JPH05123186A

JPH05123186A - 好気性微生物の測定法および測定装置

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Publication number: JPH05123186A
Application number: JP3313215A
Authority: JP
Inventors: Nariaki Kawabata; 成彬川端
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1991-10-31
Publication date: 1993-05-21
Anticipated expiration: 2015-12-25
Also published as: JP3120505B2

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は水不溶性ピリジニウム型樹脂を被覆
した不織布を酸素電極の感応部に配置し、この不織布に
微生物を含有しうる試料液を接触させ、接触時の前記酸
素電極の検知出力の変化に基づいて、前記試料液中の好
気性微生物の生菌数を測定する好気性微生物の測定法、
およびこれに用いる測定装置である。【効果】本発明の測定方法、装置によれば、水中に懸
濁された好気性および通性嫌気性微生物の生菌数を簡便
な操作によって極めて迅速に、しかも精度よく測定する
ことができ、微生物を用いる生産工程の制御、食品の品
質管理に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は好気性微生物の測定法お
よびこれに用いる測定装置に関する。さらに詳しくは、
本発明は好気性微生物の生菌数（活量）の迅速な測定法
および測定装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】水中に懸濁された生きた微生物の濃度測
定は、微生物を取り扱う上において重要である。例え
ば、発酵生産プロセスの制御、あるいは生鮮食料品の品
質管理のために、生菌数の濃度の迅速な測定法が求めら
れている。

【０００３】生菌濃度の測定法として最も一般的な方法
は、コロニー計数法である。この方法は試料の一定量を
無菌的に寒天培地上で静置培養して生成したコロニー数
を肉眼で数え、そのコロニー数に基づいて生菌数を算出
する方法である。また、他の測定法としては、試料中よ
り微生物菌体を分離し、これに色素溶液を加えて染色
し、染色された生菌数を顕微鏡下で計測する方法もあ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、コロニ
ー計数法では試料を無菌条件下に一定希釈倍率に希釈
し、少なくとも２４時間静置培養し、生成したコロニー
数を肉眼で計測する。このため、多大の時間と労力を必
要とすると共に、非常に煩雑な操作を行うため熟練を要
し、しかも得られる精度は充分とはいえない。一方、染
色法では、試料中に含まれる死滅菌体、培地中の各種固
形物なども生きた微生物と同様に染色されるため、微生
物の生菌数を正確に計測することは非常に困難である。

【０００５】このため、酵母や細菌のカタラーゼ活性を
測定し、この測定値に基づいて細菌等の生菌数を算出す
る方法も提案されている（特公昭55-15999号公報、米国
特許第3838034号参照）が、試料から細菌等の分離が必
要であったり、酵素反応の条件設定が煩雑であるなど、
やはり迅速な測定を行うことができない。

【０００６】このように従来法は、いずれも生菌数を迅
速にかつ高精度で測定することはできず、微生物を用い
た生産プロセス制御、食料品の品質管理など迅速な生菌
数濃度の測定が必要な分野には適用できなかった。

【０００７】本発明者は、このような従来の生菌数測定
方法を改良すべく研究を行い、先に不溶性ピリジニウム
型樹脂と隔膜式酸素電極を用いた生菌数濃度測定装置を
提案した（特願平１−３４００６３号）。しかしなが
ら、この装置は酸素電極に樹脂のビーズを取り付ける操
作に熟練を要し、測定結果にバラつきが大きいという欠
点があった。

【０００８】本発明の目的は水中に懸濁された好気性お
よび通性嫌気性微生物の生菌数を簡便な操作によって極
めて迅速に、しかも精度よく測定する方法およびその装
置を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、不溶性ピリ
ジニウム型樹脂で被覆した不織布が微生物を生きた状態
で強力に捕捉することができ、この固定化法により捕捉
された微生物の酸素消費と生菌濃度とが密接な関係を有
することを知り本発明を完成するに至った。本発明は水
不溶性ピリジニウム型樹脂を被覆した不織布を酸素電極
の感応部に配置し、この不織布に微生物を含有しうる試
料液を接触させ、接触時の前記酸素電極の検知出力の変
化に基づいて、前記試料液中の好気性微生物の生菌数を
測定することを特徴とする好気性微生物の測定法を提供
するものである。また、本発明は酸素電極の感応部に、
水不溶性ピリジニウム型樹脂を被覆した不織布を有する
フローセルを装着した好気性微生物の測定装置を提供す
るものである。

【００１０】本発明の測定装置は、水性懸濁液（浮遊
液）中の好気性および通性嫌気性微生物の生細胞濃度を
迅速に測定する電気化学センサーであり、酸素電極およ
びピリジニウム型ポリマーである塩化Ｎ−ベンジル−４
−ビニルピリジニウムとスチレンとのコポリマーで被覆
された不織布を含むフローセルからなる。微生物の懸濁
液試料が一定流速で電気化学センサーを通過すると微生
物は生きた状態で不織布上に捕捉、蓄積される。捕捉さ
れた生菌による酸素消費は酸素電極によって電流の減少
として検知され、この電流減少率は生菌濃度に比例す
る。

【００１１】本発明にて用いられる不溶性ピリジニウム
型樹脂は、高分子鎖中にピリジニウム基を有する水不溶
性の樹脂を意味する。かかる不溶性ピリジニウム型樹脂
の好ましい例としては、下式［化１］および下式［化
２］を構成単位とするビニル系共重合体、または下式
［化１］を構成単位とする重合体を下式［化２］を構成
単位とするポリマー鎖で架橋した架橋ビニル系重合体が
挙げられる。

【００１２】

【化１】

【００１３】

【化２】

【００１４】［式中Ｒ₁はベンジル基、炭素数４〜１６
のアルキル基またはアリール基、Ｒ₂は炭素数１〜３の
アルキル基、Ｘはハロゲン原子、Ｙは水素原子、炭素数
１〜３のアルキル基、ベンジル基、アリール基、エーテ
ル基、カルボキシル基、またはカルボン酸エステル基を
意味する］構成単位［化１］、［化２］のモル比はとくに限定され
ないが、水不溶性を保ちつつ微生物を効率よく捕捉する
ため、通常［化１］：［化２］＝１：２０〜１：０.０
１であるのが好ましい。また、重合度は通常１００以上
であれば充分である。また、架橋されたものについては
これ以下であってもよい。

【００１５】かかる不溶性ピリジニウム型樹脂は、対応
するモノマーから公知の重合法、あるいは架橋反応によ
って合成することができるが、粉末状、粒状、膜状、繊
維状等の各種市販品が容易に入手しうる。

【００１６】また、かかる樹脂を被覆する基材となる不
織布は従来公知のものが用いられてよい。さらに、本発
明に用いる酸素電極としては、いわゆる隔膜型酸素電極
が好ましい。

【００１７】本発明の測定法では、通常、酸素電極の感
応部に、前記の水不溶性ピリジニウム型樹脂を被覆した
不織布を取り付けたフローセルを装着した装置を用い、
このフローセル内に一定時間、試料を流通して行うのが
よい。この際の流通時間は、１０〜３０分で充分であ
り、フローセル内には曝気された試料が導入されてもよ
い。

【００１８】本発明によれば、酸素電極の出力に基づい
て試料中に存在する種々の好気性微生物の生菌数（活
量）を迅速に測定することができる。なお、本明細書に
おいて、好気性微生物とは、生育過程で酸素を消費し得
る広義の好気性微生物を意味し、いわゆる通性嫌気性微
生物および任意嫌気性微生物を含み、酸素を全く消費し
ない絶対嫌気性微生物は除く。

【００１９】

【作用】微生物懸濁液を注入すると、懸濁液中の微生物
は不織布表面に捕捉され、捕捉された微生物が生きてい
る場合は酸素を消費するので酸素濃度は減少する。一定
濃度の懸濁液を一定速度で流し続ければ、通液時間に比
例して微生物捕捉量が増え、これに伴って電流値は一定
速度で減少する。また懸濁液中の微生物濃度が高い場合
は、単位時間当りの微生物捕捉量が多いので電流減少速
度も大きい。特定の微生物について懸濁液濃度と電流減
少速度との関係をあらかじめ求めておけば、未知の懸濁
液中に含まれる微生物の濃度を電流減少速度から求める
ことができる。不溶性ピリジニウム型樹脂は死んだ微生
物細胞も捕捉するが、これは酸素を消費しないため電流
値の減少を生じない。このようにして、電流値の減少か
ら直ちに試料中の生菌数（活量）を知ることができ、簡
便な操作で迅速な測定が可能となる。

【００２０】

【実施例】つぎに本発明を実施例にもとづきさらに具体
的に説明する。図１は本発明のセンサーの概略断面図で
ある。図１において本発明の好気性微生物測定装置１
は、酸素電極（電気化学計器７６１６型）１０、その感
応部に配置されたフローセル２０およびこれらの間に配
置された不溶性ピリジニウム型樹脂被覆不織布３０から
なる。

【００２１】酸素電極１０は公知のものであってよく、
テフロン膜（厚さ５０μｍ）、白金カソード、アルミニ
ウムアノードおよび飽和塩化カリウム電極からなる。

【００２２】フローセル２０は、ポリメタクリル酸メチ
ル製パイプ（内径８.０ｍｍ、外径１２ｍｍ）の上部フ
ローセル２１および同様の下部フローセル２２、並びに
これらの連結部の外周に取り付けられて上下のフローセ
ルを一体に連結するシリコンパイプ（内径１０ｍｍ、外
径１４ｍｍ）２３を有する。下部フローセル２２には外
部から下部フローセルの上端に至る試験液の導入パイプ
２４および下部フローセル２２の上端よりさらに上方か
ら外部へ試験液を排出する排液パイプ２５が設けられ
る。これら導入パイプ２４および排液パイプ２５はステ
ンレス鋼パイプ（内径１.０ｍｍ、外径２.０ｍｍ）から
なりエポキシ系接着剤２６により下部フローセル２２に
封止固定される。また、上部フローセル２１の上端に
は、ナイロンメッシュ（１００メッシュ）２７が設けら
れる。

【００２３】かかるフローセル２０を酸素電極１０の感
応部に取り付けるに当たって、これらの間に不溶性ピリ
ジニウム樹脂を被覆した不織布３０を挟み込んで補助装
置２により固定する。

【００２４】ここで用いた不織布は純レーヨン製の不織
布ＷＥ−８８９０（繊度１.５デニール、厚さ０.５ｍ
ｍ、表面積２０２０ｃｍ²／ｇ；日本バイリーン（株）
製）である。この不織布に対して、ピリジニウム型ポリ
マーである塩化Ｎ−ベンジル−４−ビニルピリジニウム
とスチレンとの１：２.７５（モル比）コポリマー（以
下、ＢＶＰＳという）を被覆した。被覆は０.５％ポリ
マー溶液（溶媒；メタノール：アセトン＝６：４の混合
溶媒）に不織布を一晩浸漬させてコーティング処理した
（コーティング量：１０ｍｇ／ｇ）。また、ＢＶＰＳは
ピリジニウム基２.９４ｍｇ／ｇを含有しており、固有
粘度は０.２３ｄｌ／ｇ（ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ１０ｇ／
ｌ含有のエタノール中、３０℃）であった。

【００２５】かかる測定装置１を用い、図２に示す測定
システム（２５℃に恒温）を構成した。図２において４
１は曝気用のエアーポンプ、４２はペリスタポンプ（蠕
動ポンプ）、４３は基準液または試料液槽、４４はレコ
ーダを示す。試験微生物の試料懸濁液およびｐＨ７.０
の０.０５Ｍの滅菌燐酸緩衝液（基準液、以下、ＰＢＳ
という）は、ペリスタポンプ（東京理化器械アイラマイ
クロポンプＭＰ−３型）４２により一定流速で測定装置
１のフローセルに導かれ、レコーダ（理化電気Ｒ−２１
型）４４により電流を記録する。

【００２６】本発明装置を用いた測定にあたっては、２
５℃、４ｍｌ／分にて測定装置１に空気および前記ＰＢ
Ｓ液をレコーダ４４の電流値が一定となるまで流した。
ついで基準ＰＢＳ液を試験微生物のＰＢＳ懸濁液に切り
替え、２５℃、ｐＨ７.０、流速４.０ｍｌ／分にて流す
と、電流値は時間経過とともに減少する。電流値の減少
速度はｎＡ／ｈで評価した。この電流減少率を記録して
微生物細胞懸濁液の濁度と比較した。なお、不溶性ピリ
ジニウム型樹脂を含浸させた不敷布による微生物細胞の
捕捉は非常に強力で非可逆的であるため、各測定ごとに
樹脂は取り替えるのが好ましい。

【００２７】（試験微生物）（１）アクロモバクター・ポリモルフ（Achromobacter
polymorph）ＩＣＲ（京都大学化学研究所収集番号）Ｂ
−００８８０、（２）アルカリゲネス・フェカリス（Al
caligenes faecalis）ＩＦＯ１３１１１、（３）アルカ
リゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＩＡＭ
（東京大学応用微生物学研究所収集番号）ｂ−１４１−
１、（４）バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）
ＩＦＯ３０３７、（５）エンテロバクター・クロアカエ
（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ３３２０、（６）エシ
ェリキア・コリ（Escherichia coli）ＢＩＣＲＢ−００
１２０株、（７）シュードモナス・アエルギノーザ（Ps
eudomonas aeruginosa）ＩＦＯ３０８０、（８）セラチ
ア・マルセセンス（Serratia marcescens）ＩＦＯ３０
４６、（９）スタフィロコッカス・アルレウス（Staphy
lococus aureus）ＩＦＯ３０６０、（１０）デバリオマ
イセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）ＩＦＯ
００２３、（１１）サッカロマイセス・センビシェ（Sa
ccharomyces cerevisiae）ＩＦＯ１６６２

【００２８】なお、Ａ．ポリモルフ、Ａ．フェカリスお
よびＳ．マルセセンスは３０℃で４時間培養した。Ｂ．
サチリス、Ｅ．クロアカエ、Ｅ．コリ、Ｐ．アエルギノ
ーザおよびＳ．アウレウスは３７℃で４時間培養した。
Ｄ．ハンセニイおよびＳ．セレビシェは２８℃で４時間
培養した。Ａ．ポリモルフ、Ａ．フェカリス、Ｂ．サチ
リス、Ｅ．クロアカエ、Ｅ．コリ、Ｐ．アエルギノー
ザ、Ｓ．アウレウスおよびＳ．マルセセンスの培養に用
いた栄養ブロスは、ペプトン５.０ｇおよび肉エキス３.
０ｇをｐＨ７.２の水１０００ｍｌに溶解して調製し
た。Ｄ．ハンセニイおよびＳ．セレビシェの培養に用い
た培地は、グルコース１０.０ｇおよび酵母エキス３.０
ｇをｐＨ６.０の水１０００ｍｌに溶解して調製した。
これらの微生物細胞を、２０００ｘｇ、３０分間の遠心
分離によって集めた。採取した細胞をＰＢＳで３回洗
い、無菌条件下にＰＢＳ中に懸濁させた。これらの懸濁
液を用いて、生細胞濃度の測定および６１０ｎｍでの濁
度測定を行った。測定は微生物懸濁液調製の直後に行っ
たので、測定前の細胞損傷は無視できると思われる。

【００２９】測定にあたり、電流が安定するまでＰＢＳ
をセンサー系に短時間通した。試験微生物細胞の試料懸
濁液を一定流速でセンサー系に通したとき、最初電流が
僅かに乱れ、その後一様な減少を示した。１回の測定当
り、電流減少率の信頼すべき確認に至るまでに約１０分
間を要した。

【００３０】［試験例１］図３は６１０ｎｍにおける吸
光度０.４の A.フェカリス（A.faecalis）懸濁液を本発
明装置に注入した時の酸素電極の電流値減少を示すチャ
ートである。電流減少速度は１６０ｎＡ／ｈであった。
なお、１２１℃にて２０分間オートクレーブ処理（加圧
蒸気滅菌）したＥ.coli（６１０ｎｍでの光学濃度０.
１）の死細胞懸濁液をフローセルに通したところ、電流
減少は無視できる程度であった。したがって、本発明の
電気化学センサーは生細胞のみを記録する。

【００３１】図４は電流減少率と微生物細胞濃度との関
係を示すチャートである。電流減少率と６１０ｎｍにお
ける光学濃度との間に直線関係が得られ、電流減少率は
試料懸濁液中の微生物細胞濃度に比例する。最もよく微
生物細胞濃度の評価に使用される方法は濁度法であるた
め、電流減少率と６１０ｎｍにおける光学濃度との関係
を検討した。生細胞濃度測定にはコロニー計数法がとく
に重要であるが、この計測の定量的正確さは、望ましい
とされるほどには充分でない。本発明の電気化学法は、
微生物細胞懸濁液調製直後に行ったので、測定前の細胞
損傷および生育力の低下は無視できると思われる。

【００３２】本発明の測定法を用いて、好気性細菌３
株、通性嫌気性細菌５株および酵母２種を用いて調べ
た。電流減少率と、６１０ｎｍにおける微生物細胞懸濁
液の濁度との比は、微生物の種類に大きく依存する。結
果を表１に示す。これらの結果から電流減少率は生微生
物細胞濃度の有用な指数であることが分かる。

【００３３】本発明の電気化学測定法による生菌の最小
検出可能濃度を、６１０ｎｍにおける光学濃度が０.１
のＰＢＳ中微生物細胞懸濁液を用いて、標準偏差の３倍
値に当る濁度相当濃度として評価した。結果を表１に示
した。最小検出可能濃度は、濁度として０.００５〜０.
０２３であり、１０⁷細胞／ｍｌオーダーの細菌濃度に
相当していた。

【００３４】

【表１】

【００３５】このように本発明の測定法によれば、生菌
濃度を迅速に測定できると共に菌の生育力の有無に拘わ
らず微生物の総濃度を測定する従来の総細胞炭素分析に
基く微生物細胞濃度測定法が補完される。

【００３６】また、電流減少率に対する温度およびｐＨ
の影響を調べた結果を図５および図６に示す。電流減少
率は、３０℃よりも高い温度で幾分増大した（図５）。
電流減少率に対するｐＨの影響はそれほど著しくはなか
った（図６）。

【００３７】［比較試験例］ＢＶＰＳ被覆不織布の代り
にＢＶＰＳ樹脂ビーズを用いて６１０ｎｍにおける光学
濃度０.２のＥ.コリ懸濁液を測定したところ、図７に示
すごとく電流は幅広く変動し、センサー系の感度は低か
った。６１０ｎｍでの光学濃度が０.１のＰＢＳ中、各
種の微生物細胞懸濁液を用いて、標準偏差の３倍値に相
当する濃度として評価した最小検出可能濁度濃度は、表
２に示すごとく０.０６〜０.２９の範囲内にあった。

【００３８】

【表２】

【００３９】前記のとおり、ＢＶＰＳ被覆不織布を用い
た場合の最小検出濁度濃度は、０.００５〜０.０２３の
範囲内である。ＢＶＰＳ樹脂ビーズの場合の相対的に低
い感度および大きな電流変動の原因は、試料懸濁液が不
織布を通過するのに比して、樹脂ビーズ層を通過すると
きの流れの一様性が低いことに原因があると考えられ
る。なお、ＢＶＰＳ樹脂ビーズの平均粒径は混潤状態で
０.３〜０.４ｍｍであった。樹脂ビーズ充填層の裂け目
の大きさは不織布のそれより遥かに大きく、その結果、
微生物試料懸濁液の流れがより不均一となり、センサー
系の感度が低くなると考えられる。このように電気化学
センサー系には、不溶性ピリジニウム型樹脂であるＢＶ
ＰＳ樹脂のビーズよりも、ピリジニウム型ポリマーであ
るＢＶＰＳで被覆した不織布の方がより適している。

【００４０】

【発明の効果】本発明の測定方法、装置によれば、水中
に懸濁された好気性および通性嫌気性微生物の生菌数を
簡便な操作によって極めて迅速に、しかも精度よく測定
することができる。したがって、本発明の測定法は微生
物を用いる生産工程の制御、食品の品質管理に有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定装置を示す概略断面図である。

【図２】本発明の測定法を実施する測定システムを示す
概略説明図である。

【図３】６１０ｎｍにおける光学濃度が０.４のＡ．フ
ェカリス懸濁液を２５℃、流速４.０ｍｌ／分でセンサ
ーに通した場合の電流変化を示すチャートである。

【図４】ＰＢＳ中Ａ．フェカリス懸濁液における電流減
少率と、６１０ｎｍにおける光学濃度との関係を示すグ
ラフである。

【図５】６１０ｎｍにおける光学濃度０.２、ｐＨ７.０
のＰＢＳ中、Ｅ.コリ懸濁液の電流減少率に対する温度
の影響を示すグラフである。

【図６】６１０ｎｍにおける光学濃度０.２、温度２５
℃のＰＢＳ中、Ｅ.コリ懸濁液の電流減少率に対するｐ
Ｈの影響を示すグラフである。

【図７】ＢＶＰＳ樹脂ビーズを用いた電気化学センサー
の反応曲線である。６１０ｎｍにおける光学濃度０.２
のＥ.コリ懸濁液を２５℃、流速４.０ｍｌ／分でセンサ
ーに通した。

【符号の説明】

１：測定装置２：補助装置１０：酸素電極２０：フローセル２１：上部フローセル２２：下部フローセル２３：シリコンパイプ２４：導入パイプ２５：排液パイプ２６：エポキシ系接着剤２７：ナイロンメッシュ３０：不織布４１：エアーポンプ４２：ペリスタポンプ４３：基準液または試料液槽４４：レコーダ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水不溶性ピリジニウム型樹脂を被覆した
不織布を酸素電極の感応部に配置し、この不織布に微生
物を含有しうる試料液を接触させ、接触時の前記酸素電
極の検知出力の変化に基づいて、前記試料液中の好気性
微生物の生菌数を測定することを特徴とする好気性微生
物の測定法。
【請求項２】酸素電極の感応部に、水不溶性ピリジニ
ウム型樹脂を被覆した不織布を有するフローセルを装着
した好気性微生物の測定装置。