WO2005049854A1

WO2005049854A1 - 土壌微生物を格納したバイオセンサーおよびその利用

Info

Publication number: WO2005049854A1
Application number: PCT/JP2004/016422
Authority: WO
Inventors: Yoshihiro Hashimoto; Isao Karube
Original assignee: Sakata Seed Corporation; National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date: 2003-11-19
Filing date: 2004-11-05
Publication date: 2005-06-02
Also published as: EP1700919A4; EP1700919A1; JPWO2005049854A1; JP4528939B2

Abstract

　多様な現場の土壌について、環境測定技術などに利用されている微生物センサーを、環境中の成分検出や濃度測定に使用するのではなく、目的とする土壌微生物の多様な現場土壌環境に対する環境適応能力を評価する手段として使用し、比較検討を行った。その結果、本発明者らは、該微生物センサーにより、生態系における一般土壌微生物と病原微生物の増殖能力を調べる事により、土壌生態系のバランスを見る事ができ、さらに、病害発生の危険性や一般土壌微生物の生物防除効果の判定を行なうことができる事を見出した。

Description

明細書

土壌微生物を格納したバイオセンサーおよびその利用

技術分野

[0001] 本発明は、土壌微生物を利用したバイオセンサー、並びに、該バイオセンサーを利用した、土壌微生物の増殖能力の評価、土壌病害発生の危険性の評価、および生物防除効果の評価に関する。

背景技術

[0002] 医療分野で、特にガンなどの難病は、発見が遅れれば遅れるほど治療が難しくなる事から、「早期発見 ·早期防除」に向けた各種手法の開発が求められているが、農業分野でも同様のことが言われてきた。特に、土壌病害に関しては、「早期発見 '早期防除」の手法を開発する事が重要と考えられてきた。

[0003] 農業では、一般には作物を連作すると病害の発生頻度が高まる事が知られているものの、生産効率と作業性を考慮すると連作が継続される事が多い。その後、発病が確認されてから対策が検討されるが、発病後の修復は非常に困難であり、一般に病害は拡大し、ひどい場合には産地が崩壊する事もある。従って、病害発生についてより早期の発生予測、病害の軽減対策および周辺への拡大防除が必要とされている。病害の発生には、土壌微生物、特に直接的な要因となる土壌伝染性植物病原微生物、および拮抗微生物などを含む一般土壌微生物が関わっている。また、これらの土壌微生物を取りまく環境要因によっても病害の発生は影響される。

[0004] 土壌微生物、特に土壌伝染性植物病原微生物および一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む）は、その菌数および種類が膨大であり、すべてを調査することは困難である。現状は、選択培地を用いた土壌中の菌数測定、顕微鏡を用いた直接または間接顕鏡法、抗体を用いた検出方法、 DNAプローブを用いた検出方法などが行われている力これらの方法では、供試土壌においてサンプリングした時点に目的の微生物がいるかどうかの確認、またはその菌数までの情報し力得られな力つた。また、土壌微生物の検出においては、数日力数週間の培養時間が必要であったり、技術を習熟するまでに相当な時間を要したり、面倒な前処理が必要であったりする等の問題があつた o

[0005] 現場圃場は、（1)土壌の種類が砂質、粘土質、重粘土質、火山培土、沖積土など多岐にわたる、（2)気象条件が変動するだけでなぐ緯度、地形などの地形要因も含めて考えなければならない、（3)栽培する作物履歴が稲、麦などの穀物類、トマト、ナスなどの果菜類、ブロッコリ一、キャベツ、レタスなどの葉菜類、ダイコン、ニンジンなどの根菜類、花卉など多岐にわたる、（4)肥料、農薬、堆肥、その他資材の使用履歴が現場によって様々である、などの特徴を有する。この様な複雑系である現場圃場において、発病予測の一般解を求める事は困難である。

[0006] 従って、仮に一つの土壌に絞って発病予測の調査を行う事にした場合、膨大な経費と時間を費やして現状のあらゆる理ィ匕学分析を行い、窒素、燐酸、カリ、その他の微量要素、 pH、 EC、三相分布、透水性、排水性、微生物の菌数 ·種類などを調べ上げたとしても、数ケ月力数年の時間が必要であり、結果が出た時には、すでに現場の土壌環境は変化してしまっている。また、現状の科学技術では解析できない未知の要因（unknown factor)の問題が残されて!/、る。

[0007] 近年、複雑系の科学という分野が開けてきて、従来のように因子を個別に分けて分祈するのではなぐ複雑系を分解せずにトータルの系として考察する手法が発達してきている。例えば、土壌に関して酵素活性や呼吸活性を測定する手法が出てきたが、これらの結果について何が言えるの力まだ明確とはなっていない。土壌微生物については、資化性パターン、 DNAパターン、脂肪酸組成パターンなどのパターン分類カゝら多様性にっヽて評価する手法が提案され、土壌微生物の多様性が高!、土壌の方が、病害に対して抵抗性があるという報告もある。し力しながら、これだけで発病予測を行うには充分とは、えな、。

[0008] 一般的な発病予測の方法は、過去数年間の発病度調査結果など力増加傾向にあるか、減少傾向にあるかを推定する事が行われてきた。し力しながら、昨年まで全く発病しな力つた土壌で、突然、発病が確認されたり、昨年まで病害で困っていた圃場で突然発病しなくなったりする事例は多ぐ気象条件が変化した為であるとか、新たに加えた資材の効果であるとか説明される事があるが、あくまで推測の域を出ないし、予測を行うまでに数年間の調査が必要であった。 [0009] 発病予測について十分な結果は出ないものの、現場生産者からの要請にこたえる形で、様々な土壌病害防除に関する試験が行われている。一般には、病害発生圃場を用いて、作型変更、輪作、品種改良、農薬、肥料、微生物資材を含む土壌改良資材、土壌消毒などの試験が行われている。しかしながら、これには広い試験圃場が必要であり、限られた試験圃場にお、て数多くの試験を一度に行うことは無理があり、しかも環境変動により再現性が難しい事を考えると、数年に渡り再現性を見なければならないなど、時間は掛かり、し力も試験点数は稼げないという事で、非常に効率が悪かった。

[0010] また、土壌病害に困っている現場生産者は、多くの拮抗微生物を含む微生物資材を試みている力その効果は、非常に不安定で現場生産者の声も様々である。その原因は、多くの場合、土壌条件によって投入した拮抗微生物がうまく土壌および植物根圏に定着できな力つた、あるいは病原微生物の菌密度が高すぎて微生物資材の投入量が少なカゝつたなどと説明されるが、投入した微生物が現場土壌にうまく定着できるかどうかについては、土壌中は複雑なブラックボックスであり、実施してみなければ判らないし、拮抗微生物と病原微生物の動態については、ほとんど調査は行われていない。わずかに、薬剤耐性などの遺伝的マーカーを付与してその後の微生物の動態を調査する試験が行われているが、マーカー付与した微生物は広く一般に使用できるものではないし、また、この試験は結果を予測するのではなぐ結果を調査するレベルに留まっている。

[0011] バイオセンサー (非特許文献 1一 3)は、主に、環境測定技術として生物化学的酸素要求量 (BOD)測定 (特許文献 1一 3)や、シアン (特許文献 4、 5)、水銀 (特許文献 6) 、アルコール (特許文献 7、 8)、界面活性剤 (特許文献 9)、リン酸 (特許文献 10、 11)、アンモニアなど (特許文献 12)の環境中に含まれる有害成分や栄養分などの検出または濃度測定の為のセンサーとして開発されてきた。さらに、この技術の応用として、食品中の成分の簡易検出や、医療診断用の血液中の血糖値、尿中の尿素濃度などの測定への応用 (非特許文献 4、 5)が考えられてきている。すなわち、これまでのバイォセンサー技術の目的は、検体中の成分の検出や濃度測定であった。

従って、土壌微生物、土壌病害、植物病理に関するバイオセンサーの開発は全く行われていなかった。

特許文献 1：特公昭 58-30537

特許文献 2：特開平 7-167824

特許文献 3：特開平 5-137597

特許文献 4：特開平 8-211011

特許文献 5：特開平 9-297105

特許文献 6：特開平 5-023198

特許文献 7：特開平 5-041999

特許文献 8：特公平 6-041928

特許文献 9：特開平 8-196295

特許文献 10：特開平 5-093692

特許文献 11：特公平 8-020401

特許文献 12 :特開平 11-125600

特許文献 13：特開平 2-193059

特許文献 14 :特開昭 53-137198

特許文献 15：特公平 1-22898

特許文献 16：特開昭 55-16203

特許文献 17：特開昭 59-27255

特許文献 18：特公昭 57-15696

特許文献 19：特公昭 57-54742

特許文献 20：特公昭 61-7258

特許文献 21：特開昭 57-173745

特許文献 22：特開昭 59-133454

特許文献 23：特開平 5-252994

特許文献 24：特公昭 58-36736

非特許文献 l : Biosensors&Bioelectronics, 16 (2001) 337-353 非特許文献 2 Journal of Biotechnology, 15 (1990) 255-266 非特許文献 3 Journal of Biotechnology, 15 (1990) 267-282 非特許文献 4 : Methods in Enzymology, 137 (1988) 131-138

非特許文献 5 : Biosensors&Bioelectronics, 16 (2001) 337-353

非特許文献 6 : Microbial. EcoL, 45(3) (2003) 226-236

非特許文献 7 : Soil. Sci. Soc. Am. J., 66(2) (2002) 498-506

非特許文献 8 : Analyst, 127(1) (2002) 5-7

非特許文献 9 : Biosensors&Bioelectronics, 16 (2001) 667-674

非特許文献 10 : Environ Pollut 113 (2001) 19-26

非特許文献 11 : Field Anal. Chem. Tech., 4(5) (2000) 239-245

非特許文献 12 : Soil Biol. Biochem., 32(5) (2000) 639-646

非特許文献 13 : Soil Biol. Biochem., 32(3) (2000) 383-388

非特許文献 14 :Appl. Environ. Microbiol, 69(6) (2003) 3333-3343

非特許文献 15 :Appl. Environ. Microbiol, 60(8) (1994) 2869-2875

非特許文献 16 : Can. J. Microbiol, 47 (2001) 302-308

非特許文献 17 :Appl. Environ. Microbiol, 67(3) (2001) 1308-1317

発明の開示

[0012] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡単に短期間に、土壌微生物の増殖能力を測定しうる方法を提供することにある。さらに、この方法の利用態様として、簡単かつ短期間に、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性を評価する方法、および土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対する一般土壌微生物の防除効果を評価する方法を提供することも本発明の目的である。

[0013] 本発明者らは、上記の課題を解決すベぐ多様な現場の土壌について、環境測定技術などに利用されている微生物センサーを、環境中の成分検出や濃度測定に使用するのではなぐ目的とする土壌微生物の多様な現場土壌環境に対する環境適応能力を評価する手段として使用し、比較検討を行った。その結果、本発明者らは、該微生物センサーにより、生態系における一般土壌微生物と病原微生物の増殖能力を調べる事により、土壌生態系のバランスを見る事ができ、さらに、病害発生の危険性や一般土壌微生物の生物防除効果の判定を行なうことができる事を見出した。 [0014] 特に、土壌伝染性植物病原微生物を収納したセンサーユニットと一般土壌微生物を収納したセンサーユニットを用いて計測された一般土壌微生物 Z病原微生物の電極応答比は、この判定のための有効な指標となった。

[0015] すなわち、該電極応答比が高ければ、病原微生物の増殖よりも一般土壌微生物の増殖が上回る為に、土壌生態系のノランスは、一般土壌微生物の方が病原微生物よりもより多く存在する方向に向力う事が予想され、病害の発生もしくは拡大の危険性は低ぐまた、土壌における該一般土壌微生物の生物防除効果が高いと予想しうる。

[0016] 一方、該電極応答比が低ければ、病原微生物の増殖速度がその他の一般土壌微生物の増殖を上回る事が予想され、土壌生態系のバランスは、病原微生物の方が一般土壌微生物より多く存在する方向に向力う事が予想され、病害の発生もしくは拡大の危険性は高いと予想される。また、土壌における該一般土壌微生物の生物防除効果が低いと予想しうる。

さらに、現状分析により、病原菌と一般土壌微生物の数量および圃場の発病状況を含めて判断すれば、病害発生の危険性についての予測は、より精度を高める事ができる。

この技術は、特に病害未発生圃場における病害発生の可能性について、早期土壌診断が可能となる点で非常に有用である。

[0017] 即ち、本願は、より具体的には、下記発明を提供するものである。

〔1〕土壌における土壌微生物の増殖能力を測定する方法であって、

(a)それぞれ酸素電極と土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有する複数のセンサーであって、それぞれのセンサーの収納部に異なる土壌微生物が収納されて、る複数のセンサーを、測定する土壌の土壌懸濁液に接触させ、

(b)それぞれのセンサーの出力電流の減少量または減少速度の差異を計測する、ことを含む方法。

〔2〕土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性を評価する方法であって、

(a)酸素電極と一般土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有するセンサーおよび酸素電極と土壌伝染性植物病原微生物を収納した収納部と固定部材カもなるユニットを有するセンサーを、測定する土壌の土壌懸濁液に接触させ、

(b)それぞれのセンサーの出力電流の減少量または減少速度を計測する、ことを含み、

一般土壌微生物における出力電流の減少量または減少速度が、土壌伝染性植物病原微生物における出力電流の減少量または減少速度より有意に高い場合に、測定する土壌における、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性が少な!ヽと判定される方法。

〔3〕土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対する一般土壌微生物の防除効果を評価する方法であって、

一般土壌微生物における出力電流の減少量または減少速度が、土壌伝染性植物病原微生物における出力電流の減少量または減少速度より有意に高い場合に、測定する土壌における、該土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対し、該ー般土壌微生物が防除効果を有すると判定される方法。

〔4〕それぞれ酸素電極と土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるュ-ットを有する複数のセンサーであって、それぞれのセンサーの収納部に異なる土壌微生物が収納されている複数のセンサーを含む、上記〔1〕に記載の方法に用いるためのキット。

[5] 酸素電極と一般土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有するセンサーおよび酸素電極と土壌伝染性植物病原微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有するセンサーを含む、上記〔2〕または〔3〕に記載の方法に用いるためのキット。

図面の簡単な説明

[図 1]基質 (PD broth)添カ卩によるフザリウム (Eus i l)属菌を収納した微生物センサ一の応答性を示す図である。縦軸は微生物センサーの電流値 (nA)を、横軸は PD broth添力卩量を示す。

[図 2]根こぶ病菌を収納した微生物センサーの酵母エキスに対する応答を示す図である。縦軸は微生物センサーの電流値 (nA)を、横軸は固定化菌体量 (ml)を示す。

[図 3]土壌病害発生予測用微生物センサーの構造を示す図である。

[図 4]微生物センサーユニットの構造を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 本発明は、土壌における土壌微生物の増殖能力を測定する方法を提供する。該方法は、 (a)それぞれの酸素電極と土壌微生物を収納した収納部と固定部材カもなるユニットを有する複数のセンサーであって、それぞれのセンサーの収納部に異なる土壌微生物が収納されて、る複数のセンサーを、測定する土壌の土壌懸濁液に接触させ、（b)それぞれのセンサーの出力電流の減少量または減少速度の差異を計測する、ことを含む。

[0020] 本発明にお、て用いられる土壌微生物の種類にっ、ては特別な制限はなく、従来技術により分離'培養可能な微生物であればよい。また、根こぶ病菌のような培養できな、微生物につ、ても植物体を利用した増殖方法を利用して増殖し単離すれば、使用することができる。

[0021] 土壌微生物の種類としては、好ましくは下記に記載の微生物が挙げられる。

まず、本発明の土壌伝染性植物病原微生物としては、細菌類、放線菌類、糸状菌類に分けられる。

[0022] 土壌伝染性植物病原性細菌としては、青枯病菌 (Ralstonia solanacearum)、軟腐病菌 (Erwinia属、 Pseudomonas属)、根 g頁んしゅ 3丙菌 (Agrobacteriumfe;など力げ、られる。

[0023] 土壌伝染性植物病原性放線菌としては、そうか病菌 (StreDtomvces属)が举げられる

[0024] 土壌伝染性植物病原性糸状菌類としては、苗立枯病菌 (Pvthium属、 Rhizoctonia 属など)、 te.こぶ病慮 Plasmodiophora brassicae 、 -fe-fe菌 (Phvtophutora腐、 Verticillium属、 Fusarium.属、 Rhizoctonia属)、紋 ^习病菌 (HdicobasidiumJ¾、 Rosellinia属)、白絹病菌 (Corticium属)、褐色根腐病菌 (Pyrenochaeta属)、条斑病菌 (Cephalosporiumfe, 、草腐柄菌 (Cvlindrocarpon )などが挙げられる。

[0025] また、本発明の一般土壌微生物としては、拮抗性細菌類、拮抗性糸状菌類、（以上、拮抗微生物類)、一般土壌細菌類、一般土壌放線菌類、一般土壌糸状菌類などに分けられる（土と微生物、（1981)土壌微生物研究会編博友社)。

[0026] 拮抗性細菌類としては、例えばバチルス (Bacillus)属、非病原性ァグロバクテリゥム

(Agurobacterium)属、ェンテロノクタ一（Enterobacter)属、シユードモナス(

Pseudomonas)属、キサントモナス（Xanthomonas)属、ストレプトマイセス（

Streptomvces)属、非病原性エルビニァ (ED^)属、パスッリア（Pasteuria)属、などが挙げられる。

[0027] 拮抗性糸状菌類としては、例えばァスペルギルス (Aspergillus)属、非病原性フザリゥム (Fusarium)属、グリオクラディウム (Gliocladium)属、ぺ-シリウム (PenicilliuTn)属、ピシゥム（Pvthium)属、トリコデノレマ (Trichoderma)属、フォーマ（Phoma)嵐、タラ口マイセス (Talaromvces)属などが挙げられる。

[0028] 一般土壌細菌類としては、ァセトパクター (Acetobacter)属、アルカリゲネス（

Alcalieenes)属、バチルス（Bacillus)属、バークフオルデリア（Burkholderia)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacterium)鼠、フラボノクテリゥム（Flavobacterium)属、グノレコノパクター（Gluconobacter)属、ラクトバチノレス (Lactobacillus)属、マイコバクテリゥム（ Micobacterium)腐、ミクロコッカス (Micrococcus)鼠、プロテウス（Proteus)属、シユードモナス (Pseudomonas)属、リゾビゥム (Rhizobium)属、ロドコッカス (Rhodococcus)属、スフインゴモナス（Sphingomonas)属、ストレプトコッカス（Streptococcus)属、ザィモモナス (Zvmomonas)属などが挙げられる。

[0029] 一般土壌放線菌類としては、ストレプトマイセス (Streptomvces)属、ァクチノマデュラ

(Actinomadura)属、グリコマイセス (Glvcomvces)属、ノカノレディア (Nocardia)属、サッカロモノスポラ (Saccharomonospora)属、ストレプトバーテイシリゥム（

Streptoverticillium)属などが挙げられる。

[0030] 一般土壌糸状菌類としては、ァファノマイセス (Aphanomvces)属、ァスペルギルス ( Aspergillus)属、キャンディダ（Candida)属、クラドスポリゥム（CladosQorium)属、ムコール（Mucor)属、ぺニシリウム（Penicillium)属、フイトフィトラ（Phvtophthora)属、リゾブス（Rhizopus)属、トリコデルマ（Trichoderma)属、トルラ（I^mk)属などが挙げられる。

[0031] 本発明の一般的な微生物の培養条件に関しては、実験書 (新編土壌微生物実験法、（1997)土壌微生物研究会編、養賢堂)等に記載されている条件を用いることができる。培地は、例えば、肉エキス培地、 LB培地、ポテトデキストロース培地（PD培地 )などを用い、培養方法は、例えば、シャーレ、試験管、フラスコ、ジャーファメンターなどの容器内で、静置、振とう、攪拌などの条件で行えば良ぐ特殊な培養条件で行う必要はない。また、培養できない微生物であっても、根こぶなどの植物の特定の部位にて増殖させ、大量に単離できれば、これを利用する事も可能である。

[0032] 本発明に用いられるバイオセンサーの酸素電極としては、一般に使用されている酸素電極であれば良ぐガルバニック型、ポーラ口型いずれでも良く市販のものを使用することができる。

[0033] バイオセンサーを構成する微生物収納部については、微生物が収納部からできる限り漏れ出さない事が望ましぐ水や水に溶けている酸素などの揮発性物質や、微生物の呼吸活性に影響を及ぼす有機物質や、呼吸活性を阻害する物質など (水に溶解している物質および微生物よりも微細な粒子)を透過するサイズの網目を持つ膜であり、微生物を保持する為の充分な強度を持っている材料であれば良い。例えば、 0.45 μ mの-トロセルロース膜ゃァセチルセルロース膜などが使用される。

[0034] 微生物を収納する方法としては、微生物の懸濁液を-トロセルロース、ァセチルセルロース、ナイロン膜などに滴下し、下から吸引するまたは、上部より加圧する事により、水および水溶性物質を吸引または加圧除去し、微生物をフィルター上に吸着固定化する方法や、微生物をアルギン酸カルシウムなどのゲルに固定ィ匕した後、薄膜切片を作成する方法などがある。

[0035] ノィォセンサーを構成する固定具としては、微生物収納部を、電極にできるだけ密着して固定する事ができ、かつ土壌懸濁液力もの酸素などの揮発性物質および微生物の呼吸活性に及ぼす有機物質や阻害物質などが固定化した微生物および電極への拡散を妨げない固定具であれば特に制限はない。例えば、微生物の固定化した膜の下の部分は、ナイロンネットや金網などで作成する事により、水溶性の物質や微細な粒状物質などを透過でき、固定具の側面はブラスティックなどで作成し、ネジ込み式にしたり、 0-リング、チューブなどを用いて電極に固定ィ匕する。

[0036] ノィォセンサーに接触させる土壌懸濁液は、現場圃場より適量 (例えば、 10g— l,000g)の土壌を採取し、適量 (例えば、土壌試料 1に対して、 1一 100倍量)の水、溶媒または緩衝液を加えて良く攪拌して、混合した後、遠心分離またはろ過などを行なうことにより取得した上清液が好ましい。

[0037] 出力電流の検出においては、微生物を収納した微生物センサーに適量 (例えば、

0.01— 1,000ml)の土壌懸濁液を接触させ、攪拌しながら出力電流の減少量または減少速度を計測する。その結果、出力電流の減少量または減少速度が大きいほど、該土壌微生物の呼吸活性が高ぐ酸素消費量が多い事、すなわちその土壌において該微生物の増殖能力が高いこと (該微生物の増殖に好適な土壌環境であること）が判る。出力電流の減少量又は減少速度が小さい場合には、該土壌微生物の呼吸活性は低ぐ酸素消費量が少ない事を意味し、該土壌微生物の餌となる有機物含量が少ないか、または該土壌微生物の呼吸活性を阻害する物質が含まれるなど、その土壌にぉ、て該微生物の増殖能力が低、こと (該微生物の増殖にとって好ましくな！/、土壌環境であること)が判る。

[0038] 複数の微生物をそれぞれ別個の微生物センサーに収納して、同様な調査を行う事により、現場土壌においてどんな種類の微生物が相対的に増殖能力が高いか (優先的に増殖することができるか)を判定することができる。また、拮抗微生物を土壌に投入する場合に、拮抗微生物が、現場土壌環境に適応できるかどうかを判定することができる。また、堆肥の発酵過程における複数の微生物の動態調査を行なうことも可能である。

[0039] 上述した土壌微生物の増殖能力を測定する方法において、異なる微生物として、一般土壌微生物および土壌伝染性植物病原微生物を利用すれば、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性を評価することも可能である。

[0040] 即ち、本発明は、（a)酸素電極と一般土壌微生物を収納した収納部と固定部材からなるユニットを有するセンサーおよび酸素電極と土壌伝染性植物病原微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有するセンサーを、測定する土壌の土壌懸濁液に接触させ、 (b)それぞれのセンサーの出力電流の減少量または減少速度を計測する、ことを含む、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性を評価する方法をも提供する。

[0041] この方法においては、一般土壌微生物における出力電流の減少量または減少速度が、土壌伝染性植物病原微生物における出力電流の減少量または減少速度より有意に高い場合には、測定する土壌における、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性が少ないと判定される。一方、一般土壌微生物における出力電流の減少量または減少速度が、土壌伝染性植物病原微生物における出力電流の減少量または減少速度より有意に低い場合には、測定する土壌における、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性が大きいと判定される。

[0042] また、同様に、（a)酸素電極と一般土壌微生物を収納した収納部と固定部材カもなるユニットを有するセンサーおよび酸素電極と土壌伝染性植物病原微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有するセンサーを、特定の土壌の土壌懸濁液に接触させ、

(b)それぞれのセンサーの出力電流の減少量または減少速度を計測する、ことにより、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対する一般土壌微生物の防除効果を評価することも可能である。即ち、本発明は、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対する一般土壌微生物の防除効果を評価する方法をも提供する。

[0043] この方法においては、一般土壌微生物における出力電流の減少量または減少速度が、土壌伝染性植物病原微生物における出力電流の減少量または減少速度より有意に高い場合に、測定する土壌における、該土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対し、該一般土壌微生物が防除効果を有すると判定される。一方、一般土壌微生物における出力電流の減少量または減少速度が、土壌伝染性植物病原微生物における出力電流の減少量または減少速度より有意に低い場合に、測定する土壌における、該土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対し、該一般土壌微生物が防除効果を有しないと判定される。

[0044] 一般土壌微生物における出力電流の減少量または減少速度と、土壌伝染性植物病原微生物における出力電流の減少量または減少速度との比較は、電極応答比（一般土壌微生物 Z病原微生物)として評価することが可能である。例えば、病原微生物を収納した微生物センサーと比較して、一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)を収納した微生物センサーの電極応答が有意に高ければ、病原微生物に比べて一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)の増殖が速ぐ今後の病害発生の危険性は軽減する方向に向力う事が予想できる。この場合、該一般土壌微生物は、その土壌において防除効果があると判定することができる。

[0045] ここで「病原微生物を収納した微生物センサーと比較して、一般土壌微生物を収納した微生物センサーの電極応答が有意に高い」とは、通常、電極応答比が 0.4以上、好ましくは 0.6以上、さらに好ましくは 2.0以上であることを意味する。この数値は、後述するように現状の発病度、病原菌と一般土壌微生物の菌密度または存在比率の測定結果に基づく補正により、より信頼性を高めることができる。

[0046] 病原微生物を収納した微生物センサーと比較して、一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む）を収納した微生物センサーの電極応答に違いがなければ、病原微生物と一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む）は、ほぼ同様な増殖を示す事が予測され、今後の病害発生の危険性は、現状と変わらない事が予想される。この場合、該一般土壌微生物の、その土壌においての防除効果は、不明と判定することができる。

[0047] もしくは、病原微生物を収納した微生物センサーと比較して、一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)を収納した微生物センサーの電極応答が著しく小さ、場合には、病原微生物の増殖速度が速ぐ一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)の増殖速度が遅い為に、病原微生物を抑える事は難しぐ今後、病害の発生の危険性は、さらに増大する方向に向力事が予測できる。この場合、該一般土壌微生物は、その土壌にぉ、て防除効果が少な、と判定することができる。

[0048] 現状の発病度、病原菌と一般土壌微生物の菌密度または存在比率の測定結果から、現状を把握した後にバイオセンサーを用いた電極応答比の結果を判断すれば、発病の危険性についての予測精度を、より向上させることが可能である。例えば、病原菌が一般土壌微生物に対して、菌密度または存在比率が著しく高い場合には、防除効果は相対的に少なくなる (表 29参照)。また、発病程度が高い場合には防除価が低く出る傾向が認められる (表 24、表 25、表 27の各 2回の試験 (1)と (2)の発病度と防除価を参照のこと)。例えば、発病度 90%以上の激発生条件下では、電極応答比が有為に高くとも短期間では病害軽減効果を発現させる事は難しい (実施例 12より)。

[0049] 現場の土壌における発病度は、実施例 11や 12に示したように、作物を作付けして、病害発生状況を調査することにより評価することができる。また、土壌における病原微生物および一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)の菌数は、選択培地を用いた一般的な希釈平板法または、直接顕鏡法、抗体法、 DNAプローブを用いた方法などで各目的の微生物の土壌中における存在比率を把握する事ができる。また、希釈平板法で得られたコロニー力病原微生物や優先種を選別して単離し、本発明の微生物センサーに固定ィ匕することができる。また、圃場に投入する予定の拮抗微生物の菌数は、資材によっては菌密度が記載されているものもあるが、一般的な希釈平板法などで容易に測定できる。

また、本発明を応用すれば、以下に示すような、病害軽減対策に関する、土壌改善提案 (処方箋)の作成を行うことができる。

[0050] 現場土壌をポットに詰めて、肥料、農薬、土壌改良資材などの投入や、土壌 pH、有機物含量などの調整、透水性、保水性、通気性、生物性などの土壌改良を行い、土壌の化学性、物理性、生物性を改良する事ができるが、これに伴い、同時に病原微生物および一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)の増殖速度も変化する。どの資材をどの程度投入した場合に、病原微生物の増殖速度が小さくなるかを病原微生物を収納したセンサーを用いる事により、容易に判断する事ができる。同様に、一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)の増殖速度が大きくなるかにつ!/ヽて、一般土壌微生物（拮抗微生物を含む)を収納した微生物センサーを用いる事により、容易に判断する事ができる。

[0051] 上記の結果から、両微生物センサーの電極応答比 (一般微生物 Z病原微生物)が最も大きくなる条件、すなわち、病原微生物の酸素消費速度が小さぐかつ拮抗微生物の酸素消費速度が大きくなる土壌改良の最適化（目標値)を明確にでき、現場土壌環境に合わせた改善提案 (処方箋)を作成する事ができる。

[0052] また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットを提供する。例えば、土壌微生物の増殖能力を測定する方法に用いるキットにおいては、それぞれ酸素電極と土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有する複数センサーであって、それぞれのセンサーの収納部に異なる土壌微生物が収納されている複数のセンサーを含む。

[0053] また、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性を評価する方法、あるいは、土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対する一般土壌微生物の防除効果を評価する方法に用いるキットにおいては、酸素電極と一般土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有するセンサーおよび酸素電極と土壌伝染性植物病原微生物を収納した収納部と固定部材からなるュニットを有するセンサーを含む。

これらキットにおいては、使用説明書などをさらに含んでいてもよい。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0054] 以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[0055] 〔実施例 1〕フザリウム (Ε Ϊ 1)属菌を収納した微生物センサーの作成とその応答性

植物病原微生物の代表として、レタス根腐病菌 (Fusarium oxvsporum f. sp.

Lactucum) SN3B株を用いた。

SN3B株は、長野県洗馬地区にて分離され、長野野菜花卉試において nit—の遺伝子欠損マーカーを導入された株であり、長野県中信農業試験場より分譲して戴いたフザリウム属菌をポテトデキストロース液体（PD broth)培地にて 25°C、 1週間培養した。ガーゼろ過により菌糸を除去した後、遠心分離により胞子を集菌し、 20mMリン酸緩衝液 (ρΗ 7.0)にて 2回洗浄した。この時の菌濃度は、 OD660 = 1.33であった。血球計数盤にて胞子数を計数した結果、胞子数は、 1.0 X 10⁶個 I mlであった。

[0056] 培養液 2mlの菌体を 0.45 μ mの-トロセルロースフィルター上に吸引 ·固定ィ匕し、微生物センサーユニットに収納した。（収納した胞子数 2.0 X 10⁶個 I filter)

50mlの 20mMリン酸緩衝液（pH 7.0)をビーカーに入れ、ウォーターバスで水温を 30 でとした。フザリウム属菌を収納した微生物センサーを挿入し、スターラーにて緩やかに攪拌した。注) (攪拌速度により空気中からの酸素供給速度が変化する為、スターラ一の回転数は固定して実験を行った（回転数:約 100— 200 rpm) ) ₀

微生物電極の膜に発生する電流値 (nA)を計測した。

[0057] まず最初に、ベースラインが安定したところで、各種有機物を添加しフザリウム属菌を収納した微生物センサーの応答性を確認した。結果を表 1および図 1に示す。結果は、グルコース、フラクトースのような単一糖類を添加するよりも、実際に培養する培地 PD broth等を用いるほうが良く応答した。また、 PD brothの添加量としては、 500 1 / 50 mlが最も高い応答を示した。

[0058] [表 1]

基質添加によるフザリゥム属菌を収納した

微生物センサーの応答性

*相対値は PD broth 200 μ 1添加の時の電流値の減少を 100として算出した。

[0059] 次に、各種土壌および堆肥のサンプルに 20 mM燐酸緩衝液 (pH 7.0)をカ卩え、よく混合後、室温でインキュベートした後、遠心分離を行い、上清液を採取した。結果を表 2 に示した。 30°Cに保温した 20 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0)50 mlにフザリウム属菌を収納した微生物センサーを挿入し、ベースラインが安定している事を確認した後、各種土壌.堆肥サンプルの上清液 5 mlを加え、フザリウム属菌を収納した微生物センサーの応答性を調べた。 [0060] 表 2の結果から、フザリウム属菌を収納した微生物センサーが、各種土壌サンプル、堆肥サンプルに対してよく反応する事がわかる。黒土の場合、インキュベーションが短時間 (2時間程度)であれば、フザリウム属菌が利用できる有機物が少量存在するものの、 2日も置くと電極の応答は見られな力つた。このことは、フザリウム属菌が容易に消費できる有機物が少なくなつた場合と、フザリウム属菌の生育や呼吸を阻害を引き起こすような土壌の静菌作用 (unknown factor)によるものの 2つの場合が考えられる力肉眼観察の結果力も上清液の色は 2日置いたものの方が明らかに濃ぐ有機物含量は高いと判断された。従って、この結果は、黒土由来の静菌作用物質 (unknown factor)力 ^日インキュベーションにより出てきた可能性が高いと考えられる。また、有機物含量の明らかに少ない赤玉土では非常に小さな値となった。完熟堆肥 (鶏糞)や薬草堆肥、腐葉土などの有機物の豊富なサンプルでは、明らかにフザリウム属菌の初期の酸素消費が高くなる傾向が認められた。長後農場の様な一般の土壌サンプルにお!ヽてもフザリウム属菌を収納した微生物センサーは、充分に応答する事が確かめられた。

また、土壌および堆肥サンプル力もの抽出については、振とうせずに 2日間静置してもあまり効果なぐむしろ 2時間でもよく振とうした方が良いことが判った。

[0061] [表 2]

各種土壌および堆肥サンプルに対するフザリゥム属菌を

収納した微生物センサーの応答性

*相対値は、完熟堆肥 (鶏糞)、商品名：バイテクバイオエース、 2日静置を

100として算出した。 [0062] 〔実施例 2〕バチルス (Bacillus)属菌を収納した微生物センサーの作成とその応答性拮抗微生物の代表として、バチルスセレウス (MU ^m K12N)株を用いた。バチルス属菌を L broth培地に植菌し、 30°Cで 24時間培養した。遠心分離により集菌し、 20 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0)で 2回洗浄した。菌濃度は、 OD660 = 0.19であつた。生菌数は、約 6.0 X 10⁶ clu I mlと算出された。

培養液 2 ml相当量を 0.45 mの-トロセルロースフィルター上に吸引して固定化し

、微生物センサーユニットへ収納した（収納した菌体量は 1.2 X 10⁷ cfo I filter)。

50 mlの 20 mMリン酸緩衝液（pH 7.0)をビーカーに入れ、ウォーターバスで水温を

30°Cとした。バチルス属菌を収納した微生物センサーを挿入し、スターラーにて緩やかに攪拌した。

微生物電極の膜に発生する電流値 (nA)を計測した。

[0063] まず最初に、ベースラインが安定したところで、各種有機物を添加しバチルス属菌を収納した微生物センサーの応答性を確認した (表 3)。

結果は、アルブミンを除き、バチルス属菌を収納した微生物センサーは応答する事がわかった。アルブミンは、水に充分溶解できな力つた為、応答しな力つたと考えられた。また、グルコースよりも実際にバチルス属菌の培養に使われるアミノ酸 'タンパク質などを豊富に含む基質である酵母エキス、トリプトン、ペプトンなどの方がバチルス属菌を収納した微生物センサーの応答性が良力つた。

[0064] [表 3]

基質添加によるバチルス属菌を収納した

微生物センサーの応答性

*相対値は、 L broth添加の時の電流値の減少を 100として算出した。

[0065] 次に、各種土壌および堆肥のサンプルに 20mM燐酸緩衝液 (pH7.0)を加え、よく混合後、室温でインキュベートした後、遠心分離を行い、上清液を採取した。 30°Cに保温した 20mMリン酸緩衝液 (pH7.0)50mlにバチルス属菌を収納した微生物センサーを挿入し、ベースラインが安定している事を確認した後、各種土壌'堆肥サンプルの上清液 5mlを加え、バチルス属菌を収納した微生物センサーの応答性を調べた。結果を表 4に示した。

結果は、有機物を豊富に含む完熟堆肥 (鶏糞) (商品名：バイテクバイオエース販売会社 (株)サカタのタネ)および腐葉土 (商品名：バイオエースソフト販売会社 (株)サカタのタネ)、薬草堆肥 (商品名:ツムランドツムラ社製)および黒土 (市販品)では、バチルス属菌を収納した微生物センサーの応答が確認された。また、現場の土壌サンプルである長後農場ハウスおよび長後農場の露地の土壌サンプルにおいても応答性が確認された。一方、有機物含量の少ない赤玉土 (市販品)では、応答しなカゝつた。

[0066] [表 4] 各種土壌および堆肥サンプルに対するバチルス属菌を

収納した微生物センサ一の応答性

*相対値は、完熟堆肥 (第粪)、商品名：パイテクバイオエースを 100とした時の値を示した。

[0067] 〔実施例 3〕バチルス属菌を収納した微生物センサーとフザリウム属菌を収納した微生物センサーの応答性の比較

実施例 1および実施例 2と同様に培養した対数増殖期のバチルス (MI )属菌の菌体およびフザリウム属菌の胞子懸濁液を集菌、洗浄後、 660nmの吸光度を測定した。各菌濃度はバチルス属菌： 0.43、フザリウム属菌：0.1だった。それぞれの菌 1.0 ml ずつを-トロセルロースフィルター上に吸引して固定化した後、微生物センサーュ- ットに収内した。

別途、希釈平板法により、生菌数を測定し、センサーユニットに収納したバチルス属菌は、 1.4 X 10⁷ cfo I filter,フザリウム属菌は 1.0 x 10⁵ clu I filterと算出された。

通常の土壌において一般のバチルス属菌の菌密度は 10⁵— 10⁶ cfo I g土壌、一般のフザリウム属菌は 10²— 10³ clu / g土壌である事から、収納した菌体量は、バチルス属菌で約 14一 140g土壌中の菌量に相当する。また、フザリウム属菌では、約 100 一 1000g土壌中の菌量に相当する。

各種基質に対する応答性を調べた結果を、表 5に示した。表 5の結果力も明らかなように、バチルス属菌の方が、フザリウム属菌よりも酵母エキス、 L broth,完熟堆肥「バイテクバイオエース」に対する電極の応答性が良!、事が判った。

[0068] [表 5] バチルス属菌およびフザリゥム属菌を収納した微生物センサ一の応答性の比較

[0069] 〔実施例 4〕微生物センサーの応答性に対する土壌または堆肥の抽出時間の影響実施例 1のフザリウム属菌の胞子懸濁液をニトロセルロースフィルターに吸引、固定化し、微生物センサーユニットに収納した（OD660 = 1.45の胞子懸濁液を 0.35 ml収納：約 5 X 10⁵ cfo / filiter)。

堆肥サンプルとしては、市販の鶏糞完熟堆肥である「バイテクバイオエース」を用いた。土壌サンプルとしては、市販の「黒土」を用いた。各試料サンプル 10 gに対して 10 mM燐酸緩衝液（pH 7.0) 40 mlを添加し、 3時間、 1日、 2日、 3日振とうし、遠心分離機にて 3,000 rpm、 30分遠心し、上澄み液を得た。微生物センサーの応答性について、酵母エキスを基質として問題ないことを確認後、堆肥および土壌サンプルの抽出液を用いて応答性を調べた。

結果を表 6に示した。

[0070] [表 6] 堆肥および土壌サンプルの抽出時間が

[0071] 表 6の結果より、堆肥および土壌力の抽出に関しては、 1日一 2日間振とうして抽出する方法力データの振れも少なく安定した結果が得られる事がわ力つた。

[0072] 〔実施例 5〕各種生物農薬、微生物資材および土壌微生物を収納した微生物センサ一の作成とその応答性

[0073] [表 7]

使用した材料 ·資材一覧

[0074] 各種微生物を L brothにて 25°C、 1夜振とう培養する事により微生物を活性ィ匕した。

吸光度計で、 660應の吸光度を測定して、菌密度を算出した。その後、集菌、洗浄、フィルターに吸引、固定化し、センサーユニットへ収納した。

各種基質を用いて、各種微生物を収納した微生物センサーの応答性を調べた。結果を表 8— 10に示した。

[0075] 表 8および表 9から判るように、 L brothまたは酵母エキスを基質とした場合には、微生物センサーに収納した微生物の種類により応答に強弱はあるものの、いずれの微生物も応答する事がわ力つた。

表 10および表 11から判るように完熟堆肥 (鶏糞)や黒土などの堆肥サンプルや土壌サンプルに対してもいずれの微生物センサーも、応答する事が確かめられた。

[0076] [表 8]

各種微生物を収納した微生物センサーの L broth に対する応答

[0077] [表 9] 各種微生物を収納した微生物センサーの酵母エキスに対する応答

[0078] [表 10]

各種微生物を収納した微生物センサーの鶏糞完熟堆肥 (商品名：バイテクバイォェに対する応答

[0079] [表 11]

各種微生物を収納した微生物センサーの黒土 (市販土壌)に対する応答

[0080] 〔実施例 6〕アブラナ科根こぶ病菌を収納した微生物センサーの作成とその応答性アブラナ科根こぶ病菌 (Plasmodiophora brassicae)は、培養できな!/、微生物である為、根こぶ病の発生している圃場より、ノ、クサイの根部に発生した根こぶを採取し、ミキサ一で粉砕し、集菌'洗浄を行う事により、胞子懸濁液を調整した。胞子密度は、血球計数盤で計測し、 2.8 X 10⁹胞子 I mlであった。

上記胞子懸濁液を 100倍に希釈し、ニトロセルロースフィルター上に 200 1、 1.0 ml、 3.0 mlを滴下し、吸引、固定ィ匕して、センサーユニットへ収納した。酵母エキスを基質として作成した根こぶ病菌を収納した微生物センサーの応答性を確認した。結果を表 12および図 2に示した。収納した胞子数と酵母エキスに対する微生物センサ一の応答には、高い正の相関が認められた。

[0081] [表 12] 根こぶ病菌菌を収納した微生物センサ一の酵母エキスに対する応答

[0082] 〔実施例 7〕健全土壌と発病土壌における微生物センサーの応答性

健全土壌としては、岩手県西根町の Y氏ハウスと、 I氏ハウスの土壌サンプルを用いた。発病土壌としては、長野県の中信農業試験場の根こぶ病発病土壌、根腐病発病土壌、長野県川上村の根腐病発病土壌サンプルを用いた。

収納する植物病原性微生物としては、アブラナ科根こぶ病菌 (Plasmodiophora brassicae)、レタス fefej)丙菌 (Fusarium oxvsporum f. sp. Lactucum) SN3B株用ヽた

。また、収納する拮抗微生物としては、バチルスセレウス（Bacillus cereus) K12N株を用いた。

収納する菌体量は、植物病原性微生物については、一般的な発病土壌における菌密度の約 10— 100倍とし、拮抗微生物については、一般的な土壌における土壌中の菌密度の約 10— 100倍とした。

結果を表 13および表 14に示した。

[0083] [表 13]

根こぶ病菌または、拮抗微生物 (バチルス属菌)を収納した微生物センサーの

土壌応答性の比較

[0084] [表 14]

根腐病菌 (フザリゥム属菌)または、拮抗微生物 (バチルス属菌)を収納した

微生物センサ一の土壌応答性の比較

[0085] 表 13の結果から、拮抗微生物 Z根こぶ病菌の電極応答比が、発病土壌においては低く（0.18)、健全土壌では高い（3.33, 1.09)事が判った。

表 14の結果から、拮抗微生物 Z根腐病微生物の電極応答比が、発病土壌においては低く（0.39, 1.46)、健全土壌では高い（1.95, 1.84)事が判った。

これらの結果から、拮抗微生物 Z植物病原性微生物の電極応答比が、発病土壌では低ぐ健全土壌では高い傾向を示す事が判った。

[0086] 〔実施例 8〕土壌の滅菌処理の効果と微生物センサーの応答性につ！、て

中信農業試験場およびその周辺地区はアブラナ科の根こぶ病の発生が多ぐクロルビクリンなどの土壌消毒を行っても一時的な効果に留まり、直ぐに根こぶ病の再発が認められるようになる。この特徴は、一般的な連作障害土壌といえる。

[0087] ところが、中信農業試験場におヽてレタス根腐病の人工汚染土壌作成を行ったところ、接種後 1作目は発病するものの、 2作目には発病しなくなり、根腐病発病土壌の作成には毎年病原菌を人工接種する必要があった、この特徴は、発病抑止型土壌

(.suppressive soil)の特徴といえる。

[0088] また、川上村地域は， 30年以上のレタス連作地域もあり、近年レタス根腐病菌の発生が確認され，年々発生の拡大が報告されている。また、土壌消毒などの対策が講じられているものの、有効な手段は見出されていない。

[0089] 上記の発病土壌ではあるものの、薬剤処理などにより容易に回復しやすい土壌 (中信地区，根腐病人工発病土 =抑止型土壌)および、薬剤処理を行っても、病害が再発しやすい土壌 (中信地区'根こぶ病自然発病土、および川上村'根腐病自然発病土 =連作障害土壌)について、土壌の滅菌処理が微生物菌を収納した微生物センサ一の応答性に及ぼす影響にっ、て調査した。

[0090] [表 15]

土壌の滅菌処理が微生物菌を収納した微生物センサ一の応答性に及ぼす影響

[0091] 表 15の結果から、人工接種によって発病させても薬剤処理などにより容易に回復しゃすい中信地区'根腐病発病土の場合には、拮抗微生物 Z病原微生物の電極応答比が滅菌処理により 5.07と高くなつており、この事は、滅菌処理後の土壌では、拮抗微生物の呼吸活性が病原微生物の呼吸活性よりも相対的に高くなつていることを示している。すなわち、滅菌処理後に両微生物が土壌中に侵入してきた場合に拮抗微生物の方が、病原微生物 (根腐病菌)よりも増殖しやすい環境であり、病害再発の危険性が低い事が予想された。この結果は、人工的に病原菌を接種しても 2作目には病害が消失するという抑止型土壌の特徴を裏付ける結果となった。

[0092] 一方、発病後，土壌消毒などの対策が一時的なものとなりやすい中信地区'根こぶ病自然発病土や〗 11上村，根腐病自然発病土では、滅菌処理土壌の拮抗微生物 Z 病原微生物の電極応答比はそれぞれ 0.32と 0.66と低ぐ拮抗微生物の呼吸活性よりも病原微生物の呼吸活性が高くなつていることが判った。すなわち、滅菌処理後に両微生物が土壌中に侵入してきた場合に拮抗微生物よりも病原微生物の方が増殖しやすい環境であり、病害の再発の危険性が高いことが予想された。この結果は、現場で土壌消毒などを行っても、効果が出にくい、また再発しやすいという結果を裏付ける結果となった。

[0093] これらの結果から、拮抗微生物 Z病原微生物の電極応答比が高、程、病害発生の危険性が低ぐ拮抗微生物 Z病原微生物の電極応答比が低いほど、病害の発生の危険性が高いことが予測された。

[0094] 〔実施例 9〕一般土壌微生物の単離と微生物センサーへの固定化とその応答性の確認

健全土壌としては、岩手県西根町の I氏ハウスの土壌サンプルを用いた。発病土壌としては、長野県の中信農業試験場の根こぶ病発病土壌、長野県川上村の根腐病発病土壌サンプルを用いた。各土壌サンプルより、希釈平板法により土壌微生物を分離した。培地は、細菌用としてアルブミン寒天培地を、糸状菌用としてローズベンガル寒天培地を用いた。培地上に出現したコロニーについて、コロニーの色、輪郭、表面の状態、大きさにより分類を試みた。細菌は、色 4種類 *輪郭 2種類 *表面の状態 4種類 *大きさ 3種類に分類され、計 96パターンに分類できた。糸状菌は、色 7種類 *輪郭 2種類 *表面の状態 4種類 *大きさ 3種類に分類され、 168パターンに分類できた。結果を表 16に示した。

[0095] [表 16]

各種土壌試料から分離された土壌微生物の特徴

*：単離して、培養し、微生物センサ一に使用した。

括弧内の数値はパターン分類の値（二菌株 No. )

[0096] パターン分類により分類した後、各土壌における優先種 (1種)を単離して培養し、微生物センサーの作成に使用した。尚、単離した微生物は、未同定である。

[0097] 次に、微生物センサーユニットへ収納した各土壌微生物の酵母エキスに対する応答性を調べた。結果を表 17に示した。

[0098] [表 17]

各種土壌から単離した土壌微生物（優先種）を収納した微生物センサ一の酵母エキスに対する応答性

[0099] 表 17の結果から、いずれの土壌微生物を固定ィ匕した酸素電極も酵母エキスに対して良く応答する事がわ力つた。

[0100] 〔実施例 10〕発病土壌と健全土壌に対する病原微生物を収納した微生物センサーと一般土壌微生物を収納した微生物センサーの応答性の比較

病原微生物としては、根こぶ病菌と根腐病菌を用いた。一般土壌微生物としては、実施例 9で単離した微生物 (各土壌サンプルの優先種： 6菌株)を用いた。各微生物を培養後、各微生物センサーユニットへ収納した。尚、一部の微生物について培養した菌量が充分量確保できな力つた為、酵母エキスに対する応答性を 100とした場合の相対値で現した。結果を表 18および表 19に示した。

[0101] [表 18]

根こぶ病発病土壌と健全土壌における微生物センサ一の応答

ND*：検出されず

[0102] 表 18の結果から、中信地区の根こぶ病発病土 (発病度： 100%)では、病原微生物（根こぶ病菌)の菌密度が l(T⁷ ciU I g土壌と高いだけでなぐ一般細菌または、一般糸状菌を収納した微生物センサーの根こぶ病菌 (病原菌）を収納した微生物センサ一に対する電極応答比は低力つた (0.029, 0.753)。この事は、病原微生物の呼吸活性が相対的に高ぐ一般土壌微生物の呼吸活性が相対的に低いことを意味しており、さらに病害が拡大する方向に傾いている事が予測できた。事実、中信地区の汚染圃場では、根こぶ病の発生は激発の状態が続!、て、る。

[0103] 一方、西根地区の健全土壌では、病原微生物 (根こぶ病菌)は検出されず、かつ電極応答比は、中信地区の根こぶ病発病土に比べて高い (0.659, 0.945)事から、病害に対する抵抗性が高ぐ仮に根こぶ病菌が侵入してきた場合でも、中信地区の根こぶ発病土よりも病害の拡大速度は遅くなる事が予測できた。事実、現在まで現場土壌にぉ、て、根こぶ病の発生は確認されて、な、。

[0104] [表 19] 根腐病発病土壌と健全土壌における微生物センサ一の応答

[0105] 表 19の結果から、川上村根腐れ病発病土 (発病度 :40%)では、病原微生物 (根腐れ病菌)の菌密度が l I g土壌と高いだけでなぐ病原微生物の呼吸活性が相対的に高ぐ一般土壌微生物の呼吸活性は相対的に低ぐ一般細菌、一般糸状菌の病原菌に対する電極応答比は、それぞれ 0.059, 0.490と低かった。このことから、さらに病害が拡大する方向に傾いている事が予測できた。事実、川上村地区では、レタス根腐病の発生面積は、年々拡大している。

[0106] 一方、西根地区の健全土壌では、病原微生物 (レタス根腐病菌)は検出されず、つ電極応答比は、 1.769, 2.537と川上村根腐病発病土に比べて有為に高い事から、病害に対する抵抗性が高ぐ仮に根腐病菌が侵入した場合でも、川上村根腐病発病土よりも病害発生の危険性は低い事が予測できた。事実、現在まで、現場土壌にお V、て根腐病の発生は確認されて!、な!/、。

[0107] 実施例 7、 8、 10の電極応答比の結果 (表 13、 14、 15、 18、 19)をまとめて表 20、 2 1に示した。

[0108] [表 20]

根こぶ病菌を収納した微生物センサーと一般微生物を収納した微生物センサ応答比および各土壌の根こぶ病発病度と病原菌密度

ND :検出されず、括弧内は収納した菌株 No.

[0109] [表 21]

根腐病菌を収納した微生物センサーと一般微生物を収納した微生物センサ一の電極応答比および各土壌の根腐病の発病度と病原菌密度

ND：検出されず、括弧内は収納した菌株 No.

[0110] これらの結果から、土壌微生物として拮抗微生物または、現場土壌から単離した優先種 (一般土壌細菌および一般土壌糸状菌)を用い、病原菌との電極応答比 (一般土壌微生物 Z病原微生物)を調べる事により、土壌環境が発病の危険性が高い状態にある力、発病の危険性が低い状態にあるかを予測する事が可能となった。これらの予測結果は、現場における病害の発生状況に関する調査結果と良く一致した。

[0111] 〔実施例 11〕ピシゥム菌によるトマト青枯病防除と微生物センサーによる予測

2003年 5月 29日、育苗培土 (モジュラーシード William Sinclair Holdings pic社製)にピシゥムオリガンドラム（Pvthium olieandrum) MMR2株各種詧材を添加し、 128穴セルトレーに詰め、トマト（品種:麗夏）の種子を播種した。 6月 11日にセルトレーより 5 cm連結ポットに鉢上げし (培土:スーパーミックス A 販売会社 (株)サカタのタネ）、トマト青枯病菌 (Ralstonia solanacearum)を人工接種した。 1ヶ月栽培後、発病度、発病株率を調査した (表 22)。

[0112] [表 22]

青枯病防除試験

品種麗夏

調査曰 03. 7. 1 1

[0113] ピシゥムオリガンドラム (Pvthium oligandrum) MMR2株は、菌寄生性と抵抗性誘導を持つ拮抗微生物である力この菌を投与する事により、発病度は 46.3、発病株率は 50.0と低下し、防除価は 22.9とトマト青枯れ病菌に対して防除効果を示した。

なお、投入した両微生物の菌数は、トマト青枯病菌力 X 10⁷ clu I g土壌、ピシゥム属菌が 1 X 10⁴ clu I g土壌であった。

[0114] トマト青枯れ病菌は、 TTC寒天培地のシャーレ上で 30°C、 1-2日培養し、ピシゥム属菌は、 V8ジュース培地を入れた三角フラスコにて、 25°C、 1ヶ月振とう培養した。両菌株を集菌後、それぞれ微生物センサーユニットに収納した。

両微生物を固定ィ匕した電極にっヽて酵母エキスに対する応答を確認した。（トマト青枯れ病菌： 196 nA、ピシゥム属菌： 23 nA)。

培土に対する両微生物菌を収納した微生物センサーの応答を調べた。結果を表 2 3に示した。

[0115] [表 23]

トマト青枯病菌とピシゥム属菌の応答性

トマトピシゥム電極応答比青枯病菌

(Δ ηΑ) (厶 nA) ピシゥム属菌 / 青枯病菌育苗培土モシユラ一シ一ド 38 77 2.03 鉢上げ培土スーパーミックス A 10 67 6.70 [0116] 表 23の結果より、育苗培土および鉢上げ培土において接種したピシゥム属菌は、トマト青枯病菌よりも、この土壌環境に適応してよく増殖する事が予測される。この結果

、トマト青枯病の発病が軽減できたと考えられる。

すなわち、本発明の微生物センサーによる予測結果と実際の防除試験結果が、よく一致することがわ力つた。

[0117] 〔実施例 12〕各種微生物資材施用が土壌病害に及ぼす影響と微生物センサーによる病害軽減の予測

2003年 5月 29日と 8月 26日、各種微生物資材を培土 (メトロミックス（Scotts- Sierra Horticultural Products Company製）またはモジュラーシード）に添カ卩し、 128穴セルトレーに詰め、トマト（品種:麗夏）、レタス（品種：レッドウェーブおよびサリナス）、コマツナ（品種:きょすみ）、ホウレンソゥ（品種:プラトン)を播種した。トマト、レタス、ホウレンソゥは、 6月 11日と 9月 9日にセルトレーから、 20穴または 24穴連結ポットに鉢上げした。鉢上げ培土はスーパーミックス Aを用いた。コマツナは、 40穴連結ポットに鉢上げした。鉢上げ培土は、長野中信農試の根こぶ病発病土にスーパーミックス Aと稲育苗培土を 2： 1： 1で混合したものを用いた。

[0118] 植物病原微生物を接種し、経時的に発病状況を観察した。

微生物資材および植物病原微生物の接種菌密度は、土壌に接種する前の菌濃度から算出した。

なお、微生物資材のうちバイオ 21 (販売会社 (株)サカタのタネ）は、バチルス属菌であり、 MMR3は、独立行政法人北海道農業試験場より分譲していただいた菌寄生性と抵抗性誘導を持つピシゥム属菌である。

[0119] トマト青枯病に関しては、 7月 4日と 9月 18日に発病調査を実施した。発病度の判定基準は、 0 :発病なし、 1 :葉の一部に萎凋または黄ィ匕が認められる (軽発生）、 2 :葉の萎凋が約 50%以下認められる（中発生）、 3 :葉の萎凋が 50%以上あり、葉の一部が枯死している (激発生）、 4:枯死、の 5段階で判定し、発病度、発病株率、防除価を算出した。結果を表 24に示した。

[0120] レタス根腐病については、 7月 11日と 10月 6日に導幹部を切断して発病度を判定した。発病度の判定は、 0 :導幹部に褐変が認められない、 1 :導幹部にわずかに褐変が認められる (軽発生 )、 2：導幹部に褐変が認められる（中発生 )、 3：導幹部の褐変が著しぐ地上部の葉の黄化、萎凋が認められる (激発生 )、 4:枯死、の 5段階で判定し、発病度、発病株率、防除価を算出した。結果を表 25に示した。

[0121] ホウレンソゥの萎凋病については、 10月 6日に導幹部を切断して発病度を判定した。発病度の判定は、レタスの場合と同様の基準で行った。結果を表 26に示した。

[0122] コマツナ根こぶ病については、 7月 11日と 10月 6日に根部を洗浄して根こぶの着生程度で発病度を判定した。発病度の判定は、 0 :根こぶの着生が認められない。 1 : 毛細根にわずかに根こぶの着生が認められる（軽発生）、 2 :側根または主根に小さなこぶの着生が認められる（中発生）、 3 :大きなこぶの着生が認められる (激発生）、 4: 枯死、の 5段階で判定し、発病度、発病株率、防除価を算出した。結果を表 27に示した。

[0123] [表 24]

トマト青枯病に対する各種微生物資材の防除効果

( 1 ) 5月 2 9日播種、 7月 4日調査 (品種：麗夏)

( 2 ) 8月 2 6日播種、 9月 1 8日調査 (品種：麗夏)

*^}：菌密度の欄：無処理は、植物病原微生物の菌密度、他は、各種微生物資材 (拮抗微生物)の菌密度を記載した。 [0124] [表 25] レタス根腐病に対する微生物資材の防除効果

( 1 ) 5月 2 9日播種、 7月 1 1日調査（品種：レッドウェーブ)

( 2 ) 8月 26日播種、 1 0月 6日調査（品種：サリナス)

* 菌密度の檷：無処理は、植物病原微生物の菌密度、他は、各種微生物資材 (拮抗微生物)の菌密度を記載した。

[表 26]

ホウレンソゥ萎凋病に対する各種微生物資材の防除効果

8月 26日播種、 1 0月 6日調査 (品種：ブラトン）

*^}：菌密度の欄：無処理は、植物病原微生物の菌密度、他は、各種微生物資材 (拮抗微生物)の菌密度を記載した。

[0126] [表 27] コマツナ根こぶ病に対する各種微生物資材の防除効果

( 1 ) 5月 29日播種、 7月 1 1日調査 (品種：きよすみ)

( 2 ) 8月 26日播種、 1 0月 6日調査 (品種：きょすみ)

*»：菌密度の欄：無処理は、植物病原微生物の菌密度、他は、各種微生物資材 (拮抗微生物)の菌密度を記載した。

[0127] 各種微生物資材および植物病原微生物を収納した微生物センサーを作成する為に、細菌類は、培地 Lbrothを用い、 30°C、 12日振とう培養し、糸状菌類は、 PD broth培地を用いて 25°C、 7日振とう培養した。

集菌、洗浄後、ニトロセルロースフィルターへ固定化し、センサーユニットへ収納した。

鉢上げ培土に対する各微生物センサーの応答性および拮抗微生物 Z病原微生物の電極応答比を求めた結果を表 28に示した。

[0128] [表 28] 各種微生物資材および植物病原微生物を収納した微生物センサ一の電極応答性

[0129] 微生物資材の投入量は、原則として各資材メーカーまたは開発関係者の薦めている方法に従って行ったが、結果として、拮抗微生物として投入した微生物菌量と、病原微生物の接種量に非常に差がある場合があった。

土壌微生物においては、菌密度の差が 10倍程度ではあまり問題にならないことが多、が、 100倍以上の差があるとこれを考慮する必要がある。

電極応答比の結果に菌密度の補正を考慮した下記の表に従って、病害軽減効果を判定することとした。

[0130] [表 29]

微生物資材投入による病害軽減効果の予測に関する菌密度補正の基準

> >または < < ： 1 0 0倍以上の菌数差があることを示す。

[0131] 表 29に従って、微生物資材の効果を予測し、実際の防除効果の結果と比較した。

なお、防除価 10.0以上を防除効果ありとした。結果を表 30に示した。

[0132] [表 30] 生物資材による防除効果とバイオセンサーを用いた防除効果に関する予想結果の比較

防除価 10以上を効果ありと評価する。

電極応答比は、拮抗微生物 Z病原微生物の両微生物センサーの電極応答比菌密度補正くくまたは》は、 100倍以上の菌数差がある場合に行なった。

[0133] [表 31]

予測結果と防除試験結果の相関性

[0134] また、表 24、表 25、表 27の各 2回の試験 (1)と (2)の発病度と防除価を比較すると、明らかに、発病程度が高い場合には防除価が低く出る傾向が認められた (表 27のマィコストップ以外の全データにおいて)。特に発病度 90以上の激発生条件下では、防除効果がマスクされてしまう事がある。例えば、トマト青枯れ病菌に対する HAI00377 株の電極応答比は、 2.90と有意に高く (表 28)防除効果はあると判定される力表 24 ( 2)の発病度は 100.0、（無処理区も 99.0)と激発条件であった為、結果として防除価は -1.1となり、防除効果はマスクされてしまったと考えられる。このような場合には、発病度 90%以下の条件で、再度試験を行うのが望ま、。

[0135] バイオセンサーを用いた予想結果と、実際の防除試験結果の相関性を見ると 24の試験のうち 22の予測が的中していた。すなわち、予測的中率は、 91. 7%と高率であり、信頼性は高いと考えられる。

産業上の利用可能性

[0136] 本発明の土壌微生物動態予測用微生物センサーを用いる事により、土壌微生物の動態解析、特に土壌伝染性植物病原微生物および一般土壌微生物 (拮抗微生物を含む)の現場土壌における動態予測が可能となる。さらに、現場土壌の病害発生の危険性について早期予測が可能となり、早期防除対策につなげる事が可能となる。病害が既に発生している現場圃場において、発病予測ができるだけでなぐ病害の未発生圃場においても将来の病害発生の危険性について予測する事ができる。また、この予測結果に基づいて、土壌改善提案につなげる事が可能となる。

[0137] 多様な現場の土壌検体をそのまま水などの溶媒に懸濁し、その上清液を本発明のバイオセンサーに適用すれば、特別な処理、技術の必要はなぐ誰でも簡単かつ短期間で目的の土壌微生物がその土壌環境に適応して増殖する可能性があるかどうかの判定が可能となる。

Claims

請求の範囲

[1] 土壌における土壌微生物の増殖能力を測定する方法であって、

[2] 土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害の発生または拡大の危険性を評価する方法であって、

[3] 土壌伝染性植物病原微生物による土壌病害に対する一般土壌微生物の防除効果を評価する方法であって、

[4] それぞれ酸素電極と土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有する複数のセンサーであって、それぞれのセンサーの収納部に異なる土壌微生物が収納されて、る複数のセンサーを含む、請求項 1に記載の方法に用いるためのキット

[5] 酸素電極と一般土壌微生物を収納した収納部と固定部材力なるユニットを有するセンサーおよび酸素電極と土壌伝染性植物病原微生物を収納した収納部と固定部材カなるユニットを有するセンサーを含む、請求項 2または 3に記載の方法に用いるためのキット。