JPH09255584A

JPH09255584A - アポトーシス誘導剤

Info

Publication number: JPH09255584A
Application number: JP8093627A
Authority: JP
Inventors: Takayoshi Kato; 敬香加藤; Ikuyo Sakaguchi; 育代坂口; Yoshinori Nakayama; 美紀中山; Norikazu Ikeda; 紀和池田
Original assignee: CLUB KOSUMECHITSUKUSU KK
Current assignee: CLUB KOSUMECHITSUKUSU KK
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1997-09-30

Abstract

(57)【要約】【課題】新規で有効なアポトーシス誘導剤を提供す
る。【解決手段】ムラサキ科に属するムラサキの根（紫
根）から有機溶媒および／又は水を用いて得られる紫根
抽出物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アポトーシス誘導
剤に関する。具体的にいうと、細胞の新陳代謝等に関係
に深いアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術】紫根は古くから知られた生薬であり、特
に外用剤として広く用いられている。この紫根から水や
有機溶媒等で抽出した紫根抽出物には、これまで抗菌作
用、創傷治癒作用、抗腫瘍作用、抗炎症作用があること
が報告されている。これらの紫根抽出物には、シコニ
ン、アセチルシコニン、イソブチルシコニン、β，β−
ジメチルアクリルシコニン、デオキシシコニン、イソバ
レリルシコニン、アルカニン、リトスペルミジンＡ、Ｂ
などのナフトキノン系色素、ヒドロキシミオスコルピン
などのアルカロイド、シコノフランＡ〜Ｅなどのフリル
ヒドロキノン類、リトスペルマンＡ〜Ｃなどの多糖類、
ヒダントイン誘導体（例えばアラントイン）等数多くの
成分を含んでいる。

【０００３】これらのうち、アセチルシコニン、β，β
−ジメチルアクリルシコニン、シコニンは、グラム陽性
菌、真菌に対して抗菌作用がある。また、アセチルシコ
ニンおよびシコニンは、経口投与で軽度の抗炎症作用、
局所的軟膏塗布で毛細血管透過性亢進、急性浮腫の抑制
作用および肉芽増殖作用を促進し、さらに、創傷治癒促
進作用を有していることは、よく知られている。

【０００４】しかし、これらの効果については、他の様
々な生薬に関しても報告されており、紫根抽出物に特異
的なものではない。一方、アポトーシス誘導作用に関し
ては、これまでに、化学物質として一部の抗腫瘍剤など
ＤＮＡに直接、関与する物質以外の報告は少なく、特に
生薬についての報告は、未だない。

【０００５】ここでアポトーシスとは、個体の細胞死の
一態様であって、物理的要因や化学的要因で引き起こさ
れるネクローシスと対比される概念であり、ネクローシ
スとは、一般には、細胞が膨張し、次いで細胞膜が破裂
して、細胞死に至る過程を示している。

【０００６】一方、アポトーシスとは、個体の発生段階
などで見られる細胞死を言い、この細胞死では、細胞や
核が凝縮して、最終的には細胞の内容物を取り込んだま
ま細胞自身が断片化して、個体から脱落していく現象を
いう。このアポトーシスは、現段階では、あらかじめ死
ぬようにようにプログラム化されており、ある一定の分
化過程に達すると自らアポトーシスを発揮して、自殺死
を遂げると考えられている。つまり、個体の生命を維持
するためには、個体を構成する細胞の分化と増殖だけで
はなく、特定の時期に特定の細胞が死滅することが必要
である。

【０００７】したがって、外部からの細菌やウイルスの
アポトーシスを誘導することにより、細菌からの感染治
療をうながしたり、あるいは皮膚の表皮細胞のアポトー
シスを誘導することにより、皮膚の新陳代謝を促進する
ことができると考えられる。

【０００８】そこで、本発明の発明者らは、種々の生薬
において、免疫薬理活性に関して生化学的研究、細胞学
的研究等を進めた結果、紫根抽出物にアポトーシス誘導
作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００９】本発明は叙上の従来例の欠点に鑑みてなさ
れたものであり、その目的とするところは、古くから使
われており、比較的生体作用が緩和であると考えられる
生薬の中から、新規で有効なアポトーシス誘導剤を提供
することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明のアポトーシス誘
導剤は、紫根抽出物からなることを特徴としている。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる紫根は、ムラ
サキ科に属するムラサキ〔Lithospermum erythrorhizon
Siebold et Zuccarini（Boraginaceae）、その他の近
縁植物も含む。〕の根を乾燥させたものであり、生薬と
して広く知られているものである。本発明にいう抽出物
（以下紫根抽出物と称する）は、上記ムラサキの根を有
機溶媒および／又は水で抽出された抽出液、あるいはそ
の抽出液を適当な有機溶媒や水で希釈した希釈液、ま
た、その抽出液を抽出成分が変化しない範囲で、適当な
方法により濃縮した濃縮エキス、さらには、抽出液や濃
縮エキスを乾燥し、粉末にしたエキス粉末等を含む概念
であり、その形態は問うものではない。

【００１２】抽出溶媒としては、一般的に植物成分の抽
出に用いられる溶媒であれば、特に親水性溶媒、親油性
溶媒を問わず、制限なく用いることができる。例えば、
親水性溶媒としては、メタノール、エタノール、２−プ
ロパノール、アセトン、グリセリン、エチレングリコー
ル、、酢酸エチル、水などを用いることができる。ま
た、親油性溶媒としては、エーテル、ベンゼン、ブチレ
ングリコール、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、キシレ
ン、四塩化炭素等を用いることができる。また、これら
の溶媒は、単独であるいは、例えば、水とアセトンとの
混液など、２種若しくはそれ以上の溶媒を適当に混合し
て用いてもよい。

【００１３】抽出方法としても、一般的に植物抽出に用
いられる方法であれば、特に制限がなく、例えば、紫根
を粗切、中切、細切にしたもの、あるいは粉末にしたも
のに、溶媒を加えて、冷浸、温浸することができる。ま
た、その他、パーコレーションによる抽出法等も用いる
ことができる。

【００１４】本発明の抽出物は、上述した抽出液をその
まま、あるいは抽出液を濃縮したもの、さらに、溶媒を
留去した粉末あるいは粘性状としたものなど、いずれの
方法によっても使用することができる。また、抽出溶
媒、濃縮方法などによっても異なるが、使用する目的、
用途などにより、適宜適当な量を用いることにすればよ
い。

【００１５】

【実施例】

（実施例１）硬紫根〔Lithospermum erythrorhizon Sie
bold et Zuccarini （Boraginaceae）の乾燥した根〕１
００ｇを細切し、細切した紫根をフラスコに入れ、その
中にジエチルエーテル５００ｍｌを加え、６０℃におい
て３時間還流抽出した。その後、抽出液を減圧下常温で
ジエチルエーテルを留去し、粘性状の紫根抽出物７ｇを
得た。

【００１６】次に、上記で得られた紫根抽出物につい
て、本発明の効果を確認するため、以下の試験を行なっ
た。

【００１７】アポトーシス誘導作用を検出する際には、
細胞壊死であるネクローシスとの違いを明らかにする必
要がある。アポトーシスが誘導された細胞は、上述した
ように、まず細胞が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮
した核は断片化する。また、細胞表面の微絨毛は消失し
て平滑化し、自己認識機構を担う細胞表面分子マーカー
を徐々に喪失していく。さらに、細胞表面に大小の突起
が出現し、やがてアポトーシス小体に断片化する。この
アポトーシス小体は、生体内においてはやがてマクロフ
ァージのような貪食細胞によって除去される。

【００１８】そこで、これらの現象に着目して、ヒト骨
髄性白血病細胞ＨＬ−６０に紫根抽出物を添加し、数時
間後、アポトーシスが誘導されたかどうかを検出するた
め、以下のような複数の方法を用いて、実験を行った。

【００１９】〔細胞形態の解析〕まず、本実施例である
紫根抽出物を、エタノールとメタノールの混液（容量比
３０：１）に溶解させ、紫根抽出物の最終濃度が１．５
μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０⁵個／ｍｌとな
るように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存
在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間
遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ
７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐ
ｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、洗浄し
たＨＬ−６０細胞を採取し、７０％エタノールで固定し
た後、これらの細胞についてフローサイトメトリーで解
析を行った。

【００２０】この解析には、細胞の大きさを表す指標と
してｆｏｒｗａｒｄｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）、細胞
内部の顆粒や構造状態を表すｓｉｄｅｓｃａｔｔｅｒ
（ＳＳＣ）によって、紫根抽出物の添加によるＨＬ−６
０細胞の形態変化を観察した。また、コントロールとし
て、紫根抽出物の希釈溶媒として用いたエタノールとメ
タノールの混液（容量比３０：１）を用いて同様に処理
を行ったＨＬ−６０細胞を用いて、ＨＬ−６０細胞の形
態変化を観察した。その結果を、それぞれ図１（ａ）
（ｂ）に示す。なお、フローサイトメトリーには、Ｂｅ
ｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＦＡＣＳｃａｎを
用いた。

【００２１】

【図１】

【００２２】図１の各図において、縦軸はＳＳＣ強度
（ＳＳＣ−Ｈｅｉｇｈｔ）を、横軸はＦＳＣ強度（ＦＳ
Ｃ−Ｈｅｉｇｈｔ）を示すが、ＦＳＣ強度が大きいほど
細胞の大きさは大きく、ＳＳＣ強度が大きいほど細胞の
構造状態は複雑であることを示す。図１（ａ）（ｂ）を
比較して見るに、紫根抽出物を加えた系〔図１（ａ）〕
の方が、コントロール〔図１（ｂ）〕に比較して、ＦＳ
Ｃ強度の小さい領域が増大しており、細胞が縮小してい
ることが分かる。

【００２３】〔細胞表面抗原の解析〕アポトーシスが誘
導された細胞は、上記に示したように細胞が小片化した
後、食細胞によって貪食されるように細胞表面にある自
己認識マーカーが消失する。次に、この現象を確認する
ために、自己認識マーカーであるＭＨＣｃｌａｓｓＩ分
子の発現量を、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）により蛍光標識した抗体を用いて解析した。

【００２４】上記形態変化の解析で行なったのと同様、
紫根抽出物をエタノールとメタノールの混液（容量比３
０：１）に溶解して、紫根抽出物の最終濃度が１．５μ
ｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０⁵個／ｍｌとなる
ように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在
下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠
心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．
１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５
分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、フローサイ
トメーターによって測定した。また、コントロールとし
て、紫根抽出物の希釈に用いたエタノールとメタノール
の混液（容量比３０：１）を添加したＨＬ−６０細胞を
用いて同様に処理を行ない、自己認識マーカの消失した
細胞を測定した。その結果を図２に示す。

【００２５】

【図２】

【００２６】図２において、横軸にＦＩＴＣが結合した
細胞を検出する波長５３０ｎｍにおける蛍光強度を示
し、縦軸にはその細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を示した。コ
ントロールにおいては、ほぼ同一の蛍光強度を持った細
胞による単一のピークが現れているのに対し、上記実施
例の紫根抽出物で処理すると、蛍光強度が小さい細胞数
が多くなり、アポトーシスが誘導されたことが確認され
た。

【００２７】〔細胞周期の解析〕ＨＬ−６０のように株
化された培養細胞では、細胞周期を解析すると、ＤＮＡ
複製を行うＳ期と細胞分裂の起こるＭ期、そしてその２
つの間にあるＧ0／Ｇ1期、Ｇ2期の細胞の割合が一定と
なる。ここにおいて、アポトーシスが起こると、一定で
あった細胞周期が乱れる。そこで、ヨウ化プロピジウム
により細胞のＤＮＡを染色し、細胞周期の解析を行っ
た。

【００２８】上記形態変化の解析で行なったのと同様、
紫根抽出物をエタノールとメタノールの混液（容量比３
０：１）に溶解して、紫根抽出物の最終濃度が１．５μ
ｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０⁵個／ｍｌとなる
ように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在
下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠
心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．
１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５
分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、７０％の冷
エタノールで固定した後、５０μｇ／ｌのヨウ化プロピ
ジウム水溶液を添加し、１０分後にフローサイトメータ
を用いて解析を行った。また、コントロールとして、紫
根抽出物の希釈に用いたエタノールとメタノールの混液
（容量比３０：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて
同様に処理を行い、解析を行なった。その結果を図３に
示す。

【００２９】

【図３】

【００３０】図３において、横軸にヨウ化プロピジウム
を結合した細胞を検出する波長５８５ｎｍにおける蛍光
強度を示し、細胞中に存在する染色されたＤＮＡ含量を
意味している。また、縦軸にはその細胞数（Ｃｏｕｎｔ
ｓ）を示した。正常な細胞は、コントロールに示すよう
な蛍光強度分布を示すが、アポトーシスが誘導される
と、通常の細胞周期からずれ、核の断片化を経て、核の
小体を形成するために、ヨウ化プロピジウムによって染
色される１細胞当たりのＤＮＡ量が減少し、蛍光強度が
減少する。

【００３１】図３から分かるように、本実施例の紫根抽
出物を添加すると、ＤＮＡ含量の少ない細胞が多く見ら
れ、通常の細胞周期からはずれた細胞が多くなった。こ
の減少によっても、紫根抽出物によりアポトーシスが誘
導されたことが分かる。

【００３２】〔ＤＮＡ断片化の解析〕アポトーシスが誘
導された細胞は、ＤＮＡの断片化が生じている。そこ
で、細胞よりＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動
を行い、ＤＮＡの断片化を観察した。

【００３３】上記形態変化の解析で行なったのと同様、
上記紫根抽出物をエタノールとメタノールの混液（容量
比３０：１）に溶解して、紫根抽出物の最終濃度が１．
５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０⁵個／ｍｌと
なるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス
存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分
間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ
７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐ
ｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、プロテ
イナーゼＫを加えて３７℃で一晩反応させた後、常法に
より、フェノールで抽出し、エタノール沈殿法によって
ＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡは、常法に従い、ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで
発色させた。また、コントロールとして、紫根抽出物の
希釈に用いたエタノールとメタノールの混液（容量比３
０：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて同様に処理
を行い、解析を行なった。その結果を図４に示す。

【００３４】

【図４】

【００３５】図４に示すように、コントロール〔図４
（ａ）〕においては、ＤＮＡの断片化はほとんど見られ
なかったが、紫根抽出物で処理したＨＬ−６０細胞〔図
４（ｂ）〕には、断片化したＤＮＡからなる梯子状の泳
動像が見られ、アポトーシスの特徴であるＤＮＡの断片
化が観察された。

【００３６】以上の各試験から分かるように、本実施例
の紫根抽出物にはアポトーシス誘導作用があることが確
認された。

【００３７】（実施例２）紫根〔（Lithospermum eryth
rorhizon Siebold et Zuccarini（Boraginaceae）〕１
００ｇを細切し、微アルカリ性エタノールと１、３−ブ
チレングリコールの混液（容量比９：１）で７２時間浸
漬する。これを３回繰り返した後、すべての浸漬液を集
めて濾過した。その濾液を、減圧下で留去した後、無水
メタノールを加えて溶解し、約７００ｍｌの紫根抽出エ
キスを得た。このものについても、同様な試験を行なっ
たところ、アポトーシス誘導作用が確認された。

【００３８】次に、実施例２で得た紫根抽出エキスを用
いて、各種の化粧品を作製した。（実施例３）次に示す処方１にしたがって、油中水型の
クリームを作製した。〔処方１〕クリーム配合成分配合量（重量％）（１）紫根抽出エキス０．２（２）スクワラン８．０（３）ミリスチン酸オクチルドデシル１．０（４）バチルアルコール５．０（５）ポリオキシエチレン（１０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油１．０（６）モノステアリン酸ソルビタン０．５（７）防腐剤適量（８）１、３−ブチレングリコール５．０（９）精製水残量

【００３９】上記成分（２）〜（７）を混合し、７５℃
で加熱溶解させて油相とする。これとは別に（８）
（９）を混合した水相を加え乳化した。この後、４０℃
まで冷却したところへ、（１）を添加し、攪拌しなが
ら、さらに３０℃まで冷却しクリームを得た。

【００４０】（実施例４）次に示す処方２にしたがっ
て、化粧水を作製した。〔処方２〕化粧水配合成分配合量（重量％）（１）紫根抽出エキス０．１（２）エタノール１０．０（３）ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（１０Ｅ．Ｏ．）０．１（４）グリセリン２．０（５）防腐剤適量（６）精製水残量

【００４１】上記成分（１）〜（３）を室温にて混合
し、さらに、（４）〜（６）を混合溶解して、化粧水を
得た。

【００４２】（実施例５）次に示す処方３にしたがっ
て、乳液を作製した。〔処方３〕乳液配合成分配合量（重量％）（１）紫根抽出エキス０．２（２）ステアリン酸２．０（３）セタノール１．５（４）スクワラン５．０（５）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン２．０（６）グリセリン２．０（７）１、３−ブチレングリコール６．０（８）水酸化ナトリウム０．０３（９）防腐剤適量（１０）精製水残量

【００４３】上記成分（２）〜（５）を混合し、７０℃
で加熱溶解して油相とする。これとは別に（６）〜（１
０）を混合溶解して、７０℃に加熱した水相に、前記油
相を加え、ホモミキサーで均一に乳化した。次いで４０
℃まで冷却したところへ（１）を添加し、攪拌しなが
ら、さらに３０℃まで冷却し、乳液を得た。

【００４４】（実施例６）次に示す処方４にしたがっ
て、エッセンスを作製した。〔処方４〕エッセンス配合成分配合量（重量％）（１）紫根抽出エキス０．５（２）エタノール１０．０（３）グリセリン１０．０（４）カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１（５）防腐剤適量（６）精製水残量

【００４５】上記成分（１）（２）を室温にて混合した
のち、（３）〜（６）を添加攪拌して、エッセンスを得
た。

【００４６】（実施例７）次に示す処方５にしたがっ
て、ファンデーションを作製した。〔処方５〕ファンデーション配合成分配合量（重量％）（１）紫根抽出エキス０．１（２）１、３−ブチレングリコール５．０（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１（４）ケイ酸アルミニウムマグネシウム０．５（５）精製水残量（６）黄酸化鉄０．０７（７）黒酸化鉄０．０１（８）べンガラ０．０２（９）酸化チタン５．０（１０）タルク４．０（１１）ステアリン酸２．０（１２）セタノール１．０（１３）スクワラン５．０（１４）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン２．０（１５）防腐剤適量

【００４７】上記成分（２）〜（５）を混合し、７０℃
で加熱溶解させた後、（６）〜（１０）を混合したもの
を加え、充分に攪拌し水相とする。この水相を、（１
１）〜（１４）を混合溶解後、加熱し７０℃にした油相
に加え、ホモミキサーで均一に乳化した。次に、４０℃
まで冷却したところへ（１）を添加し、攪拌しながら、
さらに３０℃まで冷却し、ファンデーションを得た。

【００４８】（実施例８）次に示す処方６にしたがっ
て、パックを作製した。〔処方６〕パック配合成分配合量（重量％）（１）紫根抽出エキス０．１（２）ポリビニルアルコール１０．０（３）酢酸ビニル樹脂エマルジョン１０．０（４）エチルアルコール５．０（５）カオリン１５．０（６）グリセリン１．０（７）防腐剤適量（８）精製水残量

【００４９】上記成分（８）に（６）を混合した後、
（３）及び（５）を添加し、更に（４）の一部に湿潤さ
せた（２）を添加し、７０℃に加熱し溶解させた。次に
残りの成分（４）に（１）及び（７）を加えて溶解した
ものを添加した後、冷却し、パックを得た。

【発明の効果】本発明のアポトーシス誘導剤を用いるこ
とにより、細胞サイクルを制御することが可能になり、
化粧品や外用剤などとして皮膚への塗布することによっ
て、皮膚の新陳代謝を促進するなどの、細胞の賦活化効
果が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】細胞の形態変化におけるアポトーシス誘導作用
を示す説明図である。

【図２】自己認識マーカの消失におけるアポトーシス誘
導作用を示す説明図である。

【図３】細胞周期の変化におけるアポトーシス誘導作用
を示す説明図である。

【図４】細胞内ＤＮＡの断片化におけるアポトーシス誘
導作用を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 7/48 Ａ６１Ｋ 7/48 (72)発明者池田紀和大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号株式会社クラブコスメチックス内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】紫根抽出物からなることを特徴とするア
ポトーシス誘導剤。