JPH09285285A

JPH09285285A - 微生物の培養検出方法

Info

Publication number: JPH09285285A
Application number: JP12794396A
Authority: JP
Inventors: Masashi Ushiyama; 正志牛山
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1996-04-23
Filing date: 1996-04-23
Publication date: 1997-11-04

Abstract

(57)【要約】【課題】大量の試料について少ない培養面積で、試料中
の微生物を培養して、微生物の検出が行える方法を提供
すること。【解決手段】ポリビニルアルコールに、栄養成分の含ま
れた試料液を添加して試料液中の微生物を培養検出す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は試料中の微生物を培
養検出する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】通常、微生物の検査は微生物の生育に必要
な栄養成分または栄養成分と微生物を検出するための化
合物および／または検出を目的とする微生物以外の微生
物の生育を阻害する化合物を含んだ寒天培地に検査試料
液を塗布することによって行なわれている。通常は、表
面積６０〜６５ｃｍ²の寒天培地が使用されているが、
乾燥した寒天培地の表面に塗布できる試料量は通常２０
０μＬである。検出を目的とする微生物が試料中に少な
いときなどは、200μLを超える試料液を培地に塗布する
ことが必要となる。このような場合には、１試料につき
数枚以上の寒天培地を用意するか、寒天の濃度を高くす
るなどの方法がとられている。しかし寒天濃度を高くし
ても１枚の培地に1mLの試料液を加えることは難しいの
が現状である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来、検出を目的とす
る微生物が試料中に少ないとき、通常サイズの培地１枚
で試料中の微生物の培養検査を行う方法はなかった。本
発明者らは、通常、微生物の培養に使われている寒天の
代わりにポリビニルアルコールを用いることにより、通
常より多量の試料液を小さい培養面積で培養することが
可能となることを見出し、本発明を完成させた。すなわ
ち本発明の目的は、検出を目的とする微生物が少ない試
料でも、通常用いられる培地の表面積６０ｃｍ²以下の
培養面積で、簡便に試料中の微生物の培養検査が行える
方法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】

（１）ポリビニルアルコールに栄養成分を含む試料液を
加えて、試料液中の微生物を培養する方法。

【０００５】本発明に用いるポリビニルアルコールは、
冷水可溶なポリビニルアルコールまたは加熱溶解し、乾
燥した後、水を加えることで溶解または部分溶解するポ
リビニルアルコールである。また、冷水可溶なポリビニ
ルアルコール誘導体または加熱溶解し、乾燥した後、水
を加えることで溶解または部分溶解するポリビニルアル
コール誘導体も使うことができる。ポリビニルアルコー
ル誘導体として、例えば、カルボキシル基変性ポリビニ
ルアルコール等が使用できる。ポリビニルアルコールに
栄養成分を含む試料液を加えれば、1mL以上の試料液を
加えても、60cm²以下の培養面積で培養でき、培地中に
コロニーも形成される。

【０００６】ポリビニルアルコールに水を加え加熱溶解
後、この溶解物をシャーレなどの容器に入れるか、ポリ
エチレンテレフタレートフィルムなどの上に塗布し乾燥
する。粉末または顆粒状の冷水可溶なポリビニルアルコ
ールはそのままでも使用できる。ただし、このように粉
末または顆粒状のものに試料液を加えたときには構成さ
れた培地の均一性が劣るので、一端溶解し、フィルム状
にすることが好ましい。冷水可溶なポリビニルアルコー
ルまたは溶解後乾燥しフィルム化したポリビニルアルコ
ールに栄養成分などを含んだ水を加えることによって微
生物の生育する培地を構成することができる。ポリビニ
ルアルコールにあらかじめ栄養成分などを含ませても良
いが、栄養成分などに熱に不安定な化合物を含む場合に
は、ポリビニルアルコールに栄養成分などを含む水を加
え、培地を構成した後、試料を加えるか、栄養成分を含
む試料液をポリビニルアルコールに加え培養する方法が
好ましい。

【０００７】生育した微生物がコロニーを形成するため
には、添加する試料液1mLあたり50mg以上のポリビニル
アルコールが必要である。ポリビニルアルコールにグラ
フトデンプン系やポリアクリル酸系などの吸水性ポリマ
ーを混合すれば、より少ない量のポリビニルアルコール
でもコロニー形成は可能である。

【０００８】微生物の生育のための栄養成分または栄養
成分と微生物を検出するための化合物および／または検
出を目的とする微生物以外の微生物の生育を阻害する化
合物を含む水に、食品や一定範囲を拭き取った綿棒など
に付着した菌体を懸濁して試料液を作製する。または、
食品や一定範囲を拭き取った綿棒などに付着した菌体を
滅菌水または滅菌生理食塩水に懸濁後、この懸濁液を微
生物の生育のための栄養成分または栄養成分と微生物を
検出するための化合物および／または検出を目的とする
微生物以外の微生物の生育を阻害する化合物を含む水で
希釈して、試料液を作製する。

【０００９】シャーレ等の容器に入れたポリビニルアル
コールに、作製した試料液を添加して培養することによ
って、試料液中の微生物の検出を行う。１つの容器で測
定できる試料液の量は、ポリビニルアルコールの量を変
えることによって、容器の容量まで可能である。プラス
チック製などのフィルムまたはシートの上にポリビニル
アルコールフィルムを置き、試料液を加えた後、プラス
チック製などのフィルムまたはシートを被せて培養する
こともできる。試料液の量によっては、薄い容器を使っ
てもよい。また、シャーレなどに入れたポリビニルアル
コールに試料液を加えた後、容器の大きさにあったプラ
スチック製などのフィルムを被せて培養しても良い。プ
ラスチック製などの袋にポリビニルアルコールと試料液
を入れて培養することもできる。植物細胞、植物組織、
植物の培養・生育に必要な成分が含まれた水溶液をポリ
ビニルアルコールまたはポリビニルアルコール誘導体に
添加すれば、微生物ばかりでなく植物細胞、植物組織、
植物を培養・育成することもできる。

【００１０】試料液には栄養成分のほか、生じたコロニ
ーを見やすくするための染料や特定の微生物を検出する
ための発色または蛍光酵素基質、および／または、検出
を目的とする微生物以外の生育をおさえる物質を加えて
も良い。試料液に含ませる栄養成分などは、培養する微
生物に適したものであればよく、限定はされない。通常
使われている液体培地や寒天培地から寒天を除いた培地
成分が使用できる。

【００１１】一般生菌検査用の栄養成分等としては酵母
エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプト
ン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物な
どやこれらにリン酸１水素カリウムおよび／または塩化
ナトリウムを加えたものなどが一般に使用され、大腸菌
・大腸菌群検査用の栄養成分等としては、デゾキシコー
ル酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・
塩化ナトリウム・リン酸１水素カリウム・乳糖・ニュー
トラルレッド混合物、ペプトン・乳糖・リン酸１水素カ
リウム・エオジンＹ・メチレンブルー混合物などやβ−
グルクロニダーゼおよび／またはβ−ガラクトシダーゼ
の蛍光および／または発色基質を加えたペプトン・乳糖
・塩化ナトリウム・胆汁酸塩混合物・リン酸水素カリウ
ム・トリプトファン混合物などの大腸菌・大腸菌群が生
育しうる栄養成分混合物などが使用でき、ブドウ球菌用
の栄養成分等としては肉エキス・ペプトン・塩化ナトリ
ウム・マンニット・フェノールレッド・卵黄混合物、ペ
プトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム
・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物な
どが、ビブリオ用としては酵母エキス・ペプトン・蔗糖
・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸
ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁
・ブロムチモールブルー・チモールブルー混合物などが
使用できる。

【００１２】また、腸球菌用の栄養成分等としては、牛
脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸
１水素カリウム・窒化ナトリウム・ブロムチモールブル
ー・塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム混合
物などが使用でき、真菌用の栄養成分等としてはペプト
ン・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物な
どが、リステリア用の栄養成分等としてはペプトン・コ
ーンスターチ・塩化ナトリウム・エスクリン・クエン酸
鉄（III）アンモニウム・塩化リチウム・シクロヘキシ
ミド・硫酸コリスチン・アクリフラビン・セフォテタン
・ホスホマイシン混合物、ペプトン・デンプン・塩化ナ
トリウム・マンニット・クエン酸鉄アンモニウム・エス
クリン・ブドウ糖・塩化リチウム・フェノールレッド・
硫酸ポリミキシンＢ・セフタシジウム・アクリフラビン
混合物などが使用でき、サルモネラ菌用の栄養成分等と
しては、肉エキス・ペプトン・乳糖・白糖・デオキシコ
ール酸ナトリウム・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナト
リウム・クエン酸鉄アンモニウム・ニュートラルレッド
混合物、酵母エキス・ペプトン・ハートエキス・塩化ナ
トリウム・マンニット・Ｌ−リジン塩酸塩・チオ硫酸ナ
トリウム・クエン酸鉄アンモニウム・ブリリアントグリ
ーン・クリスタルバイオレット混合物などが使用でき
る。

【００１３】

【実施例】次に実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例１水１Ｌにポリビニルアルコール50gを加え、加熱溶解
後、φ90mmペトリ皿に20gずつ分注し、乾燥した。ペプ
トン11.5g、コーンスターチ0.5g、塩化ナトリウム2.5
g、エスクリン0.5g、クエン酸鉄（III）アンモニウム0.
25g、塩化リチウム7.5gを水100mLに加え溶解後滅菌した
基礎培地に、濾過滅菌したシクロヘキシミド、硫酸コリ
スチン、アクリフラビン、セフォテタン、ホスホマイシ
ン（４００：２０：５：２：１０）44mg/mL混合液250μ
Lを加え、この培地2mLに、各種チーズをＥＢ培地で４８
時間培養した培養液8mLずつを加え混合後、乾燥したポ
リビニルアルコールの入ったペトリ皿全体に広げ、３７
℃で２４〜４８時間培養した。Listeriaと推定される細
菌は緑褐色のコロニーを形成し、コロニー周辺が黒変し
た。

【００１４】実施例２水１Ｌにポリビニルアルコール50gを加え加熱溶解後、
φ90mmのペトリ皿に20gずつ分注し乾燥した。洗浄した
まな板、作業台などの表面800〜5000cm²を数本の綿棒で
拭き取った。ポテトエキス4g、ブドウ糖20gを水１Ｌに
溶解後、滅菌した培養液15mLに、該綿棒に付着した菌体
を懸濁し、試料液とした。試料液10mLを乾燥したポリビ
ニルアルコールに加え、ペトリ皿全体に広げた後、２５
℃で２〜７日間培養した。検査した試料の約２０％にか
びの生育が認められた。

【００１５】実施例３水１Ｌにポリビニルアルコール100gを加え、加熱溶解
後、10gずつを50×50×4mmのポリスチレン製容器に分注
して乾燥した。魚粉、菜種粕などをハーナ・テトラチオ
ン酸塩培地で２４時間培養した培養液8mLずつを、酵母
エキス5g、ペプトン10g、ハートエキス2g、塩化ナトリ
ウム4g、マンニット3g、Ｌ−リジン塩酸塩5g、チオ硫酸
ナトリウム4g、クエン酸鉄（III）アンモニウム1g、ブ
リリアントグリーン12.5mg、クリスタルバイオレット10
mgを水200mLに加え、加熱溶解後、冷却した培地2mLに加
え混合後、この9mLを乾燥したポリビニルアルコールの
入った容器に加えた。0.04mm厚ポリプロピレンフィルム
をこの容器に被せ、３５℃で２０時間培養した。中心部
黒色のサルモネラと推定されるコロニーが約４％の試料
で認められた。

【００１６】実施例４水1.5Ｌにポリビニルアルコール100gを加え加熱溶解
後、１×２ｍ厚さ100μmのポリエステルフィルムに塗布
乾燥して15cm平方に切断した。牡蠣に１０倍量の水を加
え、ホモジナイズ後の液8mLを、ペプトン3g、塩化ナト
リウム5g、リン酸２水素ナトリウム2.2g、リン酸１水素
ナトリウム2.7g、ピルビン酸ナトリウム1g、トリプトフ
ァン1g、ソルビトール1g、タージトール７ 0.15gを水20
0mLに加え加熱溶解後、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−グルクロニド100mgを加え混合し
た培地2mLに加え混合後、ポリビニルアルコールフィル
ム上に加えて、その上に0.04mm厚ポリプロピレンフィル
ムを被せた後、３５℃で２４時間培養した。大腸菌と推
定されるβ−グルクロニダ−ゼ活性を有する細菌は青色
のコロニーを形成した。

【００１７】

【発明の効果】本発明の方法を用いれば、従来の方法に
比べ、培養面積あたりに添加できる試料量を多くするこ
とができるため、微生物の数が少ない試料や検出を目的
とする微生物の数が少ない試料でも小さい培養面積で試
料中の微生物の培養が可能となり、その結果試料中の微
生物の検出が可能となる。また、多量の試料液を１枚の
培地に加えることができるので微生物の検出率が上が
り、より厳密な微生物の管理が可能となる。また、ポリ
ビニルアルコールの量によっては通常の1mL程度の試料
液の検査もできるなど、従来の培養方法に比べ、効率の
良い検査が可能となる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリビニルアルコールに栄養成分を含む試
料液を加えて、試料液中の微生物を培養検出する方法。