JPH09501048A - 中皮細胞遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳類レシピエントの中皮細胞をインサイチューで改変するための方法および薬剤学的組成物が提供される。この方法は、中皮細胞発現系をインビボもしくはエックスビボで形成すること、およびその発現系を哺乳類レシピエントに投与すること（正常の状態では中皮細胞が整列している体腔を経由して）を含む。この中皮細胞発現系は治療用作用物質のインサイチューでの局所的および全身的輸送に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 中皮細胞遺伝子療法 発明の分野 本発明は、遺伝子療法に関する。更に詳しくは、本発明は、ヒトおよび動物に おける中皮細胞遺伝子療法に関する。 発明の背景 遺伝子伝達は、生物学的現象および疾患過程についての細胞および分子レベル 双方での分析のための強力な手段として現在広く認識されている（マレー（Ｍｕ ｒｒａｙ），Ｅ．Ｊ．監修、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ ，７巻，ヒューマナ・プレス・インコーポレーテッド（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．），クリフトン，Ｎ．Ｊ．（１９９１）；クリーグラー （Ｋｒｉｅｇｌｅｒ），Ｍ．，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ． Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．），ニ ューヨーク（１９９０））。更に最近、遺伝性（例えば、ＡＤＡ欠損症）かまた は後天性（例えば、癌または感染症）のヒト疾患の治療のための遺伝子療法の応 用がかなり注目されている（マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ），Ｒ．Ｃ．，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２６０：９２６〜９３２（１９３３）；トルストシェブ（Ｔｏｌｓｔ ｏｓｈｅｖ），Ｐ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３〜５９６（１９９３）；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ａ．Ｄ．，Ｎａ ｔｕｒｅ ３５７：４５５〜４６０（１９９２）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓ ｏｎ），Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８〜８１３（１９９２）；お よびそれらにある参考文献）。改良された遺伝子伝達技術の出現および「欠陥遺 伝子」に関係した疾患の絶えず拡大するライブラリーの識別により、遺伝子療法 は治療理論から実際の現実のものへと急速に発展してきた。 伝統的に、遺伝子療法は、「先天性遺伝子エラーを訂正するために患者の細胞 中に外因性遺伝子を導入する操作」として定義されてきた（ブレイズ（Ｂｌａｅ ｓｅ），Ｒ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．６１： Ｓ４７〜Ｓ５５（１９９１））。現在、４５００例を越えるヒト疾患が遺伝性と して分類されているが（レイマー（Ｒｏｅｍｅｒ），Ｋ．およびフリードマン（ Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ），Ｔ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：２１１〜 ２２５（１９９２）およびそこに引用された参考文献）、ヒトゲノムにおける具 体的な突然変異は、これらの疾患の内の比較的少数でしか確認されていない。最 近まで、これらの数少ない遺伝病は、遺伝子療法研究の唯一の目的であった。し たがって、国立衛生院に承認された遺伝子療法プロトコルの大部分は、既知の先 天性遺伝子エラーを有する個体の体細胞中への欠陥遺伝子の機能性コピーの導入 に向けられてきた（ミラー，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５〜４６０ （１９９２））。やっと最近になって、大部分のヒト癌、ある種の心臓血管性疾 患および多数の変性疾患もまた重要な遺伝的成分を有すること、そして新規の遺 伝子療法を設計する目的のためにこれらを「遺伝性疾患」とみなすべきである（ レイマー，Ｋ．およびフリードマン，Ｔ．，１９９２年，上記）ということを研 究者および臨床医達が認め始めた。したがって、遺伝子療法は、より最近になっ て、「罹患した生物中への新規遺伝情報の導入による疾病表現型の訂正」と広く 定義された（レイマー，Ｋ．およびフリードマン，Ｔ．，１９９２年，上記）。 遺伝子療法に対する二つの基本的なアプローチ、すなわち（１）生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）遺伝子療法および（２）生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）遺伝子療法が展 開された。生体外遺伝子療法では、細胞を被験者から取出し且つインビトロで培 養する。機能置換遺伝子をインビトロで細胞中に導入し（トランスフェクション ）、修飾された細胞を培養中で増殖させた後、被験者に再度植込む。これらの遺 伝的に修飾され再度植込まれた細胞は、検出可能な量のトランスフェクトされた 遺伝子産物を現場で分泌すると報告されている（ミラー，Ａ．Ｄ．，Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１〜２７８（１９９１）；セルデン（Ｓｅｌｄｅｎ），Ｒ．Ｆ．ら ，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１７：１０６７〜１０７６（１９８７））。 改良されたレトロウイルス遺伝子伝達法（形質導入）の開発は、体細胞中への遺 伝物質の伝達および引き続きの体細胞による遺伝子物質の発現を大きく促進した （セプコ（Ｃｅｐｋｏ），Ｃ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ３７：１０５３〜１０６２（ １９８４））。したがって、レトロウイルスに媒介された遺伝子伝達は、オー トロガス細胞に印を付けるための臨床試験においておよび遺伝病を治療する方法 として用いられてきた（ローゼンバーク（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ），Ｓ．Ａ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３２３：５７０〜５７８（１９９０）；アンダー ソン，Ｗ．Ｆ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：９９〜１００（ １９９１））。ヒトにおいて研究されたいくつかの生体外遺伝子療法は既に始め られている（アンダーソン，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８〜８１ ３（１９９２）およびミラー，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５〜４６ ０（１９９２）で論評された）。 生体内遺伝子療法においては、標的細胞を被験者から取出さない。むしろ、伝 達される遺伝子を受容体生物の細胞中に現場で、すなわち受容体中に導入する。 生体内遺伝子療法はいくつかの動物モデルで実験されてきた（フェルグナー（Ｆ ｅｌｇｎｅｒ），Ｐ．Ｌ．およびローズ（Ｒｈｏｄｅｓ），Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：３５１〜３５２（１９９１）で論評された）。いくつかの最近の刊行 物では、臓器および組織、例えば、筋肉（フェリー（Ｆｅｒｒｙ），Ｎ．ら、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８：８３７７〜８７８１（１９９１） ；クァンティン（Ｑｕａｎｔｉｎ），Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２５８１〜２５８４（１９９２））、造血幹細胞（クラ ップ（Ｃｌａｐｐ），Ｄ．Ｗ．ら、Ｂｌｏｏｄ ７８：１１３２〜１１３９（１ ９９１））、動脈壁（ナベル（Ｎａｂｅｌ），Ｅ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ４４：１３４２〜１３４４（１９８９））、神経系（プライス（Ｐｒｉｃｅ）， Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４；１５６〜１６０（ １９８７））および肺（ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ），Ｍ．Ａ．ら 、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４（１９９１））中への現場での直接 遺伝子伝達の可能性が報告された。ＤＮＡの骨格筋（ウォルフ（Ｗｏｌｆｆ）， Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５〜１４６８（１９９０））、心 筋（キツィス（Ｋｉｔｓｉｓ），Ｒ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４１３８〜４１４２（１９９１））中への直接注射およ びＤＮＡ−脂質複合体の血管系中への注射（リム（Ｌｉｍ），Ｃ．Ｓ．ら、Ｃｉ ｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：２００７〜２０１１（１９９１）；レクラーク（Ｌ ｅ ｃｌｅｒｃ），Ｇ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６〜９４ ４（１９９２）；チャップマン，（Ｃｈａｐｍａｎ）Ｇ．Ｄ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒ ｅｓ． ７１：２７〜３３（１９９２）もまた、検出可能な発現レベルの１種類ま たは複数の挿入遺伝子産物を生体内で生成すると報告された。 一部分は、分化した幹細胞系列に関係した多数の遺伝病のために（ミラー，Ｄ ．Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５〜４６０（１９９２））、生体外ヒト遺伝子療 法に用いられる主要な標的細胞種は、当初においては造血幹細胞であろうと考え られた（例えば、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），Ｊ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５：３０１４〜３０１８（１９８８）を参照されたい ）。しかしながら、造血幹細胞トランスフェクションに固有の問題（例えば、非 能率的トランスジーン発現）（ミラー，Ａ．Ｄ．，Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１〜 ２７８（１９９１））のために、より最近の遺伝子療法研究は、形質転換のため の代わりの細胞種の同定を目的としてきた。これらとしては、ケラチノサイト（ モーガン（Ｍｏｒｇａｎ），Ｊ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１４７６〜 １４７９（１９８７））、繊維芽細胞（パルマー（Ｐａｌｍｅｒ），Ｔ．Ｄ．ら 、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１３３０〜１３３４（１９９ １）；ガーバー・ジュニア（Ｇａｒｖｅｒ Ｊｒ．），Ｒ．Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２３７：７６２〜７６４（１９８７）；公開番号ＷＯ ９２／１５６７６ 号を有する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１８９０号明細書）、リンパ球（ ライマン（Ｒｅｉｍａｎｎ），Ｊ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ｓ ８９：９３〜１０１（１９８６））、筋芽細胞（バー（Ｂａｒｒ），Ｅ．お よびライデン（Ｌｅｉｄｅｎ），Ｊ．Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１５０７ 〜１５０９（１９９１）；デイ（Ｄａｉ），Ｙ．ら、ＰＮＡＳ ８９：１０８９ ２〜１０８９５（１９９２）；ロマン（Ｒｏｍａｎ），Ｍ．ら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８：２４７〜 ２５８（１９９２））、平滑筋細胞（リンチ（Ｌｙｎｃｈ），Ｃ．Ｍ．ら、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３８〜１１４２（１９ ９２））および内皮細胞（ナベル，Ｅ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３ ４２〜１３４４（１９８９）、公開番号ＷＯ ９０／０６９９７号を有する国際 特許出願 ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５５７５号明細書）があり、これらの参考文献および特許 ／特許出願はそのまま本明細書中に援用される。 広範囲の細胞種が試験されたにもかかわらず、ヒト遺伝子療法に十分に適した 細胞種はまだ同定されていない。上記の同定された細胞種の不足としては、（１ ）挿入遺伝子の非能率的な（ウィリアムズら、１９８４年、ジョイナー（Ｊｏｙ ｎｅｒ）ら、１９８５年）または一時的な（マリガン，Ｒ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２６０：９２６〜９３２（１９９３））発現；（２）植込まれた形質導入細 胞の潜在的腫瘍形成性（セルデンら、１９８７年；ガーバーら、１９８７ｂ）； （３）不快な免疫抑制療法が不存在の場合の植込まれた遺伝的修飾細胞の拒絶（ セルデンら、１９８７年）；（４）細胞の皮下注射後の壊死（ベル（Ｂｅｌｌ） ら、１９８３年）；（５）形質導入細胞植込み部位からの挿入遺伝子産物の制限 された播種性（モーガンら、１９８７年）（ＷＯ９２／１５６７６号明細書も参 照されたい）；および（６）現場で供給される治療薬の量の制限がある。 治療的有効量の治療薬の現場での供給は、トランスフェクション（または形質 導入）の効率、更には標的細胞の数の両方による。したがって、レトロウイルス ベクターを用いる高効率の形質導入が可能であるにもかかわらず、上記の細胞種 の多くは、現場での形質導入に利用可能な細胞が比較的少数のために、生体内遺 伝子療法に十分に適した標的細胞ではない。同様に、これらの細胞種の多くは、 遺伝的に修飾された細胞を受容するための（例えば、植込みによって）現場で利 用可能な範囲が限られているために、または遺伝的に修飾された細胞を植込むた めの特定の解剖学的位置に接近するのが本質的に難しいために、生体外遺伝子療 法には十分に適していない。 内皮細胞による遺伝子療法は、特に、遺伝的に修飾された内皮細胞を受容する ための現場で利用可能な比較的小さい範囲に限定される。典型的に、内皮細胞を 用いる生体外遺伝子療法は、血管から細胞を取出す前に、または血管に細胞を導 入する前に、血管の比較的小さい部分を切除して、血管中の血流を排除すること を必要とする（ナベル，Ｅ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３４２〜１３ ４４（１９８９）；リム，Ｃ．Ｓ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３：２００ ７〜２０１１（１９９１）；チャップマン，Ｇ．Ｄ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ ｎ Ｒｅｓ． ７１：２７〜３３（１９９２））。したがって、比較的少数の遺伝 的に修飾された内皮細胞を標的血管中に植込むことができる。結果として、治療 的有効量の治療薬の現場での供給は、植込まれた内皮細胞の総数によって制限さ れる。 発明の概要 したがって、本発明の目的は、遺伝子工学処理された中皮細胞の使用に基づく 遺伝子療法の新規な方法および哺乳動物受容体に対して治療薬を供給するための その用途を提供することである。 理想的な生体外遺伝子療法は、（１）患者から容易に単離することができる； （２）外因性遺伝物質（例えば、治療薬）を安定して発現するようにインビトロ で修飾することができる；（３）受容体中に好都合に植込むことができる；（４ ）非血栓形成性である；そして（５）受容体中に多数植込むことができる細胞を 用いると考えられる。理想的な生体内遺伝子療法は、（１）受容体中に多数存在 するおよび（２）外因性遺伝物質（例えば、治療薬）を安定して発現するように 現場で修飾することができる細胞を用いると考えられる。好ましくは、遺伝的に 修飾された細胞は、転写されるおよび／または発現される治療薬の量を制御する ための調節要素、更には該治療薬を細胞内、細胞外および／または原形質膜結合 部分に向けるための追加の要素を含むと考えられる。好ましい遺伝的に修飾され た細胞は、細胞が位置する組織の正常な機能を妨げることなく治療薬が有益な（ すなわち、治療的）効果を有するのに必要な一定の時間、現場で制御された方法 で生存し且つ治療薬を生産し続けると考えられる。 本発明は、中皮細胞発現系を生成する方法、それによって製造された発現系お よびそれを含む薬剤組成物を提供することによってこれらのおよび他の目的を満 たす。中皮細胞発現系は、外因性物質（例えば、治療薬をコードしている異種遺 伝子）を発現し且つ哺乳動物受容体に対して遺伝子産物を現場で供給するための ビヒクルとして有用である。好ましい実施態様において、哺乳動物受容体はヒト である。 概して、本発明は、遺伝子工学処理された細胞および治療薬を発現させるため のその使用に関する。更に詳しくは、本発明は、治療的有効量の治療薬を局所に も全身にも供給することができる遺伝子療法のための方法に関する。例えば、本 発明は、治療的有効量の治療薬を任意の体腔（心膜、胸膜および腹膜）腔へ、そ して引き続き、体循環と直接連絡している排出リンパ管によって体循環へと供給 する方法を提供する。例えば、中皮細胞発現系は、最初に、治療薬の現場での（ 例えば、患者の腹腔に対する）供給、そして次に、相互連絡したリンパ管網によ る患者の体循環への供給によって患者の全身に治療薬を供給するのに有用である 。 本発明の一つの態様により、哺乳動物受容体において治療薬を発現するための 中皮細胞発現系を提供する。該発現系（本明細書中において「遺伝的に修飾され た中皮細胞」とも称される）は、中皮細胞および治療薬を発現するための発現ベ クターを含む。本発明の発現ベクターとしては、制限されないが、ウイルス、プ ラスミド、および異種遺伝物質を中皮細胞に供給するための他のビヒクルがある 。したがって、本明細書中で用いられる「発現ベクター」という用語は、異種遺 伝物質を中皮細胞に供給するためのビヒクルを意味する。 好ましくは、発現ベクターとしては、更に、異種遺伝子の転写を制御するため のプロモーターがある。更に好ましくは、該プロモーターは（以下に記載の）誘 導性プロモーターである。発現系は、哺乳動物受容体に対する投与用に適してい る。好ましい実施態様において、発現系は多数の不死化されていない中皮細胞を 含み、それぞれの細胞は、少なくとも一つの治療薬をコードしている少なくとも 一つの組換え遺伝子を有する。 中皮細胞発現系は、生体外または生体内で生成することができる。生体外で発 現系を生成するためには、１種類またはそれ以上の単離された中皮細胞をウイル スによって形質導入させるかまたはインビトロで核酸若しくはプラスミドによっ てトランスフェクトさせる。好ましくは、形質導入されたまたはトランスフェク トされた中皮細胞を引き続き培養中で増殖させた後、現場での治療薬の供給のた めに哺乳動物受容体に対して投与する。好ましい実施態様において、中皮細胞は 自己細胞を含み、すなわち、細胞は哺乳動物受容体から単離される。遺伝的に修 飾された１個または複数の細胞は、例えば、１個若しくは複数の細胞、または多 数の細胞を含む移植体（若しくはカプセル）を受容体の中皮細胞適合部位中に植 込むことによって受容体に投与される。典型的な中皮細胞適合部位としては、例 えば、腹膜腔、胸膜腔および心膜腔がある。好ましくは、中皮細胞適合部位を裸 出させる、すなわち、遺伝的に修飾された細胞を植込む前に中皮細胞部分を取出 してその下にある基底膜を露出させる。 本発明の更にもう一つの態様により、哺乳動物受容体（好ましくは、ヒト）の 中皮系を生体内で遺伝的に修飾する方法を提供する。該方法は、異種遺伝子を発 現させるための発現ベクターを患者の中皮細胞中に現場で導入することを含む。 発現系を生体内で生成するためには、治療薬を発現させるための発現ベクターを 、哺乳動物受容体の体腔（例えば、腹膜腔）中に、例えば、腹腔内注射によって 生体内に導入する。 好ましくは、異種遺伝子を発現させるための発現ベクターとしては、異種遺伝 子産物の転写を制御するための誘導性プロモーターがある。したがって、治療薬 の現場での供給は、異種遺伝子の転写を誘導する条件に対して細胞を現場で暴露 することによって制御される。 好ましい実施態様において、哺乳動物受容体は、遺伝子置換療法を受けやすい 症状を有する。本明細書中で用いられる「遺伝子置換療法」とは、治療薬をコー ドしている外因性遺伝物質の受容体に対する投与および投与された遺伝物質の現 場での引き続きの発現を意味する。例えば、「遺伝子置換療法を受けやすい症状 」という句は、遺伝病（すなわち、１種類またはそれ以上の遺伝子欠損に起因し うる病状）、後天性病変（すなわち、先天性欠損に起因しない病理学的症状）、 癌および予防過程（すなわち、病気または望ましくない医学的症状の予防）など の症状を包含する。したがって、本明細書中で用いられる「治療薬」という用語 は、哺乳動物受容体に対して有益な効果を有する任意の薬剤または物質を意味す る。例えば、「治療薬」とは、核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ）および／ま たはタンパク質成分を有する治療的および予防的分子両方を包含する。 一つの好ましい実施態様により、哺乳動物受容体は遺伝病を有し、そして外因 性遺伝物質はその疾患を治療するための治療薬をコードしている異種遺伝子を含 む。更にもう一つの実施態様において、哺乳動物受容体は後天性病変を有し、そ して外因性遺伝物質はその病変を治療するための治療薬をコードしている異種遺 伝子を含む。もう一つの実施態様により、患者は癌を有し、そして外因性遺伝物 質は抗腫瘍性薬をコードしている異種遺伝子を含む。更にもう一つの実施態様に おいて、患者は望ましくない医学的症状を有し、そして外因性遺伝物質は該症状 を治療するための治療薬をコードしている異種遺伝子を含む。例えば、典型的な 治療薬（それらが治療する症状は括弧内に示されている）としては、第ＶＩＩＩ 因子（血友病Ａ）および第ＩＸ因子（血友病Ｂ）、アデノシンデアミナーゼ（重 症複合型免疫不全症）、エリトロポエチン（貧血）並びに腫瘍壊死因子（癌）が ある。これらのおよび他の治療薬のリストを表１〜３に提供する。予防過程を処 置するための予防薬である典型的な治療薬（それらの用途は括弧内に示されてい る）としては、チロキシン（甲状腺機能低下症の治療用）、エストロゲン／プロ ゲステロン（避妊薬）、アルブミン（腹膜透析における腫脹薬として）がある。 更にもう一つの実施態様により、薬剤組成物を開示する。該薬剤組成物は、多 数の上記遺伝的に修飾された中皮細胞および薬学的に許容しうる担体を含む。好 ましくは、薬剤組成物は遺伝子置換療法を受けやすい症状の治療用であり、そし て外因性遺伝物質は、その症状を治療するための治療薬をコードしている異種遺 伝子を含む。更に好ましくは、薬剤組成物は、治療的有効量の治療薬を患者に対 して供給するのに十分な量の遺伝的に修飾された細胞を含む。遺伝子置換療法を 受けやすい典型的な症状を以下に記載する。 本発明のもう一つの態様により、上記薬剤組成物を生成するための方法を提供 する。該方法は、異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターを中皮細胞中 に導入して遺伝的に修飾された中皮細胞を形成し且つ該遺伝的に修飾された細胞 を薬学的に許容しうる担体中に入れることを含む。 本発明の更にもう一つの態様により、中皮細胞移植片を開示する。該移植片は 、哺乳動物受容体中への植込みに適している支持体に対して結合した多数の遺伝 的に修飾された中皮細胞を含む。該支持体は、天然または合成材料から生成する ことができる。一つの実施態様により、中皮細胞移植片は、多数の中皮細胞であ って組換え遺伝子を有する該細胞を含む腹膜のパッチを含む。好ましい実施態様 において、該細胞は、哺乳動物受容体からパッチを切除した後に、生体外で遺伝 的に修飾される。 本発明の更にもう一つの態様により、カプセル封入された中皮細胞発現系を開 示する。該カプセル封入された発現系は、哺乳動物受容体中への植込みに適して いるカプセル中に入れられた多数の遺伝的に修飾された中皮細胞を含む。該カプ セルは、天然または合成材料から生成することができる。好ましくは、多数の遺 伝的に修飾された中皮細胞を含むカプセルを腹膜腔に植込む。 本発明のこれらのおよび他の態様並びに種々の利点および有用性は、好ましい 実施態様の詳細な説明および添付図面を論及することによって一層明らかになる 。 図面の簡単な説明 図１は、インビトロでのラット一次中皮細胞の成長曲線である。 図２は、ヒト中皮細胞遺伝子療法の方法の工程図である。 図３は、安定してトランスフェクトされたラット中皮細胞（クローンメソｇｈ ２−３）によるｈｇｈのインビトロ生産を示す。 図４は、正常対照ラットのｈｇｈ濃度と比較した、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅ ｒ）ラットの腹膜腔中に再播種されたトランスフェクトされたラット中皮細胞に よる生体内でのｈｇｈ生産を示す。Ａ．血漿ｈｇｈ濃度の時間数での時間経過。 Ｂ．血漿ｈｇｈ濃度の日数での時間経過。 図５は、ｈｇｈ分泌性中皮細胞を植込まれたラットからの血清中における阻害 剤の存在を示す。Ａ．阻害活性の出現の時間経過。Ｂ．阻害力価測定値。 図６は、免疫抑制された動物（デキサメタゾン処理されたラット）の生体内で のｈｇｈ生産を示す。 図７は、安定してトランスフェクトされた非クローン化ヒト中皮細胞による生 体内でのｈｇｈ生産を示す。 好ましい実施態様の説明 本発明は、哺乳動物受容体において外因性遺伝物質を発現させるための中皮細 胞発現系を提供する。発現系は「遺伝的に修飾された中皮細胞」とも称され、中 皮細胞および外因性遺伝物質を発現するための発現ベクターを含む。遺伝的に修 飾された中皮細胞は、哺乳動物受容体に対して投与するのに適当であり、そこに おいてそれらは、受容体の内因性中皮細胞に取って代わる。したがって、好まし い遺伝的に修飾された細胞は不死化されていないし且つ腫瘍形成性ではない。 本発明の中皮細胞は、体腔（すなわち、胸膜腔、心膜腔および腹膜腔）に沿っ て並んだ境界漿膜を形成する単層偏平上皮に存在するまたは由来する壁の、内臓 表面のまたは浮遊性の中皮細胞である（ウィタカー（Ｗｈｉｔａｋｅｒ），Ｄ． ら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １０：８１〜１４４（１９８２）；ドビー（Ｄｏｂｂｉｅ），Ｊ．Ｗ．，Ａｍ ．Ｊ．Ｋｉｄ．Ｄｉｓ． １５：９７〜１０９（１９９０）；ゴトロイブ（Ｇｏｔ ｌｏｉｂ），Ｌ．およびショスタク（Ｓｈｏｓｔａｋ），Ａ．，Ｐｅｒｉｔｏｎ ｅａｌ Ｄｉａｌｙｓｉｓ ，Ｋ．Ｄ．ノルフ（Ｎｏｌｐｈ）監修、ナイホフ（Ｎ ｉｊｈｏｆｆ），アムステルダム；６７〜９５（１９８９）で論評された）。中 皮細胞は、胸膜腔、心膜腔および腹膜腔中の移動を容易にする摩擦のない表面を 与えることによって機能する（ウィタカー，Ｄ．ら、上記）。更に、中皮細胞は 分泌機能を有し（ディ・パオロ（Ｄｉ Ｐａｏｌｏ），Ｎ．，Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉ ａｌ．Ｉｎｔ． ９：１５１〜１５３（１９８９）；トビー，Ｊ．Ｗ．，Ｐｅｒｉ ｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ． ８：３〜６（１９８８））、そして腹膜腔中のそれらの 解剖学的位置のために除去されやすいし且つ引き続き再植込みが容易である（デ ィ・パオロ，Ｎ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔ．Ｏｒｇ．１２：４８５〜５０１（１ ９８９）；ディ・パオロ，Ｎ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｐｈｒｏｌ．３４： １７９〜１８４８（１９９０）；ディ・パオロ，Ｎ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｎ ５７ ：３２３〜３３１（１９９１））。 一つの実施態様により、中皮細胞を生体外で形質転換させるかまたはさもなけ れば遺伝的に修飾する。中皮細胞を哺乳動物（好ましくは、ヒト）から単離し、 治療薬をコードしている異種（例えば、組換え体）遺伝子を発現させるためのベ クターを用いてインビトロで形質転換させ（すなわち、形質導入するかまたはト ランスフェクトさせ）た後、治療薬を現場で供給するために哺乳動物受容体に対 して投与する。好ましくは、哺乳動物受容体はヒトであり、そして修飾される中 皮細胞は自己細胞である、すなわち、細胞は哺乳動物受容体から単離される。イ ンビトロでの中皮細胞の単離および培養は報告されており（例えば、スティリア ノウ（Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ），Ｅ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．３７：１５６ ３〜１５７０（１９９０）；プロンク（Ｐｒｏｎｋ），Ａ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒ ｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． ２９Ａ：１２７〜１３４（１９９３）を参照 されたい）、腹膜透析患者における自己腹膜中皮細胞の植込みの場合と同様であ る（例えば、ディ・パオロ，Ｎ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｎ ５７：３２３〜３３１（ １９９１）およびそこに引用された参考文献を参照されたい）。 もう一つの実施態様により、中皮細胞を生体内で形質転換させるかまたはさも なければ遺伝的に修飾する。哺乳動物受容体（好ましくは、ヒト）からの中皮細 胞を、治療薬をコードしている異種（例えば、組換え体）遺伝子を発現させるた めの外因性遺伝物質を有するベクターを用いて生体内で形質転換させ（すなわち 、形質導入するかまたはトランスフェクトさせ）、そして治療薬を現場で供給す る。 本明細書中で用いられる「外因性遺伝物質」とは、天然かまたは合成の、すな わち、中皮細胞中において天然に見出されない；または細胞中において天然に見 出されるとしても、それが中皮細胞によって生物学的に有意の量で転写されない 若しくは発現されない核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、「外 因性遺伝物質」としては、例えば、アンチセンスＲＮＡに転写することができる 天然に存在しない核酸、更には「異種遺伝子」（すなわち、天然に存在する中皮 細胞中において発現されないかまたは発現されるが生物学的に有意の量ではない タンパク質をコードしている遺伝子）がある。例示すると、ヒトエリトロポエチ ン（ＥＰＯ）をコードしている合成または天然の遺伝子は、ヒト腹膜中皮細胞に 関して、それらの細胞が天然においてＥＰＯを発現しないので「外因性遺伝物質 」と考えられ、同様に、腹膜中皮細胞中に挿入されたヒトインターロイキン−１ 遺伝子もまた、天然において腹膜中皮細胞はインターロイキン−１を生物学的に 有意の量で発現しないので、その細胞に対して外因性遺伝子であると考えられる 。「外因性遺伝物質」の更にもう一つの例は、相同組換えによって誘導性プロモ ーターと内因性コーディング配列とを組合わせるような、組換え遺伝子を生成す るための遺伝子の一部分のみの導入である。 好ましい実施態様において、哺乳動物受容体は、遺伝子置換療法を受けやすい 症状を有する。本明細書中で用いられる「遺伝子置換療法」とは、治療薬をコー ドしている外因性遺伝物質の受容体に対する投与および投与された遺伝物質の現 場での引き続きの発現を意味する。例えば、「遺伝子置換療法を受けやすい症状 」 という句は、遺伝病（すなわち、１種類またはそれ以上の遺伝子欠損に起因しう る病状）、後天性病変（すなわち、先天性欠損に起因しない病理学的症状）、癌 および予防過程（すなわち、病気または望ましくない医学的症状の予防）などの 症状を包含する。したがって、本明細書中で用いられる「治療薬」という用語は 、哺乳動物受容体に対して有益な効果を有する任意の薬剤または物質を意味する 。例えば、「治療薬」とは、核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ）および／また はタンパク質成分を有する治療的および予防的分子両方を包含する。 単一遺伝子欠損によって引き起こされる多数の疾患が確認されてきた（レイマ ー，Ｋ．およびフリードマン，Ｔ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：２ １１〜２２５（１９９２）；ミラー，Ａ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５ 〜４６０（１９９２））；ラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ），Ｊ．Ｍ．およびブルク （Ｂｕｒｃｋ），Ｋ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ），ニューヨーク，（１９９１）およびそこに引用された参考文献）。これら の疾患の例および典型的な疾患を治療するための治療薬を表１に与える。 本明細書中で用いられる「後天性病変」とは、異常な生理学的、生化学的、細 胞の、構造的または分子生物学的状態によって現れる疾患または症候群を意味す る。典型的な後天性病変および典型的な病変を治療するための治療薬を表２に与 える。 或いは、遺伝子置換療法を受けやすい症状は、異常な細胞増殖によって現れる 遺伝性疾患または後天性病変であることがあり、例えば、癌は体腔中で発生する かまたはそこに転移する。この実施態様により、本発明は、抗腫瘍活性（すなわ ち、異常に増殖する細胞の発育、成熟または拡散を妨げるまたは阻害する能力） を有する治療薬を、体腔中で発生したまたはそこに転移した腫瘍（例えば、卵巣 癌、中皮腫、結腸癌）に対して供給するのに有用である。これらのおよび他の癌 を治療するための治療薬としては、例えば、表３に与えられた抗腫瘍薬がある。 遺伝的に修飾された中皮細胞による治療薬の供給は、遺伝的に修飾された中皮 細胞が存在している体腔に対する供給に限定されない。体腔の解剖学的位置によ り、体腔中の遺伝的に修飾された中皮細胞によって分泌された治療薬は、その体 腔から排出されるリンパ管網に達しうる。したがって、本発明の遺伝的に修飾さ れた中皮細胞は、抗腫瘍薬などの治療薬を体腔（例えば、腹膜、胸膜、心膜）に 対して、これらの腔から排出されるリンパ管網に対して、および相互連絡したリ ンパ管網によって血管系に対して供給するのに有用である。したがって、遺伝的 に修飾された中皮細胞によって供給された抗腫瘍薬などの治療薬は、体腔中、排 出リンパ管中および遠く離れた転移部位の癌細胞に達すると考えられる。 或いは、遺伝子置換療法を受けやすい症状は予防過程、すなわち、疾患または 望ましくない医学的症状を予防するための過程である。例えば、本発明は、哺乳 動物受容体に対して予防機能（すなわち、予防薬）を有する治療薬を供給するた めの中皮細胞発現系を包含する。このような治療薬（それらが防止する疾患また は望ましくない医学的症状を括弧内に示す）としては、エストロゲン／プロゲス テロン（妊娠）；チロキシン（甲状腺機能低下症）；およびγ−インターフェロ ンなど免疫系応答を刺激するまたは抗体など免疫系応答を補足する薬剤（免疫系 の欠損に関係した疾患）がある。 要約すると、「治療薬」としては、制限されないが、表１〜３に挙げた薬剤並 びにそれらの機能的均等物がある。本明細書中で用いられる「機能的均等物」と は、機能的に均等であると考えられる治療薬として哺乳動物受容体に対して同様 のまたは改良された有益な効果を有する分子（例えば、ペプチドまたはタンパク 質）を意味する。当業者によって理解されるように、機能的に均等なタンパク質 は、組換え技術によって、例えば、「機能的に均等なＤＮＡ」を発現させること によって製造することができる。本明細書中で用いられる「機能的に均等なＤＮ Ａ」とは、治療薬をコードする天然に存在しないＤＮＡを意味する。例えば、表 １〜３に開示された薬剤の全部ではないとしても多数はそのアミノ酸配列が知ら れており、それらは天然に存在する核酸によってコードされている。しかしなが ら、遺伝コードの縮重のために、２種類以上の核酸が同一治療薬をコードするこ とができる。したがって、本発明は、天然に存在するＤＮＡによって、更には天 然に存在するＤＮＡでコードされるのと同様のタンパク質をコードする天然に存 在しないＤＮＡによってコードされた治療薬を包含する。 上記に開示された治療薬および遺伝子置換療法を受けやすい症状は単に例証す るものであり、本発明の範囲を制限するためのものではない。既知の症状を治療 するのに適当な治療薬の選択は、過度の実験を伴うことなく当該技術の範囲内で あると考えられる。中皮細胞中に遺伝物質を導入するための方法 外因性遺伝物質（例えば、１種類またはそれ以上の治療用タンパク質をコード しているｃＤＮＡ）を、生体外または生体内の中皮細胞中にトランスフェクショ ンまたは形質導入などの遺伝子伝達法によって導入して、遺伝的に修飾された中 皮細胞を提供する。種々の発現ベクター（すなわち、標的細胞中への外因性遺伝 物質の供給を促進するためのビヒクル）は当業者に知られている。 本明細書中で用いられる「中皮細胞のトランスフェクション」とは、加えられ たＤＮＡの組込みによる新規の遺伝物質の中皮細胞による獲得を意味する。した がって、トランスフェクションとは、物理的または化学的方法を用いる中皮細胞 中への核酸の挿入を意味する。いくつかのトランスフェクション技術が当業者に 知られており、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈降（分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），第７巻，Ｇｅｎｅ Ｔｒ ａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ，Ｅ．Ｊ． マレー監修，ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）（１９９１）） ；ＤＥＡＥ−デキストラン（上記）；エレクトロポレーション（上記）；陽イオ ンリポソーム媒介トランスフェクション（上記）；およびタングステン粒子に促 進された微粒子衝撃（ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ），Ｓ．Ａ．，Ｎａｔｕ ｒｅ ３４６：７７６〜７７７（１９９０））がある。リン酸ストロンチウムＤ ＮＡ共沈降（ブラシュ（Ｂｒａｓｈ）Ｄ．Ｅ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ ｏｌ． ７：２０３１〜２０３４（１９８７）は、好ましいトランスフェクション 法 である。 対照的に、「中皮細胞の形質導入」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを用い て核酸を細胞中へ伝達する方法を意味する。核酸を細胞中へ伝達するためのＲＮ Ａウイルス（すなわち、レトロウイルス）を、本明細書中において形質導入キメ ラレトロウイルスと称する。レトロウイルス中に含まれた外因性遺伝物質は、形 質導入された中皮細胞のゲノム中に組込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば 、治療薬をコードしているｃＮＤＡを有するアデノウイルス）によって形質導入 された中皮細胞は、組込まれる外因性遺伝物質をそのゲノム中には有していない が、細胞中の染色体外に保持されている外因性遺伝物質を発現することができる 。 本明細書中にそのまま援用されているレデル（Ｒｅｄｄｅｌ）らの１９８９年 １２月５日発行の米国特許第４，８８５，２３８号明細書は、不死化されたヒト 気管支上皮および中皮細胞系を開示している。不死化細胞は、レクナー（Ｌｅｃ ｈｎｅｒ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３ ８８４〜３８８８，１９８５年）によって記載されたように、胸膜滲出液または 腹水からの正常ヒト中皮（ＮＨＭ）細胞を培養した後、培養された細胞にＳＶ４ ０ウイルスまたはアデノウイルス−１２ＳＶ４０キメラウイルスによって形質導 入するかまたは、培養された細胞を、リン酸ストロンチウム共沈降（ブラシュら 、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２０３１〜２０３４（１９８７））に よるラウス肉腫ウイルス長末端反復およびｏｒｉ−ＳＶ４０初期部分を有する組 換え体プラスミドによってトランスフェクトすることにより製造された。レデル らの特許において用いられる「不死化細胞」とは、適当な増殖培地中においてイ ンビトロで培養された場合に老化を伴うことなく絶えず増殖する細胞を意味する 。したがって、レデルらの形質転換された中皮細胞は不死化されていて、しかも 哺乳動物受容体中への直接植込みには不適当である。したがって、レデルらの細 胞は、種々のインビトロ用途に限定される。不死化中皮細胞系は、ヤン・ケ（Ｙ ａｎｇ Ｋｅ）ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １３４：９７９〜９９ １（１９８９）、Ｈ．レデルが共著者であるその参考文献およびラインワルド（ Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ），Ｊ．ら、Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ ｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ，Ｊ．Ｓ．リムおよび Ａ． ドリッチロ（Ｄｒｉｔｓｈｉｌｏ）監修、（１９９１），ザ・ヒューマナ・プレ ス・インコーポレーテッド（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）， トトワ，Ｎ．Ｊ．）にも開示されている。 典型的に、外因性遺伝物質は、異種遺伝子（通常は、治療用タンパク質をコー ドするエクソンを含むｃＤＮＡの形の）を、新規の遺伝子の転写を制御するプロ モーターと一緒に含む。プロモーターは、特徴的に、転写を開始するのに必要な 特定のヌクレオチド配列を有する。場合により、外因性遺伝物質は、所望の遺伝 子転写活性を得るのに必要な追加の配列（すなわち、エンハンサー）を更に含む この論及のために、「エンハンサー」は、単純に、プロモーターによって指令さ れた基礎転写レベルを変化させるようにコーディング配列と隣接して働く任意の 非翻訳ＤＮＡ配列である。好ましくは、外因性遺伝物質を、プロモーターの直ぐ 下流の中皮細胞ゲノム中に導入するので、プロモーターおよびコーディング配列 は、コーディング配列の転写を可能にするように機能的に結合される。好ましい レトロウイルス発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御する外因 性プロモーター要素を有する。このような外因性プロモーターとしては、構成性 および誘導性プロモーターの両方がある。 天然に存在する構成性プロモーターは、不可欠な細胞機能の発現を制御する。 結果として、構成性プロモーター制御下の遺伝子は、細胞増殖の全ての条件下で 発現される。典型的な構成性プロモーターとしては、ある種の構成性または「ハ ウンキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーター、すなわ ち、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ 葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（シャーフマン（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ）ら、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６２６〜４６３０（１ ９９１））、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ） 、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター（ ライ（Ｌａｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１ ０００６〜１００１０（１９８９））および当業者に知られている他の構成性プ ロモーターがある。更に、多数のウイルスプロモーターは、真核生物細胞中にお いて構成的に機能する。これらには、特に、ＳＶ４０の初期および後期プロモー タ ー；モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲＳ ）；並びに単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターその他がある。し たがって、上記で論及された構成性プロモーターのいずれかを用いて異種遺伝子 インサートの転写を制御することができる。 誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導性物質の存在下において僅 かにまたはかなりの程度まで発現される（例えば、メタロチオネインプロモータ ーの制御下の転写は、ある種の金属イオンの存在下で大きく増加する）。誘導性 プロモーターは、それらの誘導性因子が結合した場合に転写を刺激する応答性要 素（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸およ びサイクリックＡＭＰのためのＲＥがある。特定のＲＥを有するプロモーターは 、誘導反応を得るように選択することができ、若干の場合、ＲＥ自体を種々のプ ロモーターに対して結合させることによって組換え遺伝子に対して誘導性を与え ることができる。例えば、適当なプロモーター（構成性対誘導性；強対弱）を選 択することによって、遺伝的に修飾された中皮細胞における治療薬の存在および 発現量の両方を制御することが可能である。治療薬をコードしている遺伝子が誘 導性プロモーターの制御下にある場合、治療薬の現場での供給は、遺伝的に修飾 された細胞を、治療薬の転写を可能にする条件に対して、例えば、該薬剤の転写 を制御する誘導性プロモーターの特異的誘導物質の腹腔内注射によって現場で暴 露することによって引き起こされる。例えば、メタロチオネインプロモーターの 制御下の遺伝子によってコードされた治療薬の遺伝的に修飾された中皮細胞によ る現場発現は、遺伝的に修飾された細胞を適当な（すなわち、誘導性）金属イオ ン含有溶液と現場で接触させることによって促進される。 したがって、現場で供給される治療薬の量は、（１）挿入された遺伝子の転写 を支配するのに用いられるプロモーターの性質（すなわち、プロモーターが構成 性であるかまたは誘導性であるか、強いかまたは弱いか）；（２）中皮細胞中に 挿入される外因性遺伝子のコピー数；（３）患者に対して投与される（例えば、 植込まれる）形質導入された／トランスフェクトされた中皮細胞の数；（４）植 込み体（例えば、移植片またはカプセル封入された発現系）の寸法；（５）植込 み体の数；（６）形質導入された／トランスフェクトされた細胞または植込み体 を放置する時間長さ；および（７）遺伝的に修飾された中皮細胞による治療薬の 生産速度などの因子を制御することによって調節される。治療的有効量の特定の 治療薬の供給のためのこれらの因子の選択および最適化は、上記に開示された因 子および患者の臨床プロフィールを考慮して、過度の実験を伴うことなく当該技 術の範囲内であると考えられる。 少なくとも１種類のプロモーターおよび治療薬をコードしている少なくとも一 つの異種核酸の他に、発現ベクターは、好ましくは、発現ベクターによってトラ ンスフェクトされたまたは形質導入された中皮細胞の選択を容易にするためのネ オマイシン耐性遺伝子などの選択遺伝子を含む。或いは、中皮細胞は、２種類ま たはそれ以上の発現ベクターによってトランスフェクトされ、少なくとも一つの ベクターは１種類または複数の治療薬をコードしている１種類または複数の遺伝 子を含み、他のベクターは選択遺伝子を含む。適当なプロモーター、エンハンサ ー、選択遺伝子および／またはシグナル配列（以下に記載された）の選択は、過 度の実験を伴うことなく当該技術の範囲内であると考えられる。 治療薬は、細胞外、細胞内または膜位置への供給用に的を絞ることができる。 遺伝子産物が中皮細胞から分泌されることが望まれる場合（例えば、治療薬をリ ンパ管および血管系へと供給するために）、発現ベクターは、細胞から細胞外環 境へと治療薬を分泌するのに適当な分泌「シグナル」配列を含むように設計され る。遺伝子産物が中皮細胞中で保持されることが望まれる場合、この分泌シグナ ル配列は省かれる。同様に、発現ベクターは、中皮細胞原形質膜中に治療薬をと どめるための「保持」シグナル配列を含むように構築することができる。例えば 、膜タンパク質は全て、膜中のタンパク質の輸送を停止し且つタンパク質を分泌 させない疎水性トランスメンブラン部分を有する。遺伝子産物を特定の場所に集 中させるためのシグナル配列を含む発現ベクターの構築は、過度の実験を必要と することなく当該技術の範囲内であると考えられる。 下記の考察は、本発明の様々な有用性に関する。例えば、本発明は、細胞内お よび／または細胞外毒素を現場で解毒するのに適当な発現系として有用である。 毒素を解毒することができる治療薬をコードしている遺伝子に対して適当なシグ ナル配列を結合させるかまたは省くことにより、治療薬を細胞外環境に、中皮細 胞原形質膜にまたは細胞内位置に対する供給に集中させることができる。好まし い実施態様において、細胞内解毒性治療薬をコードしている遺伝子を含む外因性 遺伝物質は、細胞中への細胞外毒素の輸送を促進するための表面受容体をコード している配列を更に含み、それらの毒素は治療薬によって細胞内で解毒されるこ とができる。或いは、中皮細胞を遺伝的に修飾して、活性部分が細胞外環境中に 延長するような中皮細胞原形質膜中にとどめられた解毒性治療薬を発現させるこ とができる。膜結合治療薬の活性部分は、細胞外環境中に存在する毒素を解毒す る。上記実施態様は、血中に有毒物質（例えば、β−２ミクログロブリン）を蓄 積する末期腎臓疾患患者の治療において有用でありうる。蓄積された毒素を解毒 するまたは除去するための治療薬を発現する遺伝的に修飾された中皮細胞の植込 みは、これらの毒素に関係した病的状態を減少させることができる。上記実施態 様が当てはまる他の病変およびそれらの対応する１種類または複数の解毒性治療 薬としては、制限されないが、高コレステロール血症（ホスホリパーゼＡ₂また はＬＤＬ受容体）；フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ） ；高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）；シトルリン血症（ アルギノスクシネートシンテターゼ）；および高ビリルビン血症（ビリルビンデ カルボキシラーゼ）（ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ），Ｓ．Ｌ．、コトラン（Ｃｏ ｔｒａｎ），Ｒ．Ｓ．およびクマル（Ｋｕｍａｒ），Ｖ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉ ｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ，第３版，Ｗ．Ｂ．サーンダース・カン パニー（Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．），フィラデルフィア，（１９８４））があ る。 それらのいくつかは細胞内保持に的が絞られている上記治療薬に加えて、本発 明は、細胞外環境中への供給のための薬剤および／または中皮細胞原形質膜中に とどめられるための薬剤を更に包含する。例えば、腹膜壁上に植込まれた多数の 中皮細胞の表面上でのトロンボモジュリンなどの抗血栓症薬の発現は、血餅形成 を妨げることができるし、更にはフィブリンの沈着を妨げることによって外科手 術後の癒着の発生率を低下させることができる。遺伝的に修飾された中皮細胞表 面上での発現に適当な治療薬の他の例としては、制限されないが、ＬＤＬ受容体 ；単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｓｃｕ−ＰＡ）；および組織 型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）がある。 単離された中皮細胞において特定の遺伝子産物を発現させるための特定の発現 ベクターの選択および最適化は、好ましくは、１種類またはそれ以上の適当な制 御部分（例えば、プロモーター、挿入配列）を有する遺伝子を入手し；該遺伝子 が挿入されているベクターを含むベクター構築物を製造し；インビトロで培養さ れた中皮細胞を該ベクター構築物によってトランスフェクトするかまたは形質導 入し；そして培養された細胞中に遺伝子産物が存在するかどうかを決定すること によって達成される。 好ましい実施態様において、中皮細胞遺伝子療法のためのベクターはウイルス 、更に好ましくは、複製能欠損ウイルス（以下に詳細に記載された）である。典 型的なウイルスベクターは、ハービー肉腫ウイルス；ラウス肉腫ウイルス（ＭＰ ＳＶ）；モロニーネズミ白血病ウイルスおよびＤＮＡウイルス（例えば、アデノ ウイルス）に由来する（テミン（Ｔｅｍｉｎ），Ｈ．，「遺伝子伝達のためのレ トロウイルスベクター（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅ ｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ クチャラパティ（ Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ） Ｒ．監修の１４９〜１８７頁，プレナム（Ｐｌｅ ｎｕｍ），（１９８６））。 複製能欠損レトロウイルスは、全ビリオンタンパク質の合成を支配することが できるが、感染性粒子を製造することはできない。したがって、これらの遺伝的 に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、培養された細胞中での遺伝子の高 効率形質導入に一般的に有用であり、本発明の方法において用いるのに特に有用 である。このようなレトロウイルスは、更に、生体内の中皮細胞中への遺伝子の 有効な形質導入に有用である。レトロウイルスは、遺伝物質を細胞中に伝達する のに広く用いられてきた。複製能欠損レトロウイルスを製造するための標準的な プロトコル（外因性遺伝物質のプラスミド中への取込み、パッケージング細胞系 のプラスミドによるトランスフェクション、パッケージング細胞系による組換え レトロウイルスの製造、組織培養培地からのウイルス粒子の採取および標的細胞 のウイルス粒子による感染の工程を含む）は、クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ ），Ｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｗ．Ｈ．フリーマン・カンパニー（Ｆｒｅ ｅ ｍａｎ Ｃｏ．），ニューヨーク，（１９９０）およびマレイ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，７巻，ヒューマナ ・プレス・インコーポレーテッド，クリフトン，Ｎ．Ｊ．，（１９９１）に与え られている。 遺伝子療法のためにレトロウイルスを用いる主な利点は、該ウイルスが、治療 薬をコードしている遺伝子を宿主細胞ゲノム中に挿入し、それによって、細胞が 分裂した場合に外因性遺伝物質を細胞の子孫に伝えることができることである。 更に、ＬＴＲ部分の遺伝子プロモーター配列は、種々の細胞種において挿入され たコーディング配列の発現を促進すると報告された（例えば、ヒルバーグ（Ｈｉ ｌｂｅｒｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５２ ３２〜５２３６（１９８７）；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８６６２〜８６６６（１９８７）；バ レリオ（Ｖａｌｅｒｉｏ）ら、Ｇｅｎｅ ８４：４１９〜４２７（１９８９）を 参照されたい）。レトロウイルス発現ベクターを用いる主な欠点は、（１）挿入 突然変異誘発、すなわち、例えば非調節的細胞増殖をもたらすような標的細胞ゲ ノム中の望ましくない位置への治療的遺伝子の挿入および（２）ベクターによっ て運ばれる治療的遺伝子を標的ゲノム中へ組込むための標的細胞増殖に対する要 求である（ミラー，Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９ 〜４２４２（１９９０））。標的細胞の増殖はインビトロで容易に達成されるが 、多くの潜在的な標的細胞の生体内増殖は極めて少ない。 これらの明らかな限界にもかかわらず、複製能欠損レトロウイルスベクターを 用いて治療的有効量の治療薬を供給する生体内遺伝子療法は、形質導入の効率が 高いおよび／または形質導入に利用可能な標的細胞の数が多い場合に有効であり うる。中皮細胞の生体内増殖を刺激する方法は報告されており（アロンソン（Ａ ｒｏｎｓｏｎ），Ｊ．Ｆ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：５２９〜５３６（ １９７６））、生体内の標的中皮細胞数を増加させるように適合させることがで きる。したがって、生体内遺伝子療法に利用可能な潜在的に多数の中皮細胞（例 えば、細胞約１〜３Ｘ１０⁵個／ｃｍ²の観察された密集細胞培養密度および約１ ｍ²の腹膜表面積に基づいて、成人では細胞約１〜４Ｘ１０⁹個（エスパ ランカ（Ｅｓｐａｒａｎｃａ），Ｍ．Ｊ．およびコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）， Ｄ．Ｌ．，Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．１：１６２〜１６９（１９６６）；ルビン（ Ｒｕｂｉｎ），Ｂ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９５：４５３〜４５ ８（１９８８））並びに体外で形質転換された中皮細胞の植込みに利用可能な大 型面積（例えば、成人においては約１ｍ²（エスパランカ，Ｍ．Ｊ．およびコリ ンズ，Ｄ．Ｌ．，Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．１：１６２〜１６９（１９６６）；ル ビン，Ｂ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９５：４５３〜４５８（１９ ８８））は、ヒト遺伝子療法のための標的細胞として中皮細胞を用いる実質的な 利点である。 中皮細胞の形質転換のための発現ベクターとして有用な更にもう一つのウイル ス候補は、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスである。アデノウイルス は、しばしばヒトの気道感染の原因であり、したがって、気道の上皮に親和性で あると考えられる（ストラウス（Ｓｔｒａｕｓ），Ｓ．，Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖ ｉｒｕｓ Ｈ．Ｓ．ギンズバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）監修，プレナム・プレス ，ニューヨーク，４５１〜４９６頁（１９８４））。更に、アデノウイルスは、 筋細胞および内皮細胞などを含む広範囲の細胞種に感染性である（ラリック（Ｌ ａｒｒｉｃｋ），Ｊ．Ｗ．およびブルック（Ｂｒｕｃｋ），Ｋ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ ，エルセビア・サイエンス・パブリッシング・カンパニー・インコー ポレーテッド（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ ｏ．，Ｉｎｃ．），ニューヨーク，７１〜１０４頁（１９９１））。アデノウイ ルスは、更に、生体内の筋細胞における発現ベクターとして用いられてきた（ク ァンティン，Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９： ２５８１〜２５８４（１９９２））。 レトロウイルスと同様、アデノウイルスゲノムは、遺伝子療法のための発現ベ クターとして、すなわち、ウイルス自体の生産を制御する遺伝情報を除去するこ とによって用いるのに適応しうる（ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）， Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４（１９９１））。アデノ ウイルスは染色体外様式で機能するので、組換え体アデノウイルスは、挿入突然 変異誘発について理論上問題がない。しかしながら、アデノウイルスは染色体外 様式で機能するので、標的中皮細胞のアテノウイルス形質転換は、安定な形質導 入をもたらさないことがありうる。 例えば、当業者に明らかであるように、種々の適当なウイルス発現ベクターが 、外因性遺伝子物質を中皮細胞中に伝達するのに利用可能である。遺伝子置換療 法をうけやすい特定の症状のために治療薬を発現させる適当な発現ベクターの選 択および選択された発現ベクターを細胞中に挿入するための条件の最適化は、過 度の実験を必要とすることなく当該技術の範囲内である。 別の実施態様において、発現ベクターはプラスミドの形であり、種々の方法の 内の一つ、すなわち、物理的に（例えば、マイクロインジェクション（カペッチ （Ｃａｐｅｃｃｈｉ），Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ ２２：４７９〜４８８（１９８０ ））、エレクトロポレーション（アンドレアソン（Ａｎｄｒｅａｓｏｎ），Ｇ． Ｌ．およびエバンス（Ｅｖａｎｓ），Ｇ．Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６５０〜６６０（１９８８））、スクレイプローディング、微粒子衝撃（ジ ョンストン，Ｓ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：７７６〜７７７（１９９０）） または化学的複合体（例えば、カルシウムまたはストロンチウム共沈降、脂質と の複合体形成、リガンドとの複合体形成）としての細胞内取込み（分子生物学の 方法，第７巻，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ，Ｅ．Ｊ．マレー監修，ヒューマナ・プレス（１９９１）） によって標的中皮細胞中に伝達される。いくつかの市販製品は陽イオンリポソー ム複合 （Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ，ゲイサーズバーグ，ＭＤ）（フェルグナー（Ｆｅｌｇ ｎｅｒ），Ｐ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ：７４１３〜７４１７（１９８７））およびトランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆ ｅ ｅｈｒ），Ｊ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６ ：６９８２〜６９８６（１９８９）；レフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ），Ｊ．Ｐ． ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５４：１８１２〜１８１５（１９９０））がある 。しかしながら、これらの方法によるトランスフェクションの効率は、標的細胞 の性 質に大きく依存し、したがって、上述の手順を用いる中皮細胞中への核酸の最適 トランスフェクションの条件を最適にすべきである。このような最適化は、過度 の実験を必要とすることなく当該技術の範囲内である。 本発明は、更に、上記の遺伝的に修飾された中皮細胞を製造し且つ用いるため の種々の方法を提供する。特に、本発明は、哺乳動物受容体の１個または複数の 中皮細胞を生体外で遺伝的に修飾し且つ遺伝的に修飾された中皮細胞を該哺乳動 物受容体に対して投与する方法を提供する。生体外遺伝子療法の好ましい実施態 様において、中皮細胞は自己細胞、すなわち、哺乳動物受容体から単離された細 胞である。本明細書中において用いられる「単離された」という用語は、天然に 存在する生体内部分から取出された１個または複数の細胞を意味する。患者から 中皮細胞を取出す方法並びに単離された中皮細胞を培養中で維持する方法は当業 者に知られている（スティリアノウ（Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ），Ｅ．ら、Ｋｉｄｎ ｅｙ Ｉｎｔｌ． ３７：１５６３〜１５７０（１９９２）；ヒェレ（Ｈｊｅｌｌ ｅ），Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｉｎｔｌ．９： ３４１〜３４７（１９８９）；ヘルディン（Ｈｅｌｄｉｎ），Ｐ．，Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．Ｊ． ２８３：１６５〜１７０（１９９２）；ディ・パオロ，Ｎ．ら、Ｉｎ ｔ．Ｊ．Ａｒｔ．Ｏｒｇ． １２：４８５〜５０１（１９８９）；ディ・パオロ， Ｎ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｐｈｒｏｌ．３４：１７９〜１８４８（１９９ ０）；ディ・パオロ，Ｎ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｎ ５７：３２３〜３３１（１９９ １））。 本発明は、更に、哺乳動物受容体の中皮細胞を生体内で遺伝的に修飾する方法 を提供する。一つの実施態様により、該方法は、異種遺伝子産物を発現させるた めの発現ベクターを哺乳動物受容体の中皮細胞中に、例えば、該受容体の体腔中 に該ベクターを注射することによって現場で導入することを含む。好ましい実施 態様において、該方法は、標的の発現ベクター、すなわち、標的中皮細胞によっ て特異的に認識される分子をそこに結合したベクターを導入することを含む。こ のような標的集中は、例えば、ウイルスを特異的に認識し且つそれと結合するウ イルス受容体を表面上に有する中皮細胞に集中するためのウイルスベクターを用 いることによってベクターに与えられる。 好ましい実施態様において、遺伝的に修飾された中皮細胞標品は、治療的有効 量の治療薬を受容体に対して現場で供給するのに十分な量の細胞を含む。既知の 症状のための特定の治療薬の治療的有効量の決定は、過度の実験を必要とするこ となく当該技術の範囲内である。したがって、有効量を決定する場合、当業者は 患者の症状、症状の苛酷さ、更には投与される特定の治療薬の臨床研究の結果を 考慮すると考えられる。 遺伝的に修飾された中皮細胞が薬学的に許容しうる担体中にまだ存在していな い場合、それらを受容体に対して投与する前にこのような担体中に入れる。この ような薬学的に許容しうる担体としては、例えば、等張食塩水並びに患者および 治療に適当な他の緩衝液がある。 遺伝的に修飾された細胞は、例えば、腹腔内注射によって、或いは細胞または 細胞含有移植片若しくはカプセルを受容体の中皮細胞適合部位に植込むことによ って投与される。本明細書中で用いられる「中皮細胞適合部位」とは、１個若し くは複数の遺伝的に修飾された細胞、中皮細胞移植片またはカプセル封入された 中皮細胞発現系を、不利益な生理学的結果を引き起こすことなく植込むことがで きる受容体の組織、腔または体液を意味する。典型的な中皮細胞適合部位として は、例えば、腹膜腔、胸膜腔および心膜腔がある。好ましくは、中皮細胞適合部 位はリンパ系と連絡し、それによって治療薬を血管系に供給することができる。 好ましい実施態様において、細胞を植込む前に中皮細胞適合部位を裸出させる 。典型的な裸出法としては、制限されないが、（１）腹膜腔中に２０分間蒸留水 を注射後に中皮層の一部分を掻落とすこと；（２）０．１％緩衝トリプシンを２ ０分間注射後に掻取ること；（３）中皮細胞を細胞スクレーパーで静かに掻取る ことによる除去；および（４）中皮細胞にゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）（ア ップジョン（Ｕｐｊｏｈｎ），カラマズー，ＭＩ）片を接触させることがある。 好ましい裸出法は実施例で開示する。 遺伝的に修飾された中皮細胞は、中皮細胞適合部位に単独でまたは他の遺伝的 に修飾された中皮細胞と一緒に植込まれる。したがって、本発明は、遺伝的に修 飾された中皮細胞の混合物を用いることによって、第一修飾細胞が第一治療薬を 発現し且つ第二修飾細胞が第二治療薬を発現するように受容体の中皮系を修飾す る方法を包含する。他の遺伝的に修飾された細胞種（例えば、肝細胞、平滑筋細 胞、繊維芽細胞、グリア細胞、内皮細胞またはケラチノサイト）を遺伝的に変更 された中皮細胞と一緒に加えて、導入された遺伝子の複合体セットを発現させる ことができる。更に、２種類以上の組換え遺伝子を、同じかまたは異なるベクタ ー用いて遺伝的に修飾された各細胞中に導入し、それによって多数の治療薬を単 一の細胞で発現させることができる。 本発明は、更に、中皮細胞移植片を包含する。該移植片は、哺乳動物受容体中 への植込みに適当な支持体に対して結合した多数の上記遺伝的に修飾された細胞 を含む。該支持体は、天然または合成物質から生成することができる。もう一つ の実施態様において、該移植片は腹膜パッチを含む。この実施態様では、該支持 体は、多数の遺伝的に修飾された細胞を一緒に支持している天然に存在するマト リックスである。或いは、該移植片は、天然に存在するマトリックスの代替物（ 例えば、ゲルフォーム（Ｇｅｌｆｏａｍ）（アップジョン、カラマズー、ＭＩ） した多数の上記細胞である。 本発明のもう一つの態様により、カプセル封入された中皮細胞発現系を提供す る。該カプセル封入された系は、哺乳動物受容体中への植込みに適したカプセル およびその中に含まれた多数の上記遺伝的に修飾された中皮細胞を含む。該カプ セルは、合成または天然に存在する物質から生成することができる。このような カプセルの処方は当業者に知られている。哺乳動物受容体中に直接的に植込まれ る（すなわち、遺伝的に修飾された細胞が中皮細胞適合部位と直接物理的に接触 しているように植込まれる）中皮細胞とは対照的に、カプセル封入された細胞は 、植込まれた後も単離された状態のままである（すなわち、該部位と直接物理的 に接触していない）。したがって、カプセル封入された中皮系は、遺伝的に修飾 された非不死化中皮細胞を含むカプセルに制限されず、遺伝的に修飾された不死 化中皮細胞を含むことができる。 実施例の序論 前記のように、本発明は、哺乳動物受容体において異種遺伝子産物（例えば、 治療薬）を発現させるための中皮細胞発現系を生成する方法、それによって製造 された発現系およびそれを含む薬剤組成物を提供する。以下の実施例は、ラット モデル系における中皮細胞遺伝子療法の実現可能性（実施例、項目Ａ）；ラット モデル系における形質導入された且つトランスフェクトされた遺伝子の安定な発 現（実施例、項目Ｂ）；ヒト中皮細胞のインビトロでのトランスフェクションお よび異種移植片としての遺伝的に修飾されたヒト中皮細胞のヌードラット中への 再植込みを実証する予備的結果（実施例、項目Ｃ）；並びに遺伝子療法のための ヒト中皮細胞の使用に関する予想例（実施例、項目Ｄ）の実証に関する。 簡単にいうと、実施例は、ラット中皮細胞が腹膜から容易に単離され且つイン ビトロで多数の細胞数まで増殖することができることを実証する。培養されたラ ット腹膜中皮細胞を、レトロウイルスベクターを用いてマーカー遺伝子（β−ガ ラクトシダーゼ）によってインビトロで形質導入させるかまたはリン酸ストロン チウム共沈降およびプラスミドｐＳＶＴＫｇｈ（ｈｇｈ）を用いてインビトロで トランスフェクトさせて、そして得られた形質導入されたまたはトランスフェク トされた中皮細胞を細胞培養中で増殖させ且つ同系ラット受容体中に再植込みし た。再植込みされた形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞は、生体 内でβ−ガラクトシダーゼまたはｈｇｈを発現し続けた。更に、実施例は、初代 ヒト中皮細胞を単離し、インビトロで増殖させ、ヒト成長ホルモンの遺伝子によ ってトランスフェクトさせ、そしてヌードラット受容体中に植込むことができる ということを実証する。 実施例において、特に断らない限り、制限酵素消化物、連結反応、形質転換お よび他の定法は、マニアティスらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ に記載のように実施される。本出願中 で開示された参考文献、特許および特許刊行物は、本明細書中にそのまま援用さ れる。 実施例 項目Ａ ラットモデル系における中皮細胞遺伝子療法の実現可能性。 １． ラット中皮細胞系のＢＡＧベクターによる形質導入。 ａ．ラット中皮細胞系の安定な形質導入。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ遺伝子は、その生産物 であるβ−ガラクトシダーゼが、細胞の細胞質を青色に染色する組織化学検定の 使用によって容易に現場で検出することができるので、好都合なリポーター遺伝 子として用いられてきた（セーンズ（Ｓｅｎｅｓ），Ｊ．Ｒ．ら、Ｅｍｂｏ．Ｊ ． ５：３１３３〜３１４２（１９８６））。ラット胸膜中皮細胞系４／４ＲＭ． ４を、（β−ガラクトシダーゼおよびネオマイシン耐性の遺伝子を有する）ＢＡ Ｇウイルスによって形質導入させた（プライス（Ｐｒｉｃｅ），Ｊ．ら、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：１５６〜１６０（１９８７） 。これは、ｐｓｉ−２ ＢＡＧ細胞の生産性培養物からのならし培地からのウイ ルスの遠心分離濃縮、および僅かに密集した４／４ＲＭ．４細胞をポリブレン（ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）中のウイルスの混合物に感染させることによって達成され た（セプコ，Ｃ．，レトロウイルスベクターによる神経細胞の系列分析および不 死化（Ｌｉｎｅａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｖ ｅｃｔｏｒｓ），Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ，１６巻：分子神経生物学技術（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ） ，ボールトン（Ｂｏｕｌｔｏｎ），Ａ．、ベーカー（Ｂａｋｅｒ），Ｇ．Ｂ．お よびカンパニョニ（Ｃａｍｐａｇｎｏｎｉ），Ａ．Ｔ．監修，ヒューマナ・プレ ス，クリフトン，Ｎ．Ｊ．（１９８９）の１７７〜２１９頁）。細胞を、ネオマ イシン類似体であるＧ４１８（「Ｇ４１８−硫酸塩」、ギブコ−ＢＲＬジェネテ ィシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））中で選択して、３種類の亜系、ＭＢ１、ＭＢ２ 、ＭＢ３を生じた。これらの亜系それぞれのβ−ガラクトシダーゼ活性を、β− ガラクトシダーゼ基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクト シド（Ｘ−ｇａｌ）とのインキュベーションによって分析した（セプコ，Ｃ．， 上記）。それぞれの亜系の細胞の５０〜７０％が、ＭＢ３＞ＭＢ２＞ＭＢ１で正 の染色（青色）を示した。 ＭＢ３を、クローニングリング法を用いて、８種類のコロニーを採取し且つそ れぞれのコロニーのβ−ガラクトシダーゼ活性をスクリーニングすることによっ てサブクローン化した。３種類のサブクローンＭＢ３．１、ＭＢ３．２およびＭ Ｂ３．３を選んで増殖させた。サブクローンＭＢ３．１、ＭＢ３．２およびＭＢ ３．３の更に別の試験は、各サブクローンの＞９５％の細胞がβ−ガラクトシダ ーゼ活性を実証し（ＭＢ３．１＞ＭＢ３．２＞ＭＢ３．３）；そして少ない百分 率（３〜５％）の細胞だけが全く正の染色を示さなかったことを示した。青色の 生産はβ−ガラクトシダーゼ活性の存在を実証した。サブクローンＭＢ３．２お よびＭＢ３．３を凍結させ且つサブクローンＭＢ３．１を大規模培養で増殖させ た。これらのＭＢ３．１細胞を最初の再植込み実験で用いた。 ２． 形質導入されたラット中皮細胞系の生体内での再植込み（実施例表１） ａ．形質導入された遺伝子発現の時間経過。 ＭＢ３．１細胞を、最初の実験において同系フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラ ット中への形質導入された中皮細胞の再植込みで用いた。実験は３種類からなっ た。（１）６匹の被験動物の腹腔内にＭＢ３．１（細胞１ｘ１０⁷個）を与えた 。これらの被験動物を再植込み後の２日目、５日目、７日目、１０日目、１４日 目、１８日目に屠殺し、そしてそれぞれの時点での腹膜にＸ−ｇａｌ染色を施し て、ＭＢ３．１細胞がそのままの腹膜表面上に植込まれることができたかどうか を確認した；（２）６匹の被験動物を外科的に処置して、腹壁を正中線に沿って 開腹した。２ｃｍ²四角片のゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）（アップジョン、 カラマズー、ＭＩ）を中皮に接触させることによって腹膜表面を損傷させ、それ によって中皮細胞部分を取出した（リース（Ｒｉｅｓｅ），Ｋ．Ｈ．ら、Ｐａｔ ｈ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ． １６２：３２７〜３３６（１９７８））。次に、腹膜 壁を縫合して閉じ、そして被験動物の腹腔内にＭＢ３．１（細胞１ｘ１０⁷個） を注射した。これらの被験動物を、ＭＢ３．１再植込み後の２日目、５日目、７ 日目、１０日目、１４日目および１８日目に屠殺し、そしてそれぞれの被験動物 の腹膜にＸ−ｇａｌ染色を施して、ＭＢ３．１細胞が裸出された腹膜表面上に優 先的に植込まれるかどうかを確認した；および（３）６匹の被験動物を上記のよ うに外科的に処置した（ゲルフィルムによって損傷させた）が、ＭＢ３．１細胞 を与えないで、むしろそれらにＨＢＳＳのみを注射した。これらの被験動物を、 前記に挙げた時点で屠殺し、そしてＸ−ｇａｌ染色を行なって、損傷された中皮 がＭＢ３．１細胞不存在下で治癒するのを監視した。次に、第二系列の被験動物 をゲルフィルムによって損傷させた後、腹腔内にＭＢ３．１（細胞１ｘ１０⁷個 ）を与 えた。これらの被験動物を再植込み後の２１日目、２８日目、３５日目、４２日 目、４９日目、６０日目に屠殺し、そしてそれぞれのラットの腹膜にＸ−ｇａｌ 染色を施して、リポーター遺伝子の発現について分析した。 切取られた腹膜壁を０．５％グルタルアルデヒド中で１５分間固定し、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂含有ＰＢＳ中で濯ぎ洗浄し、そしてＸ−ｇａｌによって３時間染色 した。正のβ−ガラクトシダーゼ染色（青色）によって判定されるように、中皮 細胞は、ゲルフィルムで損傷された部分の表面上におよび正中線切り傷に沿って 再植込みされたが、正常な（裸出されていない）腹膜表面上には再植込みされな かった。正のβ−ガラクトシダーゼ染色（青色）を示す腹膜壁の一部分を脱水し 且つパラフィン中に埋封した。４ミクロン切片を切断し、固定し、そしてヘマト キシリン・アンド・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するかまたはＨ＆Ｅ染色をするこ となく固定した。腹膜表面に結合した形質導入された中皮細胞は、碧青色単層に 見えた。内因性β−ガラクトシダーゼ活性を発現するマクロファージは、中皮表 面下の斑点のある淡青色に染色されている細胞に見えた。この系列の再植込み実 験の結果を更に、実施例表１に要約する。総合すると、これらの結果は、形質導 入された中皮細胞が裸出された腹膜表面上に優先的に再植込みされたことおよび リポーター遺伝子の発現を少なくとも２か月間検出することができたことを示す 。 ゲルフィルムで損傷された被験動物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の発現 は、約３週間強く陽性であった後、植込み後２８〜３６日目の期間中に可変的で あった。これらの結果は、いくつかの可能性、すなわち、（１）ＭＢ３．１中皮 細胞の再植込みの欠如、（２）植込まれたＭＢ３．１中皮細胞の拒絶または（３ ）ＭＢ３．１中皮細胞の成功した再植込み後の、再植込みされた中皮細胞におけ るβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の抑制のためであると考えられる。これらの 可能性を更に研究した。 ｂ．ＭＢ３．１細胞のトリプシン化後の種々の時間。 中皮裸出の程度を監視するために、更に別の３種類の損傷、（１）腹膜腔中に 蒸留水を２０分間注射後に中皮層の一部分を掻き落とすこと、（２）０．２％緩 衝トリプシンを２０分間注射後に掻取ること、および（３）細胞スクレーパーで 静かに掻取ることによる中皮細胞の除去について研究した。被験動物を手術後３ 日目に屠殺し、そして腹膜壁を取出し且つＸ−ｇａｌで染色した。トリプシンで 処理された被験動物のみがいくらかの青色部分を示し、これらの部分の表面積は 小さかった。この実験を繰り返した場合、トリプシン処理動物および蒸留水処理 動物が大きい青色部分を示した（すなわち、β−ガラクトシダーゼについて正に 染色された）。この矛盾する結果は、細胞が、それぞれの実験での注射前と同じ 状態にないことを我々に示唆した。 上記の実験において、ＭＢ３．１細胞を、トリプシン化および組織培養からの 取出し後であるが外科手術後の被験動物への注射前に氷上で維持した時間数は管 理されなかったが、２０分間〜１ １／２時間であったかもしれない。以下に記 載の引き続きの実験においては、外科手術と被験動物中へのＭＢ３．１細胞の注 射との間の経過時間数を管理した。合理的且つ好都合な時間として３０分間を選 択した。 蒸留水および掻取り処置は２匹の被験動物で実施され、そして再植込み効率は 、新たに調製され且つ外科手術終了の３０分後に裸出腹膜中に注射された細胞と 、トリブシン化され、洗浄され、そして外科手術の３０分後の受容体ラットに再 植込みされる前に３ １／２時間氷上で維持された細胞とについて比較された。 それぞれの被験動物を外科手術後１日目に屠殺し、その腹膜壁を取出し且つＸ− ｇａｌで染色した。結果は、新たに単離された中皮細胞を注射された被験動物の みが正のＸ−ｇａｌ染色を示したという点で極めて驚くべきことであった。これ らの結果は、氷上においてＨＢＳＳ中で長時間維持されているＭＢ３．１細胞が 、裸出腹膜表面上に再植込みされるそれらの能力を失っていることを実証してい るが、その正確な理由はまだ分かっていない。したがって、最も好ましい再植込 み方法は、中皮細胞をトリプシン化した直後に腹膜腔中に再植込みすることを必 要とする。 ｃ．用量反応。 ４匹の被験動物を外科的に処置して、正中線に沿って腹壁を開いた。中皮に２ ｃｍ²のゲルフィルム四角片を接触させることによって腹膜表面を損傷させ、そ れによって中皮細胞の小部分を取出した。腹膜壁を縫合して閉じ、そして被験動 物の腹腔内にＭＢ３．１（細胞１ｘ１０⁷個、１ｘ１０⁶個、１ｘ１０⁵個または １ｘ１０⁴個）を注射した。これらの被験動物を３日後に屠殺し、そして腹膜壁 にＸ−ｇａｌ染色を施して、損傷された腹膜表面上の植込みに必要なＭＢ３．１ 細胞数を決定した。正のＸ−ｇａｌ染色は、ＭＢ３．１細胞１ｘ１０⁷個および １ｘ１０⁶個を与えられた被験動物において観察されたが、それより低い用量の ＭＢ３．１細胞を与えられた被験動物では観察されなかった。したがって、引き 続きの再植込み実験においてはいずれも、５ｘ１０⁶個の細胞を注射用量として 用いた。第Ｂ部 ラットモデル系における形質導入化細胞およびトランスフェクト化細胞 の安定な発現 。 １． ラット初代腹膜中皮細胞の単離（図１） ａ． ラット初代中皮細胞の単離。 プラスチック製チャンバー装置をこれ までに報告されている方法（Ｈｊｅｌｌｅ，Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｒｉ ｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ． ９：３４１−３４７（１９８９））に基づいて組み立 てて、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラットの壁側腹膜壁から中皮細胞をエック スビボで単離した。初代中皮細胞は、切除した壁側腹膜壁から酵素処理を用いて 取り出した。数種の異なる酵素処理（２．５％トリプシン、０．０５％コラーゲ ナーゼ、２．５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％トリプシン−０ ．０２％ＥＤＴＡ）を５分から９０分まで変化させるインキュベーション期間に おいて比較した。２．５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡでの６０分間の酵素 消化を行い、その後に細胞用スクレーパーで腹膜壁表面を緩和に掻爬したところ 表現型の点では純粋な細胞集団が得られ、これらの細胞集団は１２〜２４時間以 内にプラスチック製組織培養ディッシュに付着した。ラット初代腹膜中皮細胞は 立方体様であり、接触阻害を示し、かつ集密時には特徴的な玉石状の外観を呈し た。核および核小体が可視できた。 ｂ． ラット初代中皮細胞のインビトロ培養。 ラット腹膜中皮細胞の増殖 についての様々な増殖培地の効果を比較した。１０％の子ウシ血清もしくは１５ ％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）のいずれかを補足してあるＤＭＥ／Ｆ１２がラット 初代中皮細胞にとって最良の増殖培地であるように思われた。ラット初代中皮細 胞の増殖曲線を図１に示す。１×１０⁵の細胞を、Ｔ２５フラスコ内の１５％の ＦＣＳが補足してあるＤＭＥ／Ｆ１２中に撒種した。トリプシン処理およびその 後の細胞計数により細胞数を毎日測定した。組織培養用プラスチック製ディッシ ュ上で培養したラット初代中皮細胞は１×１０⁵細胞／ｃｍ²の飽和密度に達し、 その際の倍加時間は約２４時間であった（図１）。 ２． ラット初代中皮細胞の特徴決定（実施例 表２） ａ． 初代中皮細胞およびＭＢ３．１細胞の免疫組織化学的染色。 中皮細 胞を明瞭に同定するマーカーは存在しない（Ｃｈｕｎｇ−Ｗｅｌｃｈ，Ｎ．、ｅ ｔ ａｌ．、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４２：４４−５３（１９８９） ）。従って単離した中皮細胞を、これまでに記載されている要領でフルオレセイ ン結合化二重抗体技術を用いる一連の抗体での免疫組織化学的染色に供した（Ｈ ｊｅｌｌｅ，Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ． ９： ３４１−３４７（１９８９））。ラット初代中皮細胞である４／４ＲＭ．４細胞 およびＭＢ３．１細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、 から入手したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣＳ）と比較した。結果を実施例 表２にまとめてある。全ての中皮細胞はサイトケラチン７、８、１８、および１ ９、ならびにビメンチンについて陽性であり、かつ特異的内皮細胞抗原について は陰性であった。これらの結果は、中皮細胞についてこれまでに公表されている 免疫組織化学的結果と一致し（Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ，Ｅ．、ｅｔ ａｌ．、Ｋｉ ｄ．Ｉｎｔ． ３７：１５６３−１５７０（１９９０）、Ｈｊｅｌｌｅ，Ｊ．Ｔ ．、ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ． ９：３４１−３４７（１ ９８９）、およびＷｕ，Ｙ．Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ３１：６９３−７ ０３（１９８２））、かつＨＵＶＥＣについて観察されるものとは異なる（Ｃｈ ｕｎｇ−Ｗｅｌｃｈ，Ｎ．、ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４２：４４−５３（１９８９））初代中皮細胞についての染色パターンを示す。 ｂ． マトリックスの合成。 プレート培養した後に、毎週培地交換しなが ら、初代中皮細胞を期間を延長して（２週間〜１カ月）増殖させた。細胞は依然 として接触阻害を示したが、細胞外マトリックスの産生および分泌を開始したこ とが観察された（実施例 表２）。数々の既知の細胞外マトリックス蛋白質に対 する抗体での免疫蛍光染色によりマトリックスを分析したところ、マトリックス の主要構成成分はフィブロネクチンおよびラミニンであることが示され、これは 中皮細胞による細胞外マトリックス産生のこれまでに公表されている報告と一致 する（Ｍａｃｋａｙ，Ａ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ９５ ：９７−１０７（１９９０）、およびＲｅｎｎａｒｄ，Ｓ．Ｉ．、ｅｔ ａｌ． 、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ． １３０：２６７−２７４（１９８４ ））。 ｃ． ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬの取り込み。 ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ（親油性蛍光 染料）の取り込みを初代中皮細胞において分析し、そしてヒト臍帯静脈内皮細胞 （ＨＵＶＥＣ）における取り込みと比較した。ＨＵＶＥＣは強い陽性を示し、こ のことはｄｉｌ−ＡｃＬＤＬの広範囲にわたる取り込みを表す一方で、初代中皮 細胞は非常に弱い陽性を示し、このことは親油性蛍光染料の微弱から中程度のみ の取り込みを表す。この結果は単離された細胞が中皮細胞であることの更に別の 証拠を提供する。 ３． インビトロでのラット初代中皮細胞の形質導入。 ａ． 安定に形質導入された初代中皮細胞の産生。 ラット初代中皮細胞を 以下の要領でＢＡＧベクターで形質導入した。ｐｓｉ−２ ＢＡＧ細胞からのな らし培地（コンディションド・メディウム）を遠心して細胞を除去し、そしてそ の後に０．４５ミクロンのフィルターに通して濾過した。このウイルス含有性培 地を集密状態に達するよりやや前のラット初代中皮細胞に添加した。このならし 培地を１週間の期間にわたり３回取り替えた。その後に細胞を、Ｇ４１８を含む 培地中でのインキュベーションによる選択に供した。約１カ月後にはほとんどの 初代細胞はＧ４１８選択培地中で死滅したが、幾つかのコロニーが出現した。２ ０のコロニーを二組の２４ウエルプレートに移し、そして集密状態に達した時に β−ガラクトシダーゼ活性についてテストした。３つのクローン（＃１、１４、 および１５）を選択および増幅し、そしてＸ−ｇａｌ染色過程を繰り返した。ク ローン１４はβ−ガラクトシダーゼ活性について最も強く染まり、そしてそのた めこれを再体内移植調査用に増幅した。クローン１４細胞の内の９５％を上回る ものが青色に染まった（すなわちβ−ガラクトシダーゼについて陽性であった） 。 ４． インビボで形質導入されたラット初代中皮細胞の再体内移植（実施例 表３） ａ． 時間経過および他の創傷形成方法。 形質導入したラット初代腹膜中 皮細胞（クローン１４）を以下に記載する体内移植調査に用いた。これらの調査 は既述のＭＢ３．１形質導入化ラット中皮細胞株実験と平行して行った。 蒸留水により湿らせ、その後に細胞用スクレーパーで掻爬することにより創傷 形成を施した腹膜表面の初代中皮細胞の取り込みおよび接着を、ゲルフィルム（ Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成（既述）により誘導される腹膜壁損傷後の中皮細胞接 着と比較した。この結果は、形質導入させたラット初代中皮細胞はいずれの方法 を用いても予め表皮剥脱（裸出処理）を施してある腹膜表面に接着することが可 能であることを示す（実施例 表３）。 ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成を施されたレシピエントにおけるＢ ＡＧベクターで形質導入させたラット初代中皮細胞の自己体内移植についての時 間経過研究を以下の要領で実施した。壁側腹膜壁を覆う中皮の一部分をゲルフィ ルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成法により摘除し、そしてＢＡＧベクター（クロ ーン１４）で形質導入した５×１０⁶のラット初代中皮細胞を外科手術直後に腹 膜内注入した。動物を１〜６６日後に屠殺し、そしてその腹膜壁を切開した。組 織は１５分間、０．５％のグルタールアルデヒド内で固定し、２ｍＭのＭｇＣｌ₂ を含むＰＢＳ中ですすぎ、そしてＸ−ｇａｌで３時間染色した。再体内移植後 の様々な時間に屠殺したラットからの染色化腹膜壁の全標本の写真を再体内移植 後４、１４、および２１日目に撮影した。陽性β−ガラクトシダーゼ染色（青色 ）から判定したところ、中皮細胞はゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成表 面上および正中線切開に沿って再体内移植されたが、正常な（表皮剥脱（裸出処 理）を行っていない）腹膜表面には再体内移植されなかった。再体内移植された 形質導入化中皮細胞は少なくとも２１日間はβ−ガラクトシダーゼ形質導入遺伝 子を発現し続けた。 ５． Ｄｉｏ−ラベル化ラット初代腹膜中皮細胞（クローン１４）を用いる分 析 。 実施例 表３に示される結果は、体内移植した細胞中のβ−ガラクトシダーゼ の生体内（インビボ）発現は最初（１〜１４日目）は非常に高く、減少し（１４ 〜２８日目）、中程度に観察され（２８〜６６日目）、そして最終的には検出さ れなくなることを示す。それとは対照的に、培養物中のクローン１４細胞は比較 的定常的もしくはわずかながらに減少するレベルの発現を示し、この発現は第２ ５継代にまで継続した（すなわち＞１７５日）。クローン１４発現の生体内（イ ンビボ）でのものと生体外（インビトロ）でのものとに観察された矛盾について は少なくとも２つの解釈が可能性として存在し、それは、１）表皮剥脱（裸出処 理）を施した腹膜に最初に接着した細胞はその後に２８日目までには脱落したと いう解釈、および／または２）体内移植させた細胞は接着し、かつ観察期間中ず っと接着しているままになっているが、ｌａｃＺ遺伝子の発現がその後にサイレ ントになったという解釈である。親油性蛍光オキサカルボシアニン染料ＤｉＯ（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で追加的に生体外（インビトロ）でラベ ル化してあるクローン１４細胞（ＢＡＧで形質導入したラット中皮細胞）を体内 移植してこれらの可能性を更に検討した。 ＤｉＯ［３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン・パークロレート（ 「ＤｉＯ」／ＤｉＯＣ１８（Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．、ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ２０：５４２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ］は赤茶色の結晶性粉末であり、これ は溶液中では橙色になる（ＤＭＳＯ：エタノール、１：９中に溶解した際）。Ｄ ｉＯ蛍光発光は黄緑色であり、最大吸収および最大放射はそれぞれ４８９ｎｍお よび４９９ｎｍであり、そしてそのためＤｉＯはＦＩＴＣフィルターを用いて可 視することができる。ＤｉＯは細胞移植の研究のためのマーカーとして用いられ ており（Ｐｅｎｚａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ ｅｓ １３：５８０、Ｒａｇｎａｒｓｏｎ Ｂ． ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９７：３２９、Ｓｏｒｉａｎｏ Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５４：７１７）、そ してこれは培養細胞にとって無毒性である。従って生体内（インビボ）での細胞 移植の前にＤｉＯを用いて生体外（インビトロ）で細胞を染色することが可能で あり、そしてＤｉＯで染色した細胞を蛍光顕微鏡もしくはフローサイトメトリー により受容個体組織内で明確に同定することが可能であり、そのことにより体内 移植後の移植片定着の成功および寿命の定性的および定量的評定の両方が可能に なる。 接着細胞は、ＤｉＯを補足してある培地中での以下の要領でのインキュベーシ ョンによりラベル化した。０．１％（ｗ／ｖ）ＤｉＯの保存溶液は、ジメチルス ルホキシド（ＤＭＳＯ）および１００％エタノールの１：９混合物中にＤｉＯ結 晶を溶解することにより作成した。この溶液を超音波処理して全てのＤｉＯ結晶 を溶かした。この保存溶液を培養培地に添加して２０ｎｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍ ｌの範囲にわたる最終濃度をもたらした（典型的には２０μｇ／ｍｌ）。この細 胞を染料含有性培地中で数時間〜数日間培養した（典型的には一晩）。（用量お よび時間経過は当業者に知られる方法に従って具体的な細胞の種類について至適 化させる）。その後に染料含有性培地を除去し、そして通常の培地と交換し、そ してこの細胞を蛍光顕微鏡により観察してラベル化の完了を確認した。移植調査 用に意図されたラベル化細胞をトリプシン処理し、洗浄し、そして生体内（イン ビボ）での接種前に計数した。原形質膜の代謝時間および生体内（インビボ）で の細胞増殖速度に依存するが、その染料を移植後最高数週間の間は検出すること ができる。 クローン１４細胞の集密培養物を既述の用量でＤｉＯでラベルすると、クロー ン１４細胞はＤｉＯ染料をそれらの膜内に取り込み、そして少なくとも２８日間 は生体外（インビトロ）で蛍光性であり続ける。ＤｉＯラベル化クローン１４細 胞（５×１０⁶〜１×１０⁷）をゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成を施し てあるラットに既述のプロトコールを用いて体内移植した。これらのラットを体 内移植後に様々な時間間隔をおいて屠殺したところ、ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉ ｌｍ）創傷形成面積に相当する蛍光性細胞の斑点が少なくとも９３日間は観察さ れ、これは体内移植された中皮細胞が少なくとも３カ月間は表皮剥脱（裸出処理 ）を施した中皮に接着してとどまっていることを示す。 ＢＡＧ（「β−ｇａｌ」）含有性中皮細胞をＤｉＯで標識し、そしてその後に その細胞の存在を生体内（インビボ）で追跡する実験では、蛍光性細胞の存在が β−ガラクトシダーゼ発現よりも更に長い間観察されたことを我々は確認したが 、これはウイルス性ＬＴＲが何らかの様式で遮断されるという我々の仮説に合致 する。他の研究者らは、β−ｇａｌ遺伝子を調節するウイルス性ＬＴＲのメチル 化が、ＢＡＧ β−ｇａｌにおける同様な発現喪失の原因であることを突き止め ている（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｓｏｍ．Ｃｅ ｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ． １３：２５３）。我々はメチル化の存在について は直接テストしてはいないものの、メチル化はこの系におけるβ−ｇａｌの発現 の遮断に一役買っている可能性がありそうである。 ６． ラット中皮細胞のエックスビボ遺伝子転移の至適化 ａ． リン酸ストロンチウムトランスフェクション。予備調査でリン酸カル シウムに対するラット初代中皮細胞の毒性応答が観察され、従って更に進んだ調 査を伴うことなくラット中皮細胞をトランスフェクトするための手段としてのリ ン酸カルシウムの使用を除外した。この難題を回避するために、従来のリン酸カ リシウムトランスフェクション方法の改変法、すなわちリン酸カルシウムに代わ るリン酸ストロンチウムの置換を用いてラット初代中皮細胞をトランスフェクト した。リン酸カルシウムに代わるリン酸ストロンチウムの置換は、リン酸カルシ ウムに対して感受性を示す初代細胞の安定なトランスフェクションを達成するこ とが示されている（Ｂｒａｓｈ，Ｄ．Ｅ．、ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ． ７：２０３１−２０３４（１９８７））。 リン酸ストロンチウム同時トランスフェクションプロトコールを、レポーター としてｐＳＶＴＫｇＨを用いてラット中皮細胞についてテストした。ｐＳＶＴＫ ｇＨは、チミジンキナーゼプロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーにより駆動 されるヒト成長ホルモン（ｈｇｈ）のための遺伝子を含むプラスミドである。ト ランスフェクト化ラット中皮細胞によるならし培地中へのヒト成長ホルモンの分 泌は、トランスフェクション後２〜３日目に商業的に入手可能なキット（Ｎｉｃ ｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｓｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、ＣＡ）を用いるヒト成長ホルモンのための固相二部位 放射免疫アッセイにより測定した。このアッセイは、ミリリットル当たり０．２ ｎｇ程の少量のｈｇｈを検出することが可能であり、そして０．２〜５０ｎｇ／ ｍｌの範囲内では直線となる。 この結果は、ラット中皮細胞の安定なトランスフェクションはリン酸ストロン チウムトランスフェクションを用いて達成することができることを示す。ラット 中皮細胞のトランスフェクションのためのトランスフェクションパラメーターの 至適化には、リン酸ストロンチウム−ＤＮＡ沈殿物による細胞のインキュベーシ ョン時間、トランスフェクション溶液のｐＨ、トランスフェクション中の培地中 に存在する血清のパーセンテージ、および最終グリセロールショック段階の導入 もしくは省略、を変化させることが含まれる。ラット中皮細胞のトランスフェク ションのための好ましいプロトコールはこれ以降、およびＢｒａｓｈ Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ７：２０３１、に 記載される。 細胞をトランスフェクション前日に約２５％の集密度で６０ｍｍディッシュ内 にプレート培養した。（細胞はトランスフェクションを行う日までには約５０％ の集密度になっている必要がある）。トランスフェクション前に細胞を２ｍｌの 無血清培地で１回洗浄し、その後にこの細胞を０．５％ＦＣＳを含む２ｍｌの培 地下に置いた。その後に以下の試薬を調製した。試験管Ａ（２５０ｍｌの２×Ｈ ＢＳ溶液（Ｈｅｐｅｓ緩衝化食塩水（Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．）ｐＨ７．９） および試験管Ｂ（（２４０ｍｌのｄＨ₂Ｏ）；プラスミドＤＮＡ、総計３ｍｇ； １２ｍｌの２Ｍ ＳｒＣｌ₂）。試験管Ａを定常的に震盪させながら試験管Ｂを 滴下により試験管Ａに添加した。試験管Ａの合わせた容積をその後即座に１ｍｌ のピペットを用いて滴下により細胞に添加した。細胞を注意深く観察して、得ら れた沈殿物がコショウ状の見かけを有するか、そして１００×の最終倍率で丁度 良く見えるか否かを決定した。沈殿物が見えないか、あるいは大きな塊で存在す る場合にはトランスフェクションはうまく行かないであろうし、そしてＤＮＡ濃 度もしくはＳｒＣｌ₂容積を至適化するために上述の方法を反復するべきである 。正しいサイズの沈殿物が取得された際には、このプレートをフード（ＣＯ₂非 存 在）中、室温で２０〜３０分間インキュベートした。この時間の満了時には沈殿 物が細胞上に沈着しているのが観察された。これらのディッシュをインキュベー ター内に入れ、そして追加的に７〜１６時間インキュベートした。２日後に（細 胞が依然として集密状態に達していない場合）この培地を、１００μｇ／ｍｌの Ｇ４１８−サルフェートを補足してある増殖培地に交換した。集密状態に到達し た時に細胞を継代し、そしてその後７〜１２日目にコロニーが出現した。トラン スフェクションに用いられる具体的なプラスミド構築物のサイズによってはＤＮ Ａ濃度および塩化ストロンチウム容積の更に進んだ至適化が必要とされる可能性 がある。 ７． ｐＳＶＴＫｇｈでのラット中皮細胞の安定なトランスフェクション（図 ３） ａ． トランスフェクト化ラット中皮細胞によるインビトロでのｈｇｈの分 泌の分析 。 プラスミドｐＣＤｎｅｏおよびｐＳＶＴＫｇｈを、既述のリン酸ス トロンチウム同時沈殿プロトコールを用いてラット初代腹膜中皮細胞内に同時ト ランスフェクトした。トランスフェクト化細胞をＧ４１８の存在中における生存 について選択し、そして個々のクローンをヒト成長ホルモンのための商業的に入 手可能な二部位放射免疫アッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、ＣＡ）を用 いてｈｇｈ産生についてスクリーニングした。３つの陽性クローンを増幅させ、 そして再スクリーニングした。最高レベルのｈｇｈを産生するクローン（ｇｈ２ −３）を以下に記載する再体内移植研究における使用のために増幅させた。 トランスフェクト化ラット中皮細胞（クローンｇｈ２−３）による生体外（イ ンビトロ）でのｈｇｈの産生をおおよそ毎週、各一連の再体内移植実験と組み合 わせて分析した。これらのラット中皮細胞によるｈｇｈの生体外（インビトロ） 発現についての結果を図３に示す。１５ｃｍのディッシュ中に集密に達するまで 増殖させたところ、ｈｇｈ−トランスフェクト化ラット中皮細胞の培養物はｈｇ ｈを一日当たり約１０，０００〜２４，０００ｎｇ／培養物の速度、すなわち一 日当たりの１０⁶の細胞当たり平均約１７００ｎｇ（すなわち１０⁶の細胞当たり ７０ｎｇ／時間）の速度で培地中に分泌した。ラット中皮細胞によるｈｇｈの産 生は２カ月にわたる観察期間を経過して僅かながら減少した（図３を参照せよ） 。 ８． ｐＳＶＴＫｇｈ−トランスフェクト化ラット中皮細胞での体内移植調査 （図４Ａ＆４Ｂ） ａ． トランスフェクト化ラット中皮細胞によるインビボでのｈｇｈの分泌 の分析 。 ｈｇｈ−トランスフェクト化ラット中皮細胞を再体内移植実験に用い て、生体内（インビボ）での再体内移植化細胞によるｈｇｈの分泌のレベルを決 定した。実験は以下の要領で実施した。フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラットを ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、そして腹部皮膚およびその下に存在す る腹膜壁の正中線切開を実施した。これらの動物の腹膜表面にゲルフィルム（Ｇ ｅｌｆｉｌｍ）創傷形成法による表皮剥脱（裸出処理）を施した。ｈｇｈ−トラ ンスフェクト化中皮細胞による再撒種用に利用可能な表面積を最大限にするため に、４枚のゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）を用いた。各箇所のゲルフィルム（ Ｇｅｌｆｉｌｍ）表皮剥脱（裸出処理）部の表面積は２ｃｍ×２ｃｍであり、そ のため表皮剥脱（裸出処理）を施した腹膜壁の総計表面積は多くとも約１６ｃｍ² であった。腹腔を縫合閉鎖し、そして各ラットに、２ｍｌのＨＢＳＳ中の動物 当たりｈｇｈ−トランスフェクト化中皮細胞約１×１０⁷（範囲：５×１０⁶〜２ ×１０⁷細胞）の腹膜内注入を施した。 表皮剥脱（裸出処理）を施した腹膜壁に接着したトランスフェクト化中皮細胞 が腹膜液中にｈｇｈを分泌し、そしてそのｈｇｈがリンパ球によって取り込まれ 、そして最終的には血流に達するか否かを決定するために、眼窩後穿刺による眼 採血を実施した。トランスフェクト化細胞の導入後の様々な時点（４、８、１２ 、２４、４８時間、およびその後に毎週）で血液を既知の容量のヘパリン中に取 り込ませてｈｇｈ分析用の血液を取得した（これはその後に後続の遠心分離によ り血漿とする）。血漿中のｈｇｈのレベルは、前述のヒト成長ホルモン用の二部 位放射免疫アッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ社、Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、ＣＡ）を用いて決定した 。 これらのアッセイの結果を図４Ａ＆４Ｂに示す。 体内移植細胞によるｈｇｈ発現の時間経過は幾つかの相に分かれた。最初は約 １ｎｇ ｈｇｈ／ｍｌ（血液）が外科手術の４時間以内に検出された。血漿内の ｈｇｈのレベルはその後に上昇するように思われ、６時間目までに約７ｎｇ／ｍ ｌのピークに達し、そしてその後１２時間目までに約３．５ｎｇ／ｍｌに、次い で２４時間目までに約０．６６ｎｇ／ｍｌに減少した。その後にｈｇｈのレベル は急激に下降し、そして約４〜７日目までには対照動物におけるレベルと区別す ることができなくなった。ｈｇｈに対する免疫学的応答が時間の増加に伴う検出 可能なｈｇｈの下降に一役買っているものと考えられる（以下に論議される）。 ラット血清中の理論的に予測される定常状態ｈｇｈ濃度は、以下の要領で算出 することができ（Ｔｅｕｍｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９０） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ４：３２４５）、それは、平衡濃度＝［（ｎｇ／時間という単位での移 植片からのｈｇｈ産生）／平衡容量］／Ｋ。Ｋ＝ｌｎ２／Ｔ_1/2．Ｔ_1/2は４分で あると仮定した。（Ｐｅｅｔｅｒｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．（１９７） Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １０１：１１６４）。平衡容積は、ラット体重の２２％で あると仮定した（Ｔｅｕｍｅｒ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９０） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ４：３２４５）（すなわち、１７０ｇのラットでは３７．４ｍｌ）。従 って、７０ｎｇ／時間／１０⁶細胞の生体外（インビトロ）産生速度、および１ ．６〜４．８×１０⁶の細胞に相当する表皮剥脱（裸出処理）化腹膜上に再撒種 されたトランスフェクト化中皮細胞の数（１〜３×１０⁵細胞／ｃｍ²の中皮細胞 飽和密度および１６ｃｍ²の利用可能な表皮剥脱（裸出処理）表面積に基づく） に基づき、ラット血漿中の０．３〜０．９ｎｇ／ｍｌの予想平衡定常状態ｈｇｈ 濃度が算出された。この計算においては、１）中皮細胞によるｈｇｈ産生の生体 内（インビボ）速度は生体外（インビトロ）で観察されるものに等しく、２）免 疫応答による妨害は全く存在せず、そして３）表皮剥脱（裸出処理）表面の適用 範囲は１００％であるものと仮定している。 結果は、０．６ｎｇ／ｍｌのｈｇｈレベルが外科手術の一日目以内に得られた が（一過性発現はしばしば約７ｎｇ／ｍｌを上回った）、このレベルの検出可能 なｈｇｈは持続しないことを示した。一日目の０．６ｎｇ／ｍｌというｈｇｈレ ベルは論理的に算出された定常状態ｈｇｈ濃度の範囲内で下降した。この結果は 、安定にトランスフェクトされた中皮細胞の腹膜内体内移植は検出可能な蛋白質 産物を血流中に輸送することが可能であることを示している。 ９． ラット中皮細胞モデル系における導入化遺伝子（ｈｇｈ）発現の制限。 ａ． 感作ラット血漿中の物質によるラットで測定可能なｈｇｈレベルの妨 害 。 ｈｇｈ−分泌性中皮細胞を体内移植したフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラ ットからの血清は、標準量のｈｇｈ標準品と共に混合した際にはｈｇｈ標準品の 検出能を妨害した（Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ （１９９０） Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：４７１、を参照せ よ）。この「妨害活性」が出現する時間経過を図５Ａおよび５Ｂに示す。 ｂ． 妨害性物質の同定：ｈｇｈ−分泌性ラット中皮細胞を再体内移植した 動物の血漿内のｈｇｈ抗体の存在 。 市販のＲＩＡキットを用いるｈｇｈレベル の測定を妨害する阻害性物質を、ｈｇｈ−分泌性中皮細胞を体内移植した対照ラ ット（非免疫抑制化）ラットの血漿中で検出した。この妨害性物質の力価は時間 と共に増加し、そしてこの物質は抗体である疑いが出てきた。感度のよい免疫ブ ロット法を用いてこれらのラットの血漿中の抗−ｈｇｈ抗体の存在を確認した。 ラット血漿試料中の抗−ｈｇｈ抗体レベルは中皮細胞体内移植後の１日目および ４日目には検出不可能であり、２９日目までには検出可能となり、時間と共に増 加し（５０日目）、そして６４日目には高レベルで存在した。これらの免疫適確 性ラットが時間と共に増加する免疫応答を開始させているという事実は、これら の動物における再体内移植化中皮細胞によるｈｇｈ分泌は移植後少なくとも２カ 月は持続することを示唆している。例えばｈｇｈ結合性蛋白質のような別の阻害 性物質の存在の可能性も未だ除外されていない。成長ホルモン産生の増加に応答 して力価が増加する成長ホルモンの高親和性結合性蛋白質が報告されている（Ｂ ａｕｍａｎｎ Ｇ． ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏ ｌ．Ｍｅｔａ． ６２：１３４）。更に別のアッセイ阻害および他の結合性調査 を実施して、ｈｇｈ妨害性活性が単に免疫系応答に起因するかどうか、もしくは ｈｇｈ結合性蛋白質がやはり血漿中での検出可能なｈｇｈの阻害に一役買ってい るかどうかを決定することができる。 １０． 免疫抑制化動物におけるｈｇｈの分泌（図６）。 抗体産生の可能性を回避するために受容個体の免疫系を抑制して、再体内移植 した遺伝子改変化中皮細胞によるｈｇｈ分泌の検出を可能にし、そして特に全身 性循環系内でのｈｇｈの長期発現を観察できるようにした。化学的免疫抑制はデ キサメサゾン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ）（１．２ｍｇ／ｌ）を動物の飲料水中に入れることにより達成した（Ｒｅ ｄｄｙ Ｌ． ｅｔ ａｌ．、（１９９１） Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ ３８： ４５Ｓ）。細菌感染を予防するために０．５ｇ／ｌのテトラサイクリン−ＨＣｌ （Ｓｉｇｍａ社）もデキサメサゾン処理化動物の飲料水中に添加した。中皮細胞 再体内移植のための外科手術の４日前に処理を開始し、そしてその後のｈｇｈ測 定の間中ずっとこれを継続させた。 血漿中のｈｇｈレベルの同一な一過性相の増加（６〜２４時間）が対照および 免疫抑制化動物について観察されたが、免疫抑制化動物の血漿中のｈｇｈのレベ ルは同様に迅速に低下する訳ではなく、むしろ約０．１ｎｇ／ｍｌで定常状態に 達した。この血漿ｈｇｈ濃度は約２〜３週間持続した（図６）。 ラット血清中の理論的に予想される定常状態ｈｇｈ濃度は既述のように算出し た。ラット血漿中の約０．３ｎｇ／ｍｌの平衡定常状態ｈｇｈ（最少値）濃度が 予測された。この計算は、１）中皮細胞によるｈｇｈ産生の生体内（インビボ） 速度は生体外（インビトロ）で観察されるものに等しく、２）妨害性活性は全く 存在せず、そして３）表皮剥脱（裸出処理）表面の範囲は１００％であるという 仮定に基づいた。しかしながらゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）表皮剥脱（裸出 処理）が完全でなく、かつその結果生じる範囲が不完全となるため、約５０％の 範囲を見積もって定常状態ｈｇｈ濃度についての下限を算出した。この適用範囲 見積値を用いると、約０．１５ｎｇ／ｍｌの定常状態血漿ｈｇｈ濃度が概算され た。この値は観察されるｈｇｈ血漿レベルにかなり良好に一致した。時間の増加 に伴う検出可能なｈｇｈ発現の減少は、ＬＴＲ−駆動性β−ｇａｌ発現に関して 既述したもののようなプロモーターのサイレンス化を意味する可能性がある。 １１． ＢＡＧ−形質導入化中皮細胞を用いる表皮剥脱／剥離方法の至適化（ 実施例 表４） 。 ａ． ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成による表皮剥脱。 腹膜注 入後にトランスフェクト化／形質導入化中皮細胞を接着させる目的では、腹膜壁 に表皮剥脱（裸出処理）を施す必要があることが予備調査で示されている。これ は典型的にはゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成により達成された（Ｃｈ ｅｎｇ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．（１９７２） Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏ ｃｈｅｍ． ２０：５４２）。しかしながらゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）法 による中皮細胞の除去は時々不完全であることがある。従って、動物当たりに用 いられた２ｃｍ×２ｃｍの表皮剥脱（裸出処理）部の数を１〜２カ所から４カ所 へと増加させて中皮細胞接着のための大きな利用可能表面積を提供した。同一部 位の複数のゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）表皮剥脱（裸出処理）部も用いて一 層完全にその領域の表皮剥脱（裸出処理）を行った。ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉ ｌｍ）創傷形成法のこれらの改変法は表皮剥脱（裸出処理）法を改善した。 ｂ． 他の創傷形成方法による表皮剥脱。 中皮細胞の完全な除去を確実に 行うために、数々の別の表皮剥脱（裸出処理）プロトコールを検討した。中皮細 胞は些細な損傷にさえも極度に感受性が高い。盲腸腹膜の５分間の緩和な染色も しくは湿潤が中皮細胞の変性および剥脱を誘導することが報告されている（Ｒｙ ａｎ Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ． ６５： １７７）。従って、ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成に代わる以下の別 法をテストし、それらは、１）空気流による乾燥、２）濾紙ブロッティングによ る乾燥、３）等張食塩水での湿潤、４）ＰＢＳでの湿潤、５）１００％エタノー ルでの湿潤、６）９５％エタノールでの湿潤、７）７０％エタノールでの湿潤、 および８）ＤＭＳＯでの湿潤、であった。エタノールもしくは蒸留水での湿潤に 加えるその後の掻爬もテストした。結果（実施例 表４）は、ゲルフィルム（Ｇ ｅｌｆｉｌｍ）表皮剥脱（裸出処理）プロトコールは最も再現性がよく、かつ信 頼できる方法であり、そして最も均一な表皮剥脱（裸出処理）表面を生じること を示す。しかしながら腹膜表面の空気乾燥もかなり均一な細胞斑を生じ、等張食 塩水での湿潤も同様であり、このことはこれらの別法を更に至適化させて、改善 された表皮剥脱（裸出処理）法を達成することができることを示唆する。 第Ｃ部 ヒト中皮細胞の単離、インビトロでのヒト中皮細胞のトランスフェクシ ョン、およびインビボでのトランスフェクト化ヒト中皮細胞の再体内移植に関連 する予備的結果 。 １． 初代ヒト腹膜中皮細胞の単離。 ヒト初代中皮細胞は、棄却された外科手術標本（網）からトリプシン処理によ り単離した（Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ｌ． ３７：１５６３−１５７０（１９９０）、Ｐｒｏｎｋ，Ａ． ｅｔ ａｌ ．、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２９Ａ：１２７−１３ ４（１９９３））。ヒト初代中皮細胞を以下の要領で５人の患者から単離した。 ヒト網（ｏｍｅｎｔｕｍ）の大切片は、回腸−肛門嚢再形成術を受けた患者（潰 瘍性大腸炎もしくはクローン（Ｃｒｏｈｎ）病と予め診断されている）から取得 した。切除された網組織は切除術の際に手術室内で滅菌冷却ＨＢＳＳ内に回収し 、そして氷上で研究室に持ち込んだ。単離過程は患者からの組織除去の３０分以 内に開始した。未処理の網組織をまず計量して湿潤重量を取得し（平均湿潤重量 ＝１３２ｇ、湿潤重量の範囲＝４０ｇ〜２９０ｇ）、そしてその後に２００ｍｌ のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％のトリプシン−０．５３ｍＭのＥＤＴＡ） 中で２０分間、３７℃で撹拌しながらインキュベートした。この網組織を取り出 して、新鮮なトリプシン−ＥＤＴＡの２００ｍｌのアリコート中に入れて更に２ ０分のインキュベーションにかけ、そしてトリプシン−ＥＤＴＡのこの第一アリ コート中に見いだされる分離した細胞を遠心分離により回収した。この過程を総 計５〜６回の連続トリプシン処理のために繰り返した。各消化後には単離された 細胞をＨＢＳＳで３回洗浄して赤血球を除去し、その細胞を培養培地中に再懸濁 し、そして１５ｃｍのディッシュ内でプレート培養した。 候補のヒト中皮細胞をＤＭＥ／Ｆ１２、１５％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、およ び抗生物質中、ハイドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（表皮増 殖因子）（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で増殖させた（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ， Ｊ．Ｇ． Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ：ａ ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ 、Ｂａｓｅｒｇａ，Ｒ．、Ｅｄｉｔｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８８）、中の「Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｅｒｉａｌ ｃｕｌｔ ｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏ ｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ」、ｐｐ．８１−９ ４）。免疫蛍光顕微鏡により同定したところでは（以下に論議される）、ヒト中 皮細胞は典型的にはトリプシン−ＥＤＴＡのアリコート２および３中に見いださ れる一方で、ヒト繊維芽細胞はアリコート５および６中に見いだされた。ＨＣお よびＥＧＦの存在下で増殖させた初代ヒト中皮細胞の培養物を増幅し、そして第 １継代から第４継代までの時点で凍結した。ヒト中皮細胞を、５〜１０ｎｇ／ｍ ｌのＥＧＦおよびハイドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）を含む培地中での組 織培養物中に入れた場合、これらは迅速に増殖し、準繊維芽細胞様形態を装い、 かつ接触阻害が示されなかった。しかしながらこの培養物が約５０％集密に達し た際にこれらの中皮細胞からＥＧＦを枯渇させたところ、中皮細胞の増殖速度は 実質的に減速し、細胞は一層平坦な形となり、そして一枚の細胞単層が達せられ ると分裂を停止し、それらの生体内（インビボ）での形態に類似する様相を呈し た（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｊ．Ｇ．、上述）。 ５人の提供者からの初代中皮細胞を増幅させ、そして初期継代の時点、好まし くは継代数１および２の時点で凍結した。これらの中皮細胞は表現型の変化を伴 うことなく少なくとも第４〜５継代の間うまく培養することができたが、巨大多 核細胞のパーセンテージが各継代毎に増加した。最初の提供者からの細胞はおお よそ継代数１０までには完全に衰弱し、すなわちたとえＥＧＦの存在下であって も巨大多核細胞がその培養物の大半を占めるように思われた。従ってこの結果は 、遺伝子転移トランスフェクション方法は提供者から細胞を単離した後比較的早 急に、好ましくは第２もしくは第３継代の時点で開始すべきであることを示す。 初代ヒト中皮細胞のための培養条件を当業者に知られる標準的慣習に従って至適 化させれば、トランスフェクション、選択、および体内移植前の増幅過程の間中 ずっと、遺伝子療法使用が意図されるヒト中皮細胞の生存状態を確実に保たせる ことができる。 ２． 初代ヒト中皮細胞の特徴決定。 間接的免疫蛍光法を用いてヒト初代中皮細胞の同一性を確認した。ヒト中皮細 胞（第３継代および第８継代からのもの）は以下の抗体、すなわち抗−サイトケ ラチン１９、抗−サイトケラチンペプチド８、および抗−サイトケラチンペプチ ド１８では陽性染色を示した。ヒト中皮細胞は、抗−内皮細胞抗原フォンウイレ ブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）（ＶＷＦ）およ び抗−デスミンでは陰性染色を示した。まとめると、これらの結果は既に公表さ れている中皮細胞にとっての免疫組織化学的結果と一致し（Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ ，Ｅ．、ｅｔ ａｌ．、Ｋｉｄ．Ｉｎｔ． ３７：１５６３−１５７０（１９９ ０）、Ｈｊｅｌｌｅ，Ｊ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｅｒｉｔ．Ｄｉａｌ．Ｉｎｔ ． ９：３４１−３４７（１９８９）、およびＷｕ，Ｙ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．、Ｃｅ１１ ３１：６９３−７０３（１９８２））、かつ上皮細胞について観察さ れるものとは異なる初代ヒト中皮細胞にとっての染色のパターンを示す。 ３． ｐＳＶＴＫｇｈでのヒト中皮細胞のトランスフェクション（図７）。 ｐＳＶＴＫｇＨはヒト成長ホルモン（ｇＨ）のための遺伝子を含むプラスミド である（Ｓｅｌｄｅｎ，Ｒ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ． ６：３１７３−３１７８、１９８６）。ｐＳＶＴＫｇＨをレポーターとして 用いて初代ヒト中皮細胞におけるリン酸ストロンチウムトランスフェクションプ ロトコールを至適化させた。この中皮細胞を、成長ホルモンおよびネオマイシン 耐性のための遺伝子を含むスーパーコイル型プラスミドで同時トランスフェクト した。成長ホルモン発現は、ヒト成長ホルモン用の既述の固相二部位放射免疫ア ッセイ（Ｎｉｃｏｈｌｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｓ ａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、ＣＡ）を用いてトランスフェクション 後２〜３日目に測定した。同時トランスフェクトしたクローン化されていないヒ ト中皮細胞は、培養培地中に検出可能な量のヒト成長ホルモンを分泌することが 見いだされた（図７）。ｈｇｈトランスフェクト化ヒト中皮細胞の培養物（クロ ーン化されていないもの）は、一日当たりの１０⁵の細胞当たり約１６０ｎｇの 速度で培地中にｈｇｈを分泌した。この結果（図７）は、ヒト中皮細胞をｐＳＶ ＴＫｇＨでトランスフェクトしてトランスフェクト化遺伝子の発現を達成するこ と が可能であることを示す。後者の細胞を以下に示すヌードラットでの再体内移植 調査に用いた。 ４． ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成を施したヌードラット内への ｐＳＶＴＫｇｈトランスフェクト化ヒト中皮細胞の体内移植 ：ＤｉＯ−ラベル化 細胞での試験的実験 。 リン酸ストロンチウム法（Ｂｒａｓｈ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃ ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ７：２０３１−２０３４（１９８７））を用いてｐＳ ＶＴＫｇｈで安定にトランスフェクトさせたヒト中皮細胞を用いて、ヌードラッ トにおける異種移植片として接着するヒト中皮細胞の能力についてテストした。 試験的調査では、安定にトランスフェクトされたがクローン化されていないヒト 中皮細胞のプール集団を蛍光細胞探知試薬であるＤｉＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）でラベル化し、そしてヌードラット中に 再体内移植した。この試験的研究は２匹のヌードラット、すなわち（１）対照動 物（外科手術、ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成、体内移植細胞なし） 、および（２）実験動物（外科手術、ゲルフィルム（Ｇｅｌｆｉｌｍ）創傷形成 、１×１０⁵のｐＳＶＴＫｇＨトランスフェクト化ＤｉＯラベル化ヒト中皮細胞 の再体内移植）、を含んでいた。１８日目には実験動物を屠殺し、そして腹膜壁 をＤｉＯラベル化ヒト中皮細胞の存在について検討した。蛍光細胞小斑が腹膜表 面全体に散在しているのが観察された。これらの結果は、トランスフェクト化ヒ ト中皮細胞を表皮剥脱（裸出処理）した腹膜表面に体内移植し、そしてこれの細 胞は少なくとも１８日間はその表面に接着したままである可能性があることを示 す。 第Ｄ部 ヒト中皮細胞遺伝子療法の予測的実施例（図２） 遺伝子改変化中皮細胞を用いるヒト遺伝子療法の方法が本明細書に記載される 。好ましい方法は自己細胞、すなわち遺伝子改変化細胞が意図される受容個体か ら単離された細胞を利用する。これらの細胞は、当業者に知られる方法に従って 体腔の内層、例えば網表面の試料採取を行うことによりヒト提供者から採集する 。採集は外科手術介入の際、もしくは側腹切開術により実施する。採集した細胞 は その後に、中皮細胞を培養するための当業者に知られる細胞培養物内に定着させ る。 治療薬をコードする異種遺伝子を発現させるための発現ベクターを調製するた めには、その遺伝子を当該技術分野において知られる方法に従ってウイルス性ベ クター内に挿入する。別法ではその遺伝子をプラスミドベクター内に挿入するこ とができる。異種遺伝子は、中皮細胞内への取り込み後にその異種遺伝子の転写 を可能にする構成性プロモーターを含むことが好ましい。例えばエンハンサーの ような追加的制御要素を標準方法に従ってその異種遺伝子内に挿入して発現の一 層強力な制御を可能にする。別法では誘導性プロモーターを用いて挿入遺伝子の 転写を調節する。しかしながら誘導性プロモーターの使用は、現場（インサイチ ュー）での治療薬の発現を達成するには、遺伝子改変化中皮細胞の誘導性作用物 質への現場（インサイチュー）での露出の段階を更に必要とする。 この発現系は、遺伝子改変化中皮細胞の選択を容易にする選択性マーカー（例 えば、ネオマイシン耐性のためのマーカー）を更に含む。中皮細胞には、当該技 術分野に知られる方法に従って既述のウイルス性ベクターもしくはプラスミド構 築物を用いる生体外（インビトロ）でのウイルス性形質導入もしくはトランスフ ェクションを施す。遺伝子改変化中皮細胞の培養は選択培地（例えば、ネオマイ シンを含む培地）の存在下で実施し、そして遺伝子改変化細胞の特徴決定を行う 。治療的有効レベルでの治療薬の安定な発現を示す遺伝子改変化中皮細胞のみが 更に進んだ特徴決定のために選択される。 選択された中皮細胞を免疫組織化学的染色により評定して、形質導入化細胞が ヒト受容個体への投与に適するかどうかを決定する。受容個体への直接投与に適 する形質導入化細胞もしくはトランスフェクト化細胞を非不滅化させ、そしてこ れらは非腫瘍形成性である。形質導入化細胞もしくはトランスフェクト化細胞の 追加的特徴決定を実施して、ヒト遺伝子療法の臨床実験を監視する責務である政 府機関により確立された基準にその細胞が適合することを確認する。 遺伝子改変化中皮細胞の投与はその細胞を含む懸濁液のヒト受容個体の体腔内 への腹膜内注入によるか、あるいはその細胞の体内移植による。体内移植の部位 は体内移植前に表皮剥脱（裸出処理）が施されていることが好ましい。全身性循 環系を目的とする治療薬については、現場（インサイチュー）での治療薬の発現 が好調であることをその作用物質の血液レベルを測定することにより評定する。 一般的には遺伝子転移療法の効率は、その治療薬が投与される条件に起因する臨 床症状の軽減により決定される。 これまでの記述は所定の好ましい態様の単なる詳細な説明に過ぎないというこ とが理解されるべきである。従って本発明の精神もしくは範囲から逸脱すること なく様々な改変法および等価物を作成可能であるということが当業者には明白で あるはずである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ナギー，ジャニス・アン アメリカ合衆国マサチューセッツ州02146, ブルックリン，クラーク・ロード 180, アパートメント ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 中皮細胞、および 中に含まれる発現ベクター、 を含み（前記発現ベクターは外因性遺伝物質を発現するためのものである）、哺 乳類受容個体への投与に適する、哺乳類受容個体中で外因性遺伝物質を発現する ための中皮細胞発現系。 ２． 哺乳類受容個体がヒトである、請求の範囲１に記載の発現系。 ３． 前記中皮細胞が前記ヒト受容個体から単離されたものである、請求の範 囲２に記載の発現系。 ４． 前記中皮細胞が、壁側中皮細胞、内蔵表面中皮細胞、および遊離の浮遊 性中皮細胞からなる群より選択される細胞を含む、請求の範囲３に記載の発現系 。 ５． 前記中皮細胞が、胸膜腔、心膜腔、および腹膜腔からなる群より単離さ れる、請求の範囲４に記載の発現系。 ６． 哺乳類受容個体が遺伝子置換療法を受けることが可能な条件を有し、か つ前記外因性遺伝物質が前記条件を治療するための治療薬をコードする異種遺伝 子を含む、請求の範囲１に記載の発現系。 ７． 前記条件が、遺伝子疾患、後天的病状、癌、および予防方法からなる群 より選択される、請求の範囲６に記載の発現系。 ８． 前記条件が遺伝子疾患を含み、かつ前記外因性遺伝物質が前記遺伝子疾 患を治療するための治療薬をコードする異種遺伝子を含む、請求の範囲７に記載 の発現系。 ９． 前記遺伝子疾患が、免疫不全症、高コレステロール血症、血友病Ａ、血 友病Ｂ、ゴーシャー（Ｇａｕｃｈｅｒ）病、ムコ多糖症、気腫、フェニルケトン 尿症、高アンモニア血症、シトルリン血症、筋ジストロフィー、サラセミア、鎌 状赤血球貧血、白血球接着欠乏症、およびフォンウイレブランド（ｖｏｎ Ｗｉ ｌｌｅｂｒａｎｄ）病からなる群より選択される、請求の範囲８に記載の発現系 。 １０． 前記治療薬が、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリ ラーゼ、ＬＤＬレセプター、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ 、ベータ−グルクロニダーゼ、アルファ１−抗トリプシン、フェニルアラニンヒ ドロキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシ ンセターゼ、ジストロフィン、ベータ−グロビン、ＣＤ−１８、およびフォンウ イレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子からなる群より選択される 、請求の範囲８に記載の発現系。 １１． 前記条件が、後天的病状を含み、かつ前記外因性遺伝物質が前記後天的 病状を治療するための治療薬をコードする異種遺伝子を含む、請求の範囲７に記 載の発現系。 １２． 前記後天的病状が、貧血、腹膜硬化症、腹膜炎、尿毒症、敗血症性ショ ック、糖尿病、下垂体性小人症、血栓症、外科手術後の癒合、末期腎疾患、およ びＡＩＤＳからなる群より選択される、請求の範囲１１に記載の発現系。 １３． 前記治療薬が、エリスロポイエチン、トロンボモデュリン、組織プラス ミノゲン活性化因子、インスリン、一本鎖ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因 子、スーパーオキシドジスムターゼ、ウレアーゼ、トロンボモデュリン、インス リン、ヒト成長ホルモン、ヒルジン、カタラーゼ、およびＣＤ−４からなる群よ り選択される、請求の範囲１１に記載の発現系。 １４． 前記条件が癌を含み、かつ前記外因性遺伝物質が前記癌を治療するため の抗−新生物用作用物質をコードする異種遺伝子を含む、請求の範囲７に記載の 発現系。 １５． 前記癌が腹膜腔もしくは胸膜腔の転移癌を含む、請求の範囲１４に記載 の発現系。 １６． 前記抗−新生物用作用物質が、突然変異化した癌遺伝子の発現産物、ア ンチセンスＲＮＡ、正常な腫瘍抑制因子、サイトカイン、インターフェロン、腫 瘍壊死因子、およびインターロイキンからなる群より選択される、請求の範囲１ ４に記載の発現系。 １７． 前記条件が予防方法を含み、かつ前記外因性遺伝物質が予防用作用物質 をコードする異種遺伝子を含む、請求の範囲７に記載の発現系。 １８． 前記予防方法が妊娠を回避するためのものであり、かつ前記治療薬がエ ストロゲンおよびプロゲステロンである、請求の範囲１７に記載の発現系。 １９． 前記予防方法が甲状腺機能不全症を回避するためのものであり、かつ前 記治療薬がチロキシンである、請求の範囲１７に記載の発現系。 ２０． 前記発現ベクターが複製欠損性ウイルスである、請求の範囲１に記載の 発現系。 ２１． 前記発現ベクターが、治療薬をコードする核酸を含有するキメラプラス ミドである、請求の範囲１に記載の発現系。 ２２． 前記発現ベクターが前記異種遺伝子の転写を制御するためのプロモータ ーを更に含む、請求の範囲１に記載の発現系。 ２３． 前記発現ベクターが中皮細胞から前記治療薬を細胞外環境および細胞膜 からなる群より選択される生体内（インビボ）での場所に輸送するためのシグナ ル配列を更に含む、請求の範囲２２に記載の発現系。 ２４． 複数の遺伝子改変化中皮細胞（前記細胞は外因性の遺伝物質を発現する ための発現ベクターを含む）、および 薬剤学的に許容される担体、 を含む、薬剤学的組成物。 ２５． 前記組成物が遺伝子置換療法を受けることが可能な条件を治療するため のものであり、かつ前記外因性遺伝物質が前記条件を治療するための治療薬をコ ードする異種遺伝子を含む、請求の範囲２４に記載の薬剤学的組成物。 ２６． 前記治療薬が、遺伝子疾患を治療するための作用物質、後天的病状を治 療するための作用物質、癌を治療するための抗−新生物用作用物質、および予防 用作用物質からなる群より選択される、請求の範囲２５に記載の薬剤学的組成物 。 ２７． 前記組成物が前記治療薬の治療的有効用量を前記組成物が投与される患 者に現場（インサイチュー）で輸送するのに十分な細胞量を含む、請求の範囲２ ５に記載の薬剤学的組成物。 ２８． 哺乳類受容個体内への体内移植に適する支持体、および前記支持体に接 着した複数の遺伝子改変化中皮細胞を含む、中皮細胞移植片。 ２９． 前記支持体が腹膜細片からなり、かつ前記中皮細胞が組換え遺伝子を含 む、請求の範囲２８に記載の移植片。 ３０． 前記細胞の前記支持体への接着を容易にするための基質を更に含む、請 求の範囲２８に記載の移植片。 ３１． 前記支持体が合成材料からなる、請求の範囲２８に記載の移植片。 ３２． 哺乳類受容個体内への体内移植に適するカプセルおよび前記カプセル内 に含まれる複数の遺伝子改変化中皮細胞を含む、カプセル内包化中皮細胞発現系 。 ３３． （ａ）異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターを単離された中 皮細胞内に取り込ませて遺伝子改変化中皮細胞を形成する段階、および （ｂ）薬剤学的に許容される担体内に遺伝子改変化中皮細胞を入れる段 階、 を含む、哺乳類受容個体への投与のための薬剤学的調製物を作成するための方法 。 ３４． 異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターを現場（インサイチュ ー）で哺乳類受容個体の中皮細胞中に取り込ませることを含む、哺乳類受容個体 の中皮系を遺伝子改変するための方法。 ３５． 発現ベクターを取り込ませることが前記発現ベクターを哺乳類受容個体 の体腔内に注入することを含む、請求の範囲３４に記載の方法。 ３６． 前記発現ベクターが前記異種遺伝子産物の転写制御のための誘導性プロ モーターを更に含み、前記方法が遺伝子改変化中皮細胞を現場（インサイチュー ）で前記異種遺伝子産物の転写を可能にするための条件に露出する段階を更に含 む、請求の範囲３４に記載の方法。 ３７． 異種遺伝子産物を発現するための発現ベクターを単離された中皮細胞内 に取り込ませて遺伝子改変化中皮細胞を形成すること、および 前記遺伝子改変化中皮細胞を哺乳類受容個体に投与することを含む、哺 乳類受容個体の中皮系を遺伝子改変するための方法。 ３８． 前記中皮細胞が哺乳類受容個体から単離される、請求の範囲３７に記載 の方法。 ３９． 前記遺伝子改変化細胞を投与することが、前記遺伝子改変化細胞を前記 哺乳類受容個体内に注入することからなる、請求の範囲３７に記載の方法。 ４０． 前記遺伝子改変化細胞を投与することが、前記遺伝子改変化細胞を哺乳 類受容個体の中皮細胞適合性部位内に体内移植することを含む、請求の範囲３７ に記載の方法。 ４１． 前記遺伝子改変化中皮細胞を体内移植する前に中皮細胞適合性部位の表 皮剥脱を行う段階を更に含む、請求の範囲４０に記載の方法。 ４２． 前記遺伝子改変化細胞を投与することが、支持体に接着される複数の前 記遺伝子改変化細胞を含む中皮細胞移植片を体内移植することからなる、請求の 範囲３７に記載の方法。 ４３． 前記遺伝子改変化細胞を投与することが、哺乳類受容個体内への体内移 植に適するカプセル内に含有された複数の前記遺伝子改変化細胞を含むカプセル 内包化中皮細胞発現系を体内移植することからなる、請求の範囲３７に記載の方 法。 ４４． 前記発現ベクターが前記異種遺伝子産物の制御的転写のための誘導性プ ロモーターを更に含み、前記方法が遺伝子改変化中皮細胞を現場（インサイチュ ー）で異種遺伝子産物の転写を可能にするための条件に露出する段階を更に含む 、請求の範囲３７に記載の方法。