JPH09503291A

JPH09503291A - 特にレセプター結合分析における生物学的相互作用の検出方法

Info

Publication number: JPH09503291A
Application number: JP7506835A
Authority: JP
Inventors: ガーマン，アンドリュー・ジョン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1993-08-18
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 1997-03-31
Also published as: EP0714514B1; GB2281122B; AU7389694A; GB9416583D0; US6054282A; GB2281122A; DE69414122D1; GB9317193D0; WO1995005601A1; EP0714514A1; ATE172541T1; DE69414122T2

Abstract

(57)【要約】生物学的レセプターへのリガンドの結合を調節する化合物の検出方法であって、キャピラリー作用によるその中での流体の移動を可能にするような固相マトリックス上のある位置で、生物学的レセプターへのリガンドの結合と当該固相マトリックス上での未結合リガンドの分離とを可能にするような条件下で、リガンドと生物学的レセプターと試験化合物とを接触させること、並びに、何らかのそのような分離を参照することによって試験化合物による結合の調節を検出すること、を含む上記の方法。

Description

【発明の詳細な説明】特にレセプター結合分析における生物学的相互作用の検出方法本発明は、特にレセプター結合分析における生物学的相互作用を検出するための改良された方法に関する。特には、本発明には、放射分離(radial partition) の使用が含まれる。従来の放射リガンド結合分析が関連しているが、それらは、真空ろ過および他の複雑な操作を使用する。そのような操作は、例えば、Receptor-Ligand Intera ctions，E.D．Hulme(Ed)，1992，IRL Press 中に概要が記載されている。従って、実施するのがより簡単で、かつ、例えば高出量スクリーニングによる新薬誘導の同定のためにより好適なさらに改良された技術に対する要求が存在する。放射分離は１９８２年に初めて記載された（J.L．Giegel et al，Clin．Chem. ，28，1894-1898(1982)）。それ以来、それは免疫診断分野で分析のための基礎として十分に確立するようになった。典型的な方法では、ペーパーフィルター上に固定化された抗体を使用し、分析物および２次抗体結合体を継続的に適用していく。次いで、洗浄液（場合によっては酵素免疫分析のための基質を含む）を適用し、未結合の結合体を中心から放射状に離れるように洗浄し、結合した結合体を中心のドットとして残す。使用したシグナルによる定量から、標準曲線を参照することにより、分析物の濃度が得られる。本発明者は、今回意外なことに、放射分離の原理を、対象となる生物学的レセプターに結合する化合物の同定のための新規な分析においてうまく適用することができることを見い出した。そのような新規な分離分析は、真空ろ過または他の複雑な操作を必要とはしない。これらは、高速かつ高出量スクリーニング操作に容易に適用でき、例えば、医薬および農薬産業における新規な活性化合物の同定のために使用することができる。従って、本発明の第１の側面によれば、本発明者により、生物学的レセプターへのリガンドの結合を調節する化合物の検出方法であって、キャピラリー作用によるその中での流体の移動を可能にするような固相マトリックス上のある位置で、生物学的レセプターへのリガンドの結合と当該固相マトリックス上での未結合リガンドの分離とを可能にするような条件下で、リガンドと生物学的レセプターと試験化合物とを接触させること、並びに、何らかのそのような分離を参照することによって試験化合物による結合の調節を検出すること、を含む上記の方法が提供される。上記分析の成分は任意の順序でマトリックスに加えることができる。上記成分の場合によっては３つ、好ましくは２つは、マトリックスへの適用に先立って混合することができる。好ましくは、リガンドが試験化合物の前に生物学的レセプターと接触しないような順序にすべきであり、これはリガンドを置き換えるには何らかの活性化合物を必要とし、これは運動論的に遅く、分析の感度を減じてしまうからである。好ましくは、第１の添加は生物学的レセプターを含むべきである。好ましくは、生物学的レセプターは固相マトリックス上に固定化されている。あるいはまた、本発明の方法は、対象の生物学的レセプターと試験化合物との間の相互作用を測定するのに用いてもよい。従って、本発明のさらに別の側面においては、本発明者により、生物学的レセプターに結合する化合物の検出方法であって、キャピラリー作用によるその中での流体の移動を可能にするような固相マトリックス上のある位置で、生物学的レセプターへの試験化合物の結合と当該固相マトリックス上での未結合試験化合物の分離とを可能にするような条件下で、生物学的レセプターを試験化合物と接触させること、並びに、何らかのそのような分離を参照することによって生物学的レセプターへの試験化合物の結合を検出すること、を含む上記の方法が提供される。試験化合物は他の分析成分の適用に先立って固相マトリックス上に固定化されているのが好都合である。「固定化されている（immobilized）」によって、本発明者は、マトリックスへの共有または非共有付着、あるいは、キャピラリー作用によりマトリックスを通して移動することができない物質への付着を意味する。レセプターが膜レセプターである場合、固定化は膜断片の形態でレセプターを適用することによって提供されるのが好都合である。あるいはまたレセプターはペプチドタグ（tag）とともに提供されてもよく、Ｎ−またはＣ−末端に付着し、遺伝的操作技術により融合タンパク質として製造されるのが好都合であり、そして固定化は、共有または非共有手段によってマトリックス上に固定化されたタグ、例えば抗−タグ抗体に相補的なパートナーによって行われる。試験化合物が固定化される場合、マトリックス上で試験化合物を合成することにこれを行うのが好都合である。そのようなシステムは例えば、R．Frank，Tet．Lett．48，(42)，9217-9232（1992）によって記載されている。本発明者は、理論的考察に拘束されることは望まないが、試験化合物への生物学的レセプターの結合は一般的には溶液中で生じるであろう。従って、関連化合物の１以上を溶液中で適用するのが好都合である。場合によっては、例えば添加の間に休止をおくことによる乾燥または部分乾燥を、分析の流体容積を減少する目的で行ってもよい。好ましい分析では、生物学的レセプターの添加、乾燥、試験化合物次いでリガンドの添加、インキュベーション、その後の洗浄が含まれる。流体媒体および固相マトリックスの性質に依存するが、結合後に、分離はある程度の限定された範囲で既に生じているかもしれない。しかしながら、一般に、インキュベーションを限定された位置に限定することが好ましく、インキュベーション後に、洗浄液流体を分離した工程で適用し、何らかの所望の程度の分離を生じさせるのが好都合である。本発明のマトリックスは多孔質固相マトリックスであるのが好都合であり、例えばセルロースペーパーまたはガラス繊維ペーパーあるいはガラス繊維とセルロースとを混合したペーパーのシートである。本発明の分離は放射分離であり、その後にマトリックスの中心位置または周辺領域、あるいはその両方に保持された標識成分の広がりを定量または評価するのが好都合である。あるいはまた、本分析方法は、上記よりも高い分析位置密度を可能にする直線分離として行われる。この分析は上記のように行われるが、より少量および／またはより厚いマトリックス、例えばペーパーを使用し、高い比率の洗浄緩衝液を下流に向けるが（水平のペーパーを仮定する）、この方法は場合によっては放射移動が制限されるように位置を互いに密接した場所に取ることによって容易になるかもしれない。場合によっては、この方法はマトリックスの下に吸収層を設けることによって容易になるかもしれない。この分析は、（不透明な）ペーパーを通じて有意に検出することができないシグナル、例えば、発色団（chromophore ）、発蛍光団（fluorophore）、化学発光団（chemilumophore）（またはこれらを生成する酵素）またはトリチウムで標識されたリガンドを用いて実施するのが好都合である。好ましくは、シグナルは発蛍光団である。結合の程度は、表面シグナルを測定することにより決定される：こうして、レセプターに結合する化合物は標識リガンドの結合を妨げ、減少したシグナルが生じるのであろう。放射および直線分析は両方とも、任意の適当な２次元または３次元のマトリックスで行うことができ、マトリックスの構造的完全性が支持表面によって補強されているものも含まれる。好都合な２次元マトリックスには、パーパーなどのシート類が含まれるが、それらは、別の支持体、例えばマイクロタイタープレートの底部に付着させたフィルター上に存在していてもよいと理解されるであろう。直線または放射分離分析は、液体の直線的流れを可能にする任意のマトリックス上で実施することができる。生物学的レセプターは、対象となる薬理的レセプター、例えば膜レセプター、あるいは例えば医薬または農薬用対象の任意の標的物であるのが好都合である。そのような標的物は、例えば、細胞シグナル、遺伝子発現の調節、細胞接着、炎症の媒介に関与するもののようなタンパク質；酵素およびそれらの阻害剤、プロテオグリカン類、オリゴ−またはポリ−多糖類、二本鎖または一本鎖の形態の核酸、および１以上の上記種を含む複合体である。生物学的レセプターは膜断片の形態で供給されるのが好都合である。生物学的レセプターは断片またはドメイン、あるいは対象の天然の生物学的レセプターのアナログであってもよい。リガンドは、対象の生物学的レセプターに結合することが知られている化合物から選択するのが好都合である。典型的には、リガンドはペプチド、タンパク質、オリゴ−またはポリ−多糖類、または小分子である。リガンドは天然由来のリガンドのアナログでもよい。好ましくは本発明の方法は１以上の対照を参照することにより実施される。結合または未結合の物質の存在の検出は、特定の系の可溶性成分の１以上を標識することによって実施するのが好都合である。リガンドが標識されるのが最も好都合である。あるいは、生物学的パートナーが標識される。使用される標識は、生化学的分析で使用される任意の慣用の標識である。放射分離分析のためには、標識は、２次元像形成技術によって位置付けして測定できるようなものであるのが好都合であり、例えば、オートラジオグラフィーまたは貯蔵リン光（strage phosphor）または比例ワイアーカウンティング（proportio nal wire counting）またはマイクロチャネル配列検出器技術で測定することができる放射活性、あるいは、蛍光スキャナ装置で測定できる蛍光体、あるいは、視覚観察または像分析で評価できる色素または酵素生成した色素である。結合および遊離の標識を区別するための検出技術に対する要求を取り除くその他の標識および検出系を案出してもよい。例えば、蛍光を標識として使用する場合は、結合した標識のみが蛍光を発するように位置の中心のみをイルミネートすればよい。あるいはまた、ラジオアイソトープを標識として使用する場合は、分析後に、少量のシンチラント（scintillant）を位置の中心部のみに適用して、結合した標識のみが検出されるであろう。あるいは、酵素が標識として使用される場合は、分析後に少量の基質を位置の中心部のみに適用して、結合した標識のみが検出される。この原理を２以上の要素を必要とする任意のシグナル系に適用して、シグナル（要素として光照射を含む）を得ることができ、上記の変法は平均的技術を有する科学者には明らかであろう。直線分離分析のためには、標識は、発蛍光団（fluorophore）、または選択したマトリックスを有意には透過しないシグナルを生成する酵素であるのが好都合である。あるいは、若干透過する放射活性アイソトープ、例えばトリチウムを使用してもよい。あるいは、放射および直線分離分析のためには、結合または遊離の標識を固定化成分またはマトリックス上に位置する第２のシグナル成分との相互作用によって測定できるような、相互作用シグナルを使用してもよい。相互作用シグナルは当技術で知られており、例えば蛍光エネルギー移動を含む。固定化されたパートナーまたはマトリックスの本質的特性、例えば、その大きさ（mass）またはそのハイドロパシー（hydropathy）を相互作用シグナルとして考慮することができ、蛍光極性（fluorescene polarization）または他の蛍光特性の調節による検出が可能になる。「標識」という用語には、ビオチンのような親和対の片方を形成するタグ（ta gs）が含まれ、その存在は、シグナルが結合している親和対の相補パートナーとインキュベーションすることによって続いて測定することができる。リガンドおよび生物学的パートナーの標識方法は当技術において知られており、例えば、Pierce Chemical Company および Molecular Probes のカタログ、および本明細書に含まれる引用文献中に記載されている。本発明者は、放射リガンド結合分析をこの形態で実施することが有利であることを見い出した。本方法には、適切なペーパー、例えばガラス繊維ペーパーに、対象のレセプターを含む膜断片、試験化合物および標識リガンドを、好ましくはこの順番で、そして少量、好都合なのは全部で１０μｌ未満の量、例えば６μｌ未満の量で添加する工程、および結合が生じる条件下でインキュベートする工程を含む。全ての添加はペーパー上の同じ位置でなされる。続いて、適量の洗浄緩衝液を適用して未結合のリガンドを放射状に洗浄する一方、結合リガンドは中心部に残るが、これは膜断片はペーパーを通じて移動することができないからである。リガンドが放射活性アイソトープで標識されており、分析結果はオートラジオグラフィー、比例ワイアーカウンティング、ミクロチャネル配列検出器または貯蔵リン光技術によって視覚化されるのが好都合である。後ろの３つの技術によれば結果の定量が可能である。あるいは、非アイソトープ標識を使用してもよく、特には２次元蛍光スキャナと組み合わせて使用される蛍光標識が好都合である。これらの試みにおいて、レセプターへのリガンドの結合を妨げる試験化合物が中心スポットの強度における減少によって明らかになる。本発明者はまた、上記方法において固相マトリックスとして使用するための前処理したメンブレンも開示する。そのようなメンブレンは、例えばマトリックッスへの標識成分の非特異的結合を改良したり、中心位置に固定化成分を保持するための物質で処理したりあるいはコートしたりすることことができる。本発明の分析の利点は、複数の分析をマトリックスの単一シート上で都合よく実施することができるということである。従って、多数の化合物を単一の実験でスクリーニングすることができる。好都合なことに、これはロボット（robtic）液体操作装置で達成される。複数のそのような装置が知られており、例えば、Te can RSP 5072 のようなロボット（robotic）試料加工機が挙げられる。上記の分析は、従来の技術よりも非常に有利である。これらには、出量能力の増加、簡単な作動、耐久力の向上および費用の軽減が含まれる。膜断片を用いるレセプター結合分析のためには、本分析は真のレセプター結合活性を有する化合物を検出する能力においてさらに区別できると考えられる。本発明者は理論的考察に拘束されることは望まないけれども、真空ろ過法と比較して、本方法によって使用されるより穏やかなろ過により、検出されない膜断片の構造を単に粉砕する化合物を生じさせるが、これは断片は粉砕されているにもかかわらず中央ゾーンに留まるからである。本発明を以下の実施例および図面によって説明するがこれらによって限定されるものではない。図１は、実施例１に記載した分析に従って異なる濃度の未標識のエンドセリン（endothelin）による放射標識されたエンドセリンの置換を示すオートラジオグラフを示す。Ｔ：全部（未標識エンドセリン）、ＮＳ：非特異的結合；−１１、 −１０、−９、−８、−７：１０^-11Ｍ、１０^-10Ｍ、１０^-9Ｍ、１０^-8Ｍおよび１０^-7Ｍ未標識エンドセリン。図２は、従来の真空ろ過法に対する、実施例２に記載するような放射分離分析における２４の試験化合物に関して得られた置換率の相関を示す。図３は、実施例３に記載した操作を行うことによって得られた像を示す。これは、局在したレセプターに対する全結合を示す暗い中心スポットを示しており、スポットが存在しないことは、その位置に適用したサケカルシトニンの高濃度のための結合の十分な阻害を示す（１マイクロモル濃度）。図４は、実施例４に記載した操作を行うことによって得られた像を示す。これは、以下の膜濃度で測定した、全結合Ｉおよび非特異的結合ＩＩの結果を示す：Ａ．０．７ｍｇ／ｍｌ、Ｂ．０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｃ．０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｄ．０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｅ．０．０５ｍｇ／ｍｌ。実施例１エンドセリンレセプター結合分析の確立本分析は、エンドセリン１と、放射フォルマットで分離された、ヒトエンドセリンＥＴＡレセプター（ＥＴ_Aレセプター、Adachi et al，Biochem．Biophys．R es．Commun.，1991，180，1265-1272）を発現しているマウス赤白血病細胞（ＭＥＬ）から調製された洗浄膜画分との相互作用を調査する。クローン化されたヒトＥＴ_Aレセプターを含有するＭＥＬ細胞（ＷＯ−８９／０１５１７、Grosveld et al／MRC、ＷＯ−９２／１１３８０、Hollis et al／I CI）の新鮮なペレットを得た。これらの細胞をホモジナイズ用緩衝液（５０ｍＭのトリス［ヒドロキシメチル］アミノ−メタン（Trizma base）、５μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤、１ｍＭの１，１０−フェナントロリン、１ｍＭのベンズアミジン塩酸塩、１００μｇ／ｍｌのバシトラシン（bacitracin）（全て、Si gma から）、３ｍＭのスクロース（ＢＤＨ）；ＨＣｌでｐＨ８．０）中に再懸濁した。細胞懸濁物を機械式ホモジナイザー（Polytron PT-3000、７５％出力）を用いて、３×１０秒の作動で作動の間に氷上で２分間冷却しながら、ホモジナイズした。ホモジネートを４℃で１０分間１５００×ｇで遠心した（SS34 ローター、Sorval RC5C 遠心分離器）。上清を除去し、４℃で３０分間＞４０，０００ｇ×ｇで再遠心した（SS34 ローター、Sorval 遠心分離器）。生じた上清を捨て、ペレットをホモジナイズ用緩衝液（前記したもの）中に再懸濁し、３０分間＞４０．０００×ｇで再遠心（上記の通り）することによって洗浄した。最後のペレットをガラス／テフロンの手保持ホモジナイザーを用いて、ホモジナイズ用緩衝液中に再懸濁した。最終膜懸濁物のアリコートを必要となるまで液体窒素中で凍結して保存した。全ての分析希釈物は、分析緩衝液（５０ｍＭの Trizma塩基、１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．０５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Tween 20、S igma）、０．１％の牛血清アルブミン（脂肪酸を含まない）；５６℃で３０分間加熱処理、ｐＨ７．４）を用いて作製した。エンドセリンＩ（ヒト、ブタ、Camb ridge Research Biochemicals）のストック溶液を脱イオン水中で３×１０^-5Ｍで調製し、必要になるまで−２０℃でアリコートで貯蔵した。ストック溶液を分析緩衝液（上記のもの）で希釈して、３×１０^-7Ｍの濃度にし、この濃度を使用して非特異的結合を定義した。この希釈物を作製して、３×１０^-7Ｍから３×１０^-11Ｍの濃度の範囲を得た。解凍したばかりの膜懸濁物を希釈してタンパク質濃度を約０．３ｍｇ／ｍｌにし、このうち１５μｌをガラス繊維フィルターマット（Whatman GFB）上の全分析位置に適用した。これを室温で２０分間部分乾燥させた。分析緩衝液（全結合を与えるための）、またはエンドセリン１の希釈物の何れか１５μｌをメンブレンスポットに適用し、その直後に１５μｌの９０ｐＭ（０．２テラベクレル／ｍｍｏｌ）の［１２５１］−Ｔｙｒ１３−エンドセリン１（ヒト、ブタ、NEN Research Products）を同一のスポットに適用した。次いで、マットを湿潤雰囲気中３７℃で４０分間インキュベートし、その後、６０ μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を同一のスポットに適用した。次いで、マットをオートラジオグラフィーフィルム（Fuji Ｘ線）に３日間露出した。結果を図１に示す。メンブランに結合した放射活性は移動しなかった一方、未結合の放射活性は放射様式で中心スポットから外へ洗い流され、外側の環を形成した。図１は、全結合（Ｔ）に対しては中心スポットを示し、非特異的結合（１０^-7Ｍエンドセリン）に対してはスポットの不在を示す。エンドセリンの４個の希釈物は、１０^-10から１０^-11Ｍの間のＩＣ−５０と一致する中心スポットの段階的損失を示す。実施例２試験化合物の活性の検出および従来法との相関従来のエンドセリンレセプター結合分析で活性が知られる２４個の化合物をこの実験のために選択した。簡単に言うと、通常の分析法を使用して、膜レセプター断片および放射標識エンドセリンのインキュベーションを行った（実施例１に記載されるように）。９０分間のインキュベーション後、混合物を細胞回収具（Tomtec 96 Mach 2）上で真空ろ過を用いてガラス繊維マット（Wallac printed フィルターマットＢ）を通じてろ過し、ベータカウンター（Wallac 1205 BetaPl ate）でカウントした。各化合物に置換率を全および非特異的結合対照を参照することによって計算した。これらの化合物を、以下の修正を加えて、実施例１に記載する放射分離分析において、最終濃度０．３ｍＭで分析した。レセプター、化合物および標識の量は各々２、４および４マイクロリットルであり、洗浄液の量は５マイクロリットルであった。使用したフィルターは強化マット（Tomtec RG）であった。マットを貯蔵リン光スクリーン（Molecular Dynamics）に３時間露出し、Phos phorImager SF（Molecular Dynamics）で分析した。中心スポットの強度は供給されたソフトウエアを用いて測定した。各化合物の置換は全部の値から非特異的結合値を差し引き、全測定値の比率として全測定値−化合物測定値を表すことによって計算された。この分析に関する化合物の置換を、図２において従来の分析法で得られたものと比較した。本発明の分析法がリガンドとレセプターとの結合を阻害する化合物を検出するのに有用であることが高い相関関係から示される。実施例３ヒトカルシトニンレセプターを使用する複数分析組換えヒトカルシトニンレセプター調製物を以下のようにして得た。クローン化したヒトカルシトニンレセプター（Gorn，A.H．et al J．Clin．Invest.，(19 92)，90，1726-1735）を含むＭＥＬ細胞（ＷＯ−８９／０１５１７、Grosveld e t al/MRC；ＷＯ−９２／１１３８０、Hollis et al／ICI）の新鮮なペレットを、冷却（４deg.C）ホモジナイズ用緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのヨードアセトアミド、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。細胞懸濁液を機械式ホモジナイザー（Polytron PT-3000、７５％の出力）を用いて３×１０秒の作動で作動の間に氷上で２分間冷却しながら、ホモジナイズした。ライセートをガラス／テフロンホモジナイザーに移し、１０回のストロークを与えて細胞粉砕を確実にした。ホモジネートを４deg.Cで１０分間３，０００ｒｐｍ（１１００ｇ）で遠心した（SS34 ローター、Sorval RC5C 遠心分離器）。低速上清物を除去し、ペレットを１０ｍｌのホモジナイズ用緩衝液中に再懸濁し、 Polytron ホモジナイザーで３×１０秒間処理して分散させた後、上記のように低速遠心を行った。両方の回転からの上清を併せる。次いで、これを、Ｔｉ７５ヘッドを用いてＬ７ Ultracentrifuge（Beckman）中で４degＣで３３，０００ｒｐｍ（１００，０００ｇ）で３０分間遠心した。ペレットを２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に再懸濁し、再遠心した。次いで、このペレットを前のように再懸濁し、ガラス／テフロンホモジナイザーの１０ストロークで処理した。タンパク質の測定は、Pierce Chemical Co.，のＢＣＡ法により、それらの推奨された方法および標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて行った。膜をストック濃度の０．０８ｍｇ／ｍｌのタンパク質まで希釈し、−７０deg.C で貯蔵した。全ての分析希釈物は、分析緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％のＢＳＡ（脂肪酸を含まない）；０．１％のバシトラシン、ｐＨ７．４）を用いて作製した。カルシトニン（サケ、Cambridge Research Bioch emicals）のストック溶液を１５０ｍＭのＮａＣｌと０．１％のＢＳＡとを含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で０．１ｍＭで調製し、分析緩衝液中の希釈物を０．３ｎＭで調製した。（３−［１２５Ｉ］ヨードチロシル−２２）サケカルシトニン（０．３ｎＭ）の溶液を調製し、その一部を未標識のカルシトニンと１：１で混合し、アイソトープ的に希釈された調製物を得た。解凍したばかりの膜懸濁物を希釈して０．０２ｍｇ／ｍｌの実験濃度にした。３０×４３ｃｍのガラス繊維フィルターマット（Tomtec RG）に、長方形の配列で２，３０４箇所に４マイクロリットルのレセプター調製物を添加した。これを室温で２時間乾燥させた。分析緩衝液（全結合を与えるための）、またはサケカルシトニンの希釈物の何れか２マイクロリットルを、２マイクロリットルの［１２５Ｉ］サケカルシトニンとともに同一の添加で適用した。各分析位置を室温で４０分間インキュベートし、その後、６マイクロリットルの洗浄緩衝液（１０ｍＭのトリス［ヒドロキシメチル］アミノ−メタン（Trizma base）（Sigma）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（Fisons AR）、ｐＨ７．４、０．０５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Sigma）を含む）を適用した。全ての添加は４ウエイチップ（way tip）を有する Tecan RSP 5072 ロボット試料加工機を用いて作製した。マットを完全に乾燥させ、３時間所蔵リン光スクリーン（Molecular Dynamics ）に露出し、PhosphorImager SF（Molecular Dynamics）を用いて分析した。 PhosphorImager から得られた像を図３に示す。これは、局在レセプターに対する全結合を示す中心スポットを示し、スポットの不在はその位置に適用されたサケカルシトニンの濃度（１マイクロモル濃度）が高いための結合の十分な阻害を示す。フィルターマットへの少量の適用は注意を要するけれども、図は本発明が一つの簡単な分析法で可能な試験数を著しく増加するのに好都合な方法であることを示している。実施例４ブラジキニン結合：各種のレセプター膜濃度組換えヒトブラジキニンレセプター調製物を以下のようにして得た。クローン化したヒトブラジキニンレセプターを含むＭＥＬ細胞（ＷＯ−８９／０１５１７、Grosveld et al/MRC；ＷＯ−９２／１１３８０、Hollis et al／ICI）の新鮮なペレットを、冷却（４deg.C）ホモジナイズ用緩衝液（１０ｍＭのトリス［ヒドロキシメチル］アミノ−メタン（Trizma base）ｐＨ７．５、０．１ｍｇ／ｍｌのバシトラシン、０．００５ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤（５ｍｇ／ｍｌ、エタノール中に予め溶解）、１ｍＭのベンズアミジン、２５０ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（エタノール中）（全てSigmaから）、０．２Ｍのスクロース（Fisons AR））中に再懸濁した。細胞懸濁液を３×１０秒の作動で作動の間に氷上で２分間冷却しながら、ホモジナイズした（Ultra-turax，２０，５００ｒｐｍ）。ライセートを４deg.Cで１０分間３５００ｒｐｍ（１５００ｇ）で遠心した（SS34 ローター、Sorval RC5C 遠心分離器）。低速上清物を除去し、ペレットを捨てた。上清をSorval 遠心分離器で４degＣで２０，０００ｒｐｍ（４００００ｇ）で３０分間遠心した。タンパク質の測定は、Pierce Chemical Co.，のＢＣＡ法により、それらの推奨された方法および標準としてＢＳＡを用いて行った。膜を少量ずつ分割し、使用まで−７０deg.C で貯蔵した。解凍したばかりの膜溶液を分析緩衝液（３７．５ｍＭのＮ−トリス［ヒドロキシメチル］−メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、１．５ｍＭのフェナントロリン、０．２１ｍｇ／ｍｌのバシトラシン、０．１５ｍＭのチオールファン、０．１５％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（本質的に脂肪酸を含まない）（全てSigmaから）、０．４５ｍＭの塩化マグネシウム（ＢＤＨ）、ｐＨ６．８、５６deg.Ｃで３０分間加熱処理）中で希釈し、５つの濃度の膜を得た：Ａ．０．７ｍｇ／ｍｌＢ．０．５ｍｇ／ｍｌＣ．０．３ｍｇ／ｍｌＤ．０．１ｍｇ／ｍｌＥ．０．０５ｍｇ／ｍｌ［１２５Ｉ−Ｔｙｒ８］−ブラジキニン（NEN Research Products）の溶液を分析緩衝液中で調製し、０．１５ｐＭの濃度を得た。標準ブラジキニンレセプターアゴニスト（Ｍ２４８１３８）のストック溶液を０．３ｍＭの濃度で調製し、トリス［ヒドロキシメチル］アミノ−メタン（Trizma base）（TRIS）（Sigma）ｐＨ７．０中の希釈物を作製して濃度を０．０５ｍＭにし、これを使用して非特異的結合を測定した。ガラス繊維フィルターマット（Tomtec RG）を４deg.Cで１０時間０．１５％のポリエチレンアミン（Sigma）中に含浸し、完全に乾燥させた。４×４マイクロリットルのスポットの各膜濃度を乾燥フィルターマットに適用して、室温で２時間静置した。２マイクロリットルのＴＲＩＳ緩衝液（全結合を得るための）または２マイクロリットルの阻害剤（非特異的結合を得るための）のどちらかを各スポットに適用して、その直後に２マイクロリットルの［１２５Ｉ］ブラジキニンを適用した。マットを室温で４０分間静置し、その後に６マイクロリットルの洗浄緩衝液（１ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭの塩化ナトリウム（Fisons，AR）、０．０２％のＢＳＡ、ｐＨ７．５）を各スポットに適用した。乾燥後、マットを貯蔵リン光スクリーン（Molecular Dynamics）に３時間露出して、PhosphoImager SF（Mole cular Dynamics）上で分析した。 PhosphorImager から得られた像を図４中に示す。これにより、各濃度で全結合と非特異的結合とを測定できること、並びに、膜の濃度が減少するにつれて全結合が直線様式で減少することが示され、本発明が各種の異なるレセプターおよびレセプター濃度で使用することができることが確認された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的レセプターへのリガンドの結合を調節する化合物の検出方法であって、キャピラリー作用によるその中での流体の移動を可能にするような固相マトリックス上のある位置で、生物学的レセプターへのリガンドの結合と当該固相マトリックス上での未結合リガンドの分離とを可能にするような条件下で、リガンドと生物学的レセプターと試験化合物とを接触させること、並びに、何らかのそのような分離を参照することによって試験化合物による結合の調節を検出すること、を含む上記の方法。２．生物学的レセプターが固相マトリックス上に固定化されている請求の範囲第１項に記載の方法。３．リガンドが標識されている請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。４．生物学的レセプターに結合する化合物の検出方法であって、キャピラリー作用によるその中での流体の移動を可能にするような固相マトリックス上のある位置で、生物学的レセプターへの試験化合物の結合と当該固相マトリックス上での未結合試験化合物の分離とを可能にするような条件下で、生物学的レセプターを試験化合物と接触させること、並びに、何らかのそのような分離を参照することによって生物学的レセプターへの試験化合物の結合を検出すること、を含む上記の方法。５．生物学的レセプターが固相マトリックス上に固定化されている請求の範囲第４項に記載の方法。６．分離が直線分離である前記請求の範囲の何れか１項に記載の方法。７．生物学的レセプターが膜断片の形態で供給される前記請求の範囲の何れか１項に記載の方法。８．生物学的レセプターが対象となる薬理的レセプターである前記請求の範囲の何れか１項に記載の方法。９．結合または遊離の標識が蛍光を用いて検出される請求の範囲第１項から第８項の何れか１項に記載の方法。１０．結合または遊離の標識が相互作用シグナルによって測定される請求の範囲第１項から第９項の何れか１項に記載の方法。１１．放射リガンド結合分析である請求の範囲第１項から第３項または第６項から第８項の何れか１項に記載の方法。１２．複数の試験化合物が単一の固相マトリックス上で分析される前記請求の範囲の何れか１項に記載の方法。１３．前記請求の範囲の何れか１項に記載される方法で使用するための、１以上の分析成分で処理またはコートされた、固相マトリックス。１４．生物学的レセプターが固相マトリックス上に固定化されている請求の範囲第１３項に記載の固相マトリックス。