JPH09243641A - 免疫測定方法およびその測定のために好適な器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 サンドイッチ法のような高感度を有しなが
ら、煩雑なＢ／Ｆ分離操作を必要としない免疫学的測定
法およびその測定のために好適な器具を提供する。 【解決手段】 測定対象物に対する抗原あるいは抗体を
固定化した固相を使用し、試料中の抗原あるいは抗体
と、標識した抗原あるいは抗体（標識物質）とで反応を
行わせた後、多孔質材料からなる試料滴下部と、多孔質
材料からなる発光反応部とを支持体上に配置した生体成
分測定用器具を用いて試料中の測定対象物の量を測定す
る方法であって、前記生体成分測定用器具の発光反応部
は、前記試料滴下部よりも大きく、前記発光反応部は、
前記試料滴下部と連結する形で配置され、前記試料滴下
部から移動してきた標識物質を拡散できるようにしたこ
とを特徴とする免疫測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応を利
用して物質を測定するための方法およびその測定のため
に好適な器具に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応を利用して、生物学的試料
中の微量物質を測定する技術は近年大幅に発達してい
る。抗体を使用して特定の生体成分を高感度で測定する
ことが可能になっており、このような方法はイムノアッ
セイと呼ばれ、生体成分の検出に広く用いられている。

【０００３】イムノアッセイでは、抗原抗体反応で捕ら
えた成分を様々な方法で検出することによって、その成
分の存在を明らかにすることができる。そのような検出
のための物質としては、ラジオアイソトープ、酵素、蛍
光色素や発光試薬などが使用されている。

【０００４】試料中の抗原濃度を測定するイムノアッセ
イ法として最も一般的な方法はサンドイッチ法と呼ばれ
るものである。これは、２種類の抗体を使用し、片方を
何らかの固相に結合して固相抗体とし、もう片方に何ら
かの標識を行って標識抗体とする。固相抗体と標識抗体
は、試料中の抗原と反応して抗原を挟み込んだサンドイ
ッチのような形で固相に結合する。次いで、固相に結合
できなかった標識抗体を洗浄などの操作によって除去
（Ｂ／Ｆ分離）した後、固相に残存する標識体の量を測
定することによって試料中の抗原濃度を知ることができ
るというものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】この原理を利用した測
定キットは現在広く販売されており、臨床検査の分野で
は不可欠の方法となっている。しかしながら、サンドイ
ッチイムノアッセイを行うには多くの手間と時間を要す
る。例えば、固相の抗体に対して試料中の抗原を反応さ
せ、洗浄後標識抗体を添加し、サンドイッチを形成後再
び洗浄を行い、過剰の標識抗体を除いた後、標識物質の
量を測定する。例えば、標識物質として酵素を用いるの
であれば、酵素活性を測定するために基質を添加し反応
を行って測定する。これらの操作には、度重なる洗浄操
作（Ｂ／Ｆ分離）と数多くの試薬分注が必要なので大変
手間のかかる方法となっている。近年モノクローナル抗
体の発達により、固相抗体と標識抗体を同時に添加する
ワンステップサンドイッチ法も考案されているが、Ｂ／
Ｆ分離が必要であることに変わりはない。このような問
題は、抗原を固相とする抗体検出法であっても、固相の
抗体に試料中の抗原と標識抗原が競合反応を行う競合法
であっても同様である。

【０００６】現在、抗原抗体反応を利用した生体成分測
定用の自動機として数多くの機械が市場にでているが、
その多くはサンドイッチ法の原理に基づくものであるた
めに、洗浄などの操作を行うための大掛かりな機構が組
み込まれており、そのため機械自体が大きく高価になっ
ている。

【０００７】一方、イムノアッセイにはＢ／Ｆ分離を必
要としないいわゆるホモジニアスアッセイと呼ばれる手
法がある。この方法は操作が簡便で高価な機械を必要と
しないという利点があり、これに用いる数多くの方法が
考案されている。しかしながら、現在のところ、ホモジ
ニアスアッセイはサンドイッチ法に比べて感度が低いこ
とがほとんどであり、この方法の大きな問題となってい
る。

【０００８】本発明は、サンドイッチ法のような高感度
を有しながら、煩雑なＢ／Ｆ分離操作を必要としない免
疫学的測定法およびその測定のために好適な器具を提供
することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ねた結果、固相上で抗原抗体複合体を形成しなかった
標識物質を多孔質材料中に拡散させることによって、自
然にＢ／Ｆ分離が行えることに着目して本発明を完成し
た。

【００１０】すなわち、本発明は、測定対象物に対する
抗原あるいは抗体を固定化した固相を使用し、試料中の
抗原あるいは抗体と、標識した抗原あるいは抗体（標識
物質）とでサンドイッチ法または競合法によって反応を
行わせた後、多孔質材料からなる試料滴下部と、多孔質
材料からなる発光反応部とを支持体上に配置した生体成
分測定用器具を用いて試料中の測定対象物の量を測定す
る方法であって、前記生体成分測定用器具の発光反応部
は、前記試料滴下部よりも大きく、前記発光反応部は、
前記試料滴下部と連結する形で配置され、前記試料滴下
部から移動してきた標識物質を拡散できるように構成し
たことを特徴とする免疫測定方法を提供する。

【００１１】本発明は、また多孔質材料からなる試料滴
下部と、多孔質材料からなる発光反応部とを支持体上に
配置した生体成分測定用器具であって、前記生体成分測
定用器具の発光反応部は、前記試料滴下部よりも大き
く、前記発光反応部は、前記試料滴下部と連結する形で
配置され、前記試料滴下部から移動してきた標識物質を
拡散できるようにしたことを特徴とする生体成分測定用
器具を提供する。

【００１２】上記生体成分測定用器具の試料滴下部に試
料を滴下し、標識物質を発光反応部に拡散させる。固相
上に捕らえられなかった標識物質は試料中の測定対象物
質の量と相関するので、拡散した試料に対して標識物質
の量を測定することによって試料中の測定対象物質の量
を測定することができる。

【００１３】

【発明の実施の態様】固相としては、既知のものが全て
使用できるが、抗原抗体反応を迅速に行うためには粒子
を使用するのが好ましい。粒子としては、多孔質材料に
拡散しない大きさであれば材質は特に限定されないが、
粒径の均一なラテックス粒子を使用することによって再
現性の良い、非特異反応の少ない測定を行うことができ
る。大きさは、粒径５０μ以下、好ましくは約０．１〜
２０、より好ましくは０．５〜１０μの粒子を使用する
ことができる。

【００１４】粒子上に抗体を結合し、多価抗原を測定す
る場合、ポリクローナルな抗体を用いると粒子同士の凝
集が起こり、標識抗体が粒子表面でサンドイッチを形成
する反応を阻害することがある。このため、タンパク質
のような多価抗原を測定する場合には、粒子表面に固定
化する抗体としては、単一のエピトープにのみ反応する
モノクローナル抗体を使用するのが好ましい。

【００１５】標識としては、一般的に発光イムノアッセ
イに用いられている物質なら何でも使用可能でり、例え
ば酵素、発光試薬などが挙げられる。標識として使用す
る酵素には例えば、アルカリホスファターゼ、ＨＲＰ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどがあ
り、発光試薬にはルミノール、ＡＭＰＰＤ、ルシフェリ
ンなどがある。発光試薬を使用する場合には、発光反応
部にはあらかじめ発光反応が生じるような試薬を存在さ
せておく必要があるし、また酵素活性を測定する場合に
は、酵素の発光基質を存在させておく必要がある。この
ような発光反応が生じる試薬または酵素の発光基質は、
これらを含む溶液に支持体上の発光反応部をあらかじめ
浸漬し乾燥することによって発光反応部に存在させるこ
とができる。あるいは、このような試薬または発光基質
は標識物質を発光反応部に拡散させた後に加えてもよ
い。また、発光現象としては、生じる発光が一定時間持
続するような発光系を選択することにより、再現性の高
い測定が可能となる。

【００１６】本発明の生体成分測定用器具において使用
される多孔質材料は、標識物質が拡散できるものであれ
ば何でも使用できるが、固相として粒子を使用する場合
には、粒子が拡散しないものを使用することが好まし
い。その場合、粒子の大きさに応じて多孔質材料を適宜
決定することができる。例えば、紙、グラスフィルタ
ー、多孔性プラスチック、焼成ガラスまたはプラスチッ
ク、セルロース粒子、アガロースゲル、シリカゲルなど
を挙げることができる。

【００１７】試料滴下部は、未反応の標識物質を効率よ
く発光反応部に移動させるために、可能な限り小さくす
ることが好ましい。ただし、固相として粒子を用いる場
合には、多孔質材料中に粒子をトラップできるだけの大
きさが必要であり、試料滴下部が小さすぎると発光反応
部へ試料が溢れて粒子が混入するので、滴下する試料の
量に応じて試料滴下部の大きさを決定する。

【００１８】本発明の生体成分測定用器具には、さらに
試料滴下部に滴下した試料が発光反応部に溢れるのを防
止する手段を設けてもよい。

【００１９】本発明の生体成分測定用器具には、さらに
試料滴下部に突起部を設けることもできる。反応容器の
底面が疎水性膜で構成されている場合には、突起部で膜
を破ることによって簡単に試料を試料滴下部に滴下する
ことができ、多数の試料を自動的に分析する場合に便利
である。このような突起部は支持体と同一または異なる
材料を用いて設置できる。

【００２０】発光反応部は、試料滴下部よりも大きくす
る。こうすることによって、効率よく標識物質を拡散す
ることができ、従って発光反応部において効率よく反応
を行わせることができる。

【００２１】なお、発光反応部に使用する多孔質材料に
ついては、光を透過する材料、例えば、アガロース、ポ
リアクリルアミドなどの有機高分子を粒子状あるいは網
目状にしたものを使用すれば、発光をさらに効率よく検
出することができる。

【００２２】試料滴下部と発光反応部に使用する多孔質
材料は同一であっても、異なっていてもよい。例えばグ
ラスフィルターのような材料を用いて、試料滴下部と発
光反応部とを一緒に瓢箪形に切り抜き、支持体上に配置
することが便利である。

【００２３】また、多孔質材料を支持するための支持体
は、試料不透過性の材料であって、発光反応で生じた光
を効率よく光検出器に集めることができるように、有色
の好ましくは白色または黒色のプラスチック材料または
光を反射する性質をもつ部材を用いることができる。あ
るいは、支持体表面に鏡面処理を施して光を反射するよ
うにしてもよい。

【００２４】支持体上への多孔質材料の配置は、適当な
接着剤を用いて行うことができるが、支持体に窪みを設
け、そこに多孔質材料を嵌め込むことによって行うこと
もできる。窪みの深さは、適宜設定すればよいが、フィ
ルターを用いる場合には、フィルターの厚みと同じくら
いにすることができる。

【００２５】なお、本発明の生体成分測定用器具は、免
疫測定以外の測定についても応用可能である。例えば、
酵素活性、酵素とその阻害剤の相互作用、リガンド−レ
セプターアッセイ、遺伝子検出などの生体成分の検出に
応用することができる。

【００２６】本発明の器具を用いて標識物質の量を測定
するには、例えば支持体上の発光反応部が挿入できる大
きさのドーム型測定ユニットを用いることができる。測
定ユニットのドームの頂点にはフォトダイオードが設置
されており、グラスフィルターからの発光量を測定し、
その積算値により発光反応部に存在する標識物質の量を
算出することができる。この標識物質量は抗原抗体反応
で結合しなかった量に相当し、試料中の測定すべき抗原
あるいは抗体の量と相関関係にある。

【００２７】

【発明の効果】本発明によれば、簡便な方法でＢ／Ｆ分
離を行うことができ、操作が飛躍的に簡単になるととも
に、高感度の測定を行うことができる。

【００２８】

【実施例】本発明の免疫測定方法およびその測定のため
に好適な器具を以下の実施例において図面を参照しなが
ら説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。

【００２９】実施例１：生体成分測定用器具の一態様 図１は、本発明の器具の一実施態様を示すものである。
２５ｍｍｘ４０ｍｍ、厚さ３ｍｍの黒色ポリスチレン樹
脂プレートに、瓢箪形の窪みを設ける。小さい方の窪み
（試料滴下部用）は深さ０．４２ｍｍ、直径５ｍｍであ
り、大きい方の窪み（発光反応部用）は深さ０．４２ｍ
ｍ、直径２０ｍｍである。この窪みに嵌まるように、瓢
箪形にグラスフィルター（ワットマン濾紙ＧＦ／Ｆ、厚
さ０．４２ｍｍ）を切断して嵌め込み生体成分測定用器
具とする。

【００３０】実施例２：溢れ防止手段を有する生体成分
測定用器具の一態様 図２および図３は、試料滴下部に滴下した試料が発光反
応部に溢れるのを防止する手段を設けた、本発明の器具
の一実施態様を示すものである。２５ｍｍｘ４０ｍｍ、
厚さ５ｍｍの黒色ポリスチレン樹脂プレートに、発光反
応部と同じ直径２０ｍｍの穴と、試料滴下部の直径より
やや小さな穴を設け（図２）、実施例１の生体成分測定
用器具に貼り合わせて構成される（図３）。

【００３１】実施例３：突起部を有する生体成分測定用
器具の一態様 図４は、試料滴下部に突起部を設けた本発明の器具の一
実施態様を示すものである。反応容器の底面が疎水性膜
で構成されている場合には、突起部で膜を破ることによ
って簡単に試料を試料滴下部に滴下することができる。

【００３２】実施例４：多孔質材料形状の検討 多孔質材料の形状によって発光の検出感度がどの程度変
化するかを調べた。

【００３３】多孔質材料としてはグラスフィルターを使
用して、化学発光物質であるルシゲニンの発光量で評価
を行った。グラスフィルターの形状として、長方形（図
５のＡ）、中央がくびれた形（図５のＢ）および瓢箪形
（図５のＣ）の３つの形状をもつ器具を作製した。図
中、黒丸で示す部分は試料滴下部を示す。破線で囲んだ
部分は測定ユニット内部に入る部分を示し、斜線部は測
定ユニット内に入るグラスフィルター部分（発光反応
部）を示しており、３つの形状で斜線部の面積はほぼ等
しい。

【００３４】ルシゲニンはアルカリ下で発光するが、そ
の発光量はアスコルビン酸や過酸化水素によって大幅に
増強される。また発光時間も延長する。本実験ではルシ
ゲニン溶液にアスコルビン酸とＫＯＨを添加したものを
グラスフィルターに添加し、一定時間後の発光量を半球
形の測定ユニットに設置したフォトダイオードで測定し
た（図６のＡはこのようなフォトダイオードを設置した
測定ユニットを示し、図６のＢはグラスフィルターユニ
ットを測定ユニットに挿入した測定時の概念図を示
す）。

【００３５】０．０００８％ルシゲニン溶液と１ｍＭア
スコルビン酸、１Ｎ ＫＯＨを１ｍｌずつ等量混合し、
そのうちの１ｍｌをグラスフィルターの試料滴下部に滴
下した。試料がグラスフィルターに拡散した後、各グラ
スフィルターを測定ユニットの中に挿入した。試料添加
の５分後から始めて５秒間、測定ユニットにより発光量
を測定し、その発光量の積算値を数字として表示した。

【００３６】測定ユニットはグラスフィルターを保持し
ているユニットが半分だけ入る大きさを有するドーム型
のもので、ドームの頂点にはダイオードが配置されてお
り、グラスフィルターから発する光を捕らえることがで
きる。測定ユニット自体は黒色の合成樹脂でできてお
り、外部からの光が入らないように設計されている。

【００３７】得られた結果を以下の表１に示す。

【００３８】表１ 形状 長方形 中央くびれ形 瓢箪形 発光強度 ５６２ ５８０ ３６２０

【００３９】試料滴下部の最も小さい瓢箪形のグラスフ
ィルターが最も大きな発光量を示した。このことから発
光測定を行う場合、グラスフィルターの形状は測定感度
に大きく関係しており、試料滴下部が小さく発光反応部
（測定部）が十分大きいことが高感度化につながること
が示された。

【００４０】実施例５：イムノアッセイでの使用 瓢箪形のグラスフィルター（ワットマン濾紙ＧＦ／Ｆ、
厚さ０．４２ｍｍを使用）を多孔質材料に使用し、実施
例２に記載の生体成分測定用器具を用いて化学発光のイ
ムノアッセイを実施した。測定すべき抗原として甲状腺
ホルモンであるＴＳＨを用いた。

【００４１】固相：抗ＴＳＨβ抗体標識ラテックス粒子 直径０．８μｍのポリスチレンラテックス粒子に、抗Ｔ
ＳＨβマウスモノクローナル抗体を物理吸着により結合
した。抗体溶液は５０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、５％
ラテックス溶液１ｍｌ当たり５００μｇの抗体を添加し
た。４℃で一晩静置した後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）を含むリン酸緩衝液を添加し、遠心分離を行っ
た。粒子は０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液に再分散
して実験に用いた。

【００４２】酵素標識抗体：抗ＴＳＨα抗体−ＡＬＰ
（アルカリホスファターゼ）標識物 抗ＴＳＨαマウスモノクローナル抗体とＡＬＰとをカル
ボジイミドを用いて次のようにして結合した。１０ｍＭ
マレイン酸緩衝液ｐＨ７．０中に抗体と酵素を等モルで
混合し、これにＥＤＣ（水溶性カルボジイミド）を２倍
モル量添加し、４℃で一晩撹拌した。反応液はセファク
リルＳ−３００でゲル濾過（溶出液：０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ緩衝液ｐＨ７．０）を行い、高分子側に溶出されたＡ
ＬＰ活性の部分を酵素標識抗体分画としてプールした。

【００４３】化学発光：ルシゲニン−コルチゾールリン
酸 酵素活性の測定にはコルチゾールリン酸を基質に利用し
た化学発光酵素イムノアッセイを用いた。この反応は、
コルチゾールリン酸がＡＬＰによって加水分解され、生
じるコルチゾールがルシゲニンの発光を著しく高めるこ
とを利用している。

【００４４】イムノアッセイ：抗ＴＳＨβ抗体感作ラテ
ックス１００μｌとＴＳＨを含む溶液１００μｌ、抗Ｔ
ＳＨα抗体−ＡＬＰ結合物１００μｌを混合し、３７℃
で３０分反応後、反応液を２００μｌ取り、グラスフィ
ルターの試料滴下部に滴下して拡散を行った。グラスフ
ィルターは一度ルシゲニン溶液（０．００８％ルシゲニ
ン、０．５ｍＭコルチゾールリン酸、０．１Ｍグリシン
緩衝液ｐＨ９．６）に浸けて乾燥させたものである。１
０分後に１Ｎ ＫＯＨを１ｍｌ試料滴下部に添加し、５
分後の発光量を測定した。発光量の測定は積算で行い、
５秒間の発光量を積算した。

【００４５】得られた結果を表２に示す。試料中のＴＳ
Ｈ濃度に応じて発光強度の低下が観察された。

【００４６】

【００４７】得られた結果をグラフに示したものが図７
である。ＴＳＨ濃度と発光強度との間に良好な相関関係
が得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の生体成分測定用器具の一実施態様を示
す。

【図２】溢れ防止手段を有する生体成分測定用器具の一
実施態様を示す。

【図３】溢れ防止手段を有する生体成分測定用器具に用
いる部材を示す。

【図４】試料滴下部に突起部を設けた生体成分測定用器
具の一実施態様を示す。

【図５】多孔質材料の形状の検討に用いた各生体成分測
定用器具を示す。

【図６】Ａはフォトダイオードを設置した測定ユニット
を示し、Ｂはグラスフィルターユニットを測定ユニット
に挿入した測定時の概念図を示す。

【図７】ＴＳＨ濃度と発光強度との関係を示すグラフで
ある。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 測定対象物に対する抗原あるいは抗体を
   固定化した固相を使用し、試料中の抗原あるいは抗体
   と、標識した抗原あるいは抗体（標識物質）とで反応を
   行わせた後、多孔質材料からなる試料滴下部と、多孔質
   材料からなる発光反応部とを支持体上に配置した生体成
   分測定用器具を用いて試料中の測定対象物の量を測定す
   る方法であって、前記生体成分測定用器具の発光反応部
   は、前記試料滴下部よりも大きく、前記発光反応部は、
   前記試料滴下部と連結する形で配置され、前記試料滴下
   部から移動してきた標識物質を拡散できるようにしたこ
   とを特徴とする免疫測定方法。
2. 【請求項２】 多孔質材料からなる試料滴下部と、多孔
   質材料からなる発光反応部とを支持体上に配置した生体
   成分測定用器具であって、前記生体成分測定用器具の発
   光反応部は、前記試料滴下部よりも大きく、前記発光反
   応部は、前記試料滴下部と連結する形で配置され、前記
   試料滴下部から移動してきた標識物質を拡散できるよう
   にしたことを特徴とする生体成分測定用器具。
3. 【請求項３】 試料滴下部の多孔質材料が粒子を通過さ
   せない材料である請求項２記載の器具。
4. 【請求項４】 試料滴下部に滴下した試料が発光反応部
   に溢れるのを防止する手段をさらに備えた請求項２また
   は３記載の器具。
5. 【請求項５】 試料滴下部に突起部をさらに設けた請求
   項２〜４のいずれかに記載の器具。