は、活性化合物成分、 補助剤、製薬上許容される充填剤から構成され、任意の投与形態の選択により、 錠剤、坐剤、注射用液体、注入用液体および粉末を包含する。さらに、活性化合 物（１以上）(リボザイム、タンパク質)は遺伝子産物として細胞内に発現され、 その発現は、問題の細胞中に導入された遺伝子（１以上）から誘導される。遺伝 子発現は、問題の細胞中で活性なプロモーターから誘導され、ゲノム中に組み込 むための線状または環状DNAベクターのいずれの形態でも挿入することができ、 独立して輻射されるか、あるいは一時的にトランスフェクションされ／発現され る。DNAのベクターの送達は、この技術分野で公知の全ての方法で達成できる。 T細胞cAMP-PKA通路を変更するように誘導された化合物の必要条件は、少なく とも、T細胞中への拡散性およびホスホ-ジエステラーゼによる分解に対する抵抗 性である。本発明は、Rp-cAMPの誘導体、例えばRp-8-Br-cAMPSはインビトロで、 HIV陽性患者からの、および共通の不定免疫不全患者の精製T細胞の増殖を特に増 大させることを実証した。HIV患者からのT細胞の、抗-CD3で誘発され非常に減少 したT細胞増殖を調査したとき、拮抗剤Rp-8-Br-cAMPSの使用が相補的cAMP作用剤 の効果を逆転させるだけでなく、未処置の細胞でのレベルを超えて増殖をさらに 増大させることをも本発明者らが観察したという知見は、特に驚くべきことであ った。用いた濃度範囲(0〜1000mM)内で、[3H]-チミジン取り込みにより発現され たT細胞増殖は、濃度と相関関係があった。CAMP拮抗剤の使用による増加したT細 胞増殖は、正常被験者では示されたかった。 以下に、実施例および図面により本発明をさらに詳細に説明する。 図１．(A)正常健康血液ドナー(n=10)およびHIV-感染患者(n=9)からの末梢血液 CD3+Ｔ細胞中の内因性（内存的）cAMPレベル。内因性cAMPレベルは、正常健康血 液ドナー(n=10)およびHIV-感染患者(n=9)からの末梢血液CD3+T細胞において試験 された。CM+T細胞は陰性選択により４℃で単離された。中央値（水平線）および 個別の患者のデータ（白丸）が示される。^★はp<0.05を示す。(B)正常健康血液 ドナーおよびHIV-感染患者からの末梢血液CM+T細胞のTCR/DC-3刺激増殖は、増加 する濃度の8-(4-クロロフェニルチオ)cAMP(8-CPT-cAMP)の存在下での[JH]-チミ ジン取り込みとして評価された。曲線-フィット分析を行い、IC₅₀値を計算した( 統計および個別の患者のデータについては表１および２ａ参照)。正常健康血液 ドナー（白丸）および代表的HIV-感染患者（黒丸、表２ａの患者#10）からのＴ 細胞増殖の標準化レベルが示される。(IC₅₀値6.11μM対1.78μM)。注：IC₅₀の左 シフト（矢印）および変化した曲線の傾斜。増殖の最高レベルは、HIV-感染患者 からのＴ細胞で劇的に減少した(表１参照)。 図２．プロテインキナーゼＡのレベル。(A)正常血液ドナー(レーン１)および 症候性HIV-感染患者（レーン２）におけるPKA-サブユニットのmRNAレベルのノー ザンブロット分析。総RNAを抽出してノーザンブロット分析にかけ、得られたフ ィルターをPKAサブユニットRIα、RIIα、CαおよびCβに対する³²P-標識プロー ブでハイブリダイズさせた。28Sおよび18S rRNAの移行は矢頭で示される。シグ ナル強度は、好適に照射され たオートラジオグラムの密度測定走査で評価され、移動前の臭化エチジウム（エ チジウムブロミド）染色ゲルの写真を密度測定走査することにより負荷の差に関 して補正された。(B)PKAサブユニットの免疫ブロット分析。２人の正常血液ドナ ー(レーン１および２)、無症候性HIV感染を有する２人の個々のHIV-感染患者(レ ーン３および４)、および症候性HIV感染を有する３人の患者（レーン５、６およ び７）からのCD3+T細胞の試験。矢頭は、PKAサブユニットに対する精製組み換え 標準の移行を示す。等しい負荷が、クーマシー染色ゲルの密度測定走査で証明さ れた。免疫ブロットの密度測定分析は、患者サンプル対コントロールのタンパク 質レベルに差がないこと(RIα、C)、または僅かな差(RIIα、15%増加、レーン１ および２対レーン５〜７）を示した。 図３．cAMP作用剤（アゴニスト）Sp-8-ブロモ-cAMP-ホスホロチオエート(Sp-8 -Br-cAMPS)によるTCR/CD3刺激Ｔ細胞増殖の阻害、および相補的cAMP拮抗剤（ア ンタゴニスト）Rp-8-ブロモ-cAMP-ホスホロチオエート(Rp-8-Br-cAMPS)による阻 害の逆転は、正常健康血液ドナー(A)およびHIV-感染患者(C)において評価された 。正常血液ドナー(13)およびHIV患者(D)から単離されたCD3+T細胞のTCR/CD3刺激 増殖に対する増加するcAMP拮抗剤投与量の効果は、同じ実験において別に試験さ れた。(A)および(B)は、３人の健康血液ドナーからのプールして精製されたCD3+ T細胞の増殖を示す。(Q)および(D)：１人の症候性HIV-感染患者からのＴ細胞増 殖。３連測定の平均値±SDが示される。まとめた患者のデータについては表１参 照。注：上のパネルおよび下のパネルではスケールが異なる。 図４．CVI患者および健康コントロールからのＴリンパ球中の内因性cAMPレベ ル。(A)13人のCVI患者および10人の健康コントロールからの陰性選択したＴリン パ球中のcAMPレベル。データは中央値として示される。誤差バーは、第25〜第75 百分位数を示す。^★P<0.05対コントロール。(B)1人の代表的CVI患者（黒丸）お よび１人の健康コントロール（白丸）における抗-CD3刺激Ｔリンパ球増殖に対す る、増加する濃度のcAMP作用剤8-(4-クロロフェニルチオ)cAMP(8-CPT-cAMP)の効 果が示される。最高増殖は100%に規格化された。曲線-フィット分析はSigmaプロ ットを用いて行われ、IC₅₀値が計算され、CVI患者からのＴリンパ球の値がコン トロールと比較して著しく減少したことを実証した(2.26μM対4.66μM)。CVIグ ループおよびコントロールとの間の統計については表II参照。注：IC₅₀の左シフ ト（矢印）および変化した曲線の傾斜(Hill係数)。 図５．cAMP作用剤および拮抗剤によるＴ細胞増殖の変調。cAMP作用剤(SP-8-Br -cAMPS)によるＴリンパ球の抗-CD3刺激増殖の阻害、およびその相補的PKAタイプ Ｉ選択的拮抗剤(Rp-8-Br-cAMPS)による阻害の逆転が、１人の健康コントロール( A)および１人の代表的CVI患者(C)において示される。抗-CD3刺激Ｔリンパ球増殖 に対するRp-8-Br-cAMPSの増加する濃度の効果も別に試験され、１人の健康コン トロールおよび１人の代表的CVI患者からの結果が、それぞれパネル(B)および(D )に示される。データは３連測定の平均値±SDとして与えられる。CVIグループお よびコントロールとの間の統計については表II参照。 図６．Ｔ細胞からのIL-2放出に対するcAMP拮抗剤の効果。選択的PKAタイプＩ 拮抗剤Rp-8-Br-cAMPS(Rp)を異なる濃度で添加して、または無添加で、20時間培 養した後の抗-CD3刺激Ｔリンパ球からの上澄み液中のIL-2レベルが示される。パ ネルＡ：健康コントロール。パネルＢ：代表的CVI患者。データは３連測定の平 均値±SDとして与えられる。CVIグループおよびコントロールとの間の統計につ いては表４参照。^★P<0.001対拮抗剤無添加のIL-2レベル。^★★P<0.001対拮抗剤 無添加のIL-2レベル。 図７．IL-2およびcAMP拮抗剤によるＴ細胞増殖の変調。抗-CD3刺激Ｔリンパ球 増殖に対する1000μMのRp-8-Br-cAMPS(Rp)の添加または無添加での増加する濃度 のIL-2（２単位（ユニット）/ng）の効果が、１人の健康コントロール(A)および １人の代表的CVI患者(13)について示される。データは３連測定の平均値±SDと して与えられる。 図８．プロテインキナーゼＡタイプＩのRIαサブユニットに対するリボザイム(r ibozyme)を使用することによる、TUR/CD3刺激Ｔ細胞増殖のcAMP-媒介阻害の逆転 。8-CPT-cAMP(12.5μM)の不存在（黒バー）および存在（白バー）において、リ ポソーム単独（擬似、mock）を用いるか、またはリポソームおよびRIαリボザイ ム(RIα rbz、10μM)を用いて処置した後の正常健康血液ドナーからの末梢血液C D3+T細胞のTCR/CD3刺激増殖。 図９．T細胞におけるプロテインキナーゼAタイプIのRIαサブユニットのTCR/C D3関連アンカー作用と競争する競争剤ペプチドを用いたTCR/CD3刺激Ｔ細胞増殖 のcAMP-媒介阻害の逆転。リポソーム単独(mock)を用いるか、あるいは増加する 濃度(25〜100μM)の、PKAタイプIIに対する競争剤ペプチド(Ht-31)（これはアン カー作用と競争する）またはコントロールペプチド(Ht31-P)を用いて処置した後 の正常健康血液ドナーからの末梢血液CD3+T細胞のTCR/CD3刺激増殖。注：コント ロールペプチド(Ht-31P)ではなく、Ht31競争剤ペプチドの濃度が増加するにつれ て、トランスフェクション後のcAMPに対する感度は減少した。 図１０．増加する濃度の8-CPT-cAMPの存在における末梢血液CD3+T細胞のTCR/C D3刺激増殖。リポソーム単独で擬似トランスフェクトした（黒丸、連続線）か、 あるいはリポソームおよびプロテインキナーゼAタイプIのアンカー作用と競争す るHt31ペプチド(35μM)とともにインキュベートした(白丸、点線)、T細胞増殖の 規格化レベルが、48時間後の[³H]-チミジン取り込みとして評価された([³H]-チ ミジンはこの48時間中の最後の18時間に添加された)。注：8-CPT-cAMPの存在に おいてIC₅₀が1.8から4.8μMまで右にシフト(矢印)。 実施例においては下記の方法が用いられた。 ヒト末梢血液CD3+T細胞は、正常健康ドナー(Ullevaal University Hospital B lood Center，Oslo，Norway)または患者からのヘパリン処置血液50mlから陰性選 択することにより精製された。簡単には、末梢 血液単核細胞は密度グラジエント(Lymphoprep，NycoMed，Oslo，Norway)遠心に より単離され、次いでCD14およびCD19に対する抗体で直接被覆された単分散磁性 ビーズ、およびCD56に対する抗体および磁石で被覆されたラット抗マウス-IgGビ ーズを用いて陰性選択された。磁性ビーズは全てDynalから入手されたが(Oslo， Norway，それぞれcat．no．111.12、111.04および110.11)、抗-CD56抗体はPharm ingenから入手された(San Diego，CA.，cat．no.31660.d)。全ての工程は４℃で 行われた。細胞懸濁液は、蛍光性抗体およびFacScan(Becton-Dickinson，San Di ego，CA)を用いた流動細胞計算によりルーチンにスクリーニングされ、90%より 多いCD3+細胞、および低レベルのCD14+細胞(<2%)、CD19+細胞(<2%)およびCD56+ 細胞(<5%)からなることが示された。 末梢血液CD3+T細胞の陰性選択 末梢血液CD3+T細胞は、正常健康ドナー(Ullevaal University Hospital Blood Center，Oslo，Norway)または患者からのヘパリン処置血液50mlから陰性選択す ることにより精製された。簡単には、末梢血液単核細胞は密度グラジエント(Lym phoprep，NycoMed，Oslo，Norway)遠心により単離され、次いでCD14およびCD19 に対する抗体で直接被覆された単分散磁性ビーズ、およびCD56に対する抗体およ び磁石で被覆されたラット抗マウス-IgGビーズを用いて陰性選択された。磁性ビ ーズは全てDynalから入手されたが(Oslo，Norway，それぞれcat．no．111.12、1 11.04および110.11)、抗-CD56抗体はpharmingenから入手された(San Diego，CA. ，cat．no.31660.d)。全ての工程 は４℃で行われた。細胞懸濁液は、流動細胞計算によりルーチンにスクリーニン グされ、90%より多いCD3+細胞、および低レベルのCD14+細胞(<2%)、C19+細胞(<2 %)およびCD56+細胞(<5%)からなることが示された。 環状AMPの定量 内因性。AMPのレベルは、末梢血液CD3+T細胞において試験された。CD3+T細胞 は４℃で陰性選択により単離され、３連のサンプル（2x10⁶細胞）が収穫され、 次いで他の文献(8)に記載されたようにしてcAMPが抽出され細胞内cAMP含有量が 分析された。cAMPの基底レベルが示され、４℃で粗製末梢血液単核細胞およびCD 3+T細胞の両方において120分より長い間（CD3+T細胞の精製に必要な時間間隔） 安定であった(データは示されない)。 増殖アッセイ 増殖アッセイは、底部96-ウェルマイクロタイタープレートにおいて100μl体 積で0.75x10⁶CM+T細胞/mlのインキュベーションによって行われた。活性化は、 続いて、ヒツジ抗-マウスIgGで被覆された単分散磁性ビーズ(Dynal，cat．no．1 10.02)を１：１の細胞／ビーズ比で添加した後、示された実験について抗CD3（ クローンSpvT₃b）を１：125,000の最終希釈で添加することにより達成された。 抗体の最適濃度は、初期セットアップにおいて注意深く力価測定され、抗体の幾 つかの異なる希釈における平行実験が常に行われた。増殖は、細胞を72時間イン キュベートすることにより分析され、その間、最後の16時間に[³H]チミジンが添 加された。細胞は洗浄され、Scatronハーベスター(Suffolk，UK)を用い てフィルター上で収穫され、次いでβ-シンチレーション計数により分析された 。cAMP類似体は、使用される場合、抗-CD33抗体の添加による活性化の前30分に 添加された。8-CPT-cAMPはSigorna（ST．Louis，MO）から、sp-およびRp-8-Br-c AMPSはBioLog Life Science Company(Bermen，Germany)から入手され、全てはPB S中に４〜10mMの濃度に溶解され、濃度は製造者により与えられた消光係数を用 いて計算された。 IL-2レベルの決定 IL-2レベルおよびIL-2受容体結合を決定するために、陰性選択されたCD3リン パ球（10⁶/ml，200μl/ウェル）は、異なる濃度のRp-8-Br-cAMPSと一緒の前イン キュベーションを行うかまたは行わずに、培地単独中で、または抗-CD3(クロー ンSpvT₃b)で刺激して培養された。抗-CD3抗体は、免疫磁性ビーズで架橋された か((IL-2レベル；最終抗-CD-3)希釈率１：125000)、あるいはウェル上で前もっ て被覆された(IL-2受容体；最終希釈率１：1500)。20時間の培養の後、細胞を含 まない上澄み液が収穫され、分析するまで-80℃で保存された。上澄み液中のIL- 2レベルは、ELISA（R&R Systems，Minneapolis，MN)により決定された。 単球上澄み液中のプロスタグランジンＥ₂(PGE)レベルの決定 刺激細胞（大腸菌026B6からのLPS；最終濃度10ng/n-LL，Sigma）および非刺激 細胞（3x105単球/mL，200μl/ウェル）は、RPMI 1640(Gibeo)中で10%のヒトAB血 清を補充した２mmol/LのL-グルタミンとともに、または血清を含まない培地(X-V ivo;Bio Whittaker，Inc.) 中で培養された。細胞を含まない上澄み液が24時間後に収穫され、PGE₂がELISA( Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)により決定された。 その他 特に言及しない場合、当業者に公知の方法が用いられた。 実施例１ 環状AMPは、T細胞受容体／CD3-複合体(TCR/C3)により誘発されるT細胞増殖、 ならびに抗原受容体の従事に続く初期チロシンリン酸化を完全に廃止する(1，2) 。我々は先に、T細胞シグナリングに対するcAMPの阻害効果を媒介するためには 、cAMP-依存性プロテインキナーゼ(PKA)タイプIを活性化することが必要かつ充 分であること、また、PKAタイプIはT細胞の活性化およびキャッピングの間に抗 原受容体へ再分布し、これらとともに局在化することを示した(2，3)。これは、 PKAタイプIを、T細胞抗原応答およびクローン拡張（増大）の急性の負モジュレ ーター（調節剤）として証明するのに役立つ。T細胞機能不全は、HIV-感染の経 過における初期の出来事であり、重い免疫不全の進行における主要なファクター である。しかしながら、それによってHIVがT細胞機能を害する分子メカニズムは 、明らかにされていない。最近の二つの刊行物は、HIV-誘導ペプチドが、インビ トロでcAMPレベルを増加させうるという指標を提供している(4，5)。さらに、cA MP処置は、HIVリバーストランスクリプターゼ（逆転写酵素）活性を、培養T細胞 ラインにおいて５〜10倍増加させた(6)。これは、ともに、HIV-感染T細胞中のサ ーキュラス・ヴィチ オスス(Circulus vitiosus)を証明するのに役立てることができる。しかしなが ら、cAMPシグナリング経路とHIV-誘発T細胞機能不全との間のつながりは、まだ 証明されていない。この理由のため、我々は、高活性抗レトロウイルス療法の前 および後のHIV-感染患者からの精製T細胞におけるT細胞免疫機能のcAMP媒介阻害 の可能な役割を調査した。我々は、PKAタイプIの増加した活性が、HIV-感染個体 からの細胞中でのT細胞増殖を、進行中の有力な抗レトロウイルス療法とは無関 係に、有意に阻害すること、また、この効果がPKAタイプIの特異的拮抗剤により 逆転できることを実証する。結果 HIV-感染個体からのＴ細胞中での上昇したcAMPレベル ９人の一貫性HIV-感染患者（臨床的状態とは無関係）からの陰性選択された高 度精製T細胞において、cAMPの内因性レベルは、10人のHIV血清陰性血液ドナーか ら同時に単離されたCM+T細胞中のレベルと比較して、有意に上昇した(1238対688 fmol、10⁶細胞、P<0.05、図１Ａ参照)。さらに、TCR/CD3-誘発増殖に対するcAM P作用剤の効果が、HIVプロテアーゼ阻害剤を用いた有力な抗レトロウイルス療法 を受けていない18人の個々のHIV-患者、および８人の血清陰性コントロールにお いて調査された(表１および２ａ参照)。患者は二つのグループに分類され、（7 ）に従い、一方のグループは無症候性であり、他方は症候性HIV感染であった（A IDSおよび非-AIDS）(表１)。HIV-感染患者からのＴ細胞は、外因的に添加した8- CPT-cAMPによる細胞増殖の阻害に対する感度の極めて有意な増加を明らかにした (図１Ｂ、表１および２ａ、P<0.001、n=18)。 さらに、HIV-感染患者からのT細胞の最大増加率を100%に規格化したとき(図１Ｂ 、データは示されない)、明確に左にシフトしたcAMP-阻害曲線に加えて、曲線の 勾配が有意に異なることが明らかであった(HIV血清陰性個体からのT細胞では1.1 9(1.13-1.40)、これに対して正常T細胞では1.59(1.40-1.81)のHill係数、表１、 P<0.01、n=18)。cAMP類似体による阻害に対する感度の低下は、PKAタイプIのプ ライミング（第一）cAMP結合部位Ｂにおける内因性cAMPの上昇、これに続く外因 的に添加されたcAMP類似体のためのＡ部位の親和性増加からの寄与を示唆してい る。曲線勾配が、2-リガンド部位結合の協同的状態から8-CPT-cAMPによる明らか に非-協同的阻害曲線にシフトすることもまた、内因性cAMPによるB-部位占有期 間を示している。 HIV-感染患者からのCD3+T細胞中のPKAタイプIの不変レベル 次に我々は、HIV-感染患者におけるPKAサブユニットのレベルを、正常血液ド ナーと比較して試験した。図２Ａは、３人の血液ドナーから抽出された総RNA(レ ーン１)、および症候性HIV-感染を有する10人の患者からのCD3+細胞から抽出さ れた総RNA中のPKAサブユニットのmRNAレベルを示す。正常血液ドナーと比較して 、HIV-感染患者におけるRIαおよびCβのmRNAレベルには変化が見られなかった 。症候性HIV感染を有する患者におけるRIIaのためのmRNAでは僅かな増加(20%)が 見られたのに対し、CαmRNAレベルでは20%の減少が見られた。免疫ブロット分析 (図２Ｂ)は、さらに、RIαのタンパク質のレベル（上のパネル）が、２人の正常 血液ドナー（レーン１および２）と比較して、非症候性患者(レーン３および４) 、ならびに症候性患者（レーン５、６および７）において変化 しなかったことを実証した。RIIaのためのタンパク質レベル（中央のパネル）は 、密度測定走査により評価した正常コントロールと比較して、症候性HIV感染を 有する患者では極めて僅か（15%の減少）であることを明らかにした。Cサブユニ ットのレベルは、CαおよびCβの両方と反応する抗体により検出したところによ れば、変化しなかった(下のパネル)。このように、RIαおよびCαまたはCβで構 成されるPKAIのレベルは、変化しないようでありHIV感染患者におけるPKAII(RII αおよびCで構成される）のレベルでは、極めて緩和な変化だけが見られた。 PKAタイプI拮抗剤はHIV-感染患者からのT細胞のT細胞増殖を改善する TCR/CD3-誘発T細胞増殖の阻害の特異性をさらに評価するために、我々は、PKA タイプIの完全拮抗剤として働くイオウ置換cAMP類似体(Rp-8-Br-cAMPS)を使用し た(8)。図３Ａは、正常血液ドナーからのT細胞において、TCR/CD3-刺激増殖がcA MP作用剤(Sp-8-Br cAMPS)によって阻害されたことを示す。この効果は、増加し た濃度の相補的拮抗剤(Rp-8-Br cAMPS)によって殆ど完全に逆転された。しかし ながら、拮抗剤単独では、正常T細胞の増殖を変化させなかった(図３Ｂ)。これ とは対照的に、HIV-感染患者からのT細胞のTCR/CD3-誘発増殖を調査したとき、 我々は、拮抗剤(Rp-8-Br-cAIWPS)の使用が相補的作用剤の効果を逆転させただけ でなく、増殖を未処置Ｔ細胞でのレベル以上にさらに増加させたことを観察した (図３Ｃ)。cAMP拮抗剤単独の効果をHIV-感染患者からのＴ細胞において評価した とき、我々は、TCR/CD3-誘発増殖の濃度依存性増加を観察し、これは、より高い 濃度のときに２倍を超えた(図 ３Ｄ)。cAMP拮抗剤での処置後の増殖増加度は、拮抗剤の不存在におけるTCR/CD3 -誘発増殖のレベルと反比例し(p<0.001，R=0.78、n=18、表１)、すなわち、T細 胞は、殆どがcAMP拮抗剤処置から利益を得るTCR/CD3刺激に対してほとんど応答 しなかった。cAMP拮抗剤の刺激効果は、用いた最高濃度においても飽和されなか った(図３Ｄ；同様のデータ（示されない）は表２中の全ての患者で得られた)。 これは、化合物の可溶性、細胞への親和性またはその利用可能性が、観察された 効果に対する制限ファクターでありうることを示している。このように、より透 過性が高く有力なPKAタイプI拮抗剤は、利用可能な場合に、HIV-感染患者からの TCR/CD3-誘発T細胞増殖をさらに改善することができる。 高活性の抗-レトロウイルス療法中の患者はPKAタイプI拮抗剤を用いて改善で きる、持続性T細胞機能不全を有する 最近、HIVプロテアーゼ阻害剤は、HIV-1疾患の進行を遅れさせること、および 血漿HIV RNAレベルを強力に減少させることが見出された(9，10)。この理由のた め、我々は次に、HIVプロテアーゼ阻害剤インジナヴィア(indinavir)をヌクレオ シド類似体と組み合わせて用いた有力な抗-レトロウイルス療法を受けた９人の 症候性HIV-感染患者からのT細胞増殖、cAMP感度およびT細胞に対するcAMP拮抗剤 の効果を試験した。TCR/CD3-誘発増殖応答は、プロテアーゼ阻害剤を受けなかっ た症候性HIV-感染を有する非治療患者と比較して増大した(p<0.05；表１の下の 部分および表２)。しかしながら、治療患者からのＴ細胞の免疫応答は、コント ロールと比較して、いっそう有意に減少され(p<0.001)、HIV-特異的Ｔ細胞機能 不全は、有力な抗レトロウイルス療法にもかかわらず持続す ることを示した。さらに、cAMPによる阻害に対する感度は、正常コントロールと 比較して、いっそう有意に増大し(p<0.01)、cAMP拮抗剤を用いた高活性の抗レト ロウイルス療法中の患者からのT細胞のインキュベーションは、正常個体からのT 細胞のインキュベーションと比較して、有意に改善された(p<0.05)。加えて、こ のグループの単一患者のデータは、有力なレトロウイルス療法を受けた患者間で 異質性を明らかにした(表２ｂ)。９人の患者のうち６人からのＴ細胞増殖は、Rp -8-Br cAMPSから投与量依存性様式で利益を受けたが(免疫応答が1.5〜2.8倍の増 加)、正常以下の増殖応答を有する３人の患者からのT細胞は、cAMP拮抗剤に応答 しなかった(未処置の細胞増殖の0.98〜1.11倍の増殖)。これは、拮抗剤の不存在 におけるTCR/CD3-誘発増殖レベルおよびcAMP拮抗剤を用いた処置の効果が反比例 することに反映される(p<0.01、R=0.81、n=9)。すなわち、持続性T細胞機能不全 を有する患者からのT細胞のみが、cAMP拮抗剤を用いた処置から利益を受けた。 表１および２ａにおいて試験した18人の未治療患者のうち４人を高活性抗レトロ ウイルス療法の開始後に追跡すると、処置の開始後に増加したT細胞増殖応答を 示した(表２ａおよび２ｂを比較せよ)。しかしながら、患者の２人からのＴ細胞 は、免疫応答がひどく抑制されたままであり(ａおよびｂの符号)、これらの患者 からのＴ細胞増殖は、それでもなおcAIVIP拮抗剤とのインキュベーションから利 益を受けた。他の２人の患者（ｃおよびｄの符号）からの細胞は、有力な抗レト ロウイルス療法の開始後に正常以下のT細胞増殖レベルに達し、Rp-8-Br-cAMPSと のインキュベーションから利益をさらに受けなかった。 実施例２ この研究は、CVI患者からのT細胞中における増加する内在cAMPレベルを初めて 示し、かつより重要なことに、PKATの選択的阻害が、阻害T細胞機能を有するCVI 患者の抗-CD3-誘発T細胞増殖を、著しく改善しまたはあるケースでは完全に修復 たことを示している。これら発見は、CVIにおけるT細胞欠損の可能性のある細胞 内機構を示し、かつcAMP/PKAI系がこれら患者における免疫調節治療のために標 的となり得ることを示唆する。 PBMC増殖におけるcAMP拮抗剤の効果 CVIの阻害T細胞機能におけるcAMP/PKAI系の可能性のある役割に注目するため に、最初に、20人のCVI患者および15人の健康なコントロールにおいて、PKAI(8) の完全拮抗剤として働くイオウ置換cAMP類似体（Rp-8Br-cAMPS）がPBMCの抗-CD3 刺激増殖を改善するかどうかを試験した。前出の結果(12、11)を確認すると、刺 激リンパ球増殖が、コントロールの被検者（データは示していない）と比較して 、CVI集団において有意に阻害されていた。さらに、拮抗剤は、正常血液ドナー から得られたリンパ球の増殖を有意に変化させなかった（パネルA）一方で、Rp- 8Br-cAMPSはCVIグループにおける抗-CD3刺激増殖の有意なかつ濃度依存性の改善 を誘発した(データは示していない)。しかしながら、CVIグループからの一人の 患者のデータは、異質性を明らかにした。これに対し、cAMP拮抗剤をインビトロ で細胞に加えた場合、７人のCVI患者で、抗-CD3-誘発-リンパ球増殖の100%を超 える増加が見られた一方で、５人の患者では、40%未満の増殖増加であった。重 要であるのは、cAMP拮抗剤 によるリンパ球増殖が最も著しく増加した患者は、抗-CD3刺激後の増殖応答が最 も低下した者（r=-0.85，P<0.001)であったことである。 精製Tリンパ球におけるcAMP作用剤および拮抗剤の効果 CVIにおけるT細胞機能不全の誘導でのcAMP/PKAI系の役割をよりよく研究する ために、陰性に選択された精製Tリンパ球の増殖において、内在cAMPレベルと、c AMP作用剤及び拮抗剤の効果とを分析した。最初に13人のCVI患者および10人の健 康コントロールからのTリンパ球におけるcAMPを測定し、CVI患者において有意に 高いcANTレベルが観察された(図４Ａ)。T細胞増殖のcAMP-依存性阻害に対する感 受性も増加し内在cAMPレベルの正の共同効果を示した(図４８)。表３に示された 結果は、８人のコントロール被検者における効果と比較した、著しく阻害された 抗CD-3刺激T細胞増殖を有する７人の別々のCVI患者における細胞増殖に対する8- CPT/cAMPのこのような効果を示している。外因的に添加されたCVIグループの8-C PT-cAMPによる細胞増殖の阻害に対する感受性の有意な増加は、主に阻害曲線の 傾きの変化によって、これら患者におけるIC₅₀値の著しい減少に影響した(Hill 係数；表３および図４Ｂ)。 更に抗-CD3刺激T細胞増殖の阻害の特異性に注目するために、cAMP作用剤（Sp- 8-Br-cAMPS）および相補的PKAI選択的拮抗剤（Rp-8-Br-cAMPS）を用いた。健康 コントロールにおいて、cAMP作用剤の阻害効果はその相補的拮抗剤により完全に 逆転（図５Ａ）したが、拮抗剤単独ではT細胞増殖は更に強化されなかった(図５ Ｂおよび表３)。これに反して、Rp-8-Br-cAMPSを細胞培地に添加した場合に、CV I患者の 抗-CD3刺激増殖における濃度依存性増加が観察された（３人の患者で〉100%増加 であり、２人の患者で正常範囲内に達した）(図５Ｃ、図５Ｄおよび表３)。した がって、CVI患者では、阻害抗-CD3刺激増殖を有するTリンパ球は、慢性的に上昇 した内在cAMPレベルによって特徴付けられ、選択的PKAI拮抗剤を用いた処置は、 これら細胞における抗-CD3刺激増殖を著しく改善し、健康コントロールと対等な 増殖レベルを達成した(各々、Rp-8-Br-cAMPSを用いるかまたは用いずに、各々健 康コントロールにおける〜25%または75%のレベル)ようである。 CD4⁺およびCD8⁺リンパ球の増殖におけるcAMP拮抗剤の効果 次いで、８人の不全リンパ球機能を有するCIV患者および７人のコントロール にて、BrdUを組み込んだ流動細胞計算分析によって、Rp-8-Br-cAMPSの存在下お よび非存在下でCD4⁺およびCD8⁺Tリンパ球のサブセットにおける抗-CD3刺激Tリン パ球DNA合成を試験した。cAMP拮抗剤を細胞培地に添加した場合、CVI患者におい て、CD4⁺Tリンパ球はBrdU⁺の存在下有意に増加した(拮抗剤を用いるかまたは用 いない場合に、各々55.8(40.7〜77.0)%対69.6(50.5〜90.0)%、P<0.03)。殆どの 患者において、最大の増加が、Rp-8-Br-cAMPSの最高濃度（1000μM）で観察され た。健康コントロールからのCD4⁺リンパ球では、DNA合成におけるRp-8-Br-cAMPS の効果はなかった(データは示されていない)。CD8⁺リンパ球に付いては、三人の CVI患者において中間的な増加が見られたが、CVI患者およびコントロールの何れ においても、cAMP拮抗剤の添加後BrdU⁺細胞の存在下では有意な増加は見られな かった(データは示されていない)。 Tリンパ球のIL-2レベルおよびIL-2レセプター結合におけるcAMP拮抗剤の効果 IL-2は、Tリンパ球の成長および機能において極めて重要な役割を果たし(13) 、かつこれら細胞からのIL-2産生減少はCVIの免疫病理学において重要な役割を 果たす(14、15)。環状AMPは、Tリンパ球におけるIL-2レセプター産生及びIL-2レ セプター発現を減少させる(16、17)。CVIにおけるTリンパ球増殖のcAMP誘発阻害 の機構を更に明らかにするために、阻害リンパ球機能を有する７人のCVI患者お よび８人のコントロールにおいて、抗-CD刺激Ｔリンパ球からの上澄み中のIL-2 レベルにおけるRp-8-Br-cAMPSの効果を試験した。コントロール被検者と比較し て、CVI患者からのTリンパ球は有意に低いレベルでIL-2を上澄みに放出し(表４) 、cAMP拮抗剤存在下で、著しく、かつ濃度依存性のIL-2レベル増加が観察された (表４および図６Ｂ)。CVI T細胞のIL-2レベルにおけるRp-8-Br-cAMPSの効果は、 増殖におけるものと非常に類似していた。しかしながら、CVI患者における細胞 培地に対してRp-8-Br-cAMPSを添加した後にIL-2レベルが劇的に増加したにもか かわらず、IL-2レベルはなおもコントロール被検者で観察されたものより著しく 低かった(表４)。このように、CVI患者において、Tリンパ球増殖は、インビトロ 細胞に対するcAMP拮抗剤の添加によるIL-2分泌よりも広範囲となるまで正常化さ れる。 次に、流動細胞計算法によって、Rp-8-Br-cAMPSの細胞培地への添加が、阻害 リンパ球機能を有する８人のCVI患者および６人のコントロール からの抗-CI3刺激T細胞におけるIL-2レセプター結合にも影響を与えることがで きるかどうかを試験した。抗-CD3刺激細胞では、CD4⁺およびCD8⁺リンパ球の何れ においても、CVI患者およびコントロール間でIL-2レセプター結合は、有意な差 異がなかった。しかしながら、CVI患者からのCD4⁺リンパ球（CD8⁺リンパ球では ない）において、細胞培地へのRp-8-Br-cAMPSの添加後にIL-2レセプター結合が 中程度であるが有意に増加した。健康コントロールからの細胞では、このような 増加は観察されなかった。 抗-CD3誘発Tリンパ球増殖におけるcAMP拮抗剤と組み合わせた外因的に添加され たIL-2の効果 cAMP拮抗剤の添加によるT細胞増殖の増強におけるIL-2の役割を更に試験する ために、阻害リンパ球増殖を有する４人のCVI患者および４人のコントロールに おいて、抗CD3刺激T細胞増殖に、単独でまたはRp-8-cAMPSと組み合わせて外因的 に添加したIL-2の効果を試験した。細胞培地へのIL-2の添加後、CVI患者および コントロールの両方において、著しい増殖増加があった(図７)。しかしながら、 cAMP拮抗剤の添加後に達成されたIL-2レベル増加と同等のIL-22濃度（〜0.15ng/ mL、図６Ｂ）では、CVI患者およびコントロールの何れにおいても、増殖におけ る有意な効果はなかった(図７)。事実、CVI患者でのcAMP拮抗剤の増強効果は、1 5ng/mLのIL-2の効果と同等であった(図７)。CVI患者では、Tリンパ球増殖におけ るRp-8-Br-cAMPSおよびIL-2の増強効果は、累積的であった(図７)。 実施例３ プロテインキナーゼAのRIαサブユニットに対するリボザイムは、インビトロ で発現し、RIα mRNAを完全に開裂することが示された。合成RNAリボザイムとし て、または末梢血液CD3+T細胞に2-デオキシシトシンまたは2-デオキシ-ウラシル 類似体を組み込むことにより安定化された合成RNAリボザイムとして、トランス フェクションされた場合、リボザイムは、RIα mRNAを除去することによってコ ントロールレベルの約20％までRIαタンパク質レベルを減少させた。この戦略に より、プロテインキナーゼAタイプIの殆どが、T細胞から除去された。次いで、 リボザイムを用いてトランスフェクションされたCD3⁺Ｔ細胞の免疫感応性を、T 細胞レセプター/CD3複合体(TCR/CD3)の刺激によるT細胞活性化後のT細胞増殖と して測定される、コントロール（mock:モック）トランスフェクションT細胞と比 較して調査した。cAMPの上昇させたレベルおよびプロテインキナーゼAタイプIの 増加させた活性によって、HIV感染と同様のT細胞機能不全を刺激するために、正 常T細胞を低投与量(IC₅₀の12.5あたり)のcAMP類似体8-(4-クロロフェニル)-チオ -cAMPS(8-CPT-cAMP)で処理した。図８から判るように、cAMPは、モックトランス フェクションT細胞において、コントロールの約20%までT細胞増殖を阻害した。 それに反して、RIaリボザイムでトランスフェクションしたT細胞は、cAMPによっ て約40％まで阻害されたにすぎず、即ち、RIaリボザイムの存在下での免疫感応 性が二倍増加した。このことは、プロテインキナーゼAタイプI（RIa）の産生を 阻害するプロテインキナーゼAのRIaサブユニットに対するリボザイムが、免疫不 全症におけるプロテインキナーゼAタイプIの活性化により生じたT細胞機能不全 を回復させる治療に有効であり得 ることを示す。インビボでの使用のためには、リボザイムを予備処理して、小遺 伝子としての細胞取込みまたは細胞内導入を可能とする必要があるであろう。 実施例４ T細胞機能不全において、プロテインキナーゼAタイプIを介した増加するシグ ナリングを無効とするために、プロテインキナーゼAタイプIの局在化をTCR/CD3 と競争させて、基質から取り除くことを試みた。 A-キナーゼアンカー作用（アンカリング）タンパク質(AKAP)Ht31(SEQ.ID.NO2) のアミノ酸493-515をカバーするペプチドは、両親媒性αヘリックスを含み、こ れはAKAPSをアンカー作用するRII-およびRI両方のアンカー作用ドメインが現れ 、かつRサブユニット結合ドメインとの相互作用する疎水性表面を形成する。最 近のデータは、R.Iccの結合が二重特異的AKAPS(D-AKAPIおよびDAKAP2)に対して であり、かつRI及びRIIのAKAPsへの結合は、インビトロでHt31競合ペプチドと競 争し得ることを示す。しかしながら、RIは、RIIのAKAPsに対するより非常に低い 親和性で結合する。したがって、より低い濃度では、細胞培地中に、RII-介在効 果よりRI-介在効果が競争を行うと予想される。 血液CD3+T細胞を、徐々にHt31(SEQ.ID.NO2)ペプチドの濃度を増加させながら インキュベートした。取り込みを促進するために、細胞を、ペプチドの存在下ま たは非存在下で、リポソームで処理した。DOTAPリポソームの最適濃度は、T細胞 の膜安定性および正常なTCR/CD3-依存活性を 維持するために、注意深く滴定した。細胞をDOTAP/ペプチドで２０時間インキュ ベートし、インキュベートは、8-CPT-cAMPの非存在下（中実棒）または存在下（ 6.25μM、斜線棒）で継続し、活性化してTCR/CD3の刺激で増殖させた。T細胞免 疫感応性を[3H]チミジン取り込みとして調査した。この結果は、免疫不全症にお けるプロテインキナーゼAタイプIの増加する活性状態をシミュレートするために cAMPで処置したT細胞では、Ht-3Iペプチドの濃度が、T細胞増殖のcAMP依存阻害 を逆転させた（50μMHt-31存在下のcAMPで、モックトランスフェクションと比較 して三倍増加増殖した）を示した(図ａ)。これは、競争剤ペプチドが。AMPレベ ルが上昇した機能不全T細胞の免疫応答を、正常化し得ることを示す。 両親媒性ヘリックスが二つのバリン残基をプロリンで置換することによって破 壊されたペプチド(Ht-31P)は右パネルにコントロールとして提示する。この場合 、ペプチドの濃度を増加させながらの処理は、cAMP存在下での増殖を増加させな かった。 次に、T細胞増殖における競争剤ペプチド(Ht-31、35μM)の効果を、徐々に8-C PT-cAMPの濃度を増加させる存在下で試験し、同濃度の8-CPT-cAMPで処理したモ ックトランスフェクション細胞と比較した(図１０)。正常末梢血液T細胞につい ては既に示したように(実施例１および２，図１および図４Ｂ)、8-CPT-cAMPは、 約1.8μM（多分増加するリポソームとの浸透性により、トランスファクションし ていない細胞と比較してより低いIC₅₀）のICにて、正の協同様式でモックトラン スフェクション細胞をも阻害した。Ht-3I競争剤ペプチドの存在下、cAMPによる 右 方シフト阻害曲線が、4.8μMの見かけのIC₅₀とともに観察された。外因性cAMP活 性化PKAタイプIの上昇したレベルにより、HIV-感染患者またはCIVを有する患者 からのT細胞で観察された左方シフト曲線と比較すると、ここで観察された右方 シフトは、患者の病状を正常化することが予想される。 要約すると、結果は、プロテインキナーゼAタイプIの局在化をTCR/CD3と競争 させて、基質から取り除くことは、免疫不全症におけるプロテインキナーゼAタ イプIの活性化により生じた、T細胞機能不全を逆転する有用な治療となり得るこ とを示している。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１１月２６日（１９９９．１１．２６） 【補正内容】 （１）請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）明細書第１０頁下から３行目において 「AMP」とあるのを、 「AKAP」と補正する。 （３）明細書第１１頁１行目において 「(２３)」とあるのを、 「(２，３)」と補正する。 請求の範囲１． 免疫抑制疾患治療用の製剤調製物を製造するための、cAMP拮抗剤、ハンマ ーヘッドのリボザイム、配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアン カー作用破壊ペプチドからなる群から選択され、cAMP依存性プロティンキナーゼ （PKA）タイプＩα（RIα₂C₂）の機能を選択的または特異的に廃止する阻害剤の 使用。２． 前記cAMP拮抗剤が、RIαサブユニットを結合させ、かつPKAタイプＩαの 選択的なまたは特異的な拮抗剤として作用する硫黄置換cAMP類似体（アデノシン -3',5'-サイクリックモノホスホロチオエート、Rp-アイソマー）である請求項１ に記載の使用。３． 前記cAMP拮抗剤が、Rp-8-Br-cAMPSまたはRp-8-Cl-cAMPSである請求項１ま たは２に記載の使用。４． 前記ハンマーヘッドのリボザイムが、下記の基本配列： を有する請求項１または２に記載の使用。５． 前記ハンマーヘッドのリボザイムが、下記の基本配列：を有する請求項１に記載の使用。６． 前記ハンマーヘッドのリボザイムが、2-デオキシ-シトシンおよび2-デオ キシ-ウラシル類似体の導入により安定化されている請求項５に記載の使用。７． 前記配列特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、下記の配列： を有する請求項１に記載の使用。８． 前記配列特異的アンチセンスヌクレオチドが、下記の配列： を有する請求項１に記載の使用。９． PKAにより介在される効果を、PKAタイプＩαのT細胞受容体／CD3複合体と の局在化の競争に関与するPKAタイプＩαのアンカー作用を破壊することによっ て阻害する方法。 １０． 前記アンカー作用破壊ペプチドが、少なくとも２２個のアミノ酸を含有 する請求項１に記載の使用。 １１． 前記アミノ酸が、 である請求項１０に記載の使用。 １２． 前記アミノ酸が、 である請求項１０に記載の使用。 １３． 前記アミノ酸が、 である請求項１０に記載の使用。 １４． 前記アミノ酸が、 である請求項１０に記載の使用。１５． 請求項１０、１１、１２、１３または１４のいずれかで記載または定義 される配列を含み、PKAＩαのアンカー作用を破壊するために使用されるペプチ ド。１６． 請求項４〜６のいずれかで定義された核酸配列を有し、RIαの発現を破 壊するために使用されるハンマーヘッドリボザイム。１７． 請求項７または８で定義された核酸配列を含み、RIαの発現を破壊する ために使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。１８． 前記免疫抑制疾患が、AIDS、HIV感染またはCVIである請求項１〜１４の 何れかに記載の使用。１９． 請求項１〜１８のいずれかで定義された阻害剤および一以上の製薬上許 容される補助剤または充填剤を含む製剤組成物。２０． 薬剤として使用するための、請求項１〜１９のいずれかで定義さ れた阻害剤。２１． 免疫抑制疾患を処置するために使用される、請求項１〜２０のいずれか で定義された阻害剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 オークルスト，パル ノールウェー エヌ―2322 リダブ，アブ ラハム ピールス ベグ ５ (72)発明者 スカルヘッグ，ビョーン，エス. ノールウェー エヌ―1322 ホービク，ビ ョーケアレーン ３ビー (72)発明者 ミューラー，フレドリク ノールウェー エヌ―0588 オスロ，オッ トー ブレアース ファイ ４ (72)発明者 フローランド，スティグ ノールウェー エヌ―0851 オスロ，ハッ セルハウグファイエン 34 (72)発明者 ハンソン，ヴィダー ノールウェー エヌ―1300 サンドヴィ カ，インガーリエン 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 免疫抑制疾患処置用の製薬剤調製物の製造への、cAMP依存性プロテインキ ナーゼAタイプIの機能を廃止する阻害剤の使用。 ２． 前記阻害剤が、cAMP拮抗剤、ハンマーヘッドのリボザイム、配列特異的ア ンチセンスヌクレオチドおよびアンカー作用破壊ペプチドからなる群から選択さ れる請求項１に記載の使用。 ３． 前記cAMP拮抗剤が、Rp-8-Br-cAMPS、Rp-8-Br-モノブチリル-cAMPS、Rp-モ ノ-ブチリル-CAMPS、Rp-8-Cl-cAMPS、Rp-8-(4-クロロフェニルチオール)-cAMPS およびRp-8-ピペリジノ-cAMPSからなる群から選択される請求項１または２に記 載の使用。 ４． 前記cAMP拮抗剤が、Rp-8-Br-cAMPSである請求項１〜３の何れかに記載の 使用。 ５． 前記ハンマーヘッドのリボザイムが、下記の基本配列： を有する請求項１または２に記載の使用。 ６． 前記ハンマーヘッドのリボザイムが、下記の基本配列： を有する請求項１または２に記載の使用。 ７． 前記ハンマーヘッドのリボザイムが、2-デオキシ-シトシンおよび2-デオ キシ-ウラシル類似体の導入により安定化されている請求項６に記載の使用。 ８． 前記配列特異的アンチセンスヌクレオチドが、下記の配列： を有する請求項１または２に記載の使用。 ９． 前記配列特異的アンチセンスヌクレオチドが、下記の配列：を有する請求項１または２に記載の使用。 １０． 前記競争アンカー作用破壊ペプチドが、少なくとも２２個のアミノ酸を 含有する請求項１または２に記載の使用。 １１． 前記アミノ酸が、 である請求項１０に記載の使用。 １２． 前記アミノ酸が、 である請求項１０に記載の使用。 １３． 前記アミノ酸が、 である請求項１０に記載の使用。 １４． 前記アミノ酸が、である請求項１０に記載の使用。 １５． 前記免疫抑制疾患が、ヒト免疫不全ウイルス感染または共通の不定免疫 不全である請求項１〜１４の何れかに記載の使用。