DE69804125T2 - Verwendung von immunomodulatoren - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Inhibitoren bzw. Hemmstoffen, die die Funktion von cANPabhängiger Proteinkinase A Typ I aufheben, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung immunsuppressiver Erkrankungen.
• Das Immunsystem von Säugern hat im Lauf der Evolution verschiedene Strategien zur Verteidigung des Organismus gegen die Vielzahl potentiell infektiöser Erreger bzw. Agenzien entwickelt. Die Fähigkeit, spezifische und gedächtnisbildende Antworten bzw. Reaktionen gegen Eindringlinge zu erwerben, kennzeichnet das adaptive Immunsystem. Die wichtigsten Akteure im adaptiven Immunsystem sind B- und T- Lymphozyten, und die spezifische Erkennung von Antigen durch diese Zellen wird von Rezeptoren mit einem gewissen Grad an struktureller Ähnlichkeit, jedoch sehr unterschiedlicher Funktion vermittelt. Die unterschiedlichen Rezeptorspezifitäten werden durch somatische Umlagerung einer begrenzten Anzahl von Genen möglich und sind klonal verteilt. Die Hauptstrategie dieses Systems ist die Erzeugung einer fast unbegrenzten Anzahl an Spezifitäten, um die Erkennung fast jedes fremden Antigens abzudecken. Das immunologische Gedächtnis ist teilweise ein Ergebnis der klonalen Vermehrung von Untergruppen der T- und B-Zellen, die mit einem bestimmten Antigen reagieren, und ermöglicht es dem Organismus, bei einem zweiten Zusammentreffen mit dem gleichen Antigen schneller zu reagieren.
• Die Zellproliferation wird als Parameter für eine Immunaktivierung verwendet. Der Theorie der klonalen Selektion zufolge führt das Zusammentreffen mit einem Antigen zu einer Aktivierung einzelner B- und T-Zellklone mit entsprechenden Rezeptorspezifitäten. Die Anzahl von Zellen mit einer Affinität für ein bestimmtes Antigen ist jedoch nur ein kleiner Bruchteil der Gesamtanzahl an Zellen (~ 0,001%). Daher ist es entscheidend, daß die aktivierten Zellen zur Proliferation (klonalen Vermehrung) in der Lage sind, damit eine angemessene Immunantwort erzeugt wird. Somit ist die Proliferation ein sehr wichtiger Parameter, der die Lymphozytenfunktion und die Fähigkeit zur Immunaktivierung kennzeichnet. In in-vitro-Experimenten läßt sich die gesamte Population von isolierten T-Lymphozyten durch Verwendung von Antikörpern stimulieren, die gegen den Antigenrezeptorkomplex (TCR/CD3) gerichtet sind. Dies ahmt die in-vivo-Situation nach, wenn T-Zellen über den Antigenrezeptor zur klonalen Vermehrung immunaktiviert werden. Bekanntlich wird die T- Zellproliferation über den cAMP-Signalweg gehemmt.
• Von zyklischem AMP abhängige Proteinkinase (PKA) ist ein Enzym, das in allen Zellen vorliegt. Hormone und Neurotransmitter, die an spezifische Rezeptoren binden, stimulieren die Bildung des sekundären Signalmoleküls (second messenger) zyklisches 3',5'-Adenosinmonphosphat (cAMP). Zyklisches AMP ist eines der häufigsten und vielseitigsten sekundären Signalmoleküle und übt seine Wirkung über eine Bindung an und Aktivierung von PKA aus. PKA ist eine Serin/Threonin-Proteinkinase, die eine Reihe unterschiedlicher Proteine in einer Zelle phosphoryliert und dadurch deren Aktivität reguliert. Bekanntlich steuert PKA eine große Vielzahl an zellulären Vorgängen, wie Metabolismus, Proliferation, Differenzierung und Regulation der Gentranskription. PKA ist aus vier verschiedenen Untereinheiten aufgebaut, einem Dimer von regulatorischen Untereinheiten (R) und zwei katalytischen Untereinheiten (C). Zudem wurden zwei Hauptklassen von PKA-Isoenzymen, PKA Typ I und PKA Typ II (PKAI bzw. PKAII) beschrieben. PKAI und PKAII lassen sich aufgrund ihrer R-Untereinheiten unterscheiden, die als RI und RiI bezeichnet werden. Isoformen von RI und RII werden RIα, RIß, RIIα, RIIß genannt. Zudem liegen auch die C- Untereinheiten als Isoformen vor, die man als Cα, Cß und Cγ bezeichnet. Die verschiedenen Untereinheiten können viele verschiedene Formen von PKA (Isoenzyme) mit potentiell mehr als 18 verschiedenen Funktionen bilden.
• PKA ist ein wesentlicher negativer Regulator der Lymphozytenfunktion. Die Erfinder und andere haben gezeigt, daß cAMP die durch den T-Zellantigenrezeptor/CD3-Komplex (TCR/CD3) induzierte T-Lymphozytenproliferation hemmt. Wir haben gezeigt, daß T-Zellen sowohl PKAI als auch PKAII exprimieren. Nur die selektive Aktivierung von PKAI reicht jedoch aus, um die hemmende Wirkung von cAMP zu vermitteln. Außerdem haben wir gezeigt, daß PKAI, aber nicht PKAII, sich auf die Antigenrezeptoren auf B- und T-Zellen und natürlichen Killerzellen verteilt, die gleiche Lokalisierung wie diese aufweist und deren Signalgebung hemmt sowie die mitogenen Antworten in T- und B-Zellen und akuten zytotoxischen Antworten in NK-Zellen steuert. Somit dient PKAI als wesentlicher negativer Regulator von Lymphozytenfunktionen, z. B. mitogenen und zytotoxischen Antworten, die durch Antigenrezeptoren eingeleitet werden.
HIV und allgemeine variable Immundefizienz (common variable immunodeficiency (CVI)).
• Primäre und sekundäre Immundefekte verursachen ein erhöhtes Auftreten von opportunistischen Infektionen und Krebs und sind zunehmende Ursachen von Krankheit und Sterblichkeit in allen Teilen der Welt. Das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht eine chronische Infektion, die zu schwerer Dysfunktion des Immunsystems mit einem deutlich erhöhten Auftreten einer großen Zahl von Infektionen und bestimmten Formen von Malignitäten (z. B. Lymphom und Kaposi-Sarkom) führt. In vielen Gemeinden in den USA ist eine HIV-Infektion die führende Todesursache unter "jungen" Erwachsenen. In den Entwicklungsländern ist das Problem noch größer. Neben der Immunglobulin-(Ig-)A- Defizienz ist die allgemeine variable Immundefizienz (CVI) der häufigste Typ einer primären Immundefizienz. Diese Form der primären Hypogammaglobulinämie ist durch das Einsetzen der Immundefizienz nach den ersten zwei Lebensjahren, schwerwiegend verringerte Serum-IgG-Spiegel und wiederkehrende Bakterieninfektionen, insbesondere im Atemtrakt, gekennzeichnet.
Zelluläre Defekte bei Immundefizienzen.
• T-Zell-Dysfunktion ist das immunologische Kennzeichen einer HIV-Infektion. Eine fehlerhafte Cytokinproduktion der Lymphozyten und eine gestörte Proliferationsantwort nach einer Stimulation sind erste Anzeichen von Immunschwäche bei diesen Patienten, die sich sogar manifestieren, bevor eine Abnahme der CD4+- Lyphozytenzahlen beobachtet wird. B-Zell-Dysfunktion mit gestörter Antikörpersynthese ist das wichtigste immunologische Merkmal bei CVI-Patienten. Die immunologischen Anomalitäten bei CVI sind jedoch nicht auf B-Zellen beschränkt, sondern umfassen oft auch eine T-Zell-Dysfunktion, z. B. eine gestörte Proliferationsantwort bei Stimulation. Bei CVI- Patienten sind die B-Zellen nicht notwendigerweise von sich aus fehlerhaft, und eine gestörte T-Zell-"Hilfe" kann für den B-Zell-Defekt bei diesen Patienten von Bedeutung sein. Eine T-Zell-Dysfunktion kann bei diesen Patienten auch für bestimmte klinische Manifestationen von Bedeutung sein, die nicht notwendigerweise mit einer fehlerhaften Antikörperproduktion zusammenhängen, z. B. ein erhöhtes Auftreten von Granulomata und Malignitäten.
Gegenwärtige Therapien.
• Eine anti-retrovirale Therapie ist der Hauptbestandteil der Behandlung HIV-infizierter Patienten. Obwohl eine starke anti-retrovirale Kombinationstherapie die CD4+- und CD8+-Lymphozytenzahlen in HIV-infizierten Patienten deutlich erhöhen kann, scheint die gestörte T- Zellfunktion jedoch bestehen zu bleiben, wie die im Beispiel 1, Tabellen I und 2B gemachten Beobachtungen anzeigen. Daher besteht bei diesen Patienten ein Bedarf an immunmodulierenden Mitteln zusätzlich zur anti-retroviralen Therapie. Eine Immunglobulinsubstitution ist der Hauptbestandteil der Behandlung von CVI-Patienten. Die Substitutionstherapie stellt jedoch die fehlerhafte T- und B- Zellfunktion nicht wieder her. Bei einigen klinischen Komplikationen, z. B. nicht verkäsenden Granulomata und bleibenden Virusinfektionen, besteht zudem ein Bedarf an einer Therapie, die die T-Zellfunktion direkter verändern kann.
Therapeutisches Potential neuer Medikamente, die auf die T- Zell-Dysfunktion abzielen.
• Obwohl eine gestörte T- Zellfunktion ein gut bekanntes immunologisches Merkmal sowohl von HIV-Infektion als auch CVI ist, ist der genaue molekulare Mechanismus für diese T-Zell-Störung unbekannt. Therapiearten, die gegen solche intrazellulären Defekte gerichtet sind, können bei der Behandlung dieser Patienten von entscheidender Bedeutung sein und haben möglicherweise das Potential, wichtige immunologische. Defekte bei HIVinfizierten Patienten und bei Patienten mit CVI zu beheben.
• Hofmann et al. (Aids, Bd. 7; 659-664, 1993) und WO 93/19766 haben gezeigt, daß HIV-seropositive Personen ohne AIDS einen signifikanten Anstieg der intrazellulären cAMP-Spiegel und der PKA-Aktivität in rohen mononukleären Zellen aus peripherem Blut (peripheral blood mononuclear cells (PBMC)) von HIVseropositiven Personen aufwiesen. Eine Untersuchung von T-Zellen wurde als nicht gezeigte Daten erwähnt und erreichte aufgrund einer höheren Variabilität, die wahrscheinlich durch das T-Zell-Reinigungsverfahren induziert worden war, keine Signifikanz. Ihre Studie zeigte zudem, daß Adenosin-Analoga, wie 2',5'-Didesoxyadenosin (ddAdo), die zellulären cAMP-Spiegel in PBMC verringerten und die ZelTproliferation steigerten. Diese Wirkung war jedoch konzentrationsabhängig, so daß Konzentrationen im Bereich von 6 ng/ml wirksam waren und höhere Konzentrationen unterdrückend wirkten oder die cAMP-Spiegel nicht weiter hemmten. Es wurden weder ähnliche Wirkungen in den T-Zellen von HIV- Patienten noch eine einfache Konzentration-Antwort- Beziehung demonstriert. In ihren Beispielen verwendeten sie gereinigte T-Zellen, aber diese Zellen wurden von gesunden Blutspendern entnommen und durch positive Selektion gereinigt, was zu einer vorzeitigen T-Zellaktivierung führen kann.
• Chu-Chung, YS, Genieser, H, und Jastorff, B (WO 93/21929-A) zeigten eine auf Krebszellen angewendete Behandlung, bei der Phosphorthioat-Derivate von cAMP als Antagonisten von cAMP-abhängigen Proteinkinasen eingesetzt werden.
• Zusammengefaßt läßt sich sagen, daß man im Stand der Technik die Rolle des cAMP-Spiegels in T-Zellen im Hinblick auf die T-Zellproliferation und die Immunantwort unter physiologischen Bedingungen nicht kennt. Zudem kennt man nicht die Rolle der Proteinkinase-Isoenzyme im Hinblick auf T- Zellfunktionen unter physiologischen Bedingungen und weiß nicht, ob cAMP/PKAI eine immunmodulatorische Aktivität besitzt. Obgleich die Ergebnisse von Hofman et al. (siehe oben) einen erhöhten cAMP-Spiegel in mononukleären Zellen nahelegen, wurde kein Nachweis erbracht, der auf ähnliche Bedingungen in T-Zellen hindeutet. Daher ist nicht bekannt, ob der cAMP-Spiegel in gereinigten T-Zellen und negativ selektierten (nicht aktivierten) T-Zellen von HIV+-Personen erhöht ist, und es ist nichts über den cAMP/PKA-Weg bei Patienten bekannt, die an CVI leiden.
• Daher ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bei mit dem menschlichen Immunschwächevirus infizierten Patienten und Patienten mit allgemeiner variabler Immundefizienz spezifisch die T-Zell-Immunfunktion zu erhöhen und eine T- Zell-Dysfunktion aufzuheben, indem geeignete Verbindungen eingesetzt werden, die den cAMP-PKA-Weg in den T-Zellen stören. Da die Rolle von PKA Typ I als Immunmodulator für alle lymphoiden Zellen (T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen) gleich ist, kann zudem die Zerstörung des cAMP/PKA-Wegs auch für B- und NK-Zellen gelten.
• Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, die durch die beigefügten Ansprüche gekennzeichnet ist. Somit stellt die vorliegende Erfindung unter einem ersten Merkmal die Verwendung von Hemmstoffen bzw. Inhibitoren bereit, die aus der aus cAMP-Antagonisten, Hammerkopf- Ribozymen, sequenzspezifischen Antisense-Oligonukleotiden und eine Verankerung zerstörenden Peptiden bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei die Hemmstoffe die Funktion von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKA) Typ Iα (RIα&sub2;C&sub2;) aufheben, um eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von immunsuppressiven Erkrankungen herzustellen. Vorzugsweise ist der Hemmstoff oder Antagonist selektiv oder spezifisch für PKA Typ Iα. Vorzugsweise sind die zu behandelnden Erkrankungen AIDS, HIV-Infektion oder CVI.
• Die Aufhebung von Wirkungen, die von cAMP-abhängiger Proteinkinase vermittelt werden, läßt sich auf die folgenden Weisen durchführen:
PKA-Isoenzym-spezifische cAMP-Antagonisten.
• Die Aktivität von PKA wird in vivo spezifisch durch cAMP über die R- Untereinheit gesteuert. Chemisch modifizierte, diffusionsfähige cAMP-Analoga können zur Manipulation intrazellulärer cAMP-Spiegel verwendet werden. Thiosubstituierte Analoga, bei denen der Phosphor im zyklischen Phosphat von cAMP durch Schwefel ersetzt worden ist, bilden eine Verbindung, die gegenüber dem Abbau durch Phosphodiesterasen resistent ist. Zudem können thiosubstituierte Analoga zwei Formen annehmen: Der Schwefel kann sich in einer äquatorialen oder axialen Position in Bezug auf den Adeninring befinden. Das axiale Diasteromer (Sp-cAMP-Phosphorthioat, Sp-cAMPS und Derivate) dient als cAMP-Agonist, wohingegen das äquatoriale Diastereomer (Rp-cAMP-Phosphorthioat, Rp-cAMPS und Derivate) kompetitiv an die cAMP-Bindungsstellen der R- Untereinheiten bindet, aber das Enzym nicht aktiviert. Eine eingehendere Charakterisierung zeigte, daß Rp-cAMPS ausschließlich für PKAI-Isoenzyme (RIα&sub2;C&sub2;, RIß&sub2;C&sub2;) als vollständiger Antagonist und für PKAII-Isoenzyme (RIIα&sub2;C&sub2;, RIIß&sub2;C&sub2;) teilweise als Agonist wirkt. Beispiele für diffusionsfähige Derivate von Rp-cAMPS, die für lebende Zellen geeignet sind, sind Rp-8-Br-cAMPS, Rp-8-Br-MonobutyrylcAMPS, Rp-Monobutyryl-cAMPS, Rp-8-C1-cAMPS, Rp-8-(4- Chlorphenylthio)-cAMPS, Rp-Piperidino-cAMPS. Vorzugsweise sind erfindungsgemäß verwendbare cAMP-Antagonisten thiosubstituierte cAMP-Analoga, besonders bevorzugt Rp-8-Br-cAMPS oder Rp-8-Cl-cAMPS.
Strategien zum Ausschalten der Genfunktion.
• Von spezifischen PKA-Isoenzymen vermittelte Wirkungen lassen sich durch Hemmung der Synthese von Untereinheiten dieses Enzymkomplexes aufheben. Dies kann durch Einsatz sequenzspezifischer Antisense-Oligonukleotide erfolgen, die an mRNA hybridisieren und eine Translation zu PKA-Untereinheiten blockieren. Eine weitere Strategie ist die Verwendung von Hammerkopf-Ribozymen, die spezifisch mRNA für PKA- Untereinheiten erkennen und spalten und so die Synthese dieser Untereinheiten hemmen.
Ribozyme.
• Ribozyme sind RNA-Moleküle, welche die Spaltung und Bildung von Phosphodiesterbindungen katalysieren. Die Entdeckung kurzer Oligoribonukleotide mit Endoribonukleaseaktivität lieferte den Forschern ein wichtiges Werkzeug zur Blockierung einer Expression spezifischer Gene. Die Hammerkopf-Domäne ist ein guter Kandidat für den Einbau in genspezifische Antisense-Transkripte, induziert eine enzymatische Spaltung bei einer angesteuerten GUC-Sequenz in der mRNA und hemmt die anschließende Translation der mRNA zu Protein. Ribozyme lassen sich in Zellen als RNA transfizieren oder als Minigene einbringen, von denen das Ribozym intrazellulär unter der Kontrolle eines Promotors intrazellulär transkribiert wird. Zudem können Ribozyme durch Addition von Alkylgruppen in der Position 2 der Riboseeinheit chemisch modifiziert werden, wodurch die Permeabilität erhöht wird, oder intrazelluläre Wirkungen können durch Substitution mit 2-Desoxycytosin oder 2- Desoxyuracil verlängert werden.
Sequenzspezifische Antisense-Oligonukleotide.
• Antisense-Oligonukleotide zu spezifischen mRNAs binden an RNA in einem DNA/RNA-Heteroduplex und hemmen die Translation der mRNA zu Protein, indem sie die Wanderung zur und die Ablesung durch die Translationsmaschinerie blockieren. Thiosubstituierte Analoga sind gegenüber einem Abbau stabiler und können zur Blockierung der Translation spezifischer Gene transfiziert werden.
Zerstörung der Verankerung.
• Es wurde gezeigt, daß spezifische cAMP-vermittelte Wirkungen an bestimmten subzellulären Orten von der Verankerung von PKA Typ II über hydrophobe Wechselwirkungen mit einer amphipatischen Helixdomäne in A- Kinase-Verankerungsproteinen (AKAPs) abhängt, die sich ganz in der Nähe des Substrats an derselben subzellulären Stelle befinden. Es wurde gezeigt, daß eine Zerstörung der Verankerung durch 22 Aminosäuren lange Kompetitorpeptide an der Wechselwirkungsdomäne, die über liposomenvermittelten Peptidtransfer eingebracht werden, die isoenzymspezifischen Wirkungen aufheben, die von PKA Typ II vermittelt werden. Für PKA Typ I hat man bisher keine ähnlichen Wirkungen gefunden. Beispiele für AKAP-Kompetitorpeptide sind
• 22-mer: H&sub2; N-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val- Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Tyr-COOH (SEQ. ID. NR 1)
• H&sub2;N-Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala- Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr-COOH (SEQ. ID. NR 2)
• H&sub2;N-Gln-Val-Ile-Ser-Glu-Ala-Thr-Gln-Val-Leu-Ala-Thr-Thr- Val-Gly-Lys-Val-Ala--Gly-Arg-Val-Cys-Gln-Ala-COOH (SEQ. ID. NR 3) und
• H&sub2;N-Val-Gln-Gly-Asn-Thr-Asp-Glu-Ala-Gln-Glu-Glu-Leu-Ala- Trp-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Ile-Val-Ser-Asp-Val-Met-Gln-Gln- Ala-His-His-Asp-Gln-Pro-Leu-Glu-Lys-Ser-Thr-Lys-Leu-COOH (SEQ.ID. NR 4).
• Die Erfindung betrifft auch die Verwendung erfindungsgemäßer konkurrierender, Verankerungen zerstörender Peptide, wobei das Peptid mindestens 22 Aminosäuren enthält und vorzugsweise wie vorstehend beschrieben ist. Die Erfindung betrifft zudem ein Peptid, das SEQ.ID. NR. 3 oder 4 umfaßt, zur Verwendung zur Zerstörung der Verankerung von PKAIα.
• Erfindungsgemäß kann die Aufhebung der cAMP-induzierten Hemmung von T-Zell-Immunantworten erzielt werden, indem PKA Typ I/RIα beseitigt wird. Dann sind Hammerkopf-Ribozyme für PKA Typ I-RIα synthetisiert und in vitro getestet worden, wobei gezeigt wurde, daß sie nach Transfektion von T-Zellen aus peripherem Blut vollständig aktiv sind. Die funktionellen Folgen einer Ribozymbehandlung werden als anti-CD3- induzierte Proliferation gemessen und zeigen die Aufhebung der Empfindlichkeit gegenüber cAMP.
• Beispiele für Hammerkopf-Ribozyme, die so gestaltet sind, daß sie die RIα-Untereinheit von PKA Typ I ausschalten, sind
• GUACUGCCACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUCCAUG (SEQ.ID. NR 5) und
• GGCGGUACUGCCACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUCCAUGGA (SEQ.ID. NR 6).
• Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung der erfindungsgemäßen Ribozyme und die Ribozyme zur Verwendung bei der Aufhebung der Expression von RIα.
• Beispiel für Antisense-Oligonukleotide gegen RIα:
• GTACTGCCAGACTCCATG (SEQ.ID. NR 7) und
• GGCGGTACTGCCAGACTC CATGGT (SEQ.ID. NR 8).
• Diese Antisense-Oligonukleotide umfassen die Zielsequenzen der Hammerkopf-Ribozyme. Die Erfindung betrifft die Verwendung dieser erfindungsgemäßen Antisense-Nukleotide und von Antisense-Oligonukleotiden, die eine wie in SEQ.ID. NR 7 oder 8 definierte Nukleotidsequenz aufweisen, zur Aufhebung der Expression von RIα.
• Eine Zerstörung der Verankerung wurde zuvor für die Translokation von PKA Typ II, aber nicht für PKA Typ I gezeigt. Zur Klonierung der Verankerungsproteine für PKA Typ I verwendeten wir die Far-Western-Technik unter Verwendung von RIα als Sonde bei der Durchmusterung von Blutzellexpressionsbanken. Zudem setzen wir ein Hefe-Two-Hybrid- System zum Nachweis von wechselwirkenden Proteinen ein. Die Bindungsdomänen werden durch Deletionskartierung und Mutationsanalyse charakterisiert. Es werden Kompetitorpeptide und Transfektionsvektoren, die die Expression löslicher AMP-Fragmente steuern, hergestellt.
• Auf der Grundlage früherer Beobachtungen, die von den Erfindern gemacht und veröffentlich wurden (23), ist eine Aktivierung von Proteinkinase A Typ 1 (und nicht von Typ-II- Isoenzymen) notwendig und ausreichend, um eine cAMPabhängige Hemmung von Immunfunktionen, beispielsweise der T- und B-Zellproliferation, die durch den Antigenrezeptor induziert wird, oder der NK-Zelltoxizität, die von spezifischen NK-Rezeptoren vermittelt wird, zu vermitteln. Zudem verteilt sich nach Aktivierung und Capping von T- und B- Zellen die Proteinkinase A Typ I auf den Antigenrezeptorkomplex und zeigt die gleiche Lokalisierung wie dieser (3). Diese Verankerung von Proteinkinase A Typ I spricht für eine Rolle dieses spezifischen Isoenzyms bei der Modulation von Immunantworten, die durch Rezeptoren auf lymphoiden Zellen vermittelt werden.
• Somit stellt die Erfindung zudem ein Verfahren zur Hemmung der von PKA Typ Iα vermittelten Wirkungen bereit, wobei die Verankerung von PKA Typ Iα zerstört wird, welches die Konkurrenz der Lokalisierung von PKA Typ Iα mit dem T- Zellrezeptor/CD3-Komplex umfaßt.
• Entdeckungen, welche die Erfinder in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gemacht haben, zeigen, daß in T- Zellen von Patienten mit einer HIV-Infektion oder mit CVI eine erhöhte Aktivierung der Proteinkinase A Typ I vorliegt. Zudem wird gezeigt, daß die Aktivierung dieses PKA- Isoenzyms zu einer Hemmung der Immunfunktion führt, die durch selektive Hemmung des Typ-I- und nicht des Typ-II- Isoenzyms der PKA aufgehoben werden kann. Aufgrund dieser Befunde läßt sich die Erfindung zusammenfassen als eine Verwendung von Verbindungen, die auf die Aufhebung einer unangemessenen Aktivierung von Proteinkinase A Typ T bei Immundefekten (HIV, CVI) abzielt und dadurch die T- Zellfunktion und die Immunreaktionsfähigkeit wiederherstellt. Die angefügten Beispiele zeigen, daß die folgenden Formulierungen sämtlich mit der Signalweitergabe durch Proteinkinase A Typ I wechselwirken und daß sie getrennt oder in Kombinatioh verwendet werden können, um die unangemessene Aktivierung von Proteinkinase A Typ I anzusteuern und aufzuheben.
• Formulierungen/Verbindungen, die als Hemmstoffe der Funktion von Proteinkinase A Typ I wirken, wirken folgendermaßen:
• 1) Unter Verwendung von für Proteinkinase A Typ I selektiven, konkurrierenden, vollständigen Antagonisten von cAMP wird die ligandenabhängige Aktivierung von Proteinkinase A Typ I, aber nicht von Proteinkinase A Typ II gehemmt (Beispiele 1, 2).
• 2) Unter Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden oder Ribozymen wird die Funktion von Proteinkinase A Typ I gehemmt, indem dieses PKA-Isoenzym beseitigt wird (Beispiel 3).
• 3) Unter Verwendung von Kompetitorpeptiden, die Proteinkinase A Typ I von ihrer Verankerung am Antigenrezeptorkomplex verdrängen, wird die Funktion von Proteinkinase A Typ I gehemmt, indem das aktivierte Enzym von Substraten im Antigenrezeptorkomplex verdrängt wird, die für die Hemmung von Immunfunktionen in T-Zellen relevant sind (Beispiel 4).
• Erfindungsgemäß werden somit Hemmstoffe, welche die Funktion von cAMP-abhängiger Proteinkinase A Typ I aufheben, zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung immunsuppressiver Erkrankungen verwendet.
• Die Erfindung stellt zudem pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die einen aus der Gruppe der cAMP-Antagonisten, die aus Hammerkopf-Ribozymen oder eine Verankerung zerstörenden Peptiden, wie vorstehend definiert, oder einem sequenzspezifischen Antisense-Oligonukleotid, wie vorstehend definiert, besteht, ausgewählten Hemmstoff und einen oder mehrere pharmazeutische verträgliche Hilfs- oder Füllstoffe umfassen. Diese Hemmstoffe zur Verwendung als Medikament, vorzugsweise zur Behandlung immunsuppressiver Erkrankungen, stellen weitere Aspekte der Erfindung dar.
• Die wirksame(n) chemische(n) Verbindung(en) wird/werden einem Patienten, der eine Behandlung benötigt, über sämtliche im Fachgebiet bekannte Verabreichungswege verabreicht. Folglich besteht das erfindungsgemäße Medikament aus wirksamen chemischen Inhaltstoffen, Hilfsstoffen, pharmazeutisch verträglichen Füllstoffen und umfaßt Tabletten, Suppositorien, Injektionsflüssigkeiten, Infusionsflüssigkeiten und Pulver zur Herstellung einer beliebigen Verabreichungsform. Zudem wird/werden der/die Wirkstoff(e) (Ribozym, Protein) intrazellulär als Genprodukt(e) exprimiert, deren Expression von (einem) Gen(en) gesteuert wird, das/die in die Zellen von Interesse eingebracht wurde(n). Die Genexpression wird von einem Promotor gesteuert, der in den Zellen von Interesse wirksam ist und zum Einbau in das Genom, zur unabhängigen Replikation oder vorübergehenden bzw. transienten Transfektion/Expression in jede Form eines linearen oder zirkulären DNA-Vektors eingebracht werden kann. Die Einbringung der DNA-Vektoren kann durch alle im Fachgebiet bekannten Verfahren erfolgen.
• Die Anforderungen an eine Verbindung, welche den T-ZellcAMP-PKA-Weg modifizieren soll, sind mindestens Diffusionsfähigkeit in die T-Zellen und Resistenz gegen Abbau durch Phosphodiesterasen. Die vorliegende Erfindung hat gezeigt, daß ein Derivat von Rp-cAMP, wie Rp-8-Br-cAMPS, in vitro die Proliferation gereinigter T-Zellen von HIV-positiven Patienten und in Patienten mit allgemeiner variabler Immundefizienz spezifisch erhöhte. Bei der Untersuchung der anti-CD3-induzierten und stark verringerten Proliferation von T-Zellen von einem HIV-Patienten erhielten die Erfinder den besonders überraschenden Befund, daß die Verwendung des Antagonisten Rp-8-Br-cAMPS nicht nur die Wirkung des komplementären cAMP-Agonisten aufhob, sondern zudem die Proliferation auf ein Niveau über dem in unbehandelten Zellen erhöhte. Im verwendeten Konzentrationsbereich (0-1000 mM) korrelierte die T-Zellproliferation, ausgedrückt als der [³H]-Thymidin-Einbau, mit der Konzentration. Bei normalen Personen wurde keine erhöhte T-Zellproliferation unter Verwendung des cAMP-Antagonisten gezeigt.
• Im folgenden wird die Erfindung eingehender anhand von Beispielen und Figuren beschrieben. Es zeigt Fig. 1. (A) Spiegel von endogenem cAMP in CD3+-T-Zellen aus peripherem Blut von normalen gesunden Blutspendern (n = 10) und HIV-infizierten Patienten (n = 9). Die endogenen cAMP-Spiegel wurden in CD3+-T-Zellen aus peripherem Blut von normalen gesunden Blutspendern (n = 10) und HIVinfizierten Patienten (n = 9) untersucht. cm+-T-Zellen wurden bei 4ºC durch negative Selektion isoliert. Die Mittelwerte (horizontale Gerade) und Daten von einzelnen Patienten (offene Kreise) sind gezeigt. * bedeutet p < 0,05. (B) Die TCR/CD3-stimulierte Proliferation von cm+-T-Zellen aus peripherem Blut von, normalen gesunden Blutspendern und HIVinfizierten Patienten wurde als [³H]-Thymidin-Einbau in Gegenwart steigender Konzentrationen an 8-(4-Chlorphenylthio)-cAMP (8-CPT-cAMP) untersucht. Es wurden Kurvenanpassungsanalysen durchgeführt und IC&sub5;&sub0;-Werte berechnet (die Statistik und Einzelpatientendaten siehe Tabellen 1 und 2a). Die normalisierten Proliferationswerte von T-Zellen aus einem gesunden Blutspender (offene Kreise) und einem repräsentativen HIV-infizierten Patienten (ausgefüllte Kreise, Patient #10 in Tabelle 2a) sind gezeigt (IC&sub5;&sub0;-Werte 6,11 pM gegenüber 1,78 uM). Anmerkung: Linksverschiebung des IC&sub5;&sub0; (Pfeil) und veränderte Kurvensteigung. Die maximalen Proliferationswerte waren in T-Zellen von HIVinfizierten Patienten drastisch verringert (siehe Tabelle 1).
• Fig. 2. Proteinkinase-A-Spiegel. (A) Northern-Blot- Analysen der mRNA-Spiegel von PKA-Untereinheiten bei normalen Blutspendern (Spur 1) und symptomatischen HIVinfizierten Patienten (Spur 2). Gesamt-RNA wurde extrahiert und einer Northern-Blot-Analyse unterworfen (20 ug pro Spur), und die erhaltenen Filter wurden mit 32P-markierten Sonden mit den PKA-Untereinheiten RI&alpha;, RII&alpha;, C&alpha; und Cß hybridisiert. Die Wanderung der 285- und 18S-rmA ist durch Pfeilspitzen markiert. Die Signalintensität wurde mittels densitometrischer Untersuchung geeignet exponierter Autoradiogramme untersucht und im Hinblick auf Unterschiede in der Beladung durch densitometrische Untersuchung von Photographien ethidiumbromidgefärbter Gele vor dem Transfer korrigiert. (B) Immunblot-Analyse von PKA-Untereinheiten. Untersuchung von CD3+-T-Zellen von 2 normalen Blutspendern (Spuren 1 und 2), 2 einzelnen HIV-infizierten Patienten mit asymptomatischer HIV-Infektion (Spuren 3 und 4) und 3 Patienten mit symptomatischer HIV-Infektion (Spuren 5, 6 und 7). Pfeilspitzen markieren die Wanderung gereinigter rekombinanter Standards für PKA-Untereinheiten. Die gleichmäßige Beladung wurde durch densitometrische Untersuchung Coomassie-gefärbter Gele geprüft. Densitometrische Analysen der Immunblots zeigten keine (RI&alpha;, C) oder kleine (Rilet, 15%ige Abnahme, Spuren 1 und 2 gegenüber Spuren 5 bis 7) Unterschieden in den Proteinspiegeln von Patientenproben im Vergleich zu Kontrollen.
• Fig. 3. Eine Hemmung von TCR/CD3-stimulierter T-Zellproliferation durch den cAMP-Agonisten Sp-8-Brom-cAMP-Phosphorthioat (Sp-8-Br-cAMPS) und Aufhebung der Hemmung durch den komplementären cAMP-Antagonisten Rp-8-Brom-cAMP- Phosphorthioat (Rp-8-Br-cAMPS) wurde bei normalen gesunden Blutspendern (A) und HIV-infizierten Patienten (C) untersucht. Die Wirkung steigender Dosen des cAMP-Antagonisten auf die TCR/CD3-stimulierte Proliferation von CD3+-T- Zellen, die von normalen Blutspendern (B) und HIV-Patienten (D) isoliert worden waren, wurde getrennt in den gleichen Experimenten untersucht. (A) und (B) zeigen eine Proliferation von vereinigten und gereinigten CD3+-T-Zellen von 3 gesunden Blutspendern. (C) und (D): T-Zellproliferation bei einem Patienten mit symptomatischer HIV-Infektion. Die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung sind gezeigt. Siehe die zusammengefaßten Patientendaten (n = 18) in Tabelle 1. Anmerkung: Die Skala ist bei den oberen und den unteren Abbildungen unterschiedlich.
• Fig. 4. Endogene cAMP-Spiegel in T-Lymphozyten von CVI- Patienten und gesunden Kontrollen. (A) cAMP-Spiegel in negativ selektierten T-Lymphozyten von 13 CVI-Patienten und 10 gesunden Kontrollen. Die Daten sind als Mittelwerte angegeben. Die Fehlerbalken stellen die 25. bis 75. Percentile dar. *P < 0,05 verglichen mit den Kontrollen. (B) Es ist die Wirkung steigender Konzentrationen des cAMP- Agonisten 8-(4-Chlorphenylthio)-cAMP (8-CPT-cAMP) auf die anti-CD3-stimulierte T-Lymphozytenproliferation in einem repräsentativen CVI-Patienten (ausgefüllte Kreise) und einer gesunden Kontrolle (offene Kreise) gezeigt. Die maximale Proliferation wurde auf 100% normalisiert. Es wurden Kurvenanpassungsanalysen unter Verwendung eines Sigma- Verlaufs durchgeführt, und die IC&sub5;&sub0;-Werte wurden berechnet und zeigten deutlich verringerte Werte für T-Lymphozyten von dem CVI-Patienten im Vergleich zur Kontrolle (2,26 uM gegenüber 4,66 uM). Die statistische Auswertung der CVI- Gruppe und der Kontrollen siehe Tabelle II. Anmerkung: Linksverschiebung des IC&sub5;&sub0; (Pfeil) und veränderte Kurvensteigung (Hill-Koeffizient)
• Fig. 5. Modulation der T-Zellproliferation durch cAMP- Agonisten und -Antagonisten. Es sind die Hemmung der anti- CD3-stimulierten Proliferation von T-Lymphozyten durch den cAMP-Agonisten (SP-8-Br-cAMPS) und die Aufhebung der Hemmung durch dessen komplementären, für PKA Typ I selektiven Antagonisten (Rp-8-Br-cAMPS) bei einer gesunden Kontrolle (A) und einem repräsentativen CVI-Patienten (C) gezeigt. Die Wirkung steigender Konzentrationen von Rp-8-Br-cAMPS auf die anti-CD3-stimulierte T-Lymphozytenproliferation wurde zudem getrennt untersucht, und die Ergebnisse von einer gesunden Kontrolle und einem repräsentativen CVI- Patienten sind in den Abbildungen (B) bzw. (D) gezeigt. Die Daten sind als Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Auswertung der CVI-Gruppe und der Kontrollen, siehe Tabelle II.
• Fig. 6. Wirkung des cAMP-Antagonisten auf die IL-2-Freisetzung aus T-Zellen. Es sind die IL-2-Spiegel in Überständen von anti-CD3-stimulierten T-Lymphozyten nach 20 Std. Kultur mit oder ohne die Zugabe verschiedener Konzentrationen des für PKA Typ I selektiven Antagonisten Rp-8-Br-cAMPS (Rp) gezeigt. Bild A: Gesunde Kontrolle. Bild B: Repräsentativer CVI-Patient. Die Daten sind als Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Auswertung der CVI-Gruppe und der Kontrollen, siehe Tabelle 4. *P < 0,01 gegenüber dem IL-2-Spiegel ohne Antagonist. **P < 0,001 gegenüber dem IL-2-Spiegel ohne Antagonist.
• Fig. 7. Modulation der T-Zellproliferation durch IL-2 und cAMP-Antagonist. Die Wirkung steigender Konzentrationen IL- 2 (2 Einheiten/ng) mit oder ohne 1000 uM Rp-8-Br-cAMPS (Rp) auf die anti-CD3-stimulierte T-Lymphozytenproliferation sind für eine gesunde Kontrolle (A) und einen repräsentativen CVI-Patienten (B) gezeigt. Die Daten sind als Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung angegeben.
• Fig. 8. Aufhebung der cAMP-vermittelten Hemmung der TCR/CD3-stimulierten T-Zellproliferation unter Verwendung eines Ribozyms für die RI&alpha;-Untereinheit der Proteinkinase A Typ 1. TCR/CD3-stimulierte Proliferation von CD3+-T-Zellen aus peripherem Blut von einem normalen gesunden Blutspender nach Behandlung nur mit Liposomen (mock) oder mit Liposomen und RI&alpha;-Ribozym (RI&alpha; rbz, 10 uM) in Abwesenheit (ausgefüllte Balken) und Anwesenheit (offene Balken) von 8-CPT-cAMP (12, 5 jiM).
• Fig. 9. Aufhebung der cAMP-vermittelten Hemmung der TCR/CD3-stimulierten T-Zellproliferation unter Verwendung eines Kompetitorpeptids, das mit der TCR/CD3-assoziierten Verankerung der RI&alpha;-Untereinheit der Proteinkinase A Typ I in T-Zellen konkurriert. TCR/CD3-stimulierte Proliferation von CD3+-T-Zellen aus peripherem Blut von einem normalen gesunden Blutspender nach Behandlung nur mit Liposomen (mock) oder mit steigenden Konzentrationen (25 bis 100,uM) eines Kompetitorpeptids (Ht-31), das mit der Verankerung von PKA Typ II konkurriert oder eines Kontrollpeptids (Ht31-P). Anmerkung: Reduzierte Empfindlichkeit gegenüber cAMP nach Transfektion mit steigenden Konzentrationen an Ht31-Kompetitorpeptid, aber nicht mit dem Kontrollpeptid (Ht-31P).
• Fig. 10. TCR/CD3-stimulierte Proliferation von CD3+-T- Zellen aus peripherem Blut in der Gegenwart steigender Konzentrationen 8-CPT-cAMP. Die normalisierten Spiegel der Proliferation von T-Zellen, die nur mit Liposomen scheintransfiziert wurden (ausgefüllte Kreise, durchgezogene Linie) oder mit Liposomen und Ht31-Peptid (35 uM), das mit der Verankerung von Proteinkinase A Typ I konkurriert, inkubiert wurden (offene Kreise, gestrichelte Linie), wurde mittels [³H]-Thymidin-Einbau nach 48 Std. untersucht, wobei [³H]-Thymidin für die letzten 18 Std. hinzugefügt wurde. Anmerkung: Rechtsverschiebung des IC50 (Pfeil) von 1,8 nach 4,8 uM in der Gegenwart von 8-CPT-cAMP.
• Die nachstehenden Verfahren werden in den Beispielen verwendet:
• CD3+-T-Zellen aus menschlichem peripherem Blut wurden durch negative Selektion aus 50 ml heparinbehandeltem Blut von normalen gesunden Spendern (Ulleval Universitätshospital Blutzentrum, Oslo, Norwegen) oder Patienten gereinigt. Kurz gesagt wurden mononukleäre Zellen aus peripherem Blut mittels Dichtegradientenzentrifugation (Lymphoprep, NycoMed, Oslo, Norwegen), gefolgt von negativer Selektion unter Verwendung von monodispersen Magnetperlen, die direkt mit Antikörpern gegen CD14 und CD19 beschichtet waren, Ratte- anti-Maus-IgG-Perlen, die mit Antikörpern gegen CD56 beschichtet waren, und eines Magneten isoliert. Alle Magnetperlen stammten von Dynal (Oslo, Norwegen, Kat. Nr. 111.12, 111.04 bzw. 110.11), wohingegen der anti-CD56-Antikörper von Pharmingen (San Diego, CA, Kat. Nr. 3I660.d) war. Alle Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Die Zellsuspensionen wurden routinemäßig mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung fluoreszierender Antikörper und eines FacScan (Becton-Dickinson, San Diego, CA) durchmustert, und es wurde .gezeigt, daß sie aus mehr als 90% CD3+-Zellen und kleinen Mengen an CD14+- (< 2%), CD19+- (< 2%) und CD56+-Zellen (< 5%) bestanden.
Negative Selektion von CD3+-T-Zellen aus peripherem Blut
• CD3+-T-Zellen aus menschlichem peripherem Blut wurden durch negative Selektion aus 50 ml heparinbehandeltem Blut von normalen gesunden Spendern (Ullevaal Universitätshospital Blutzentrum, Oslo, Norwegen) oder Patienten gereinigt. Kurz gesagt, wurden mononukleäre Zellen aus peripherem Blut mittels Dichtegradientenzentrifugation (Lymphoprep, NycoMed, Oslo, Norwegen), gefolgt von negativer Selektion unter Verwendung von monodispersen Magnetperlen, die direkt mit Antikörpern gegen CD14 und CD19 beschichtet waren, Ratteanti-Maus-IgG-Perlen, die mit Antikörpern gegen CD56 beschichtet waren, und eines Magneten isoliert. Alle Magnetperlen stammten von Dynal (Oslo, Norwegen, Kat. Nr. 111.12, 111.04 bzw. 110.11), wohingegen der anti-CD56-Antikörper von Pharmingen (San Diego, CA, Kat. Nr. 31660. d) war. Alle Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Die Zellsuspensionen wurden routinemäßig mittels Durchflußzytometrie durchmustert, und es wurde gezeigt, daß sie aus mehr als 90% CD3+-Zellen und kleinen Mengen an CD14+- (< 2%), CD19+- (< 2%) und CD56+-Zellen (< 5%) bestanden.
Quantifizierung von zyklischem AMP
• Die Spiegel von endogenem cAMP wurden in CD3+-T-Zellen aus peripherem Blut untersucht. CD3+-T-Zellen wurden bei 4ºC mittels negativer Selektion isoliert, und Dreifachproben (2 · 10&sup6; Zellen) wurden geerntet, gefolgt von anschließender Extraktion von cAMP und Analyse des intrazellulären cAMP- Gehaltes, wie an anderer Stelle beschrieben ist (8). Es wurde gezeigt, daß die basalen cAMP-Spiegel bei 4ºC sowohl in rohen mononukleären Zellen als auch in CD3+-T-Zellen aus peripherem Blut für mehr als 120 min stabil waren (der zur Reinigung der CD3+-T-Zellen benötigte Zeitraum, Daten nicht dargestellt).
Proliferationstests
• Proliferationstests wurden durch Inkubation von 0, 75 · 10&sup6; cm+-T-Zellen/ml in einem Volumen von 100 ul in Flachboden- Mikrotiterplaten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Aktivierung wurden durch anschließende Zugabe von monodispersen Magnetperlen, die mit Schaf-anti-Maus-IgG beschichtet waren (Dynal, Kat. Nr. 110.02), in einem Zellen : Perlen- Verhältnis von 1 : 1, gefolgt von einer Zugabe von anti-CD3 (Klon SpvT3b) in einer Endverdünnung von 1 : 125000 für die gezeigten Experimente erreicht. Die optimale Antikörperkonzentration wurde sorgfältig in der anfänglichen Anordnung titriert, und es wurden immer parallele Experimente bei mehreren verschiedenen Antikörperverdünnungen durchgeführt.
• Die Proliferation wurde analysiert, indem Zellen für 72 Stunden inkubiert wurden, wobei [³H]-Thymidin für die letzten 16 Stunden hinzugefügt wurde. Die Zellen wurden gewaschen und unter Verwendung einer Scatron-Erntevorrichtung (Suffolk, UK) auf Filtern geerntet und anschließend mittels &beta;-Szintillationszählung analysiert. Bei Verwendung von cAMP-Analoga wurden diese 30 min vor der Aktivierung durch Zugabe von anti-CD3-Antikörpern hinzugefügt. 8-CPT-cAMP stammte von Sigorna (St. Louis, MO), und Sp- und Rp-8-BrcAMPS war von BioLog Life Science Company (Bremen, Deutschland), sie wurden sämtlich in Konzentrationen von 4 bis 10 mM in PBS gelöst, und die Konzentrationen wurden unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Extinktionskoeffizienten berechnet.
Bestimmung der IL-2-Spiegel.
• Zur Bestimmung der IL-2-Spiegel und der IL-2- Rezeptorbindung wurden negativ selektierte CD3-Lymphozyten (10&sup6;/ml, 200 ul/Vertiefung) nur in Medium gezüchtet oder mit anti-CD3 (Klon SpvT&sub3;b) mit oder ohne Vorinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Rp-8-Br-cAMPS stimuliert. Die anti-CD3-Antikörper wurden entweder mit Immunmagnetperlen quervernetzt (IL-2-Spiegel; endgültige anti-CD3- Verdünnung 1 : 125000) oder zuvor auf die Vertiefungen geschichtet (IL-2-Rezeptorbindung; endgültige Verdünnung 1 : 1500). Nach 20stündiger Kultur wurden die zellfreien Überstände geerntet und bis zur Analyse bei -80ºC aufbewahrt. Die IL-2-Spiegel in den Überständen wurden mit einem ELISA (R&R Systems, Minneapolis, MN) bestimmt.
Bestimmung der Prostaglandin-E2-Spiegel (PGE2-Spiegel) in Monozytenüberständen
• Stimulierte (LPS von Escherichia coli 026B6; Endkonzentration 10 ng/mL; Sigma) und unstimulierte Zellen (3 · 105 Monozyten/ml, 200 ul/Vertiefung) wurden in RPMI 1640 (Gibco) mit 2 mmol/l L-Glutamin, das mit 10% menschlichem AB-Serum angereichert war, oder in serumfreiem Medium (X-Vivo 15; Bio Whittaker, Inc.) gezüchtet. Die zellfreien Überstände wurden nach 24 Std. geerntet, und die PGE2-Konzentration wurde mittels ELISA (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) bestimmt.
Sonstige.
• Wenn keine Angabe erfolgt, werden dem Fachmann bekannte Standardverfahren eingesetzt.
Beispiel 1
• Zyklisches AMP verhindert vollständig die durch den T-Zellrezeptor/CD3-Komplex (TCR/CD3) induzierte T-Zellproliferation sowie die frühe Tyrosinphosphorylierung nach Besetzung des Antigenrezeptors (1, 2). Wir haben zuvor gezeigt, daß eine Aktivierung von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKA) Typ I notwendig und ausreichend ist, um die hemmende Wirkung von cAMP auf die T-Zellsignalgebung zu vermitteln, und daß sich PKA Typ I bei Aktivierung und Capping von T-Zellen auf den Antigenrezeptor verteilt und die gleiche Lokalisierung zeigt wie dieser (2, 3). Dadurch wird PKA Typ I zu einem akuten negativen Modulator der Antigenreaktionen und der klonalen Vermehrung von T-Zellen. T-Zell-Dysfunktion ist ein frühes Ereignis im Verlauf einer HIV-Infektion und ein Hauptfaktor bei der Entwicklung einer schweren Immunschwäche. Der molekulare Mechanismus, durch den HIV die T- Zellfunktion stört, ist jedoch noch nicht aufgeklärt. Zwei neuere Veröffentlichungen liefern Hinweise, daß von HIV stammende Peptide die cAMP-Spiegel in vitro erhöhen können (4, 5). Zudem erhöhte eine cAMP-Behandlung die Aktivität der Reversen Transkriptase von HIV 5- bis 10fach in einer kultivierten T-Zellinie (6). Zusammen kann dies als circulus vitiosus in der HIV-infizierten T-Zelle wirken. Es wurde bisher jedoch noch keine Verbindung zwischen dem cAMP- Signalweg und der HIV-induzierten T-Zell-Dysfunktion festgestellt. Aus diesem Grund untersuchten wir die mögliche Rolle einer cAMP-vermittelten Hemmung der T-Zell- Immunfunktion in gereinigten T-Zellen aus HIV-infizierten Patienten vor und während einer hochwirksamen antiretroviralen Therapie. Wir zeigen, das eine erhöhte Aktivierung von PKA Typ I die T-Zellproliferation in Zellen von HIV-infizierten Personen unabhängig von der andauernden anti-retroviralen Therapie signifikant hemmt und daß diese Wirkung durch einen spezifischen Antagonisten von PKA Typ I aufgehoben werden kann.
Ergebnisse Erhöhte cAMP-Spiegel in T-Zellen von HIV-infizierten Personen
• In negativ selektierten, hochgereinigten T-Zellen aus neun aufeinanderfolgenden HIV-infizierten Patienten (unabhängig vom klinischen Status) waren die endogenen cAMP-Spiegel verglichen mit den Spiegeln in cm+-T-Zellen, die gleichzeitig von 10 HIV-seronegativen Spendern isoliert wurden, signifikant erhöht (1238 gegenüber 688 fmol, 106 Zellen, p < 0,05, siehe Fig. 1A). Zudem wurden die Wirkung eines cAMP- Agonisten auf die TCR/CD3-induzierte Proliferation in 18 einzelnen HIV-infizierten Patienten, die keine starke antiretrovirale Therapie mit HIV-Proteaseinhibitor erhielten, und 8 seronegativen Kontrollen untersucht (Tabellen 1 und 2a). Die Patienten wurden gemäß (7) in zwei Gruppen eingeteilt: eine Gruppe mit asymptomatischer HIV-Infektion und die andere mit symptomatischer HIV-Infektion (AIDS und non- AIDS) (Tabelle 1). T-Zellen aus HIV-infizierten Patienten zeigten einen hochsignifikanten Anstieg in der Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung der Zellproliferation durch exogen zugegebenes 8-CPT-cAMP (Fig. 1B und Tabellen 1 und 2a, p < 0,001, n = 18). Wurden die maximalen Proliferationsraten der T-Zellen von HIV-infizierten Patienten und seronegativen T-Zellen auf 100% normalisiert (Fig. 1B und nicht gezeigte Daten), war zudem ersichtlich, daß zusätzlich zu einer deutlichen Linksverschiebung der cAMP-Hemmkurve die Steigungen der Kurven signifikant verschieden waren (Hill- Koeffizienten von 1,19 (1,13 - 1,40) für T-Zellen von HIVseropositiven Personen gegenüber 1,59 (1,40 - 1,81) für normale T-Zellen, Tabelle 1, p < 0,01, n = 18). Die erhöhte Empfindlichkeit gegenüber einer Hemmung durch das cAMP- Analogon legt einen Beitrag des erhöhten endogenen cAMP an der Vorbereitung der cAMP-Bindungsstelle B von PKA Typ I mit einer anschließenden höheren Affinität der A-Stelle für das exogen zugegeben cAMP-Analogon nahe. Die Verschiebung der Kurvensteigung von einer kooperativen Bindungssituation an einer Zwei-Liganden-Stelle zu einer anscheinend nicht kooperativen Hemmkurve durch 8-CPT-cAMP zeigt zudem, daß die B-Stelle durch endogenes cAMP besetzt ist.
Unveränderte Spiegel von PKA Typ I in CD3+-T-Zellen von HIV-infizierten Patienten
• Als nächstes untersuchten wir die Spiegel von PKA Untereinheiten bei HIV-infizierten Patienten im Vergleich zu normalen Blutspendern. Fig. 2A zeigt die mRNA-Spiegel von PKA- Untereinheiten in von 3 Blutspendern extrahierter Gesamt- RNA (Spur 1) und in aus CD3+-Zellen von 10 Patienten mit symptomatischer HIV-Infektion extrahierter Gesamt-RNA. Es wurden keine Veränderungen in den mRNA-Spiegeln für RI&alpha; und Cfl bei HIV-infizierten Patienten im Vergleich zu normalen Blutspendern festgestellt. Während in der mRNA für RII&alpha; bei Patienten mit symptomatischer HIV-Infektion ein leichter Anstieg (20%) festgestellt wurde, wurde im C&alpha;-mRNA-Spiegel eine 20%ige Abnahme festgestellt. Immunblot-Analysen (Fig. 2B) zeigten zudem, daß die Spiegel an RI&alpha;-Protein (oberes Bild) bei asymptomatischen Patienten (Spuren 3 und 4) sowie bei symptomatischen Patienten (Spuren 5, 6 und 7) verglichen mit 2 normalen Blutspendern (Spuren 1 und 2) unverändert waren. Die Proteinspiegel für RII&alpha; (mittleres Bild), die mittels densitometrischer Untersuchung bestimmt wurden, zeigten sehr kleine Veränderungen (15%ige Abnahme) bei Patienten mit symptomatischer HIV-Infektion verglichen mit normalen Kontrollen. Die Spiegel der C-Untereinheit waren dem Nachweis mit einem Antikörper zufolge, der sowohl mit C&alpha; als auch mit Cß reagiert, unverändert (unteres Bild). Somit erschienen bei HIV-infizierten Patienten die Spiegel an PKA I, die aus RI&alpha; und C&alpha; oder Cß besteht, unverändert, und im Spiegel von PKA II (die aus RII&alpha; und C besteht) wurden nur sehr kleine Veränderungen beobachtet.
Ein Antagonist von PKA Typ I verbessert die T-Zellproliferation von T-Zellen aus HIV-infizierten Patienten
• Zur weiteren Untersuchung der Spezifität der Hemmung der TCR/CD3-induzierten T-Zellproliferation verwendeten wir ein schwefelsubstituiertes cAMP-Analogon (Rp-8-Br-cAMPS), das als vollständiger Antagonist von PKA Typ I wirkt (8). Fig. 3A zeigt, daß in T-Zellen von normalen Blutspendern die TCR/CD3-stimulierte Proliferation durch einen cAMP- Agonisten (Sp-8-Br-cAMPS) gehemmt wurde. Diese Wirkung wurde durch steigende Konzentrationen des komplementären Antagonisten (Rp-8-Br-cAMPS) fast vollständig aufgehoben. Der Antagonist allein veränderte jedoch nicht die Proliferation normaler T-Zellen (Fig. 3B). Wurde dagegen die TCR/CD3- induzierte Proliferation von T-Zellen von einem HIV- infizierten Patienten untersucht, beobachteten wir, daß die Verwendung des Antagonisten (Rp-8-Br-cAMPS) nicht nur die Wirkung des komplementären Agonisten vollständig aufhob, sondern zudem die Proliferation über die Spiegel in unbehandelten Zellen hinaus erhöhte (Fig. 3C). Wurde die Wirkung des cAMP-Antagonisten allein in T-Zellen von HIV- infizierten Patienten untersucht, beobachteten wir einen konzentrationsabhängigen Anstieg der TCR/CD3-induzierten Proliferation, der bei höheren Konzentrationen mehr als 2fach war (Fig. 3D). Der Grad des Proliferationsanstiegs nach Behandlung mit einem cAMP-Antagonisten war umgekehrt proportional zum Spiegel der TCR/CD3-induzierten Proliferation in Abwesenheit des Antagonisten (p < 0,001, R = 0,78, n = 18, Tabelle 1), d. h. T-Zellen, die schwach auf die TCR/CD3-Stimulation reagierten, hatten den größten Nutzen von der Behandlung mit dem cAMP-Antagonisten. Die stimulatorische Wirkung des cAMP-Antagonisten war auch bei den höchsten verwendeten Konzentrationen noch nicht gesättigt (Fig. 3D; ähnliche Daten (nicht gezeigt) wurden für alle Patienten aus Tabelle 2 erhalten). Dies zeigt, daß die Löslichkeit der Verbindung, ihre Affinität oder Verfügbarkeit für die Zellen ein limitierender Faktor für die beobachtete Wirkung sein kann. Somit kann ein stärker permeabler und wirksamerer Antagonist von PKA Typ I, wenn er verfügbar ist, die TCR/CD3-induzierte Proliferation von T-Zellen von HIV-infizierten Patienten weiter verbessern.
Patienten unter hochwirksamer anti-retroviraler Therapie weisen eine bleibende T-Zell-Dysfunktion auf, die durch einen Antagonisten von PKA Typ I verbessert werden kann
• Kürzlich wurde entdeckt, daß HIV-Proteaseinhibitoren das Voranschreiten einer HIV-1-Erkrankung verlangsamen und die Spiegel an HIV-RNA im Plasma stark verringern (9, 10). Aus diesem Grund untersuchten wir als nächstes die T- Zellproliferation, die cAMP-Empfindlichkeit und die Wirkung eines cAMP-Antagonisten auf T-Zellen von 9 symptomatischen HIV-infizierten Patienten, die eine starke anti-retrovirale Therapie mit dem HIV-Proteaseinhibitor Indinavir in Kombination mit Nukleosidanaloga erhielten. Die TCR/CD3- induzierte Proliferationsreaktion war verglichen mit unbehandelten Patienten mit symptomatischer HIV-Infektion, die keinen Proteaseinhibitor erhielten, erhöht (p < 0,05; Tabelle 1, unterer Teil und Tabelle 2b). Die Immunantwort von T-Zellen aus behandelten Patienten jedoch war verglichen mit normalen Kontrollen immer noch signifikant verringert (p < 0,001), was zeigt, daß die HIV-spezifische T-Zell- Dysfunktion trotz einer wirksamen anti-retroviralen Behandlung bestehen bleibt. Zudem war verglichen mit normalen Kontrollen die Empfindlichkeit gegenüber einer Hemmung durch cAMP immer noch signifikant erhöht (p < 0,01), und eine Inkubation von T-Zellen von Patienten unter hochwirksamer anti-retroviraler Therapie mit einem cAMP- Antagonisten verbesserte die TCR/CD3-induzierte T- Zellproliferation verglichen mit derjenigen der T-Zellen von normalen Personen signifikant (p < 0,05). Außerdem zeigten Einzelpatientendaten aus dieser Gruppe eine Heterogenität unter den Patienten, die eine starke antiretrovirale Therapie erhielten (Tabelle 2b). Die T- Zellproliferation von 6 der 9 Patienten profitierte von Rp- 8-Br-cAMPS in dosisabhängiger Weise (1,5- bis 2,8facher Anstieg der Immunantwort), wohingegen T-Zellen von 3 Patienten mit einer subnormalen Proliferationsreaktion nicht auf den cAMP-Antagonisten reagierten (Proliferation 0,98- bis 1,11fach verglichen mit der in unbehandelten Zellen). Dies spiegelt sich in der umgekehrten Proportionalität zwischen dem Spiegel der TCR/CD3-induzierten Proliferation in Abwesenheit des Antagonisten und der Wirkung der Behandlung mit dem cAMP-Antagonisten wider (p < 0,01, R = 0,81, n = 9); d. h. nur T-Zellen aus Patienten mit bleibender T-Zell- Dysfunktion profitierten von der Behandlung mit dem cAMP- Antagonisten. Eine Nachsorge bei 4 der 18 unbehandelten Patienten, die in den Tabellen 1 und 2a untersucht worden sind, nach Beginn eine hochwirksamen anti-retroviralen Therapie, zeigte eine erhöhte Proliferationsreaktion der T- Zellen nach Einsetzen der Behandlung (vergleiche Tabellen 2a und 2b). Die T-Zellen aus 2 der Patienten zeigten jedoch weiterhin eine stark unterdrückte Immunantwort (mit a und b markiert), und die T-Zellproliferation bei diesen Patienten profitierte immer noch erheblich von der Inkubation mit dem cAMP-Antagonisten. Die Zellen der beiden anderen Patienten (mit c und d markiert) erreichten subnormale Spiegel der T- Zellproliferation nach Einsetzen der starken antiretroviralen Therapie und profitierten nicht weiter von der Inkubation mit Rp-8-Br-cAMPS. TABELLE 1: Zusammengefaßte Daten für normale Kontrollen nach (7) in Gruppen mit asymptomatischer und symptomatischer HIV-Infektion eingeteilte Patienten und symptomatische Patienten unter hochwirksamer anti-retroviraler Therapie.
• Die Daten sind als Mittelwerte ausgedrückt, der 25-75%-Bereich steht in Klammern. *IC&sub5;&sub0; ist die Konzentration des cAMP-Analogs, die nötig ist, um eine halbmaximale Hemmung der CD3-indizierten T-Zellproliferation zu erzielen. Bereich der CD4-Lymphozytenzahl bei 21 Blutspnden n.d.: nicht durchgeführt. Die anti-CD3-indizierte T-Zellproliferation. Hemmung der Proliferation mit 8-CPT-cAMP (IC&sub5;&sub0; und Hill-Koeffizient) und der Anstieg der Proliferation nach Behandlung mit Rp-8-Br-cAMPS bei normalen vs. HIV-infizierten CD3-T-Zellen wurde mittels Mann-Withney-U-Test bestimmt. Signifikanz steht für p< 0.005, steht für p< 0.01 und steht für p< 0.001. Dreifachkombinationstherapie bezeichnet Patienten mit einer HIV-Infektion, die eine hochwirksame anti-retrovirale Therapie mit einer Kombination aus HIV-Proteaseinhibitor (Indinavir) und den Nukleosidanaloga Zidovudin und Lamivudin erhalten. TABELLE 2a: Einzelpatientendaten
• * Die Patienten wurden anhand einer &alpha;CD3-induzierten Proliferationsreaktion geordnet. n.d.: nicht durchgeführt. HKlinischer Status: a: asymptomatische HIV-Infektion, s: symptomatische HIV-Infektion (AIDS oder non-AIDS). a,b,c,d bezeichnet einzelne Patienten, die nachträglich während einer hochwirksamen anti-retroviralen Therapie untersucht wurden. TABELLE 2b: Daten von einzelnen Patienten, die eine hochwirksame anti-retrovirale Therapie erhielten
• * Die Patienten wurden anhand einer &alpha;CD3-induzierten Proliferationsreaktion geordnet. Die Behandlung erfolgte mit Indinavir, Lamivudin und Zidovudin a,b,c,d bezeichnet Patienten, für die Daten vor Beginn der hochwirksamen antiretroviralen Therapie verfügbar sind (vergleiche Tabelle 2a).
Beispiel 2
• Die vorliegende Untersuchung zeigt zum ersten Mal erhöhte endogene cAMP-Spiegel in T-Zellen aus CVI-Patienten, und noch wichtiger, daß eine selektive Hemmung von PKAI die anti-CD3-induzierte T-Zellproliferation in CVI-Patienten mit gestörter T-Zellfunktion deutlich verbessern oder in einigen Fällen sogar vollständig wiederherstellen konnte. Diese Befunde deuten auf einen möglichen intrazellulären Mechanismus für den T-Zelldefekt bei CVI und legen nahe, daß das cAMP/PKAI-System ein potentielles Ziel für eine immunmodulatorische Therapie bei diesen Patienten sein kann.
Wirkung eines cAMP-Antagonisten auf die PBMC-Proliferation
• Zur Untersuchung der möglichen Rolle des cAMP/PKAI-Systems bei der gestörten T-Zellfunktion bei CVI untersuchten wir zuerst, ob ein schwefelsubstituiertes cAMP-Analogon (Rp-8- Br-cAMPS), das als vollständiger Antagonist von PKAI wirkt (8), eine anti-CD3-stimulierte Proliferation von PBMC bei 20 CVI-Patienten und 15 gesunden Kontrollen verbessern konnte. Unter Bestätigung vorheriger Ergebnisse (12, 11) war die stimulierte Lymphozytenproliferation bei dieser CVI-Gruppe verglichen mit Kontrollpersonen signifikant gestört (Daten nicht gezeigt). Zudem veränderte zwar der Antagonist die Proliferation von Lymphozyten aus normalen Blutspendern nicht signifikant (Bild A), aber Rp-8-Br-cAMPS induzierte eine signifikante und konzentrationsabhängige Verbesserung der anti-CD3-stimulierten Proliferation bei der CVI-Gruppe (Daten nicht gezeigt). Die Einzelpatientendaten aus der CVI-Gruppe wiesen jedoch eine Heterogenität auf. Während ein mehr als 100%iger Anstieg der anti-CD3- induzierten Lymphozytenproliferation bei 7 der CVT- Patienten gefunden wurde, wiesen 5 der Patienten einen weniger als 40%igen Anstieg der Proliferation auf, wenn der cAMP-Antagonist in vitro den Zellen hinzugefügt wurde. Es ist zu beachten, daß die Patienten mit dem deutlichsten Anstieg der Lymphozytenproliferation aufgrund des cAMP- Antagonisten diejenigen mit der am stärksten unterdrückten Proliferationsreaktion nach anti-CD3-Stimulation waren (r = -0,85; p < 0, 001).
Wirkung des cAMP-Agonisten und -Antagonisten in gereinigten T-Lymphozyten
• Zur besseren Untersuchung der Rolle des cAMP-PKAI-Systems bei der Induktion der T-Zell-Dysfunktion bei CVI analysierten wir die endogenen cAMP-Spiegel und die Wirkungen des cAMP-Agonisten und -Antagonisten auf die Proliferation von negativ selektierten gereinigten T-Lymphozyten. Wir maßen zuerst die cAMP-Spiegel in T-Lymphozyten von 13 der CVI- Patienten und 10 gesunden Kontrollen und fanden signifikant höhere cAMP-Spiegel in der CVI-Gruppe (Fig. 4A). Die Empfindlichkeit gegenüber der cAMP-abhängigen Hemmung der T- Zellproliferation war ebenfalls erhöht, was die positiv kooperative Wirkung der endogenen cAMP-Spiegel zeigt (Fig. 4B). Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen diese Wirkung von 8-CPT/cAMP auf die Zellproliferation bei 7 getrennten CVI-Patienten mit deutlich gestörter anti-CD3- stimulierter T-Zellproliferation verglichen mit der Wirkung bei 8 Kontrollpersonen. Dieser signifikante Anstieg der Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung der Zellproliferation durch exogen zugegebenes 8-CTP-cAMP bei der CVI-Gruppe spiegelte sich in einer deutlichen Abnahme der IC&sub5;&sub0;-Werte bei diesen Patienten wider, die hauptsächlich auf eine Änderung in der Steigung der Hemmkurve (Hill-Koeffizient; Tabelle 3 und Fig. 4B) zurückzuführen war.
• Zur weiteren Untersuchung der Spezifität der Hemmung der anti-CD3-stimulierten T-Zellproliferation verwendeten wir einen cAMP-Agonisten (Sp-8-Br-cAMPS) und dessen komplementären PKAT-selektiven Antagonisten (Rp-8-Br-cAMPS). Bei gesunden Kontrollen wurde die Hemmwirkung des cAMP-Agonisten durch dessen komplementären Antagonisten vollständig aufgehoben (Fig. 5A), aber der Antagonist allein verstärkte die T-zellproliferation nicht weiter (Fig. 5B und Tabelle 3). Dagegen fanden wird einen konzentrationsabhängigen Anstieg der anti-CD3-stimulierten Proliferation bei CVI-Patienten (> 100%iger Anstieg bei 3 Patienten und Erreichen eines Spiegels im normalen Bereich bei 2 Patienten), wenn Rp-8- Br-cAMPS zu Zellkulturen hinzugefügt wurde (Fig. 5C und D und Tabelle 3). Somit scheinen bei CVI-Patienten die T- Lymphozyten mit gestörter anti-CD3-stimulierter Proliferation durch chronisch erhöhte endogene cAMP-Spiegel gekennzeichnet zu sein, und eine Behandlung mit einem selektiven PKAI-Antagonisten verbessert die anti-CD3-stimulierte Proliferation in diesen Zellen deutlich, wobei Proliferationswerte erreicht werden, die mit gesunden Kontrollen vergleichbar sind (.- 25% und 75% der Spiegel bei gesunden Kontrollen mit bzw. ohne Rp-8-Br-cAMPS).
Wirkung eines cAMP-Antagonisten auf die Proliferation von CD4+- und CD8+-Lymphozyten
• Als nächstes untersuchten wir mittels Durchflußzytometrieanalyse des BrdU-Einbaus die DNA-Synthese in anti-CD3- stimulierten T-Lymphozyten in Anwesenheit und Abwesenheit von Rp-8-Br-cAMPS in Untergruppen der CD4&spplus;- und CD8&spplus;-T- Lymphozyten bei 8 CVI-Patienten mit gestörter Lymphozytenfunktion und 7 Kontrollen. Bei CVI-Patienten gab es einen signifikanten Anstieg im Prozentsatz der BrdU&spplus;-CD4&spplus;-T- Lymphozyten, wenn der cAMP-Antagonist zur Zellkultur hinzugefügt wurde [55,8 (40,7-77,0)] % gegenüber 69,6 (50,5 - 90, 0) % ohne bzw. mit Antagonist, p < 0, 03]. Bei den meisten Patienten wurde der maximale Anstieg bei der höchsten Rp-8-Br-cAMPS-Konzentration (1000 uM) gefunden. Es wurde keine Wirkung von Rp-8-Br-cAMPS auf die DNA-Synthese bei CD4&spplus;-Lymphozyten von gesunden Kontrollen beobachtet (Daten nicht gezeigt). Bei den CD8&spplus;-Lymphozyten gab es nach Zugabe des cAMP-Antagonisten weder bei CVI-Patienten, noch bei den Kontrollen einen signifikanten Anstieg im Prozentsatz der BrdU&spplus;-Zellen, obgleich ein leichter Anstieg bei drei CVI- Patienten beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt).
Wirkung des cAMP-Antagonisten auf die IL-2-Spiegel und die IL-2-Rezeptorbindung in T-Lymphozyten
• IL-2 spielt eine Schlüsselrolle bei Wachstum und bei der Funktion von T-Lymphozyten (13), und eine verringerte IL-2- Produktion dieser Zellen kann eine wichtige Rolle bei der Immunpathogenese von CVI spielen (14, 15). Zyklisches AMP senkt die IL-2-Produktion und die IL-2-Rezeptorexpression in T-Lymphozyten (16, 17). Zur weiteren Aufklärung des Mechanismus (der Mechanismen) der cAMP-induzierten Hemmung der T-Lymphozytenproliferation bei CVI untersuchten wird daher die Wirkung von Rp-8-Br-cAMPS auf die IL-2-Spiegel in Überständen von anti-CD3-stimulierten T-Lymphozyten bei 7 CVI-Patienten mit gestörter Lymphozytenfunktion und 8 Kontrollen. Verglichen mit den Kontrollpersonen setzen die T- Lymphozyten von CVI-Patienten signifikant kleinere Mengen IL-2 in die Überstände frei (Tabelle 4), und wir fanden einen deutlichen und konzentrationsabhängigen Anstieg der IL- 2-Spiegel in Anwesenheit des cAMP-Antagonisten (Tabelle 4 und Fig. 6B). Die Wirkung von Rp-8-Br-cAMPS auf die IL-2- Spiegel von CVI-T-Zellen war größtenteils ähnlich wie auf die Proliferation. Trotz der dramatischen Zunahme der IL-2- Spiegel nach Zugabe von Rp-8-Br-cAMPS zu Zellkulturen von CVI-Patienten waren jedoch die IL-2-Spiegel immer noch deutlich niedriger als die in Kontrollpersonen gefundenen (Tabelle 4). Somit wird bei CVI-Patienten durch Zugabe eines cAMP-Antagonisten zu Zellen in vitro die T- Lymphozytenproliferation in einem höheren Ausmaß normalisiert als die IL-2-Sekretion.
• Als nächstes untersuchten wir mittels Durchflußzytometrie, ob die Zugabe von Rp-8-Br-cAMPS zu Zellkulturen auch die IL-2-Rezeptorbindung in anti-CD3-stimulierten T-Zellen von 8 CVI-Patienten mit gestörter Lymphozytenfunktion und in 6 Kontrollen beeinflussen konnte. Bei anti-CD3-stimulierten Zellen gab es weder in CD4&spplus;-, noch in CD8&spplus;-Lymphozyten einen signifikanten Unterschied bei der IL-2-Rezeptorbindung zwischen CVI-Patienten und Kontrollen. Bei CD4&spplus;-Lymphozyten aus CVI-Patienten, aber nicht bei CD8+-Lymphozyten gab es jedoch einen mäßigen, aber signifikanten Anstieg der IL-2- Rezeptorbindung nach Zugabe von Rp-8-Br-cAMPS zur Zellkultur. Kein derartiger Anstieg wurde in Zellen von gesunden Kontrollen gefunden.
Wirkung von exogen zugegebenem IL-2 in Kombination mit dem cAMP-Antagonisten auf die anti-CD3-induzierte T- Lymphozytenproliferation.
• Zur weiteren Untersuchung der Rolle von IL-2 bei der Verstärkung der T-Zellproliferation durch Zugabe des cAMP- Antagonisten untersuchten wir die Wirkung von IL-2, das exogen entweder allein oder in Kombination mit Rp-8-BrcAMPS zugegeben wurde, auf die anti-CD3-stimulierte T- Zellproliferation bei 4 CVI-Patienten mit gestörter Lymphozytenproliferation und bei 4 Kontrollen. Nach Zugabe von IL-2 zur Zellkultur gab es einen deutlichen Anstieg der Proliferation sowohl bei CVI-Patienten als auch bei den Kontrollen (Fig. 7). Bei IL-2-Konzentrationen, die vergleichbar mit dem nach Zugabe des cAMP-Antagonistes ereichten Anstiegs der LL-2-Spiegel waren (- 0,15 ng/ml, Fig. 6B), wurde jedoch weder bei CVI-Patienten, noch bei den Kontrollen eine signifikante Wirkung auf die Proliferation beobachtet (Fig. 7). Tatsächlich war die verstärkende Wirkung des cAMP-Antagonisten bei CVI-Patienten vergleichbar mit der Wirkung von 15 ng/ml IL-2 (Fig. 7). Bei CVI- Patienten waren die verstärkenden Wirkungen von Rp-8-BrcAMPS und IL-2 auf die T-Lymphozytenproliferation additiv (Fig. 7). TABELLE 3: Wirkung des cAMP-Antagonisten und -Agonisten auf die anti-CD3-stimulierte T-Zellproliferation bei 7 CVI-Patienten und 8 gesunden Kontrollen.
• Die Einzelwerte für die tatsächlichen Variablen sind für 7 CVI-Patienten angegeben, die anhand der anti-CD3-stimulierten Proliferationsantwort geordnet wurden. Die Gruppenwerte für die tatsächlichen Variablen sind für die CVI- und Kontrollgruppe als Mittelwerte und 25.-75. Percentile angegeben. *IC&sub5;&sub0; steht für die Konzentration des cAMP-Analogon, die zur Erzielung einer halbmaxi­malen Hemmung der anti-CD3-stimulierten T-Zellproliferation nötig ist.P < 0.005, P < 0.02, jeweils gegenüber den Kontrollen a,b,c,d steht für einzelne Patienten; bei denen zudem die IL-2-Freisetzung untersucht wurde (siehe Tabelle 4). TABELLE 4: Wirkung des cAMP-Antagonisten (F.p-8-Br-cAMPS) auf die IL-2-Spiegel in Überständen von anti-CD3- stimulierten T-Lymphozyten bei 7 CVI-Patienten und 8 gesunden Kontrollen
• Die einzelnen Werte für die tatsächlichen Variablen sind für 7 CVI-Patienten angegeben, die anhand der anti-CD3- stimulierten IL-2-Spiegel im T-Zellüberstand geordnet wurden. Die Gruppenwerte für die tatsächlichen Variablen sind für die CVI- und die Kontrollgruppe als Mittelwerte und 25.-75. Percentile angegeben. *Alle CVI-Patienten hatten zwar die höchsten IL-2-Spiegel, wenn 1000 uM Rp-8-Br-cAMPS zu den Zellkulturen gegeben wurden, aber die ausgeprägtesten Wirkungen bei den Kontrollen wurden bei niedrigeren Antagonistenkonzentrationen (100 uM) beobachtet. +p < 0, 005, §p < 0,02 gegenüber den Kontrollen; a,b,c,d,e bezeichnet einzelne Patienten, die auch bezüglich der T- Zellproliferation untersucht wurden (siehe Tabelle 3).
Beispiel 3
• Ein gegen die RI&alpha;-Untereinheit der Proteinkinase A gerichtetes Ribozym wurde entwickelt, und es wurde gezeigt, daß es RI&alpha;-mRNA in vitro vollständig spaltet. Bei der Transfektion als synthetisches RNA-Ribozym oder synthetisches RNA- Ribozym, das durch Einbau von 2-Desoxycytcsin- und 2- Desoxyuracil-Analoga stabilisiert worden war, in CD3+-T- Zellen aus peripherem Blut verringerte das Ribozym die Spiegel an RI&alpha;-Protein auf etwa 20% der Kontrollspiegel, indem es die RI&alpha;-mRNA beseitigte. Durch diese Strategie wurde der Hauptteil der Proteinkinase A Typ I aus den T- Zellen entfernt. Wir untersuchten dann die Immunreaktionsfähigkeit von CD3-T-Zellen, die mit dem Ribozym transfiziert worden waren, verglichen mit kontrolltransfizierten T-Zellen (mock), die als T-Zellproliferation nach Aktivierung der T-Zellen durch Stimulation des T-Zellrezeptor/CD3- Komplexes (TCR/CD3) gemessen wurde. Zur Simulierung einer T-Zell-Dysfunktion wie bei einer HIV-Infektion mit erhöhten cAMP-Spiegeln und erhöhter Aktivierung von Proteinkinase A Typ I behandelten wir normale T-Zellen mit einer niedrigen Dosis (12,5 um IC&sub5;&sub0;) des cAMP-Analogons 8-(4-Chlorphenyl)thio-cAMPS (8-CPT-cAMP). Aus Fig. 8 ist ersichtlich, daß cAMP die T-Zellproliferation bis auf etwa 20% der Kontrolle in scheintransfizierten T-Zellen hemmte. Dagegen wurden mit dem RI&alpha;-Ribozym transfizierte T-Zellen durch cAMP nur bis auf etwa 40% gehemmt, d. h. es erfolgte ein 2facher Anstieg der Immunreaktionsfähigkeit in Anwesenheit des RI&alpha;-Ribozyms. Dies zeigt, daß Ribozyme gegen die RI&alpha;-Untereinheit von Proteinkinase A zur Hemmung der Produktion von Proteinkinase A Typ I (RI&alpha;) eine geeignete Therapie zur Aufhebung der T-Zell-Dysfunktion sein können, die durch eine Aktivierung der Proteinkinase A Typ I bei Tmmunschwächen hervorgerufen wird. Für die Verwendung in vivo ist eine Vorbehandlung der Ribozyme notwendig, so daß die Aufnahme in die Zellen oder die Einbringung in die Zellen als Minigene möglich ist.
Beispiel 4
• Zur Beseitigung der erhöhten Signalgebung durch Proteinkinase A Typ I bei der T-Zell-Dysfunktion versuchten wir, mit der Lokalisierung von Proteinkinase A Typ I mit dem TCR/CD3 zu konkurrieren und sie dadurch vom Substrat zu verdrängen.
• Es wurde gezeigt, daß ein Peptid, das die Aminosäuren 493- 515 des A-Kinase-Verankerungsproteins (AKAP) abdeckt, Ht31 (SEQ.ID. Nr 2), eine amphipatische &alpha;-Helix enthält, die eine hydrophobe Oberfläche bildet, welche die Verankerungsdomäne sowohl der RII- als auch der RI-Verankerungs-AKAPs bildet und mit der Bindungsdomäne der R-Untereinheit in Wechselwirkung tritt. Neuere Daten zeigen inzwischen, daß die Bindung von R. Icc an AKAPs mit zweifacher Spezifität (D-AKAPI und DAKAP2) erfolgt und daß das Ht31-Kompetitorpeptid in vitro sowohl um die Bindung von RI als auch von RII an AKAPs konkurrieren kann. RI bindet jedoch mit viel geringerer Affinität an AKAPs als RII. Folglich wird erwartet, daß in Zellkulturen niedrigere Konzentrationen mit den RI-vermittelten Wirkungen konkurrieren als mit den RII-vermittelten Wirkungen.
• Wir inkubierten Blut-CD3+-T-Zellen mit steigenden Konzentrationen an HT31-Peptid (SEQ.ID. Nr 2). Zur Erleichterung der Aufnahme wurden die Zellen mit Liposomen in der Anwesenheit oder Abwesenheit des Peptids behandelt. Die optimalen Konzentrationen von DOTAP-Liposomen und anti-CD3- Antikörper wurden sorgfältig titriert, um die Membranstabilität und die normale TCR/CD3-abhängige Aktivierung von T- Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden 20 Stunden mit DOTAP/Peptid inkubiert, und die Inkubationen wurden in Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit von 8-CPTcAMP (6,25 uM, schraffierte Balken) fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Stimulation von TCR/CD3 zur Proliferation angeregt. Die T-Zell-Immunreaktionsfähigkeit wurde als [³H]- Thymidin-Einbau gemessen. Die Ergebnisse (Fig. 9) zeigen, daß in T-Zellen, die mit cAMP behandelt worden waren, um die Situation einer erhöhten Aktivierung von Proteinkinase A Typ I bei einer Immunschwäche zu simulieren, steigende Konzentrationen an Ht-31-Peptid die cAMP-abhängige Hemmung der T-Zellproliferation aufhoben (3fach erhöhte Proliferation mit cAMP in Anwesenheit von 50 uM Ht-31 verglichen mit Scheintransfektion). Dies zeigt, daß das Kompetitorpeptid die Immunantworten funktionell gestörter T-Zellen mit erhöhten cAMP-Spiegeln normalisieren konnte.
• Ein Peptid (Ht-31P), bei dem die amphipatische Helix durch Ersetzen der beiden Valinreste durch Prolin zerstört worden war, diente als Kontrolle, rechtes Bild. In diesem Fall erhöhte eine Behandlung mit steigenden Konzentrationen an Peptid die Proliferation in der Anwesenheit von CAMP nicht.
• Als nächstes wurde die Wirkung des Kompetitorpeptids (Ht- 31, 35 uM) auf die T-Zellproliferation in der Anwesenheit steigender 8-CPT-cAMP-Konzentrationen untersucht und mit scheintransfizierten Zellen verglichen, die mit den gleichen 8-CPT-cAMP-Konzentrationen behandelt worden waren ( Fig. 10). Wie zuvor für normale T-Zellen aus peripherem Blut gezeigt (Beispiele 1 und 2, Fig. 1 und 4B), hemmt 8-CPTcAMP auch scheintransfizierte Zellen auf positiv kooperative Weise mit einem IC&sub5;&sub0; von etwa 1,8 uM (der niedrigere IC&sub5;&sub0; verglichen mit untransfizierten Zellen wird wahrscheinlich durch eine erhöhte Permeabilität zusammen mit Liposomen hervorgerufen). In Anwesenheit des Ht-31-Kompetitorpeptids wurde eine durch cAMP rechtsverschobene Hemmkurve mit einem apparenten IC&sub5;&sub0; von 4,8 uM beobachtet. Verglichen mit den linksverschobenen Kurven, die bei T-Zellen von HIVinfizierten Patienten oder Patienten mit CVI aufgrund erhöhter Spiegel an endogenem cAMP, das PKA Typ I aktiviert, beobachtet wurden, wird erwartet, daß die hier beobachtete Rechtsverschiebung die Situation in den Patienten normalisiert.
• Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse, daß eine Konkurrenz der Lokalisierung von Proteinkinase A Typ I mit TCR/CD3, so daß sie vom Substrat entfernt wird, eine geeignete Therapie zur Aufhebung der T-Zell-Dysfunktion bei Immunschwächen sein kann, die durch die Aktivierung von Proteinkinase A Typ I verursacht wird.
Literatur:
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• 13. Waldmann, T. A., J. Biol. Chem. 266 : 2681-2684 (1991).

Claims (25)

1. Verwendung von Hemmstoffen, die aus der aus cAMP- Antagonisten, Hammerkopf-Ribozymen, sequenzspezifischen Antisense-Oligonukleotiden und eine Verankerung zerstörenden Peptiden bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei die Hemmstoffe die Funktion von cAMP-abhängiger Proteinkinase (PKA) Typ I&alpha; (RI&alpha;&sub2;C&sub2;) aufheben, um eine pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung von immunsupressiven Erkrankungen herzustellen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der cAMP-Antagonist ein Thio-substituiertes cAMP-Analogon (Derivat von zyklischem Adenosin-3',5'-monophosophorthioat, Rp-Isomer) ist, dadurch gekennzeichnet, daß es an die RI&alpha;-Untereinheit bindet und als Antagonist von PKA Typ I&alpha; wirkt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei cer Hemmstoff oder Antagonist selektiv oder spezifisch für PKA Typ I&alpha; ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der cAMP-Antagonist Rp-8-Br-cAMPS oder Rp-8-C&sub1;-cAMPS ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Hammerkopf-Ribozym die folgende Basensequenz aufweist:

GUACUGCCACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUCCAUG (SEQ. ID. Nr. 5).

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Hammerkopf-Ribozym die Basensequenz GGCGGUACUGCCACUGAUGAGU- CCGUGAGGACGAAACUCCAUGGA (SEQ. ID. Nr. 6) aufweist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 oder 6, wobei ein Cytosin- oder ein Uracilrest in dem Hammerkopf- Ribozym durch einen 2-Desoxycytosin- bzw. einen 2- Desoxyuracilrest substituiert ist.

8. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, wobei das sequenzspezifische Antisense-Oligonukleotid die Basensequenz GTACTGCCAGACTCCATG aufweist (SEQ. ID. Nr. 7).

9. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, wobei das sequenzspezifische Antisense-Nukleotid die Basensequenz GGCGGTACTGCCAGACTCCATGGT (SEQ. ID. Nr. 8) aufweist.

10. Verfahren zur Hemmung der durch PKA Typ Io. vermittelten Wirkungen durch Zerstören der Verankerung von PKA Typ I&alpha;, das das Konkurrieren der Lokalisierung bzw. Anordnung von PKA Typ I&alpha; mit dem T-Zellenrezeptor/CD3-Komplex umfaßt.

11. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, wobei das eine Verankerung unterbrechende kompetitive Peptid mindestens 22 Aminosäuren enthält.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Aminosäuren H&sub2;N- Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asr-Ala-Val - Ile-Glu-Gln-Val-Lys-A1a-Ala-Tyr-COOH (SEQ. 1D. Nr. 1) sind.

13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Aminosäuren H&sub2;N- Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val- Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gln-Ala-Tyr-COOH (SEQ. 1D. Nr. 2) sind.

14. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Aminosäuren H&sub2;N- Gln-Val-Ile-Ser-Glu-Ala-Thr-Gln-Val-Leu-Ala-Thr-Thr-Val - Gly-Lys-Val-Ala-Gly-Axg-Val-Cys-Gln-Ala-COOH (SEQ. ID. Nr. 3) sind.

15. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren H&sub2; N- Val-Gln-Gly-Asn-Thr-Asp-Glu-Ala-Gln-Glu-Glu-Leu-Ala-Trp- Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Ile-Val-Ser-Asp-Val-Met-Gln-Gln-Ala- His-His-Asp-Gln-Pro-Leu-Glu-Lys-Ser-Thr-Lys-Leu-COOH (SEQ. ID. Nr. 4) sind.

16. Peptid, das eine Sequenz aufweist, wie sie im Anspruch 14 oder 15 beschrieben und definiert ist.

17. Hammerkopf-Ribozyme mit einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 5 bis 7.

18. Antisense-Oligonukleotide mit einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 8 oder 9.

19. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die immunsupressiven Erkrankungen AIDS, HIV-Infektion oder CVI sind.

20. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Hemmstoff, der aus der Gruppe von cAMP-Antagonisten ausgewählt ist, die aus Rp-8-Br-cAMPS, RP-8-Br-Monobutyryl-cAMPS, Rp- Monobutyryl-cAMPS, Rp-8-(4-Chlorphenylthio)- cAMPS, Rp- Piperidino-cAMPS, einem Hammerkopf-Ribozym oder einem die Verankerung zerstörendem Peptid besteht, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 7, 10 bis 17 oder 19 definiert sind, oder ein sequenzspezifisches Antisense-Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 8, 9, 18 oder 19 und einen oder mehrere pharmazeutisch brauchbare bzw. zulässige Hilfsstoffe oder Füllstoffe aufweisen.

21. Hemmstoffe nach Anspruch 20 zur Verwendung als Medikament.

22. Hemmstoffe nach Anspruch 20 zur Verwendung und zur Behandlung von immunsupressiven Erkrankungen.

23. Peptid mit einer Sequenz nach Definition des Anspruchs 14 oder 15, das zur Zerstörung der Verankerung von PKA I&alpha; geeignet ist.

24. Hammerkopf-Ribozyme mit einer Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 5 bis 7, die zur Zerstörung bzw. Unterbrechung der Expression von PKA I&alpha; geeignet sind.

25. Antisense-Oligonukleotide mit einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 8 oder 9, die zur Zerstörung bzw. Unterbrechung der Expression von PKA I&alpha; geeignet sind.