JPH0947299A

JPH0947299A - 微生物活動状態計測方法

Info

Publication number: JPH0947299A
Application number: JP8135747A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Iwasaki; 裕岩崎; Tomoaki Fukushige; 朋昭福重; Hirofumi Akano; 裕文赤野; Satoshi Nomura; 聡野村; Katsuhiko Tomita; 勝彦冨田
Original assignee: Horiba Ltd; Nakano Vinegar Co Ltd
Current assignee: Horiba Ltd; Nakano Vinegar Co Ltd
Priority date: 1995-05-31
Filing date: 1996-05-01
Publication date: 1997-02-18

Abstract

(57)【要約】【課題】微生物の活動状態を容易かつ迅速に、しか
も、リアルタイムに評価することができる微生物活動状
態計測方法を提供すること。【解決手段】微生物Ｂを活動させたいプロセス中また
は環境中で活動させたり、培地２５で培養し、そのとき
微生物Ｂの代謝によって変化する化学物質の変化を二次
元画像として観測し、その画像変化に基づいて微生物Ｂ
の活動状態を数値的に把握するようにした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、微生物の活動状
態を計測する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物の活動は、酒類の醸造や医薬品の
製造、環境汚染の修復など、広い分野で利用されてい
る。一方、伝染病など各種の疾病や食物の腐敗など、微
生物の害も多岐にわたる。いずれの場合でも、微生物が
存在しているか否か、存在していればどの程度活動する
かを観測することが必要である。

【０００３】一般に、前記観測を行うには、実際に微生
物をプロセス（例えば酒醸造のプロセスなど）に適用し
てみて、必要とする効果が得られたが否かを評価する
か、あるいは、適当な培地で微生物を培養して、微生物
が繁殖した結果を確認して行われている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記い
ずれの場合も、微生物がある程度活動を行った結果、あ
るいは、活動し終わった結果による評価であり、結果を
得るまでにかなりに時間が必要となるとともに、微生物
の活動状態をリアルタイムに評価することができなかっ
た。

【０００５】この発明は、上述の事柄に留意してなされ
たもので、微生物の活動状態を容易かつ迅速に、しか
も、リアルタイムに評価することができる微生物活動状
態計測方法を提供することを目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、この発明の微生物活動状態計測方法（以下、単に計
測方法という）は、微生物を活動させたいプロセス中ま
たは環境中で活動させたり、培地で培養し、そのとき微
生物の代謝によって変化する化学物質の変化を二次元画
像として観測し、その画像変化に基づいて微生物の活動
状態を数値的に把握するようにしたことを特徴としてい
る。

【０００７】実際に、微生物を活動条件下に置いたと
き、微生物が代謝によって引き起こす、微生物近傍の化
学物質の変化を、二次元濃度分布画像として捉えること
によって、微生物の活動状態をその最終結果を待たずし
て直接観測することが可能となる。

【０００８】すなわち、二次元画像をリアルタイムに取
り込むことによって、化学物質濃度が極大である点または極小である点に
おける時間に対する化学物質の濃度の変化の割合、化学物質濃度が所定値以上または所定値以下の部分
の面積を求め、時間に対する面積値の変化の割合、化学物質の全変化量を求め、時間に対する全変化量
の割合、化学物質濃度が所定値以上または所定値以下の部分
の数をカウントし、一個体の微生物の増殖した割合、のいずれかを得る。これらの値は、微生物の代謝が多い
か少ないかの指標となり、微生物の活動の度合いを数値
的に評価することが可能になる。

【０００９】微生物の活動で変化する化学物質は、光走
査型二次元濃度分布測定装置を用いて測定する。この光
走査型二次元濃度分布測定装置の一つに、ＬＡＰＳセン
サ（Ｌｉｇｈｔ−ＡｄｄｒｅｓｓａｂｌｅＰｏｔｅｎ
ｔｉｏｍｅｔｒｉｃＳｅｎｓｏｒ）がある。このＬＡ
ＰＳセンサは、近年、液体中あるいは物質中にしみこん
だ液体中に溶存している物質のｐＨを二次元的に測定す
るため開発されたものであり、このようなセンサは、例
えば、Ｊｐｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｖｏｌ．３３
（１９９４）ｐｐＬ３９４−Ｌ３９７に記載してある
ように、イオンなどに感応するセンサ面を形成した半導
体基板を適宜の光でスキャンし、このスキャンによっ
て、半導体基板中に誘発された光電流を取り出すことに
より測定を行うことができる。

【００１０】前記装置のセンサ面を直接計測したい対象
物質に挿入したり接触させることによって溶存物質の濃
度分布を測定する。得られたデータはコンピュータ処理
により、二次元または三次元の濃度分布画像として出力
される。ある時間での濃度分布のみならず、その変化の
様子をリアルタイムに追跡することができる。リアルタ
イムに得られた画像を、目視、ＣＣＤカメラなどによっ
て得られた電磁波画像と容易に比較できる。

【００１１】なお、本願出願人は、上記ｐＨなどのイオ
ン濃度の二次元分布を測定するのに用いる装置を、「光
走査型デバイス」として平成７年２月４日付けにて特許
出願している（特願平７−３９１１４号）。

【００１２】そして、前記化学物質は、各種の無機イオ
ン、有機イオン、有機物、酵素反応に関与する物質、抗
原抗体反応に関与する物質、遺伝に関する物質で、液体
に溶け、かつ前記光走査型二次元濃度分布測定装置のセ
ンサ面を適当に修飾することことによって測定できるも
のなら何でもよい。

【００１３】さらに、前記二次元濃度分布画像と電磁波
画像との比較を行い、微生物が引き起こした化学物質の
濃度分布と実際の微生物の存在位置との相関を得ること
もできる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、この発明の好ましい実施例
を、図を参照しながら説明する。

【００１５】〔実施例１〕まず、この発明の計測方法
を、醗酵や醸造などの食品製造プロセスに適用した例に
ついて、図１および図２を参照しながら説明する。微生
物の能力を利用したプロセスにおいては、プロセスに最
適の微生物を選び出す（スクリーニングする）必要があ
るが、最適微生物は、微生物を実際のプロセスに適用し
てみて、その活動状態を以下に述べる方法によって観測
することによって見出すことができる。この場合、微生
物の代謝によって変化する物質は水素イオンであり、測
定にはｐＨに感応する光走査型二次元濃度分布測定装置
を用いる。

【００１６】すなわち、図１は、この発明の計測方法を
実施する際使用する光走査型二次元濃度分布測定装置を
概略的に示す図で、この図において、１は光走査型二次
元濃度分布測定装置のセンサ部で、このセンサ部１は、
例えばシリコンなどの半導体よりなる基板２の一方の面
（図示例では上面）にＳｉＯ₂層３、Ｓｉ₃Ｎ₄層４を
熱酸化、ＣＶＤなどの手法によって順次形成してなるも
ので、水素イオンに応答するように形成されている。そ
して、ＣＥ、ＲＥはセンサ面であるＳｉ₃Ｎ₄層４の上
方に設けられる対極、比較電極で、後述するポテンショ
スタット１０に接続されている。また、ＯＣは半導体基
板２に設けられる電流信号取出し用のオーミック電極
で、後述する電流−電圧変換器１１および演算増幅回路
１２を介してポテンショスタット１０に接続されてい
る。

【００１７】５は前記センサ部１の半導体基板２を照射
する光照射部で、半導体基板２の下面側（センサ面４と
は反対側）に設けられ、後述するインターフェイスボー
ド１３を介して後述するコンピュータ１５の制御信号に
よって、最適なビーム径になるように調整された光をプ
ローブ光６として断続的に発するレーザ光源７と、この
レーザ光源７を、二次元方向（図中のＸ，Ｙ方向）に走
査制御走査する走査制御装置８とからなる。

【００１８】９は前記センサ部１および光照射部５の制
御するための制御ボックスで、半導体基板２に適宜のバ
イアス電圧を印加するためのポテンショスタット１０、
半導体基板２に形成されたオーミック電極ＯＣから取り
出される電流信号を電圧信号に変換する電流−電圧変換
器１１、この電流−電圧変換器１１からの信号が入力さ
れる演算増幅回路１２、この演算増幅回路１２と信号を
授受したり、走査制御装置８に対する制御信号を出力す
るインターフェイスボード１３などよりなる。

【００１９】１４は各種の制御や演算を行うとともに、
画像処理機能を有する制御・演算部としてのコンピュー
タ、１５はｐＨ濃度分布を表示するディスプレィであ
る。この光走査型二次元濃度分布測定装置は、上記特願
平７−３９１１４号に示したものと変わるところがな
い。

【００２０】この発明の計測方法で使用するサンプル
は、一般に用いられている方法で形成し、例えば寒天培
地のサンプルを形成する。この方法は、例えば微生物検
査（医学書院刊、臨床検査技術全書７）に記載されてい
る。適用できるプロセスとして、図２（Ａ）に示すよう
に、適宜の容器２１内に微生物を活動させるための適当
な条件に調整された溶液２２に寒天２３を加えてこれを
シャーレ２４に収容してゲル２５とする。一方、同図
（Ｂ）に示すように、試験管２６において評価したい微
生物Ｂを適宜の希釈液２７によって希釈し、この希釈さ
れた微生物Ｂを前記シャーレ２４に収容されたゲル２５
の表面に塗布して、サンプル２８とする（同図（Ｃ）参
照）。

【００２１】そして、図２（Ｃ）に示すように、サンプ
ル２８を上下逆さにして、光走査型二次元濃度分布測定
装置のセンサ部１のセンサ面４に載せ、周囲温度などを
適当に設定して、微生物Ｂの培養を開始する。

【００２２】上記光走査型二次元濃度分布測定装置にお
いては、対極ＣＥおよび比較電極ＲＥをサンプル２８の
ゲル２５に挿入し、半導体基板２に空乏層が発生するよ
うに、ポテンショスタット１０からの直流電圧を比較電
極ＲＥとオーミック電極ＯＣとの間に印加して、半導体
基板２に所定のバイアス電圧を印加する。この状態で半
導体基板２に対してプローブ光６を一定周期（例えば、
１０ｋＨｚ）で断続的に照射することによって半導体基
板２に交流光電流を発生させる。

【００２３】さらに、光照射部７をＸ，Ｙ方向に移動さ
せることにより、半導体基板２にはプローブ光６が二次
元方向に走査されるようにして照射され、サンプル２８
における位置信号（Ｘ，Ｙ）と、その場所で観測された
交流光電流値により、コンピュータ１４のディスプレイ
１５の画面上にｐＨを表す二次元画像１６が表示され
る。

【００２４】そこで、培養開始時点でのｐＨ値を記録し
（このとき、サンプル２８においてはｐＨの分布は見ら
れない）、培養を開始する。そして、培養開始後で一番
最初にｐＨ値変化が起こった場所をｐＨ測定点として、
その測定でのｐＨ値を一定時間ごとに記録し、培養開始
時と開始後のｐＨ値の差を一定時間ごとに測定して記録
する。前記ｐＨ値の差は、ある一定時間後は、時間に対
して対数関数的に増加するようになる。図３はこのとき
のｐＨ値と時間の関係を表したもので、横軸に時間を、
縦軸にｐＨ値（対数軸表示）をそれぞれとってある。そ
して、それまでの時間をＴ_b、ｐＨ値の増加が時間に対
して対数関数的になってからのｐＨ値の単位時間当たり
の増加量の対数値をＳとすると、これらの値Ｔ_b、Ｓが
微生物Ｂの活動状態の指標１７となる（図１参照）。す
なわち、微生物Ｂの活動条件を一定にして、数種の微生
物Ｂのスクリーニングを行う場合は、前記Ｔ_bの値が小
さくかつＳの値が大きいものほど、目的とするプロセス
を効率よく行う能力があると見做せる。

【００２５】上述のプロセスは、微生物Ｂの活動条件を
一定にして、複数の微生物Ｂの活動を評価してスクリー
ニングを行った例であったが、スクリーニングで選び出
された微生物Ｂについて、プロセスを行う上での最適条
件の決定を行う場合にも、同様の手法を用いることがで
きる。但し、この場合、微生物種を一定にして、ゲルサ
ンプルの条件やプロセス実施中の条件を変動させた場合
のＴ_b、Ｓをそれぞれ比較すればよい。

【００２６】また、上述の例において、ｐＨ値の変化が
最初に生ずる場所が複数点になる場合がある。この場合
は、任意の一点をｐＨ値変化観測点と定めてもよいし、
そのうちの数点または全点をｐＨ値変化観測点としても
よい。いずれを採用するかは、一連のスクリーニングや
活動条件の検討において一定に定める必要がある。

【００２７】そして、上述の実施例は、醗酵や醸造など
の食品製造プロセスに適用した例であったが、微生物Ｂ
の能力を利用した他のプロセスに適用できることはいう
までもない。

【００２８】〔実施例２〕この実施例では、微生物Ｂの
活動状態の指標として、微生物Ｂの個体数の増加の割合
を用いる。前記実施例１と同様に、微生物Ｂの培養を開
始して、放出される化学物質の二次元濃度分布画像を順
次得る。測定する化学物質は、実施例１と同様に水素イ
オンであるが、他の化学物質でもよい。

【００２９】微生物Ｂは、一定時間培養を続けると、そ
の個体数を増やし、図４（Ａ）に示すように、いくつか
の個体（微生物Ｂ）が集合したコロニー２９を形成す
る。このコロニー２９の周囲では、ｐＨ値が培養開始時
の値とは異なってくるので、二次元濃度分布画像を観察
することにより、より容易に特定できる。

【００３０】前述のように、コロニー２９は複数個形成
されるので、それらのうちの１ヶ所ずつを一定時間ごと
に，図４（Ａ）において仮想線で示すように、ゲル２５
ごと切り取る。切り取られたコロニー２９は、同図
（Ｂ）に示すように、試験管３０内の培養液３１によっ
て溶解し、一個体ずつの微生物Ｂに単離し、再び、上述
した方法で光走査型二次元濃度分布測定装置のセンサ部
１のセンサ面４に固定して培養する。

【００３１】単離された微生物Ｂのそれぞれは、再び増
殖を繰り返してコロニーを形成する。このコロニーの周
囲では、やはりｐＨ値が培養開始時の値と異なってくる
ので、二次元濃度分布画像を観察することにより、より
容易に特定でき、今度は、そのコロニーの総数を知るこ
とができる。このコロニーの総数が先にゲルごと切り取
ったコロニー中の微生物Ｂの数で、切り取られた時点で
増殖した個数を表している。

【００３２】ところで、最初の微生物培養とコロニーの
切取りを一定時間ごとに行って、コロニー中の微生物の
数を求めることで、一個体の微生物が時間の経過ととも
の個体数を増加させていく様子を知ることができる。個
体数の増加は、一定時間（例えばＴ_b’）後からは対数
的となり、そのときの増加量の対数値をＳ’とすると、
Ｔ_b’の値が小さくかつＳ’の値が大きいものほど、目
的とするプロセスを効率よく行う能力があると見做せる
ので、これらの値を用いて微生物Ｂのスクリーニングや
最適活動条件を得ることができる。

【００３３】〔実施例３〕この実施例では、タンカーや
石油プラントなどの事故で漏れ出した原油や、その他の
石油系廃液で汚染された土壌を、微生物の力で浄化する
場合への適用例を説明する。前記汚染は、汚染の形態が
千差万別であり、より適切な微生物Ｂのスクリーニング
と選ばれた微生物Ｂを最大限活動させる条件を迅速に見
出すことが要求される。以下、具体的な適用方法を述べ
る。

【００３４】この実施例においても、測定対象化学物質
は水素イオンであるが、他の各種のイオン種や有機物質
でも可能である。また、測定装置としては、水素イオン
に感応する光走査型二次元濃度分布測定装置を用いる
が、測定対象化学物質に応じて光走査型二次元濃度分布
測定装置のセンサ面４を適宜の感応物質によって修飾し
たものを用いることはいうまでもない。

【００３５】この実施例においては、候補の数種の微生
物Ｂを同時に評価できるように、図５（Ａ）に示すよう
に、センサ面４をいくつかの測定ゾーン４ａ，４ｂ，４
ｃ，４ｄ，…，４ｎに区分し、それぞれの測定ゾーン４
ａ〜４ｎにおいて異なる微生物Ｂ₁，Ｂ₂，Ｂ₃，
Ｂ₄，…，Ｂ_n（図示してない）を培養して、それらの
活動状態を観測する。各微生物Ｂ₁〜Ｂ_nを適当な溶液
で希釈した後、各測定ゾーン４ａ〜４ｎに塗布し、その
後、同図（Ｂ）に示すように、浄化したい土壌３２を載
せれば、それぞれの微生物Ｂ₁〜Ｂ_nを固定できる。こ
の後の測定は、前記実施例１と同様に行えばよい。

【００３６】最適微生物Ｂのスクリーニングのみなら
ず、選ばれた微生物Ｂが最大限活動できる条件を見出す
過程でも同様に測定することができる。但し、この場
合、各測定ゾーン４ａ〜４ｎに塗布する微生物Ｂを同一
にして、各測定ゾーン４ａ〜４ｎに加える栄養分などを
適宜変化させればよい。

【００３７】なお、浄化したい土壌３２をセンサ面４に
載せるのに代えて、各微生物Ｂ₁〜Ｂ_nを塗布したセン
サ部１を浄化したい土壌中に直接埋め込むことに寄って
もスクリーニングすることができる。

【００３８】〔実施例４〕上述の各実施例は微生物Ｂの
代謝によって変化する化学物質が水素イオンであった
が、これに代えて、例えばカルシウムイオンなど各種の
無機イオンや、乳酸などの有機酸その他各種の化学物質
の変化を観測することもできる。この場合、光走査型二
次元濃度分布測定装置のセンサ部１のセンサ面４を観測
した物質に選択的に応答する物質で修飾すればよい。

【００３９】〔実施例５〕この実施例では、病原菌など
の有害微生物の存在を発見する場合を述べる。この方法
で使用するサンプルは、一般に用いられている方法で、
例えば寒天培地のサンプルを形成する。この方法は、例
えば微生物検査（医学書院刊、臨床検査技術全書７）に
記載されている。

【００４０】すなわち、実施例１と同様に、培養開始と
ともに、化学物質の変化を一定時間ごとに二次元濃度分
布画像として観測する。測定する化学物質は、水素イオ
ンを始め、あらゆる化学物質が可能である。微生物が存
在しておれば、一定時間培養を続けると、微生物はその
個体数を増やし、いくつかの個体が集合したコロニーを
形成する。このコロニーの周囲では、化学物質の濃度が
培養開始時の値と異なってくるので、二次元濃度分布画
像により迅速かつ容易に特定できる。

【００４１】上記二次元濃度分布画像により微生物の存
在を確認するのみならず、目視やＣＣＤカメラによる実
際の画像（電磁波画像）を基に、培地上のどの部分に微
生物が存在しているのか、さらには、微生物中のどの部
分で化学物質の濃度変化が生じているかなど、関心のあ
る部位を特定すること、すなわち、化学情報と物理情報
との相関を得ることもできる。特に、上述したカルシウ
ムイオンや乳酸イオンなどは、生体反応で頻繁に見られ
る物質であり、この発明の測定方法が、微生物Ｂを有効
に利用したプロセスのみならず、生体反応などの研究に
も適用できる。

【００４２】なお、上述の光走査型二次元濃度分布測定
装置においては、半導体基板２の裏面側（センサ面４と
は反対側）からプローブ光６を照射するようにしている
が、これに代えて、センサ面４側から照射するようにし
てもよい。

【００４３】

【発明の効果】以上説明したように、この発明方法によ
れば、微生物が存在しているか否か、存在しておればど
の程度活動するかなど微生物の活動状態を容易かつ迅速
に、しかも、リアルタイムに評価することができる。し
たがって、微生物を利用した各種のプロセスにおける最
適な微生物のスクリーニングやその微生物の最適活動条
件を、迅速かつ容易に行うことができる。また、有害な
微生物の存在を迅速に知ることも可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の計測方法において用いる光走査型二
次元濃度分布測定装置の一例を概略的に示す図である。

【図２】第１実施例を説明するための図である。

【図３】動作説明図である。

【図４】第２実施例を説明するための図である。

【図５】第３実施例を説明するための図である。

【符号の説明】

２５…培地、Ｂ，Ｂ₁，Ｂ₂，Ｂ₃，Ｂ₄…微生物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者赤野裕文愛知県半田市有脇町２−46−28 (72)発明者野村聡京都府京都市南区吉祥院宮の東町２番地株式会社堀場製作所内 (72)発明者冨田勝彦京都府京都市南区吉祥院宮の東町２番地株式会社堀場製作所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物を活動させたいプロセス中または
環境中で活動させたり、培地で培養し、そのとき微生物
の代謝によって変化する化学物質の変化を二次元画像と
して観測し、その画像変化に基づいて微生物の活動状態
を数値的に把握するようにしたことを特徴とする微生物
活動状態計測方法。