JPH09187276A - 核酸の蛍光偏光検出法 - Google Patents
核酸の蛍光偏光検出法Info
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- JPH09187276A JPH09187276A JP8304465A JP30446596A JPH09187276A JP H09187276 A JPH09187276 A JP H09187276A JP 8304465 A JP8304465 A JP 8304465A JP 30446596 A JP30446596 A JP 30446596A JP H09187276 A JPH09187276 A JP H09187276A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Abstract
(57)【要約】
【課題】 増幅した、または増幅していない核酸標的配
列を、高温での標識プローブのハイブリダイゼーション
に際しての蛍光偏光の変化により検出する方法を提供す
る。 【解決手段】 本発明は、増幅した、または増幅してい
ない核酸標的配列を高温で蛍光偏光の変化により検出す
る方法を提供する。より高く、よりストリンジェントな
温度でのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
に伴う蛍光偏光の減少が、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を
アッセイに含有させることにより克服される。オリゴヌ
クレオチドプローブまたはプライマーが一本鎖から二本
鎖に変換する際に生じる蛍光偏光の大きさの変化を、高
温で二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が再生し、かつしばしば
増大させる。
列を、高温での標識プローブのハイブリダイゼーション
に際しての蛍光偏光の変化により検出する方法を提供す
る。 【解決手段】 本発明は、増幅した、または増幅してい
ない核酸標的配列を高温で蛍光偏光の変化により検出す
る方法を提供する。より高く、よりストリンジェントな
温度でのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
に伴う蛍光偏光の減少が、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を
アッセイに含有させることにより克服される。オリゴヌ
クレオチドプローブまたはプライマーが一本鎖から二本
鎖に変換する際に生じる蛍光偏光の大きさの変化を、高
温で二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が再生し、かつしばしば
増大させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸標的配列を検
出する方法、特に蛍光偏光の変化によりそれらの標的配
列を検出する方法に関するものである。
出する方法、特に蛍光偏光の変化によりそれらの標的配
列を検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】蛍光偏光（ＦＰ）は蛍光性分子の時間平
均回転運動の尺度である。それは１９２０年代から知ら
れており、分子の体積およびミクロ粘度の高感度測定の
ために、研究および臨床の両方の用途に用いられてい
る。ＦＰ法は溶液中の分子の回転特性の変化に依存す
る。すなわち溶液中の分子はそれらの種々の軸の周りに
“混転する（ｔｕｍｂｌｅ）”傾向がある。大型分子ほ
ど（たとえば体積または分子量がより大きいものほど）
小型分子より緩慢に、より少ない軸に沿って混転する。
したがって励起と発光の間の運動がより少なく、このた
め発光光線は比較的高度の偏光を示す。逆に、励起と発
光の間でより大きな混転を示す小型の蛍光性分子からの
蛍光発光ほど、より多面性（ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ）
（偏光度が低い）である。小型分子がより大きい、より
堅牢なコンホメーションをとると、その混転は低下し、
発光蛍光は相対的により大きく偏光するようになる。こ
の発光蛍光の偏光度の変化を測定して、蛍光分子の大き
さおよび／または堅牢度の増大の指標として利用するこ
とができる。
均回転運動の尺度である。それは１９２０年代から知ら
れており、分子の体積およびミクロ粘度の高感度測定の
ために、研究および臨床の両方の用途に用いられてい
る。ＦＰ法は溶液中の分子の回転特性の変化に依存す
る。すなわち溶液中の分子はそれらの種々の軸の周りに
“混転する（ｔｕｍｂｌｅ）”傾向がある。大型分子ほ
ど（たとえば体積または分子量がより大きいものほど）
小型分子より緩慢に、より少ない軸に沿って混転する。
したがって励起と発光の間の運動がより少なく、このた
め発光光線は比較的高度の偏光を示す。逆に、励起と発
光の間でより大きな混転を示す小型の蛍光性分子からの
蛍光発光ほど、より多面性（ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ）
（偏光度が低い）である。小型分子がより大きい、より
堅牢なコンホメーションをとると、その混転は低下し、
発光蛍光は相対的により大きく偏光するようになる。こ
の発光蛍光の偏光度の変化を測定して、蛍光分子の大き
さおよび／または堅牢度の増大の指標として利用するこ
とができる。
【０００３】蛍光偏光法においては、蛍光性分子をまず
偏光により励起する。（ｉ）偏光した励起光線の平面に
対して平行な発光と（ｉｉ）偏光した励起光線の平面に
対して垂直な発光との相対強度を測定することにより、
発光の偏光を測定する。大きさおよび／または堅牢度の
変化による混転率の変化に伴って、励起光線平面と発光
蛍光平面との関係の変化、すなわち蛍光偏光の変化が生
じる。このような変化は、たとえば一本鎖オリゴヌクレ
オチドプローブが二本鎖になった場合、または核酸結合
性蛋白質がオリゴヌクレオチドに結合した場合に起こる
可能性がある。蛍光異方性はＦＰに密接な関係をもつ。
この方法で分子の混転率の変化を測定することもできる
が、ただしこれは異なる方程式を用いて計算される。偏
光と異方性は本発明に用いるための互換性のある方法で
あることを理解すべきである。本明細書においては蛍光
偏光という用語を一般に用いるが、これには蛍光異方性
法も包含されると解すべきである。定常状態の偏光およ
び異方性の測定においては、これらの数値は以下の方程
式に従って計算される： 式中のＩｐａは偏光した励起光線の平面に対して平行な
蛍光発光の強度であり、Ｉｐｅは偏光した励起光線の平
面に対して垂直な蛍光発光の強度である。
偏光により励起する。（ｉ）偏光した励起光線の平面に
対して平行な発光と（ｉｉ）偏光した励起光線の平面に
対して垂直な発光との相対強度を測定することにより、
発光の偏光を測定する。大きさおよび／または堅牢度の
変化による混転率の変化に伴って、励起光線平面と発光
蛍光平面との関係の変化、すなわち蛍光偏光の変化が生
じる。このような変化は、たとえば一本鎖オリゴヌクレ
オチドプローブが二本鎖になった場合、または核酸結合
性蛋白質がオリゴヌクレオチドに結合した場合に起こる
可能性がある。蛍光異方性はＦＰに密接な関係をもつ。
この方法で分子の混転率の変化を測定することもできる
が、ただしこれは異なる方程式を用いて計算される。偏
光と異方性は本発明に用いるための互換性のある方法で
あることを理解すべきである。本明細書においては蛍光
偏光という用語を一般に用いるが、これには蛍光異方性
法も包含されると解すべきである。定常状態の偏光およ
び異方性の測定においては、これらの数値は以下の方程
式に従って計算される： 式中のＩｐａは偏光した励起光線の平面に対して平行な
蛍光発光の強度であり、Ｉｐｅは偏光した励起光線の平
面に対して垂直な蛍光発光の強度である。
【０００４】ＦＰは均質であるので、この方法は物理的
操作による妨害なしに溶液中の分子の相互作用を研究す
るために理想的である。したがって蛍光偏光は、一本鎖
の蛍光標識ＤＮＡがハイブリダイゼーションにより二本
鎖形に変換したのを監視するのに好都合な方法である
（Ｍｕｒａｋａｍｉ，ｅｔ．ａｌ．１９９１，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４０９７−４１０
２）。ＦＰが一本鎖核酸と二本鎖核酸のコンホメーショ
ンを両形態の物理的分離なしに識別しうることにより、
この技術は診断形式においてプローブハイブリダイゼー
ションを監視するための魅力的な代替法となった。欧州
特許出願公開第０ ３８２ ４３３号明細書には、蛍光
プローブをアンプリコンにハイブリダイズさせることに
より、または蛍光標識した増幅プライマーの標的特異性
伸長法によって蛍光標識を増幅生成物に取り込ませるこ
とにより、増幅した標的配列を蛍光偏光検出することが
記載されている。国際特許出願公開第ＷＯ ９２／１８
６５０号明細書には、増幅したＲＮＡまたはＤＮＡ標的
配列を蛍光プローブのハイブリダイゼーションに伴う蛍
光偏光の増大により検出するための類似の方法が記載さ
れている。
操作による妨害なしに溶液中の分子の相互作用を研究す
るために理想的である。したがって蛍光偏光は、一本鎖
の蛍光標識ＤＮＡがハイブリダイゼーションにより二本
鎖形に変換したのを監視するのに好都合な方法である
（Ｍｕｒａｋａｍｉ，ｅｔ．ａｌ．１９９１，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４０９７−４１０
２）。ＦＰが一本鎖核酸と二本鎖核酸のコンホメーショ
ンを両形態の物理的分離なしに識別しうることにより、
この技術は診断形式においてプローブハイブリダイゼー
ションを監視するための魅力的な代替法となった。欧州
特許出願公開第０ ３８２ ４３３号明細書には、蛍光
プローブをアンプリコンにハイブリダイズさせることに
より、または蛍光標識した増幅プライマーの標的特異性
伸長法によって蛍光標識を増幅生成物に取り込ませるこ
とにより、増幅した標的配列を蛍光偏光検出することが
記載されている。国際特許出願公開第ＷＯ ９２／１８
６５０号明細書には、増幅したＲＮＡまたはＤＮＡ標的
配列を蛍光プローブのハイブリダイゼーションに伴う蛍
光偏光の増大により検出するための類似の方法が記載さ
れている。
【０００５】蛍光偏光は３種類の異なる状態のいずれに
おいても監視することができる：定常状態、前定常状態
または動的状態。前定常状態ＦＰの場合、励起光源を試
料にフラッシュし、励起光源を消灯したのち光電子増倍
管を点灯することにより、発光光線の偏光を監視する。
蛍光は光散乱より長時間持続するので、これにより光散
乱による妨害は減少するが、蛍光強度がある程度失われ
る。定常状態ＦＰの場合、励起光および発光監視が連続
的である（すなわち励起光源および光電子増倍管を連続
的に点灯しておく）。その結果、監視期間全体にわたる
平均混転時間が測定され、これには散乱光の影響が含ま
れる。動的ＦＰは時間ドメインまたは周波数ドメインの
いずれかにおいて監視することができる。動的蛍光法
は、蛍光性分子の寿命をナノ秒で測定することによる。
動的蛍光監視法の理論は“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐ
ｙ”（Ｌａｃｏｗｉｃｚ，プレナム・プレス，１９８
３）に記載されている。定常状態ＦＰは蛍光現象の平均
または“断片”を提供するのに対し、動的ＦＰは被験系
における蛍光性成分の個々の寄与を観察することができ
る。これら３種類の蛍光法の利用についてはＫｕｍｋｅ
ら（１９９５，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７，３９４５−
３９５１）、Ｄｅｖｌｉｎら（１９９３，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．３９，１９３９−１９４３）、およびＷａｌｋ
ｅｒら（１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．引用省略）に
より記載されている。
おいても監視することができる：定常状態、前定常状態
または動的状態。前定常状態ＦＰの場合、励起光源を試
料にフラッシュし、励起光源を消灯したのち光電子増倍
管を点灯することにより、発光光線の偏光を監視する。
蛍光は光散乱より長時間持続するので、これにより光散
乱による妨害は減少するが、蛍光強度がある程度失われ
る。定常状態ＦＰの場合、励起光および発光監視が連続
的である（すなわち励起光源および光電子増倍管を連続
的に点灯しておく）。その結果、監視期間全体にわたる
平均混転時間が測定され、これには散乱光の影響が含ま
れる。動的ＦＰは時間ドメインまたは周波数ドメインの
いずれかにおいて監視することができる。動的蛍光法
は、蛍光性分子の寿命をナノ秒で測定することによる。
動的蛍光監視法の理論は“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐ
ｙ”（Ｌａｃｏｗｉｃｚ，プレナム・プレス，１９８
３）に記載されている。定常状態ＦＰは蛍光現象の平均
または“断片”を提供するのに対し、動的ＦＰは被験系
における蛍光性成分の個々の寄与を観察することができ
る。これら３種類の蛍光法の利用についてはＫｕｍｋｅ
ら（１９９５，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７，３９４５−
３９５１）、Ｄｅｖｌｉｎら（１９９３，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．３９，１９３９−１９４３）、およびＷａｌｋ
ｅｒら（１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．引用省略）に
より記載されている。
【０００６】核酸の分析、特に特異的核酸標的配列の検
出は、診断および生物学的材料の同定のための極めて高
感度の道具を提供する。一般に核酸標的配列は、標識オ
リゴヌクレオチドプローブへの特異的ハイブリダイゼー
ションにより検出される。核酸標的配列を検出するため
のプローブハイブリダイゼーション法が幾つか当技術分
野で知られている（たとえばドットブロット、サザンブ
ロット、ノーザンブロット）が、これらは感度が若干低
く、一般には検出すべき標的配列を比較的大量含有する
試料に適用しうるにすぎない。核酸増幅法は、検出前に
標的配列の量を特異的に増加させる方法を提供すること
により、標的配列の検出感度を大幅に向上させた。核酸
増幅法は処理の温度要件に従って分類することができ
る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋ
ｉら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，１３５０−１
３５４）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｄ．Ｙ．Ｗｕ
ら，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０−５６
９；Ｋ．Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら，１９９０，Ｇｅｎｅ
８９，１１７−１２２；Ｆ．Ｂａｒａｎｙ，１９９１，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８，１８９−１９３）、および転写に基づく増幅（Ｄ．
Ｙ．Ｋｗｏｈら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７）は
温度循環を必要とする。これに対し鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ；Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９２−３
９６、およびＧ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６お
よび米国特許第５，４５５，１６６号明細書）、自己持
続型配列増幅（３ＳＲ；Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉら，
１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８７，１８７４−１８７８）、核酸配列に基づく
増幅（米国特許第５，４０９，８１８号明細書）、制限
増幅（米国特許第５，１０２，７８４号明細書）および
Ｑβレプリカーゼ系（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉら，１９
８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１７９−１
２０２）は等温反応である。ＰＣＲなどの増幅反応に特
徴的な高温と低温の間での循環に対し、等温増幅は本質
的に一定の温度で行われる。上記に引用した刊行物に最
初に報告されたＳＤＡ反応（“一般的ＳＤＡ”）は、一
般に３５−４２℃の温度で行われ、約２時間で標的配列
を１０8倍増幅することができる。最近、ＳＤＡがより
高い反応温度に適用されている（約４５−６５℃−“好
熱性（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）ＳＤＡ”または
“ｔＳＤＡ”）。ｔＳＤＡは約５０−６０℃において約
１５−３０分間で１０9−１０10倍の増幅を生じること
ができる。反応速度の増大のほか、ｔＳＤＡにおいては
一般的ＳＤＡと比較して非特異的バックグラウンド増幅
が有意に低下する。
出は、診断および生物学的材料の同定のための極めて高
感度の道具を提供する。一般に核酸標的配列は、標識オ
リゴヌクレオチドプローブへの特異的ハイブリダイゼー
ションにより検出される。核酸標的配列を検出するため
のプローブハイブリダイゼーション法が幾つか当技術分
野で知られている（たとえばドットブロット、サザンブ
ロット、ノーザンブロット）が、これらは感度が若干低
く、一般には検出すべき標的配列を比較的大量含有する
試料に適用しうるにすぎない。核酸増幅法は、検出前に
標的配列の量を特異的に増加させる方法を提供すること
により、標的配列の検出感度を大幅に向上させた。核酸
増幅法は処理の温度要件に従って分類することができ
る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋ
ｉら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，１３５０−１
３５４）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｄ．Ｙ．Ｗｕ
ら，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，５６０−５６
９；Ｋ．Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら，１９９０，Ｇｅｎｅ
８９，１１７−１２２；Ｆ．Ｂａｒａｎｙ，１９９１，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
８，１８９−１９３）、および転写に基づく増幅（Ｄ．
Ｙ．Ｋｗｏｈら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３−１１７７）は
温度循環を必要とする。これに対し鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ；Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９２−３
９６、およびＧ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６お
よび米国特許第５，４５５，１６６号明細書）、自己持
続型配列増幅（３ＳＲ；Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉら，
１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８７，１８７４−１８７８）、核酸配列に基づく
増幅（米国特許第５，４０９，８１８号明細書）、制限
増幅（米国特許第５，１０２，７８４号明細書）および
Ｑβレプリカーゼ系（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉら，１９
８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１７９−１
２０２）は等温反応である。ＰＣＲなどの増幅反応に特
徴的な高温と低温の間での循環に対し、等温増幅は本質
的に一定の温度で行われる。上記に引用した刊行物に最
初に報告されたＳＤＡ反応（“一般的ＳＤＡ”）は、一
般に３５−４２℃の温度で行われ、約２時間で標的配列
を１０8倍増幅することができる。最近、ＳＤＡがより
高い反応温度に適用されている（約４５−６５℃−“好
熱性（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｉｃ）ＳＤＡ”または
“ｔＳＤＡ”）。ｔＳＤＡは約５０−６０℃において約
１５−３０分間で１０9−１０10倍の増幅を生じること
ができる。反応速度の増大のほか、ｔＳＤＡにおいては
一般的ＳＤＡと比較して非特異的バックグラウンド増幅
が有意に低下する。
【０００７】増幅していない標的配列または増幅した標
的配列のいずれかを、標識オリゴヌクレオチドプローブ
のハイブリダイゼーションにより検出することができ
る。このためには、信号を測定する前に遊離プローブと
ハイブリダイズしたプローブとを分離する必要のある場
合が多い。しかしＦＰの変化を監視することにより遊離
プローブとハイブリダイズしたプローブを物理的に分離
せずに識別することができ、これにより操作工程および
処理の複雑さが少なくなる。プローブハイブリダイゼー
ションの代替として、増幅反応に際して一本鎖シグナル
プライマーから標的増幅依存性様式で二本鎖二次増幅生
成物を生成させることにより、標的増幅を検出すること
ができる。標的増幅に際しての二次増幅生成物の生成
は、欧州特許出願公開第０ ６７８ ５８２号および第
０ ６７８ ５８１号明細書に記載および図示されてい
る。この方法においては、検出可能な標識を含む一本鎖
オリゴヌクレオチドシグナルプライマーを標的増幅依存
性様式で二本鎖形に変換する。シグナルプライマーの変
換は増幅反応と同時に起こり、標識が蛍光性である場
合、ＦＰの変化として検出することができる。標的増幅
の結果としてのシグナルプライマーから二本鎖形への変
換に伴うＦＰの増大は、蛍光標識としてフルオレセイン
またはラジョラブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）
を用いた場合、約２０ｍＰである。低温（たとえば約３
５−４５℃）で増幅を行う場合、このＦＰの変化は、二
本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質をシグナルプライマー中に取り
込まれたそれの特異的結合配列に結合させることにより
増強することができる（たとえば約１３３−１８５ｍＰ
に）。この系においては、蛋白質の結合は二次増幅生成
物中の結合配列が標的増幅の結果として二本鎖になった
時点でのみ起こりうるのであるから、増強は増幅特異的
である。二重らせんが完全に二本鎖である約４５℃より
低い温度では、偏光の増大は恐らく主としてＤＮＡ結合
性蛋白質が分子の混転時間をさらに緩慢にする結果であ
ろう。
的配列のいずれかを、標識オリゴヌクレオチドプローブ
のハイブリダイゼーションにより検出することができ
る。このためには、信号を測定する前に遊離プローブと
ハイブリダイズしたプローブとを分離する必要のある場
合が多い。しかしＦＰの変化を監視することにより遊離
プローブとハイブリダイズしたプローブを物理的に分離
せずに識別することができ、これにより操作工程および
処理の複雑さが少なくなる。プローブハイブリダイゼー
ションの代替として、増幅反応に際して一本鎖シグナル
プライマーから標的増幅依存性様式で二本鎖二次増幅生
成物を生成させることにより、標的増幅を検出すること
ができる。標的増幅に際しての二次増幅生成物の生成
は、欧州特許出願公開第０ ６７８ ５８２号および第
０ ６７８ ５８１号明細書に記載および図示されてい
る。この方法においては、検出可能な標識を含む一本鎖
オリゴヌクレオチドシグナルプライマーを標的増幅依存
性様式で二本鎖形に変換する。シグナルプライマーの変
換は増幅反応と同時に起こり、標識が蛍光性である場
合、ＦＰの変化として検出することができる。標的増幅
の結果としてのシグナルプライマーから二本鎖形への変
換に伴うＦＰの増大は、蛍光標識としてフルオレセイン
またはラジョラブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）
を用いた場合、約２０ｍＰである。低温（たとえば約３
５−４５℃）で増幅を行う場合、このＦＰの変化は、二
本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質をシグナルプライマー中に取り
込まれたそれの特異的結合配列に結合させることにより
増強することができる（たとえば約１３３−１８５ｍＰ
に）。この系においては、蛋白質の結合は二次増幅生成
物中の結合配列が標的増幅の結果として二本鎖になった
時点でのみ起こりうるのであるから、増強は増幅特異的
である。二重らせんが完全に二本鎖である約４５℃より
低い温度では、偏光の増大は恐らく主としてＤＮＡ結合
性蛋白質が分子の混転時間をさらに緩慢にする結果であ
ろう。
【０００８】プローブのハイブリダイゼーションおよび
／または増幅の特異性は温度が高いほど（たとえば約４
５−７５℃）増大する。したがって核酸標識配列検出の
ためのＦＰの利点を高い増幅温度と組み合わせることが
望ましい。しかし、高い反応温度はＦＰ検出に適合しな
いと予想されていた。多くの蛍光標識が高温では不安定
である。さらに、高温では二重らせんの“ブリージン
グ”および末端の“フレイイング（ｆｒａｙｉｎｇ）”
が促進され、その結果一本鎖性が増大する。蛍光標識付
近の、特に二重らせん末端のこの一本鎖性の増大によっ
て、二本鎖形に関するＦＰの変化の大きさが有意に低下
し、ハイブリダイゼーション特異性のために最適化した
温度では排除される可能性がある。これらの問題は５５
℃におけるＦＰの変化を評価する予備実験により支持さ
れた。この温度では、一本鎖形と二本鎖形のオリゴヌク
レオチド間で偏光に差がなかった。さらに、ＦＰは試料
の粘度に対して敏感であり、粘度は高温で変動する。し
たがって試料粘度の変動が高い反応温度での核酸標的配
列の検出にＦＰの変化を利用しうる可能性に及ぼす影響
は不確実であった。
／または増幅の特異性は温度が高いほど（たとえば約４
５−７５℃）増大する。したがって核酸標識配列検出の
ためのＦＰの利点を高い増幅温度と組み合わせることが
望ましい。しかし、高い反応温度はＦＰ検出に適合しな
いと予想されていた。多くの蛍光標識が高温では不安定
である。さらに、高温では二重らせんの“ブリージン
グ”および末端の“フレイイング（ｆｒａｙｉｎｇ）”
が促進され、その結果一本鎖性が増大する。蛍光標識付
近の、特に二重らせん末端のこの一本鎖性の増大によっ
て、二本鎖形に関するＦＰの変化の大きさが有意に低下
し、ハイブリダイゼーション特異性のために最適化した
温度では排除される可能性がある。これらの問題は５５
℃におけるＦＰの変化を評価する予備実験により支持さ
れた。この温度では、一本鎖形と二本鎖形のオリゴヌク
レオチド間で偏光に差がなかった。さらに、ＦＰは試料
の粘度に対して敏感であり、粘度は高温で変動する。し
たがって試料粘度の変動が高い反応温度での核酸標的配
列の検出にＦＰの変化を利用しうる可能性に及ぼす影響
は不確実であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、増幅した、
または増幅していない核酸標的配列を、高温での標識プ
ローブのハイブリダイゼーションに際しての蛍光偏光の
変化により検出する方法を提供することを目的とする。
または増幅していない核酸標的配列を、高温での標識プ
ローブのハイブリダイゼーションに際しての蛍光偏光の
変化により検出する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】１態様において本発明
は、増幅した、または増幅していない核酸標的配列を、
高温での標識プローブのハイブリダイゼーションに際し
ての蛍光偏光の変化により検出する方法を提供する。第
２態様においては、本発明方法を高温での標的配列増幅
の検出に利用する。増幅は、二本鎖蛍光性二次増幅生成
物をＦＰの増大により検出する方法を利用して検出しう
る。予備実験から、高温では核酸二重らせんの一本鎖性
が増大することによって、付随するＦＰ変化が著しく低
下または排除されるであろうということが示された。し
かし高温で二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が二本鎖性に伴う
偏光の変化の大きさを再生し、しばしば増大させること
が見出された。ハイブリダイゼーションまたは増幅を特
異性向上のために高温（約４５−７５℃）で行う際、二
本鎖生成物に二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を結合させると
二本鎖形が安定化し、温度に伴う偏光低下に関与する一
本鎖性が減少するのであろうと考えられる。
は、増幅した、または増幅していない核酸標的配列を、
高温での標識プローブのハイブリダイゼーションに際し
ての蛍光偏光の変化により検出する方法を提供する。第
２態様においては、本発明方法を高温での標的配列増幅
の検出に利用する。増幅は、二本鎖蛍光性二次増幅生成
物をＦＰの増大により検出する方法を利用して検出しう
る。予備実験から、高温では核酸二重らせんの一本鎖性
が増大することによって、付随するＦＰ変化が著しく低
下または排除されるであろうということが示された。し
かし高温で二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が二本鎖性に伴う
偏光の変化の大きさを再生し、しばしば増大させること
が見出された。ハイブリダイゼーションまたは増幅を特
異性向上のために高温（約４５−７５℃）で行う際、二
本鎖生成物に二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を結合させると
二本鎖形が安定化し、温度に伴う偏光低下に関与する一
本鎖性が減少するのであろうと考えられる。
【００１１】核酸標的配列が十分な量で存在すると、そ
れは検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ
のハイブリダイゼーションにより検出することができ
る。ハイブリダイゼーションによる直接検出のための方
法が当技術分野で多数知られている。それらにはたとえ
ば、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを単に標的配列
にハイブリダイズさせ、そして検出可能な標識により検
出する方法、およびハイブリダイズしたプローブを診断
しうる長さにまで検出前にポリメラーゼにより伸長させ
る方法が含まれる。標的配列のハイブリダイゼーション
の特異性、したがって検出の特異性を向上させるために
は、効果的なハイブリダイゼーションが起こる最高温度
またはその付近の温度でプローブを標的にハイブリダイ
ズさせることが望ましい。この温度は、部分的にはプロ
ーブおよび標的の個々の配列に依存するが、実験的に、
または計算によって、いかなる標的配列およびプローブ
／プライマーについても容易に判定することができる。
高温でハイブリダイズさせるとストリンジェンシーが増
大し、類似配列へのプローブの非特異的交差ハイブリダ
イゼーションが減少し、当該標的配列へのハイブリダイ
ゼーションが優先的に促進される。標識プローブのハイ
ブリダイゼーションにより、増幅した標的配列または増
幅していない標的配列をいずれかを検出することができ
る。蛍光標識を含むプローブのハイブリダイゼーション
を特異性の向上のために高温で行う際、二本鎖構造を配
列特異的または配列非特異的な二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白
質によって安定化して、一本鎖オリゴヌクレオチドから
二本鎖形への変換に伴うＦＰの変化を維持することがで
きる。
れは検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ
のハイブリダイゼーションにより検出することができ
る。ハイブリダイゼーションによる直接検出のための方
法が当技術分野で多数知られている。それらにはたとえ
ば、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを単に標的配列
にハイブリダイズさせ、そして検出可能な標識により検
出する方法、およびハイブリダイズしたプローブを診断
しうる長さにまで検出前にポリメラーゼにより伸長させ
る方法が含まれる。標的配列のハイブリダイゼーション
の特異性、したがって検出の特異性を向上させるために
は、効果的なハイブリダイゼーションが起こる最高温度
またはその付近の温度でプローブを標的にハイブリダイ
ズさせることが望ましい。この温度は、部分的にはプロ
ーブおよび標的の個々の配列に依存するが、実験的に、
または計算によって、いかなる標的配列およびプローブ
／プライマーについても容易に判定することができる。
高温でハイブリダイズさせるとストリンジェンシーが増
大し、類似配列へのプローブの非特異的交差ハイブリダ
イゼーションが減少し、当該標的配列へのハイブリダイ
ゼーションが優先的に促進される。標識プローブのハイ
ブリダイゼーションにより、増幅した標的配列または増
幅していない標的配列をいずれかを検出することができ
る。蛍光標識を含むプローブのハイブリダイゼーション
を特異性の向上のために高温で行う際、二本鎖構造を配
列特異的または配列非特異的な二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白
質によって安定化して、一本鎖オリゴヌクレオチドから
二本鎖形への変換に伴うＦＰの変化を維持することがで
きる。
【００１２】高温でのプライマーハイブリダイゼーショ
ンの特異性が向上したことにより、核酸増幅反応を効果
的な増幅プライマーハイブリダイゼーションのための最
高に近い温度で行うことが望ましいものとなる。これに
よりミスプライミングが減少し、その結果、非特異的バ
ックグラウンド増幅の量が減少する。先に述べたよう
に、増幅した標的配列への標識プローブのハイブリダイ
ゼーションを検出に利用することができる。しかし増幅
反応における標的配列を検出するための最近開発された
方法は、少なくとも１種類のシグナルプライマーを用い
る（検出プローブとも呼ばれる；欧州特許第０ ６７８
５８２号および第０ ６７８ ５８１号明細書）。シ
グナルプライマーは標的増幅の検出または監視を促進す
るために、増幅反応に装入される。標的増幅に際してこ
の一本鎖オリゴヌクレオチド（シグナルプライマー）は
標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼにより伸長
する。一本鎖シグナルプライマーは標的増幅の結果とし
て二本鎖になって、二次増幅生成物を生成する。一本鎖
シグナルプライマーから二次増幅生成物における二本鎖
形への変換が標的増幅の指標である。標的増幅がない場
合、二次増幅生成物は生成しないからである。プローブ
のコンホメーション（主として鎖の性状）の変化に伴っ
て発蛍光団の局部移動度が低下した結果、蛍光標識に関
する相関時間（混転時間）が検出可能な程度に変化す
る。したがって、蛍光標識を含むシグナルプライマーの
一本鎖から二本鎖への変換を、蛍光偏光または蛍光異方
性の変化の測定により監視することができる。
ンの特異性が向上したことにより、核酸増幅反応を効果
的な増幅プライマーハイブリダイゼーションのための最
高に近い温度で行うことが望ましいものとなる。これに
よりミスプライミングが減少し、その結果、非特異的バ
ックグラウンド増幅の量が減少する。先に述べたよう
に、増幅した標的配列への標識プローブのハイブリダイ
ゼーションを検出に利用することができる。しかし増幅
反応における標的配列を検出するための最近開発された
方法は、少なくとも１種類のシグナルプライマーを用い
る（検出プローブとも呼ばれる；欧州特許第０ ６７８
５８２号および第０ ６７８ ５８１号明細書）。シ
グナルプライマーは標的増幅の検出または監視を促進す
るために、増幅反応に装入される。標的増幅に際してこ
の一本鎖オリゴヌクレオチド（シグナルプライマー）は
標的配列にハイブリダイズし、ポリメラーゼにより伸長
する。一本鎖シグナルプライマーは標的増幅の結果とし
て二本鎖になって、二次増幅生成物を生成する。一本鎖
シグナルプライマーから二次増幅生成物における二本鎖
形への変換が標的増幅の指標である。標的増幅がない場
合、二次増幅生成物は生成しないからである。プローブ
のコンホメーション（主として鎖の性状）の変化に伴っ
て発蛍光団の局部移動度が低下した結果、蛍光標識に関
する相関時間（混転時間）が検出可能な程度に変化す
る。したがって、蛍光標識を含むシグナルプライマーの
一本鎖から二本鎖への変換を、蛍光偏光または蛍光異方
性の変化の測定により監視することができる。
【００１３】等温核酸増幅に典型的な温度（たとえば約
３５−４５℃）では、５′−フルオレセイン標識シグナ
ルプライマーの一本鎖から二本鎖形への変換によって約
２０ｍＰの容易に検出しうるＦＰ増大が生じる。欧州特
許第０ ６７８ ５８２号および第０ ６７８ ５８１
号明細書に記載されるように、この増大は、配列特異性
の二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質、たとえば制限エンドヌク
レアーゼ、リプレッサー蛋白質、リセプター結合性蛋白
質などの添加によって増強することができる。二本鎖Ｄ
ＮＡ結合性蛋白質に対する適切な認識部位をシグナルプ
ライマーに取り込ませ、標的増幅の結果として認識部位
が二本鎖になることにより、二次増幅生成物へのその蛋
白質の特異的結合が保証され、ＦＰの増幅特異的変化が
増大する。低温では、その蛋白質が二次増幅生成物にの
み結合するのを保証するために特異的蛋白質結合配列が
必要である。これは、低温ほど増幅プライマーによるミ
スプライミングの水準が相対的に高くなることによると
考えられる。二次増幅生成物中に特異的認識配列がない
場合、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質がＦＰの増幅特異性増
大の検出を阻害するのに十分な量で非特異的増幅生成物
に結合する。これに対し本発明においては、より高い、
よりストリンジェントな増幅温度でＦＰの変化を維持す
るために、配列特異的または配列非特異的な二本鎖ＤＮ
Ａ結合性蛋白質のいずれかを用いることができる。
３５−４５℃）では、５′−フルオレセイン標識シグナ
ルプライマーの一本鎖から二本鎖形への変換によって約
２０ｍＰの容易に検出しうるＦＰ増大が生じる。欧州特
許第０ ６７８ ５８２号および第０ ６７８ ５８１
号明細書に記載されるように、この増大は、配列特異性
の二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質、たとえば制限エンドヌク
レアーゼ、リプレッサー蛋白質、リセプター結合性蛋白
質などの添加によって増強することができる。二本鎖Ｄ
ＮＡ結合性蛋白質に対する適切な認識部位をシグナルプ
ライマーに取り込ませ、標的増幅の結果として認識部位
が二本鎖になることにより、二次増幅生成物へのその蛋
白質の特異的結合が保証され、ＦＰの増幅特異的変化が
増大する。低温では、その蛋白質が二次増幅生成物にの
み結合するのを保証するために特異的蛋白質結合配列が
必要である。これは、低温ほど増幅プライマーによるミ
スプライミングの水準が相対的に高くなることによると
考えられる。二次増幅生成物中に特異的認識配列がない
場合、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質がＦＰの増幅特異性増
大の検出を阻害するのに十分な量で非特異的増幅生成物
に結合する。これに対し本発明においては、より高い、
よりストリンジェントな増幅温度でＦＰの変化を維持す
るために、配列特異的または配列非特異的な二本鎖ＤＮ
Ａ結合性蛋白質のいずれかを用いることができる。
【００１４】一本鎖プローブまたはプライマーが二本鎖
になる際に見られるＦＰ値の変化を、選ばれた蛍光標識
の検出に適した種々の蛍光光度計で監視することができ
る。これには前定常状態蛍光光度計（たとえばダイアト
ロンより）、定常状態蛍光光度計（たとえばジョリー・
インスツルメンツより）、または周波数−ドメイン蛍光
光度計（たとえばＳＬＭ−ミルトン−ロイより）で監視
することができる。蛍光偏光の測定は、ハイブリダイゼ
ーション後または増幅後に行うことができる（終末点測
定）。あるいは蛍光偏光の測定は、ハイブリダイゼーシ
ョンまたは増幅反応の途中で、すなわちそれと同時に行
うことができる（リアルタイム測定）。蛍光のリアルタ
イム監視は、本質的に即刻に結果を提供し、定量的であ
り、感度を向上させ（勾配の変化の分析が１回の終末点
より精確である）、試料が自身の内標準として用いられ
るという点で、アッセイに際して著しい利点をもつ。こ
の最後の利点は臨床検体の分析に特に重要である。試料
の粘度が終末点の読みに著しく影響する可能性があるか
らである。
になる際に見られるＦＰ値の変化を、選ばれた蛍光標識
の検出に適した種々の蛍光光度計で監視することができ
る。これには前定常状態蛍光光度計（たとえばダイアト
ロンより）、定常状態蛍光光度計（たとえばジョリー・
インスツルメンツより）、または周波数−ドメイン蛍光
光度計（たとえばＳＬＭ−ミルトン−ロイより）で監視
することができる。蛍光偏光の測定は、ハイブリダイゼ
ーション後または増幅後に行うことができる（終末点測
定）。あるいは蛍光偏光の測定は、ハイブリダイゼーシ
ョンまたは増幅反応の途中で、すなわちそれと同時に行
うことができる（リアルタイム測定）。蛍光のリアルタ
イム監視は、本質的に即刻に結果を提供し、定量的であ
り、感度を向上させ（勾配の変化の分析が１回の終末点
より精確である）、試料が自身の内標準として用いられ
るという点で、アッセイに際して著しい利点をもつ。こ
の最後の利点は臨床検体の分析に特に重要である。試料
の粘度が終末点の読みに著しく影響する可能性があるか
らである。
【００１５】予備実験によれば、核酸が一本鎖から二本
鎖形に変換することに伴うＦＰ増大の大きさは末端標識
オリゴヌクレオチドに関しては温度の上昇に伴って低下
することが示唆された。核酸ハイブリダイゼーション試
験において、ＦＰの変化（△ｍＰ）は約４５℃より低い
温度では実質的に影響されなかった。しかし△ｍＰは約
４５℃で低下し始め、ハイブリダイゼーション温度が約
６０℃に近づくと本質的に認められなくなった。しか
し、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が存在する場合、４５℃
以上の温度で意外にもＦＰの変化を維持し、増大すらさ
せうることが見出された。さらに、プローブハイブリダ
イゼーション実験によれば、一本鎖シグナルプライマー
から二本鎖二次増幅生成物への変換に伴うＦＰの増大
は、好熱性増幅反応、たとえばｔＳＤＡおよびＰＣＲに
典型的な反応温度では実質的に排除されることが示唆さ
れた。しかし、意外にもＦＰの増大は二次増幅生成物の
生成を約４５−７５℃の増幅反応において監視した場合
に維持されることが見出された。核酸標的の増幅に用い
たポリメラーゼは二本鎖核酸結合性蛋白質であるので、
この現象は増幅ポリメラーゼが二次増幅生成物に配列非
特異的に結合して、プローブハイブリダイゼーション実
験で二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を添加した際に見られた
ものと同様な効果を生じたことに起因すると本発明者ら
は考える。
鎖形に変換することに伴うＦＰ増大の大きさは末端標識
オリゴヌクレオチドに関しては温度の上昇に伴って低下
することが示唆された。核酸ハイブリダイゼーション試
験において、ＦＰの変化（△ｍＰ）は約４５℃より低い
温度では実質的に影響されなかった。しかし△ｍＰは約
４５℃で低下し始め、ハイブリダイゼーション温度が約
６０℃に近づくと本質的に認められなくなった。しか
し、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が存在する場合、４５℃
以上の温度で意外にもＦＰの変化を維持し、増大すらさ
せうることが見出された。さらに、プローブハイブリダ
イゼーション実験によれば、一本鎖シグナルプライマー
から二本鎖二次増幅生成物への変換に伴うＦＰの増大
は、好熱性増幅反応、たとえばｔＳＤＡおよびＰＣＲに
典型的な反応温度では実質的に排除されることが示唆さ
れた。しかし、意外にもＦＰの増大は二次増幅生成物の
生成を約４５−７５℃の増幅反応において監視した場合
に維持されることが見出された。核酸標的の増幅に用い
たポリメラーゼは二本鎖核酸結合性蛋白質であるので、
この現象は増幅ポリメラーゼが二次増幅生成物に配列非
特異的に結合して、プローブハイブリダイゼーション実
験で二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を添加した際に見られた
ものと同様な効果を生じたことに起因すると本発明者ら
は考える。
【００１６】また、高温での増幅に伴うミスプライミン
グの水準が低いことにより、増幅に伴うＦＰ変化を維持
するために意外にも配列−非特異性の二本鎖ＤＮＡ結合
性蛋白質を使用しうると思われる。したがってこのよう
な増幅系における増幅のＦＰ検出は著しく簡略化され
る。シグナルプライマー中へ特異的結合性配列を工学的
に挿入する必要がなく、かつ付加的な反応成分（別個の
二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質）が任意成分となるからであ
る。すなわち、低温での増幅と対照的に、高温では標的
増幅のために既に存在する酵素（たとえばポリメラー
ゼ）が標的増幅特異的なＦＰ増大を維持し、かつ増強す
るのにも役立つ。もちろん本発明においては高温で標的
増幅またはプローブハイブリダイゼーションアッセイに
おけるＦＰの変化を監視するために、所望により欧州特
許第０ ６７８ ５８２号および第０６７８ ５８１号
明細書に教示されるように配列特異性の二本鎖ＤＮＡ結
合性蛋白質に対する結合配列を用いてもよい。
グの水準が低いことにより、増幅に伴うＦＰ変化を維持
するために意外にも配列−非特異性の二本鎖ＤＮＡ結合
性蛋白質を使用しうると思われる。したがってこのよう
な増幅系における増幅のＦＰ検出は著しく簡略化され
る。シグナルプライマー中へ特異的結合性配列を工学的
に挿入する必要がなく、かつ付加的な反応成分（別個の
二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質）が任意成分となるからであ
る。すなわち、低温での増幅と対照的に、高温では標的
増幅のために既に存在する酵素（たとえばポリメラー
ゼ）が標的増幅特異的なＦＰ増大を維持し、かつ増強す
るのにも役立つ。もちろん本発明においては高温で標的
増幅またはプローブハイブリダイゼーションアッセイに
おけるＦＰの変化を監視するために、所望により欧州特
許第０ ６７８ ５８２号および第０６７８ ５８１号
明細書に教示されるように配列特異性の二本鎖ＤＮＡ結
合性蛋白質に対する結合配列を用いてもよい。
【００１７】二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の結合は、高温
では二重らせんの一本鎖性が増大するという傾向を相殺
し、これによって二本鎖形を安定化することができる。
すなわち、蛋白質の結合により二重らせんの末端フレイ
イングおよびブリージングを減少させることができる。
これらの蛋白質による安定化効果はしばしば、ＦＰの増
大を少なくとも低温でのアッセイに典型的な水準にまで
完全に再生するのに十分であることが認められた。すな
わち、増幅またはハイブリダイゼーションの温度が約４
５−７５℃である場合、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質は一
般に、少なくとも約３７℃で観察されるＦＰ増大を維持
する。先に述べたように、高温アッセイにおける二本鎖
ＤＮＡ結合性蛋白質の存在は、ＦＰの変化の大きさをも
増大させることができる。
では二重らせんの一本鎖性が増大するという傾向を相殺
し、これによって二本鎖形を安定化することができる。
すなわち、蛋白質の結合により二重らせんの末端フレイ
イングおよびブリージングを減少させることができる。
これらの蛋白質による安定化効果はしばしば、ＦＰの増
大を少なくとも低温でのアッセイに典型的な水準にまで
完全に再生するのに十分であることが認められた。すな
わち、増幅またはハイブリダイゼーションの温度が約４
５−７５℃である場合、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質は一
般に、少なくとも約３７℃で観察されるＦＰ増大を維持
する。先に述べたように、高温アッセイにおける二本鎖
ＤＮＡ結合性蛋白質の存在は、ＦＰの変化の大きさをも
増大させることができる。
【００１８】本明細書の記載においてはＳＤＡを標的増
幅反応における本発明の例として用いるが、本発明は一
本鎖プローブまたはプライマーから標的特異性の二本鎖
二次増幅生成物を生成しうるいかなる増幅法にも利用す
ることができる。これは増幅ポリメラーゼを用いて下流
のシグナルプライマーを置換することにより達成しう
る。したがって、検出方法は標的配列がＲＮＡまたはＤ
ＮＡのいずれであるかに無関係であるので、本発明方法
はＳＤＡ以外の等温増幅反応、たとえば３ＳＲにも利用
しうる。３ＳＲの場合、二本鎖二次増幅生成物の標的依
存性生成は一般にＳＤＡの場合と同様に起こる。３ＳＲ
に用いるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは５′−３′エキソ
ヌクレアーゼ活性を欠如し、逆転写酵素の分解活性はＤ
ＮＡにハイブリダイズしたＲＮＡに対してのみ活性なＲ
ＮＡｓｅ Ｈ活性である。したがってＧｕａｔｅｌｌｉ
ら（１９９０，８７，１８７４−１８７８）の３ＳＲ増
幅経路の場合、シグナルプライマーはＲＮＡ標的にハイ
ブリダイズし、そして３′側増幅プライマーの伸長によ
り置換されるであろう（Ｇｕａｔｅｌｌｉらの図１の
“Ａ”）。あるいはシグナルプライマーは５′側増幅プ
ライマーの下流の位置において逆転写により生成するｃ
ＤＮＡにハイブリダイズするであろう（Ｇｕａｔｅｌｌ
ｉらの図１の“Ｂ”）。いずれの場合も、伸長したシグ
ナルプライマーは上流の３′側（“Ａ”）または５′側
（“Ｂ”）増幅プライマーが伸長された場合にポリメラ
ーゼにより置換される。次いで反対側の増幅プライマー
がシグナルプライマー伸長生成物に結合し、伸長して、
標識シグナルプライマーを二本鎖形に変換する。Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むシグナルプ
ライマー伸長生成物は３ＳＲにより増幅され、シグナル
プライマーの追加コピー源を提供する。転写仲介増幅
（ＴＭＡ）およびＮＡＳＢＡ反応は本質的に３ＳＲと同
じであり、シグナルプライマーの付加により同様に進行
して二本鎖の標的増幅特異性二次増幅生成物を生成する
であろう。３ＳＲおよび関連の増幅法は現在は好熱温度
範囲より低い（すなわち約４５−７５℃より低い）温度
で実施されているが、必要に応じて熱安定性酵素に交換
することにより、本発明に従った好熱条件下での増幅の
蛍光偏光検出が可能であろう。これらの増幅反応はすべ
て、高温で二重らせんを安定化しかつＦＰの変化を維持
する配列−非特異性の二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を含む
からである。
幅反応における本発明の例として用いるが、本発明は一
本鎖プローブまたはプライマーから標的特異性の二本鎖
二次増幅生成物を生成しうるいかなる増幅法にも利用す
ることができる。これは増幅ポリメラーゼを用いて下流
のシグナルプライマーを置換することにより達成しう
る。したがって、検出方法は標的配列がＲＮＡまたはＤ
ＮＡのいずれであるかに無関係であるので、本発明方法
はＳＤＡ以外の等温増幅反応、たとえば３ＳＲにも利用
しうる。３ＳＲの場合、二本鎖二次増幅生成物の標的依
存性生成は一般にＳＤＡの場合と同様に起こる。３ＳＲ
に用いるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは５′−３′エキソ
ヌクレアーゼ活性を欠如し、逆転写酵素の分解活性はＤ
ＮＡにハイブリダイズしたＲＮＡに対してのみ活性なＲ
ＮＡｓｅ Ｈ活性である。したがってＧｕａｔｅｌｌｉ
ら（１９９０，８７，１８７４−１８７８）の３ＳＲ増
幅経路の場合、シグナルプライマーはＲＮＡ標的にハイ
ブリダイズし、そして３′側増幅プライマーの伸長によ
り置換されるであろう（Ｇｕａｔｅｌｌｉらの図１の
“Ａ”）。あるいはシグナルプライマーは５′側増幅プ
ライマーの下流の位置において逆転写により生成するｃ
ＤＮＡにハイブリダイズするであろう（Ｇｕａｔｅｌｌ
ｉらの図１の“Ｂ”）。いずれの場合も、伸長したシグ
ナルプライマーは上流の３′側（“Ａ”）または５′側
（“Ｂ”）増幅プライマーが伸長された場合にポリメラ
ーゼにより置換される。次いで反対側の増幅プライマー
がシグナルプライマー伸長生成物に結合し、伸長して、
標識シグナルプライマーを二本鎖形に変換する。Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むシグナルプ
ライマー伸長生成物は３ＳＲにより増幅され、シグナル
プライマーの追加コピー源を提供する。転写仲介増幅
（ＴＭＡ）およびＮＡＳＢＡ反応は本質的に３ＳＲと同
じであり、シグナルプライマーの付加により同様に進行
して二本鎖の標的増幅特異性二次増幅生成物を生成する
であろう。３ＳＲおよび関連の増幅法は現在は好熱温度
範囲より低い（すなわち約４５−７５℃より低い）温度
で実施されているが、必要に応じて熱安定性酵素に交換
することにより、本発明に従った好熱条件下での増幅の
蛍光偏光検出が可能であろう。これらの増幅反応はすべ
て、高温で二重らせんを安定化しかつＦＰの変化を維持
する配列−非特異性の二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を含む
からである。
【００１９】本発明方法はＰＣＲによる増幅の検出にも
利用しうる。ただし蛍光偏光の測定は、増幅の“リアル
タイム”監視のためには増幅サイクルの低温期間に行わ
なければならない。ＰＣＲにおいては、プライマーのハ
イブリダイゼーションおよび伸長工程は一般に約６０−
７５℃で実施される。５′−３′エキソヌクレアーゼ欠
失ポリメラーゼ（たとえばｅｘｏ-Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ-Ｐ
ｆｕ、またはＴａｑのストッフェルフラグメント）を用
いると、標的配列にハイブリダイズしたＰＣＲ増幅プラ
イマーの伸長によって下流の伸長したシグナルプライマ
ーが置換される。反対側のＰＣＲ増幅プライマーはシグ
ナルプライマーの伸長生成物にハイブリダイズし、伸長
して、一本鎖シグナルプライマーが二本鎖形に変換され
る。二本鎖シグナルプライマーは、後続サイクルで１増
幅プライマーおよび１シグナルプライマーのハイブリダ
イゼーションおよび伸長により増幅されて、追加の二本
鎖シグナルプライマー源を提供する。次いでＰＣＲの終
結後に、増幅生成物が二本鎖を維持する条件下で蛍光偏
光または蛍光異方性の増大を検出することができる。あ
るいはＰＣＲに際して循環プロトコール（６０−７５
℃）の低温時点で低温二次増幅生成物を検出することが
でき、その際増幅ポリメラーゼが二次増幅生成物の二本
鎖構造を安定化し、かつ検出可能なＦＰ変化を維持する
作用をする。
利用しうる。ただし蛍光偏光の測定は、増幅の“リアル
タイム”監視のためには増幅サイクルの低温期間に行わ
なければならない。ＰＣＲにおいては、プライマーのハ
イブリダイゼーションおよび伸長工程は一般に約６０−
７５℃で実施される。５′−３′エキソヌクレアーゼ欠
失ポリメラーゼ（たとえばｅｘｏ-Ｖｅｎｔ、ｅｘｏ-Ｐ
ｆｕ、またはＴａｑのストッフェルフラグメント）を用
いると、標的配列にハイブリダイズしたＰＣＲ増幅プラ
イマーの伸長によって下流の伸長したシグナルプライマ
ーが置換される。反対側のＰＣＲ増幅プライマーはシグ
ナルプライマーの伸長生成物にハイブリダイズし、伸長
して、一本鎖シグナルプライマーが二本鎖形に変換され
る。二本鎖シグナルプライマーは、後続サイクルで１増
幅プライマーおよび１シグナルプライマーのハイブリダ
イゼーションおよび伸長により増幅されて、追加の二本
鎖シグナルプライマー源を提供する。次いでＰＣＲの終
結後に、増幅生成物が二本鎖を維持する条件下で蛍光偏
光または蛍光異方性の増大を検出することができる。あ
るいはＰＣＲに際して循環プロトコール（６０−７５
℃）の低温時点で低温二次増幅生成物を検出することが
でき、その際増幅ポリメラーゼが二次増幅生成物の二本
鎖構造を安定化し、かつ検出可能なＦＰ変化を維持する
作用をする。
【００２０】シグナルプライマーを用いる代わりに、前
記増幅法のいずれにおいても増幅プライマーを蛍光標識
してもよい。これにより二本鎖蛍光標識増幅生成物が一
本鎖増幅プライマーから生成し、これに伴ってＦＰが変
化する。シグナルプライマーを用いる場合と比較してこ
の態様はバックグラウンドがより高いので、感度が低下
する可能性がある。
記増幅法のいずれにおいても増幅プライマーを蛍光標識
してもよい。これにより二本鎖蛍光標識増幅生成物が一
本鎖増幅プライマーから生成し、これに伴ってＦＰが変
化する。シグナルプライマーを用いる場合と比較してこ
の態様はバックグラウンドがより高いので、感度が低下
する可能性がある。
【００２１】核酸の標識に関する技術分野で既知のいか
なる蛍光分子をも本発明方法に使用しうる：たとえばフ
ルオレセイン、およびフルオレセイン誘導体、たとえば
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ
フルオレセイン（５−ＤＴＡＦ）；エオシン；ローダミ
ン類、たとえばテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）およ
びテトラメチルローダミン；シアニン染料、たとえばチ
アゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ならびに米
国特許第４，９５７，８７０号および第４，８８８，８
６７号明細書に記載される関連の染料；ピレン；ポルフ
ィリン染料、たとえばラジョラブルー。温度、粘度、お
よび蛍光染料が結合するオリゴヌクレオチドの大きさが
すべて混転時間に影響を及ぼすことを考慮して、蛍光標
識はその蛍光寿命の長さが測定の行われる相関時間に匹
敵するように選択されるべきである。たとえばフルオレ
セイン（寿命約４ナノ秒）およびラジョラブルー（寿命
約２ナノ秒）は両方とも約０．１−１００ナノ秒の相関
時間につき有用である。核酸結合性蛋白質を蛍光標識と
併用する場合、相関時間は一般に増大する。たとえば遊
離フルオレセイン標識に関する相関時間は約０．２ナノ
秒である。フルオレセイン標識が一本鎖オリゴヌクレオ
チドに結合した場合には相関時間は約０．４ナノ秒に増
大し、二本鎖オリゴヌクレオチドに結合した場合には相
関時間はさらに約２ナノ秒に増大する。フルオレセイン
標識二本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡ結合性蛋
白質と結合することによりＦＰが増大した場合、相関時
間は再び約２０ナノ秒に増大する。４５℃より低い温度
では、本質的に二重らせんの核酸の末端フレイイングお
よびブリージングがない。したがってこれらの温度にお
いてＤＮＡ結合性蛋白質の存在下で相関時間が増大する
ことは、その蛋白質が二本鎖分子の混転時間をさらに緩
慢にする作用を反映している。ラジョラブルー（Ｄｅｖ
ｌｉｎら，１９９３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９，１９
３９−１９４３）は、生物学的試料中の核酸標的配列の
検出に用いるプライマーおよびプローブを標識するのに
特に有用である。この染料は近赤外スペクトル、すなわ
ち臨床検体についてバックグラウンド蛍光が比較的低い
領域の光線を吸収および発光するからである（それぞれ
６８５ｎｍおよび７０５ｎｍにピーク最大）。核酸の標
識として用いる場合、５−ＤＴＡＦはＦＰ分析にとって
フルオレセインより優れていることも見出された。この
標識はフルオレセインまたはラジョラブルーと比較して
有意に高い動的範囲を提供し、したがってＦＰアッセイ
の感度を向上させる。
なる蛍光分子をも本発明方法に使用しうる：たとえばフ
ルオレセイン、およびフルオレセイン誘導体、たとえば
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノ
フルオレセイン（５−ＤＴＡＦ）；エオシン；ローダミ
ン類、たとえばテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）およ
びテトラメチルローダミン；シアニン染料、たとえばチ
アゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ならびに米
国特許第４，９５７，８７０号および第４，８８８，８
６７号明細書に記載される関連の染料；ピレン；ポルフ
ィリン染料、たとえばラジョラブルー。温度、粘度、お
よび蛍光染料が結合するオリゴヌクレオチドの大きさが
すべて混転時間に影響を及ぼすことを考慮して、蛍光標
識はその蛍光寿命の長さが測定の行われる相関時間に匹
敵するように選択されるべきである。たとえばフルオレ
セイン（寿命約４ナノ秒）およびラジョラブルー（寿命
約２ナノ秒）は両方とも約０．１−１００ナノ秒の相関
時間につき有用である。核酸結合性蛋白質を蛍光標識と
併用する場合、相関時間は一般に増大する。たとえば遊
離フルオレセイン標識に関する相関時間は約０．２ナノ
秒である。フルオレセイン標識が一本鎖オリゴヌクレオ
チドに結合した場合には相関時間は約０．４ナノ秒に増
大し、二本鎖オリゴヌクレオチドに結合した場合には相
関時間はさらに約２ナノ秒に増大する。フルオレセイン
標識二本鎖オリゴヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡ結合性蛋
白質と結合することによりＦＰが増大した場合、相関時
間は再び約２０ナノ秒に増大する。４５℃より低い温度
では、本質的に二重らせんの核酸の末端フレイイングお
よびブリージングがない。したがってこれらの温度にお
いてＤＮＡ結合性蛋白質の存在下で相関時間が増大する
ことは、その蛋白質が二本鎖分子の混転時間をさらに緩
慢にする作用を反映している。ラジョラブルー（Ｄｅｖ
ｌｉｎら，１９９３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９，１９
３９−１９４３）は、生物学的試料中の核酸標的配列の
検出に用いるプライマーおよびプローブを標識するのに
特に有用である。この染料は近赤外スペクトル、すなわ
ち臨床検体についてバックグラウンド蛍光が比較的低い
領域の光線を吸収および発光するからである（それぞれ
６８５ｎｍおよび７０５ｎｍにピーク最大）。核酸の標
識として用いる場合、５−ＤＴＡＦはＦＰ分析にとって
フルオレセインより優れていることも見出された。この
標識はフルオレセインまたはラジョラブルーと比較して
有意に高い動的範囲を提供し、したがってＦＰアッセイ
の感度を向上させる。
【００２２】蛍光標識は、標識からの蛍光の発光または
標的配列へのプローブもしくはプライマーのハイブリダ
イゼーションを妨害しないようにプローブまたはプライ
マーに共有結合または結合される。標識がコンホメーシ
ョンの変化に近接しているか、または関与する場合にＦ
Ｐの変化が起こるので、結合はコンホメーションの変化
が予想される部位付近にすべきである。これは一般にプ
ローブもしくはプライマーの内部、プライマーの５′末
端、またはプローブのいずれかの末端であろう。一般に
標識をシグナルプライマーの３′末端には結合させな
い。３′末端はポリメラーゼによる伸長に利用できなけ
ればならないからである。蛍光標識は、標識をオリゴヌ
クレオチドに結合させるために用いるのに適したリンカ
ーまたは“つなぎ鎖（ｔｅｔｈｅｒ）”、たとえばアミ
ノエチル、アミノヘキシルおよびアミノプロピル結合ア
ームを介してプローブまたはプライマーに共有結合する
（アプライド・バイオシステムズ、クローンテク、グレ
ン・リサーチ、Ｄｅｖｌｉｎら、前掲）。他のアミノリ
ンカーは国際特許出願公開第ＷＯ ９２／１８６５０号
明細書に記載されている。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９
０，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ，１，１６５に全般的に
記載されるように、標識をピリミジン類のＣ５またはプ
リン類のＣ８においてオリゴヌクレオチドに結合させて
もよい。ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチド
を合成し、次いでインドアセトアミドフルオレセインと
反応させることにより、フルオレセインを内部に結合さ
せることができる。５−ＤＴＡＦをオリゴヌクレオチド
に結合させる方法は、一般にアミノ修飾オリゴヌクレオ
チドをＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液中で５−ＤＴＡ
Ｆと反応させることによる。標識オリゴヌクレオチドを
過剰の未反応染料からカラムクロマトグラフィーにより
精製し、非標識オリゴヌクレオチドを除去して最終生成
物を得る。より堅牢なつなぎ鎖、たとえば二重結合を含
むものは蛍光標識の混転時間を緩慢にし、より長い相関
時間の測定を可能にする。
標的配列へのプローブもしくはプライマーのハイブリダ
イゼーションを妨害しないようにプローブまたはプライ
マーに共有結合または結合される。標識がコンホメーシ
ョンの変化に近接しているか、または関与する場合にＦ
Ｐの変化が起こるので、結合はコンホメーションの変化
が予想される部位付近にすべきである。これは一般にプ
ローブもしくはプライマーの内部、プライマーの５′末
端、またはプローブのいずれかの末端であろう。一般に
標識をシグナルプライマーの３′末端には結合させな
い。３′末端はポリメラーゼによる伸長に利用できなけ
ればならないからである。蛍光標識は、標識をオリゴヌ
クレオチドに結合させるために用いるのに適したリンカ
ーまたは“つなぎ鎖（ｔｅｔｈｅｒ）”、たとえばアミ
ノエチル、アミノヘキシルおよびアミノプロピル結合ア
ームを介してプローブまたはプライマーに共有結合する
（アプライド・バイオシステムズ、クローンテク、グレ
ン・リサーチ、Ｄｅｖｌｉｎら、前掲）。他のアミノリ
ンカーは国際特許出願公開第ＷＯ ９２／１８６５０号
明細書に記載されている。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，１９９
０，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ，１，１６５に全般的に
記載されるように、標識をピリミジン類のＣ５またはプ
リン類のＣ８においてオリゴヌクレオチドに結合させて
もよい。ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチド
を合成し、次いでインドアセトアミドフルオレセインと
反応させることにより、フルオレセインを内部に結合さ
せることができる。５−ＤＴＡＦをオリゴヌクレオチド
に結合させる方法は、一般にアミノ修飾オリゴヌクレオ
チドをＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液中で５−ＤＴＡ
Ｆと反応させることによる。標識オリゴヌクレオチドを
過剰の未反応染料からカラムクロマトグラフィーにより
精製し、非標識オリゴヌクレオチドを除去して最終生成
物を得る。より堅牢なつなぎ鎖、たとえば二重結合を含
むものは蛍光標識の混転時間を緩慢にし、より長い相関
時間の測定を可能にする。
【００２３】ＦＰの変化をリアルタイムでの（増幅また
はハイブリダイゼーションの終了後ではなくその途中
で、一本鎖オリゴヌクレオチドから二本鎖形への変換と
同時に）核酸のハイブリダイゼーションまたは増幅の検
出に利用する場合、終末点測定の場合には必ず必要であ
るような、バックグラウンド蛍光を補償するために試料
を“ゼロ”にすることが必要ではない点を留意すべきで
ある。それはＦＰ検出においては偏光の変化または偏光
の変化率（変化の絶対的大きさでなく）が正の結果を示
すからである。一定濃度の増幅標的については、低い濃
度の蛍光標識シグナルプライマーまたはプローブほど高
い割合の一本鎖シグナルプライマーまたは一本鎖プロー
ブが二本鎖形に変換されるのが保証されることにより、
検出感度が向上する。しかし低いシグナルプライマーま
たはプローブ濃度では、終末点測定法を採用した場合に
広範囲の標的水準にわたって飽和する可能性がある。し
たがってＦＰの終末点測定法は増幅またはハイブリダイ
ゼーション反応終了後に採用した場合、初期標的水準に
関して厳密には定量的でない可能性がある。ＦＰをリア
ルタイムで監視することにより飽和の問題は克服され
る。高い水準の標的を含有する試料ほど、少ない標的を
含有するものより急速なＦＰ値増大を示すからである。
もちろんＦＰ増大率と初期標的水準の相関は、増幅率ま
たはハイブリダイゼーション率が本質的に等しい試料を
比較する場合にのみ有効である。臨床検体については、
それぞれが異なる水準の阻害物質を含有し、アッセイが
厳密には定量的でない可能性がある。たとえば高い量の
初期標的を含有し、かつ増幅が効果的に行われなかった
試料を、低い量の初期標的を含有していたが増幅は高率
で行われた試料と識別するのは困難であろう。それにも
かかわらず、増幅中のＦＰ値をリアルタイムで監視する
ことにより、少なくとも準定量的に初期標的水準を推定
することができる。内部陽性対照として既知の初期濃度
の追加標的配列を含有させることにより（Ｗａｌｋｅｒ
ら，１９９４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２
６７０−２６７７）、または陽性対照を含有する試料を
平行してアッセイすることによって、定量を向上させる
ことができる。内部陽性対照標的は試料についての全般
的な増幅またはハイブリダイゼーションの性能の指標
（すなわち偽陰性に対する対照）を提供するだけでな
く、その試料中の標的の初期量を定量するための基準を
も提供する。
はハイブリダイゼーションの終了後ではなくその途中
で、一本鎖オリゴヌクレオチドから二本鎖形への変換と
同時に）核酸のハイブリダイゼーションまたは増幅の検
出に利用する場合、終末点測定の場合には必ず必要であ
るような、バックグラウンド蛍光を補償するために試料
を“ゼロ”にすることが必要ではない点を留意すべきで
ある。それはＦＰ検出においては偏光の変化または偏光
の変化率（変化の絶対的大きさでなく）が正の結果を示
すからである。一定濃度の増幅標的については、低い濃
度の蛍光標識シグナルプライマーまたはプローブほど高
い割合の一本鎖シグナルプライマーまたは一本鎖プロー
ブが二本鎖形に変換されるのが保証されることにより、
検出感度が向上する。しかし低いシグナルプライマーま
たはプローブ濃度では、終末点測定法を採用した場合に
広範囲の標的水準にわたって飽和する可能性がある。し
たがってＦＰの終末点測定法は増幅またはハイブリダイ
ゼーション反応終了後に採用した場合、初期標的水準に
関して厳密には定量的でない可能性がある。ＦＰをリア
ルタイムで監視することにより飽和の問題は克服され
る。高い水準の標的を含有する試料ほど、少ない標的を
含有するものより急速なＦＰ値増大を示すからである。
もちろんＦＰ増大率と初期標的水準の相関は、増幅率ま
たはハイブリダイゼーション率が本質的に等しい試料を
比較する場合にのみ有効である。臨床検体については、
それぞれが異なる水準の阻害物質を含有し、アッセイが
厳密には定量的でない可能性がある。たとえば高い量の
初期標的を含有し、かつ増幅が効果的に行われなかった
試料を、低い量の初期標的を含有していたが増幅は高率
で行われた試料と識別するのは困難であろう。それにも
かかわらず、増幅中のＦＰ値をリアルタイムで監視する
ことにより、少なくとも準定量的に初期標的水準を推定
することができる。内部陽性対照として既知の初期濃度
の追加標的配列を含有させることにより（Ｗａｌｋｅｒ
ら，１９９４，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２
６７０−２６７７）、または陽性対照を含有する試料を
平行してアッセイすることによって、定量を向上させる
ことができる。内部陽性対照標的は試料についての全般
的な増幅またはハイブリダイゼーションの性能の指標
（すなわち偽陰性に対する対照）を提供するだけでな
く、その試料中の標的の初期量を定量するための基準を
も提供する。
【００２４】
実施例１ ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＥＲ Ｃ６−ＴＦＡ（グレン
・リサーチ）を用いてＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザー・
モデル３８０Ｂにより標準プロトコールを採用して、第
一級アミン標識オリゴヌクレオチド（ＴＡＧＡＧＴＣＴ
ＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡＡＣＡ
Ａ、配列番号：１）を合成した。相補的オリゴヌクレオ
チドも同様に合成した。オリゴヌクレオチドを濃水酸化
アンモニウムと共に５５℃で１５時間加熱することによ
り脱保護し、標準ＰＡＧＥ法によって精製した。配列番
号：１（１５０μＭ溶液５６μＬ）を６０μＬのＮａＨ
ＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ９）と混合
した。この溶液にＤＭＦ中の４０ｍＭ ５−ＤＴＡＦを
１０μＬ添加した。反応物を３７℃で７２時間、暗所で
インキュベートした。標識オリゴヌクレオチドをまず、
２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液で平衡化し
たＮＡＰ−５カラム（ファルマシア）上でのカラムクロ
マトグラフィーにより、過剰の未反応染料から精製し
た。０．５ｍＬの画分数個を採集し、標識オリゴヌクレ
オチドを画分２中に見出した。次いで画分２をオリゴヌ
クレオチド・ピュアリフィケーション・カートリッジ
（ＯＰＮ、ＡＢＩ）および一般的プロトコールによって
さらに精製して、標識オリゴヌクレオチドを非標識オリ
ゴヌクレオチドから分離した。最終画分を、２４０−６
００ｎｍで走査するＨＰ ８９５３２Ａ分光光度計によ
りスペクトル純度につきアッセイした。光学濃度は以下
のとおりであった：Ａ260 ０．１１２７３、Ａ494０．
０２１５、Ａ260／280 １．６２、Ａ260／494 ５．２
５。
・リサーチ）を用いてＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザー・
モデル３８０Ｂにより標準プロトコールを採用して、第
一級アミン標識オリゴヌクレオチド（ＴＡＧＡＧＴＣＴ
ＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡＡＣＡ
Ａ、配列番号：１）を合成した。相補的オリゴヌクレオ
チドも同様に合成した。オリゴヌクレオチドを濃水酸化
アンモニウムと共に５５℃で１５時間加熱することによ
り脱保護し、標準ＰＡＧＥ法によって精製した。配列番
号：１（１５０μＭ溶液５６μＬ）を６０μＬのＮａＨ
ＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ９）と混合
した。この溶液にＤＭＦ中の４０ｍＭ ５−ＤＴＡＦを
１０μＬ添加した。反応物を３７℃で７２時間、暗所で
インキュベートした。標識オリゴヌクレオチドをまず、
２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液で平衡化し
たＮＡＰ−５カラム（ファルマシア）上でのカラムクロ
マトグラフィーにより、過剰の未反応染料から精製し
た。０．５ｍＬの画分数個を採集し、標識オリゴヌクレ
オチドを画分２中に見出した。次いで画分２をオリゴヌ
クレオチド・ピュアリフィケーション・カートリッジ
（ＯＰＮ、ＡＢＩ）および一般的プロトコールによって
さらに精製して、標識オリゴヌクレオチドを非標識オリ
ゴヌクレオチドから分離した。最終画分を、２４０−６
００ｎｍで走査するＨＰ ８９５３２Ａ分光光度計によ
りスペクトル純度につきアッセイした。光学濃度は以下
のとおりであった：Ａ260 ０．１１２７３、Ａ494０．
０２１５、Ａ260／280 １．６２、Ａ260／494 ５．２
５。
【００２５】ＦＰＭ−１蛍光光度計による分析のため
に、１ｍＬの試料３つを使い捨てホウケイ酸ガラス試験
管（１２×７５ｍｍ、フィッシャー）中に調製した。第
１試料は緩衝液ブランクであり（５５ｍＭ ＮａＣｌ、
１１１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．７ｍＭ
Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．４）、１．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２７μｇ
／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）
Ｘ−１００、７％（ｖ／ｖ）グリセリン）、第２は一本
鎖５−ＤＴＡＦ標識オリゴヌクレオチドを含有し、第３
はそれの相補体にハイブリダイズした５−ＤＴＡＦ標識
オリゴヌクレオチドを含有していた。ＦＰＭ−１はＦＰ
測定中、３７℃の温度を維持した。この温度で一本鎖５
−ＤＴＡＦ標識オリゴヌクレオチドは１２１ｍＰのＦＰ
読みを与え、二本鎖５−ＤＴＡＦ標識オリゴヌクレオチ
ドは２３３ｍＰのＦＰ読みを与えた。これは、オリゴヌ
クレオチドが一本鎖から二本鎖形に変換した際の偏光変
化（△ｍＰ）が１１２ｍＰであることを表す。
に、１ｍＬの試料３つを使い捨てホウケイ酸ガラス試験
管（１２×７５ｍｍ、フィッシャー）中に調製した。第
１試料は緩衝液ブランクであり（５５ｍＭ ＮａＣｌ、
１１１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．７ｍＭ
Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．４）、１．１ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．７ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２７μｇ
／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）
Ｘ−１００、７％（ｖ／ｖ）グリセリン）、第２は一本
鎖５−ＤＴＡＦ標識オリゴヌクレオチドを含有し、第３
はそれの相補体にハイブリダイズした５−ＤＴＡＦ標識
オリゴヌクレオチドを含有していた。ＦＰＭ−１はＦＰ
測定中、３７℃の温度を維持した。この温度で一本鎖５
−ＤＴＡＦ標識オリゴヌクレオチドは１２１ｍＰのＦＰ
読みを与え、二本鎖５−ＤＴＡＦ標識オリゴヌクレオチ
ドは２３３ｍＰのＦＰ読みを与えた。これは、オリゴヌ
クレオチドが一本鎖から二本鎖形に変換した際の偏光変
化（△ｍＰ）が１１２ｍＰであることを表す。
【００２６】配列番号：１がハイブリダイゼーションに
より二本鎖形に変換することに伴う△ｍＰに温度が及ぼ
す影響を、同じ緩衝液系中で調べた。４種類の２ｍＬ試
料を調製した：緩衝液ブランク、１０ｎＭ ５−ＤＴＡ
Ｆ一本鎖オリゴヌクレオチド、１０ｎＭ ５−ＤＴＡＦ
二本鎖オリゴヌクレオチド、および好熱性の二本鎖ＤＮ
Ａ結合性蛋白質（好熱性ＤＮＡポリメラーゼ）を含む１
０ｎＭ ５−ＤＴＡＦ二本鎖オリゴヌクレオチド。二本
鎖試料中には相補的オリゴヌクレオチドが５０％過剰に
存在した。これらの試料を３７℃で３０分間インキュベ
ートし、ＦＰＭ−１蛍光光度計により初期ＦＰの読みを
得た。次いで試料を１０ｍｍの石英製蛍光測定キュベッ
ト（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｉｌ Ｆａｒ ＵＶ Ｑｕａｒｔ
ｚ、ステルナ）に移し、ＳＬＭ ８１００分光光度計に
より温度試験を行った。温度（３７℃、℃、５０℃およ
び５５℃）は試料タレットを通じて水浴（Ｌａｕｄａ
Ｍ−２０）により制御された。４試料をタレット中で少
なくとも１時間インキュベートし、次いで励起のモノク
ロメータースリット設定８／４ｍｍ、波長４９４ｍｍ、
および発光のモノクロメータースリット設定１０／１０
ｍｍ、波長５２０ｍｍで読み取った。一貫性を得るため
に、すべての偏光結果をＦＰＭ−１形式（ｍＰ）で記載
した。２７５単位のＤＮＡポリメラーゼを５μＬの容量
で添加したのち、実験を繰り返した。
より二本鎖形に変換することに伴う△ｍＰに温度が及ぼ
す影響を、同じ緩衝液系中で調べた。４種類の２ｍＬ試
料を調製した：緩衝液ブランク、１０ｎＭ ５−ＤＴＡ
Ｆ一本鎖オリゴヌクレオチド、１０ｎＭ ５−ＤＴＡＦ
二本鎖オリゴヌクレオチド、および好熱性の二本鎖ＤＮ
Ａ結合性蛋白質（好熱性ＤＮＡポリメラーゼ）を含む１
０ｎＭ ５−ＤＴＡＦ二本鎖オリゴヌクレオチド。二本
鎖試料中には相補的オリゴヌクレオチドが５０％過剰に
存在した。これらの試料を３７℃で３０分間インキュベ
ートし、ＦＰＭ−１蛍光光度計により初期ＦＰの読みを
得た。次いで試料を１０ｍｍの石英製蛍光測定キュベッ
ト（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｉｌ Ｆａｒ ＵＶ Ｑｕａｒｔ
ｚ、ステルナ）に移し、ＳＬＭ ８１００分光光度計に
より温度試験を行った。温度（３７℃、℃、５０℃およ
び５５℃）は試料タレットを通じて水浴（Ｌａｕｄａ
Ｍ−２０）により制御された。４試料をタレット中で少
なくとも１時間インキュベートし、次いで励起のモノク
ロメータースリット設定８／４ｍｍ、波長４９４ｍｍ、
および発光のモノクロメータースリット設定１０／１０
ｍｍ、波長５２０ｍｍで読み取った。一貫性を得るため
に、すべての偏光結果をＦＰＭ−１形式（ｍＰ）で記載
した。２７５単位のＤＮＡポリメラーゼを５μＬの容量
で添加したのち、実験を繰り返した。
【００２７】３７℃で、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を用
いた（＋）、および用いない（−）ハイブリダイゼーシ
ョンのＦＰＭ−１結果を表１に示す。
いた（＋）、および用いない（−）ハイブリダイゼーシ
ョンのＦＰＭ−１結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】低いハイブリダイゼーション温度（３７
℃）ですら、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質は一本鎖オリゴ
ヌクレオチドから二本鎖形への変換に伴って△ｍＰをほ
ぼ３倍増大させた。結合性蛋白質の存否は一本鎖オリゴ
ヌクレオチドの偏光には影響を及ぼさなかった。しかし
二本鎖形のＦＰは、ＤＮＡ結合性蛋白質の存在下ではそ
の不在下より１２２Ｍｐ高く、これは二本鎖核酸に対す
る増大の特異性を示す。このハイブリダイゼーション温
度ではハイブリダイズした二重らせんは完全に二本鎖で
あり、したがって増大効果は、一本鎖から二本鎖への変
換による相関時間の増大のほか、結合した蛋白質が分子
の混転時間に及ぼす影響によるものであると考えられ
る。
℃）ですら、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質は一本鎖オリゴ
ヌクレオチドから二本鎖形への変換に伴って△ｍＰをほ
ぼ３倍増大させた。結合性蛋白質の存否は一本鎖オリゴ
ヌクレオチドの偏光には影響を及ぼさなかった。しかし
二本鎖形のＦＰは、ＤＮＡ結合性蛋白質の存在下ではそ
の不在下より１２２Ｍｐ高く、これは二本鎖核酸に対す
る増大の特異性を示す。このハイブリダイゼーション温
度ではハイブリダイズした二重らせんは完全に二本鎖で
あり、したがって増大効果は、一本鎖から二本鎖への変
換による相関時間の増大のほか、結合した蛋白質が分子
の混転時間に及ぼす影響によるものであると考えられ
る。
【００３０】二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を含まない、３
７℃、５０℃および５５℃でのハイブリダイゼーション
についてのＳＬＭ ８１００の結果を表２に示す。
７℃、５０℃および５５℃でのハイブリダイゼーション
についてのＳＬＭ ８１００の結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】ハイブリダイゼーション温度の上昇に伴っ
て、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチド双方の偏光
値が低下した。これは一部は温度の上昇に伴う試料粘度
の低下によるものであろう。ただしＦＰの低下は二本鎖
オリゴヌクレオチドの場合の方がはるかに顕著であり
（３７℃と５５℃の間で１１５ｍＰと３９ｍＰ）、これ
は恐らく一本鎖オリゴヌクレオチドにおいては起こらな
いブリージングおよび末端フレイイングによる一本鎖性
増大を反映するものであろう。したがって△ｍＰも温度
の上昇に伴って減少し、５５℃ではわずか５ｍＰであっ
た。これは有意の偏光変化でなく、信頼性のある二本鎖
性への変換の指標ではない。
て、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチド双方の偏光
値が低下した。これは一部は温度の上昇に伴う試料粘度
の低下によるものであろう。ただしＦＰの低下は二本鎖
オリゴヌクレオチドの場合の方がはるかに顕著であり
（３７℃と５５℃の間で１１５ｍＰと３９ｍＰ）、これ
は恐らく一本鎖オリゴヌクレオチドにおいては起こらな
いブリージングおよび末端フレイイングによる一本鎖性
増大を反映するものであろう。したがって△ｍＰも温度
の上昇に伴って減少し、５５℃ではわずか５ｍＰであっ
た。これは有意の偏光変化でなく、信頼性のある二本鎖
性への変換の指標ではない。
【００３３】ＤＮＡポリメラーゼを添加した、３７℃、
５０℃および５５℃でのハイブリダイゼーションについ
てのＳＬＭ ８１００の結果を表３に示す。
５０℃および５５℃でのハイブリダイゼーションについ
てのＳＬＭ ８１００の結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】すべてのハイブリダイゼーション温度にお
いて、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の添加によりオリゴヌ
クレオチドの一本鎖から二本鎖への変換に伴う偏光の変
化が有意に増大した。３７℃においては、結合性蛋白質
の存在下ではその不在下より△ｍＰの大きさが３倍以上
大きかった（表２と表３を比較されたい）。高いハイブ
リダイゼーション温度（５０℃および５５℃）では、先
に見られた偏光損失がＤＮＡ結合性蛋白質の存在によっ
て克服されただけでなく、△ｍＰの大きさも３７℃で蛋
白質によって増大した場合に見られたものと同様な水準
にまでさらに増大した。これらの結果は、ＤＮＡ結合性
蛋白質が二本鎖性を維持または安定化して高温での偏光
損失を克服したことを示唆する。ＤＮＡ結合性蛋白質は
安定化した二本鎖形の混転時間を緩慢にすることによっ
ても△ｍＰを増大させることができる。
いて、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の添加によりオリゴヌ
クレオチドの一本鎖から二本鎖への変換に伴う偏光の変
化が有意に増大した。３７℃においては、結合性蛋白質
の存在下ではその不在下より△ｍＰの大きさが３倍以上
大きかった（表２と表３を比較されたい）。高いハイブ
リダイゼーション温度（５０℃および５５℃）では、先
に見られた偏光損失がＤＮＡ結合性蛋白質の存在によっ
て克服されただけでなく、△ｍＰの大きさも３７℃で蛋
白質によって増大した場合に見られたものと同様な水準
にまでさらに増大した。これらの結果は、ＤＮＡ結合性
蛋白質が二本鎖性を維持または安定化して高温での偏光
損失を克服したことを示唆する。ＤＮＡ結合性蛋白質は
安定化した二本鎖形の混転時間を緩慢にすることによっ
ても△ｍＰを増大させることができる。
【００３６】実施例２ 高いハイブリダイゼーション温度でのＦＰの維持が二本
鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の全般的効果であること、および
この効果が他の蛍光標識についても見られることを確認
するために、追加実験を行った。制限エンドヌクレアー
ゼＡｐｏＩ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含む３３−ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチドを合成し、５′末端において６−
ＦＡＭで標識した。３３−ｍｅｒの相補体も合成した。
１００ｎＭ一本鎖６−ＦＡＭオリゴヌクレオチドを含有
する１００μＬの試料４つを４ｍＭ ＴＡＥ、５０ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）中に調製した。相補的オリゴ
ヌクレオチド（３００ｎＭ）を２つの試料に添加した。
試料をすべて３７℃で３０分間インキュベートしたの
ち、それらを下記の緩衝液９００μＬ中に希釈した：５
５ｍＭ ＮａＣｌ、１１１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．７ｍＭＫ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．４）、１．
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７ｍＭ β−メルカプトエタノ
ール、２７μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％トリトン
（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００、および７％グリセリン。
処理のこの時点で蛍光性オリゴヌクレオチドの濃度は１
０ｎＭであった。次いで試料を同緩衝液に１：１０に希
釈して、一本鎖および二本鎖両方の試料中の蛍光性オリ
ゴヌクレオチドの最終濃度を１ｎＭにした。制限エンド
ヌクレアーゼＡｐｏＩ（２１００単位、ニュー・イング
ランド・バイオラボズ）を一本鎖試料１つおよび二本鎖
試料１つに添加した。すべての試料をまず３７℃で１時
間インキュベートし、ＦＰＭ−１蛍光光度計でＦＰを測
定した。次いでそれらを５６℃で１時間インキュベート
し、ＦＰＭ−１で再度読み取った。
鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の全般的効果であること、および
この効果が他の蛍光標識についても見られることを確認
するために、追加実験を行った。制限エンドヌクレアー
ゼＡｐｏＩ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含む３３−ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチドを合成し、５′末端において６−
ＦＡＭで標識した。３３−ｍｅｒの相補体も合成した。
１００ｎＭ一本鎖６−ＦＡＭオリゴヌクレオチドを含有
する１００μＬの試料４つを４ｍＭ ＴＡＥ、５０ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）中に調製した。相補的オリゴ
ヌクレオチド（３００ｎＭ）を２つの試料に添加した。
試料をすべて３７℃で３０分間インキュベートしたの
ち、それらを下記の緩衝液９００μＬ中に希釈した：５
５ｍＭ ＮａＣｌ、１１１ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．７ｍＭＫ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．４）、１．
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７ｍＭ β−メルカプトエタノ
ール、２７μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０２％トリトン
（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００、および７％グリセリン。
処理のこの時点で蛍光性オリゴヌクレオチドの濃度は１
０ｎＭであった。次いで試料を同緩衝液に１：１０に希
釈して、一本鎖および二本鎖両方の試料中の蛍光性オリ
ゴヌクレオチドの最終濃度を１ｎＭにした。制限エンド
ヌクレアーゼＡｐｏＩ（２１００単位、ニュー・イング
ランド・バイオラボズ）を一本鎖試料１つおよび二本鎖
試料１つに添加した。すべての試料をまず３７℃で１時
間インキュベートし、ＦＰＭ−１蛍光光度計でＦＰを測
定した。次いでそれらを５６℃で１時間インキュベート
し、ＦＰＭ−１で再度読み取った。
【００３７】結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
【００３９】ＡｐｏＩは二本鎖ＤＮＡを制限開裂するた
めにＭｇ2+を必要とする。この実験にはマグネシウムが
存在しないので、この酵素はハイブリダイズしたオリゴ
ヌクレオチド中のそれの二本鎖認識部位に結合するが、
開裂は阻止された。この結果は、配列特異性の二本鎖Ｄ
ＮＡ結合性蛋白質が高いハイブリダイゼーション温度で
同様に△ｍＰを安定化し、維持することを証明する。こ
の場合、５６℃における制限エンドヌクレアーゼの結合
はオリゴヌクレオチドから二本鎖形への変換に伴うＦＰ
の変化を再生しただけでなく、それを増大すらさせた。
５６℃における△ｍＰは３７℃で見られた△ｍＰと比較
して５０％以上増大した。
めにＭｇ2+を必要とする。この実験にはマグネシウムが
存在しないので、この酵素はハイブリダイズしたオリゴ
ヌクレオチド中のそれの二本鎖認識部位に結合するが、
開裂は阻止された。この結果は、配列特異性の二本鎖Ｄ
ＮＡ結合性蛋白質が高いハイブリダイゼーション温度で
同様に△ｍＰを安定化し、維持することを証明する。こ
の場合、５６℃における制限エンドヌクレアーゼの結合
はオリゴヌクレオチドから二本鎖形への変換に伴うＦＰ
の変化を再生しただけでなく、それを増大すらさせた。
５６℃における△ｍＰは３７℃で見られた△ｍＰと比較
して５０％以上増大した。
【００４０】同様に、制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＦ
Ｉ認識部位（ＧＴＣＣＣ）を含む４１−ｍｅｒオリゴヌ
クレオチドを合成し、５′末端において６−ＦＡＭで標
識した。相補的オリゴヌクレオチドも合成した。Ａｐｏ
Ｉ実験の場合と同様に、１００μＬの試料６つを調製
し、相補的オリゴヌクレオチドを３つの試料に添加し
た。ＢｓｍＦＩ（１０単位、ニュー・イングランド・バ
イオラボズ）を一本鎖試料１つおよび二本鎖試料１つに
添加した。さらに４０単位のＢｓｍＦＩを他の一本鎖試
料１つおよび二本鎖試料１つに添加した。結果を表５に
示す。
Ｉ認識部位（ＧＴＣＣＣ）を含む４１−ｍｅｒオリゴヌ
クレオチドを合成し、５′末端において６−ＦＡＭで標
識した。相補的オリゴヌクレオチドも合成した。Ａｐｏ
Ｉ実験の場合と同様に、１００μＬの試料６つを調製
し、相補的オリゴヌクレオチドを３つの試料に添加し
た。ＢｓｍＦＩ（１０単位、ニュー・イングランド・バ
イオラボズ）を一本鎖試料１つおよび二本鎖試料１つに
添加した。さらに４０単位のＢｓｍＦＩを他の一本鎖試
料１つおよび二本鎖試料１つに添加した。結果を表５に
示す。
【００４１】
【表５】
【００４２】ＢｓｍＦＩはＣｌａｓｓ ＩＩｓ制限エン
ドヌクレアーゼであり、二本鎖ＤＮＡ中のそれの認識部
位に結合するが、隣接部位を開裂する。この実験では、
ＢｓｍＦＩ認識部位は二本鎖分子から開裂部位を除外す
るのに十分なほどオリゴヌクレオチドの末端に近かっ
た。この構造、およびマグネシウムが存在しなかったこ
とにより、この酵素は結合することはできたが、ハイブ
リダイズしたオリゴヌクレオチドの開裂は阻止された。
ＢｓｍＦＩは高いハイブリダイゼーション温度での△ｍ
Ｐの再生および増大について、ＡｐｏＩよりさらに有効
であった。５６℃で４０単位のＢｓｍＦＩの存在下で
は、△ｍＰの大きさは３７℃でＢｓｍＦＩの不在下より
ほとんど３倍大きかった。△ｍＰ増大の程度はこの二本
鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の濃度にも関係があると思われ
る。
ドヌクレアーゼであり、二本鎖ＤＮＡ中のそれの認識部
位に結合するが、隣接部位を開裂する。この実験では、
ＢｓｍＦＩ認識部位は二本鎖分子から開裂部位を除外す
るのに十分なほどオリゴヌクレオチドの末端に近かっ
た。この構造、およびマグネシウムが存在しなかったこ
とにより、この酵素は結合することはできたが、ハイブ
リダイズしたオリゴヌクレオチドの開裂は阻止された。
ＢｓｍＦＩは高いハイブリダイゼーション温度での△ｍ
Ｐの再生および増大について、ＡｐｏＩよりさらに有効
であった。５６℃で４０単位のＢｓｍＦＩの存在下で
は、△ｍＰの大きさは３７℃でＢｓｍＦＩの不在下より
ほとんど３倍大きかった。△ｍＰ増大の程度はこの二本
鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の濃度にも関係があると思われ
る。
【００４３】２７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを合成
し、５′末端において６−ＲＯＸで標識した。２７−ｍ
ｅｒ相補体も合成した。前記に従って１００μＬの試料
４つを調製し、相補的オリゴヌクレオチドを２つの試料
に添加した。Ｂｓｔポリメラーゼ（１２５単位、ニュー
・イングランド・バイオラボズ）を一本鎖試料１つおよ
び二本鎖試料１つに添加した。蛍光偏光をＳＬＭ ８１
００蛍光光度計（Ｅｘ／Ｅｍ ５８４／６０４）により
測定した。結果を表６に示す。
し、５′末端において６−ＲＯＸで標識した。２７−ｍ
ｅｒ相補体も合成した。前記に従って１００μＬの試料
４つを調製し、相補的オリゴヌクレオチドを２つの試料
に添加した。Ｂｓｔポリメラーゼ（１２５単位、ニュー
・イングランド・バイオラボズ）を一本鎖試料１つおよ
び二本鎖試料１つに添加した。蛍光偏光をＳＬＭ ８１
００蛍光光度計（Ｅｘ／Ｅｍ ５８４／６０４）により
測定した。結果を表６に示す。
【００４４】
【表６】
【００４５】ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔも３７℃より高
いハイブリダイゼーション温度で△ｍＰを再生および増
大させた。この実験でＢｓｔは、３７℃でポリメラーゼ
の不在下において見られた偏光変化と比較して、５６℃
では△ｍＰの大きさを３倍以上増大させた。この二本鎖
ＤＮＡ結合性蛋白質の存在下では、３７℃においてすら
約５倍の△ｍＰ増大が見られた。さらに、結合性蛋白質
の存在下でのハイブリダイゼーションに際しての偏光の
変化の大きさは、５６℃におけるより４７℃における方
が３０ｍＰ以上大きかった。温度の上昇に伴う△ｍＰの
減少は高い温度ほど媒質の粘度が低下すること、および
／または二本鎖分子の柔軟性が増大することを反映する
ものであろう。しかしながら、温度が高いほど二重らせ
んの一本鎖性が増大するという傾向が、二本鎖ＤＮＡ結
合性蛋白質が二重らせんを安定化して偏光の増大を維持
する能力を越え始めるかもしれない。これらおよびこれ
に類する試験から本発明者らは、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋
白質は約７５℃まではハイブリダイゼーションおよび増
幅の検出に有用な偏光変化を維持するのに有効であると
推定する。
いハイブリダイゼーション温度で△ｍＰを再生および増
大させた。この実験でＢｓｔは、３７℃でポリメラーゼ
の不在下において見られた偏光変化と比較して、５６℃
では△ｍＰの大きさを３倍以上増大させた。この二本鎖
ＤＮＡ結合性蛋白質の存在下では、３７℃においてすら
約５倍の△ｍＰ増大が見られた。さらに、結合性蛋白質
の存在下でのハイブリダイゼーションに際しての偏光の
変化の大きさは、５６℃におけるより４７℃における方
が３０ｍＰ以上大きかった。温度の上昇に伴う△ｍＰの
減少は高い温度ほど媒質の粘度が低下すること、および
／または二本鎖分子の柔軟性が増大することを反映する
ものであろう。しかしながら、温度が高いほど二重らせ
んの一本鎖性が増大するという傾向が、二本鎖ＤＮＡ結
合性蛋白質が二重らせんを安定化して偏光の増大を維持
する能力を越え始めるかもしれない。これらおよびこれ
に類する試験から本発明者らは、二本鎖ＤＮＡ結合性蛋
白質は約７５℃まではハイブリダイゼーションおよび増
幅の検出に有用な偏光変化を維持するのに有効であると
推定する。
【００４６】実施例３ 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）のＩＳ６１１０標的配列をｔＳＤＡにより
増幅させ、その際二次増幅生成物の生成による増幅の検
出のためにシグナルプライマーを含有させた。オリゴヌ
クレオチドはすべて標準法により合成され、ゲル電気泳
動により精製された。５′−フルオレセイン標識シグナ
ルプライマーは、標準法および６−ＦＡＭ ＡＭＩＤＩ
ＴＥ（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて調製
された。シグナルプライマーはＩＳ６１１０要素のヌク
レオチドの９８５−１０１０位（Ｔｈｉｅｒｒｙら，１
９９０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，１８８）
にハイブリダイズし、下記の配列をもつものであった：
ｌｏｓｉｓ）のＩＳ６１１０標的配列をｔＳＤＡにより
増幅させ、その際二次増幅生成物の生成による増幅の検
出のためにシグナルプライマーを含有させた。オリゴヌ
クレオチドはすべて標準法により合成され、ゲル電気泳
動により精製された。５′−フルオレセイン標識シグナ
ルプライマーは、標準法および６−ＦＡＭ ＡＭＩＤＩ
ＴＥ（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて調製
された。シグナルプライマーはＩＳ６１１０要素のヌク
レオチドの９８５−１０１０位（Ｔｈｉｅｒｒｙら，１
９９０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，１８８）
にハイブリダイズし、下記の配列をもつものであった：
【化１】 増幅プライマーおよびバンパープライマー（ｂｕｍｐｅ
ｒ ｐｒｉｍｅｒ）は下記のとおりであり、ＢｓｏＢＩ
認識配列を肉太のイタリック体で示し、ＩＳ６１１０標
的結合配列にアンダーラインを付した：
ｒ ｐｒｉｍｅｒ）は下記のとおりであり、ＢｓｏＢＩ
認識配列を肉太のイタリック体で示し、ＩＳ６１１０標
的結合配列にアンダーラインを付した：
【化２】 試料を使い捨てホウケイ酸ガラス試験管（１２×７５ｍ
ｍ）に入れ、ＦＰＭ−１蛍光光度計による偏光測定中、
３７℃に維持した。
ｍ）に入れ、ＦＰＭ−１蛍光光度計による偏光測定中、
３７℃に維持した。
【００４７】１００μＬの試料において下記の最終濃度
の試薬を用いてｔＳＤＡを実施した：３５ｍＭ Ｋ2Ｈ
ＰＯ4（ｐＨ７．５）、３ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．９）、１５ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、
１０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各１．４ｍＭのｄＧＴＰ、
ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰαＳ、０．１ｍｇ／ｍ
Ｌウシ血清アルブミン、５００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ、１
５ｎＭプライマーＳ1、６ｎＭプライマーＳ2、各５ｎＭ
のプライマーＢ1およびＢ2、３２０単位のＢｓｏＢＩ
（ニュー・イングランド・バイオラボズ）、８単位のＢ
ｃａ（パンベラ）、５ｎＭ ５′−フルオレセイン標識
シグナルプライマー、ならびに表１に示す量の結核菌Ｄ
ＮＡ。試料をまず下記のもの７０μＬ中に調製した：５
０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．５）、１０．７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、各２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよ
びｄＣＴＰαＳ、０．１４ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブ
ミン、２１．４ｎＭプライマーＳ1、８５．７ｎＭプラ
イマーＳ2、各７．１ｎＭのプライマーＢ1およびＢ2、
ならびに７．１ｎＭ ５′−フルオレセイン標識シグナ
ルプライマー。次いで各試料に、下記のもの１０μＬア
リコート中の種々の量の標的を添加した：１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび５００ｎｇヒ
ト胎盤ＤＮＡ。これら８０μＬの試料を沸騰水浴中で２
分間加熱することにより変性させ、プライマーアニーリ
ングのために６０℃で３分間平衡化した。ＢｓｏＢＩお
よびｅｘｏ-Ｂｃａポリメラーゼを合わせて、１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ中にそれぞ
れ１６単位／μＬおよび０．４単位／μＬに希釈し、２
０μＬアリコートで、６０℃において平衡化した８０μ
ＬのＳＤＡ試料に添加した。混合後にＳＤＡを６０℃で
１５分間進行させ、次いで６μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
の添加により終結させた。試料を下記のもの０．９ｍＬ
で希釈した：５５ｍＭ ＮａＣｌ、１１１ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ
７．４）、１．１ｍＭＥＤＴＡ、０．７ｍＭ β−メル
カプトエタノール、２７μｇ／ｍＬウシ血清アルブミ
ン、０．０２％トリトンＸ−１００、７％（ｖ／ｖ）グ
リセリン。３７℃で平衡化したのち蛍光偏光を測定し
た。次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼのエキ
ソヌクレアーゼ欠失クレノー断片（ユナイテッド・ステ
ーツ・バイオケミカル）の調製物を添加し（５単位／μ
Ｌの原液５μＬ）、３７℃で再度、蛍光偏光を記録し
た。
の試薬を用いてｔＳＤＡを実施した：３５ｍＭ Ｋ2Ｈ
ＰＯ4（ｐＨ７．５）、３ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．９）、１５ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、
１０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、各１．４ｍＭのｄＧＴＰ、
ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰαＳ、０．１ｍｇ／ｍ
Ｌウシ血清アルブミン、５００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ、１
５ｎＭプライマーＳ1、６ｎＭプライマーＳ2、各５ｎＭ
のプライマーＢ1およびＢ2、３２０単位のＢｓｏＢＩ
（ニュー・イングランド・バイオラボズ）、８単位のＢ
ｃａ（パンベラ）、５ｎＭ ５′−フルオレセイン標識
シグナルプライマー、ならびに表１に示す量の結核菌Ｄ
ＮＡ。試料をまず下記のもの７０μＬ中に調製した：５
０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．５）、１０．７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、各２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよ
びｄＣＴＰαＳ、０．１４ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブ
ミン、２１．４ｎＭプライマーＳ1、８５．７ｎＭプラ
イマーＳ2、各７．１ｎＭのプライマーＢ1およびＢ2、
ならびに７．１ｎＭ ５′−フルオレセイン標識シグナ
ルプライマー。次いで各試料に、下記のもの１０μＬア
リコート中の種々の量の標的を添加した：１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび５００ｎｇヒ
ト胎盤ＤＮＡ。これら８０μＬの試料を沸騰水浴中で２
分間加熱することにより変性させ、プライマーアニーリ
ングのために６０℃で３分間平衡化した。ＢｓｏＢＩお
よびｅｘｏ-Ｂｃａポリメラーゼを合わせて、１０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ中にそれぞ
れ１６単位／μＬおよび０．４単位／μＬに希釈し、２
０μＬアリコートで、６０℃において平衡化した８０μ
ＬのＳＤＡ試料に添加した。混合後にＳＤＡを６０℃で
１５分間進行させ、次いで６μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
の添加により終結させた。試料を下記のもの０．９ｍＬ
で希釈した：５５ｍＭ ＮａＣｌ、１１１ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．７ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ
７．４）、１．１ｍＭＥＤＴＡ、０．７ｍＭ β−メル
カプトエタノール、２７μｇ／ｍＬウシ血清アルブミ
ン、０．０２％トリトンＸ−１００、７％（ｖ／ｖ）グ
リセリン。３７℃で平衡化したのち蛍光偏光を測定し
た。次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼのエキ
ソヌクレアーゼ欠失クレノー断片（ユナイテッド・ステ
ーツ・バイオケミカル）の調製物を添加し（５単位／μ
Ｌの原液５μＬ）、３７℃で再度、蛍光偏光を記録し
た。
【００４８】シグナルプライマーは表７に示すように標
的依存性の蛍光偏光増大を示した（ｍＰ）。
的依存性の蛍光偏光増大を示した（ｍＰ）。
【００４９】
【表７】 結核菌のゲノム数 １０００ １００ １０ １ ０ １１４(１５４) １０８(１３６) ７９(９５) ６２(６８) ５７(６０) ＊かっこ内の数値はポリメラーゼ添加後のものである。
【００５０】高い装入標的を含有する試料ほど高い偏光
値を示したが、陰性対照（０装入標的）は一本鎖シグナ
ルプライマーのものに匹敵する偏光値を示した。結核菌
の１０ゲノムの増幅は陰性対照より明らかに検出可能で
あり、１ゲノムの増幅はバックグラウンドよりわずかに
増大した。
値を示したが、陰性対照（０装入標的）は一本鎖シグナ
ルプライマーのものに匹敵する偏光値を示した。結核菌
の１０ゲノムの増幅は陰性対照より明らかに検出可能で
あり、１ゲノムの増幅はバックグラウンドよりわずかに
増大した。
【００５１】ポリメラーゼを添加し、蛍光偏光を再度測
定したところ、結核菌ＤＮＡを含有する増幅試料につい
てはＦＰ値がかなり増大し、アッセイ感度が増大した。
ＦＰを３７℃で測定したので、これは主として恐らくポ
リメラーゼが二本鎖二次増幅生成物に結合することによ
りシグナルプライマー上の蛍光標識の混転時間をさらに
緩慢にしたためであろう。標的を含有しない試料におい
ては、本質的にＦＰの増大はなかった。ポリメラーゼを
添加したｔＳＤＡにおいて△ｍＰが増大したのは予想外
であった。一般的ＳＤＡは増大したＦＰを観察するため
には配列特異的結合性蛋白質を必要とするからである。
これは、一般的ＳＤＡで採用する低温ではミスプライミ
ングの発生率が高いことによるものであろう。これに対
しｔＳＤＡに採用する高い操作温度では、バックグラウ
ンド増幅はＤＮＡ結合性蛋白質における配列特異性の必
要性がなくなる水準にまで低下すると思われる。すなわ
ちｔＳＤＡが終了した時点で存在する二本鎖ＤＮＡは主
として標的特異性である。バックグラウンド増幅が本質
的に存在しないような条件にあるので、二次増幅生成物
に特異的に結合するものではない二本鎖ＤＮＡ結合性蛋
白質を使用しうる。したがってｔＳＤＡ条件下では、い
かなる二本鎖ＤＮＡ特異的結合性蛋白質もＦＰの変化を
増大させるために有効である。
定したところ、結核菌ＤＮＡを含有する増幅試料につい
てはＦＰ値がかなり増大し、アッセイ感度が増大した。
ＦＰを３７℃で測定したので、これは主として恐らくポ
リメラーゼが二本鎖二次増幅生成物に結合することによ
りシグナルプライマー上の蛍光標識の混転時間をさらに
緩慢にしたためであろう。標的を含有しない試料におい
ては、本質的にＦＰの増大はなかった。ポリメラーゼを
添加したｔＳＤＡにおいて△ｍＰが増大したのは予想外
であった。一般的ＳＤＡは増大したＦＰを観察するため
には配列特異的結合性蛋白質を必要とするからである。
これは、一般的ＳＤＡで採用する低温ではミスプライミ
ングの発生率が高いことによるものであろう。これに対
しｔＳＤＡに採用する高い操作温度では、バックグラウ
ンド増幅はＤＮＡ結合性蛋白質における配列特異性の必
要性がなくなる水準にまで低下すると思われる。すなわ
ちｔＳＤＡが終了した時点で存在する二本鎖ＤＮＡは主
として標的特異性である。バックグラウンド増幅が本質
的に存在しないような条件にあるので、二次増幅生成物
に特異的に結合するものではない二本鎖ＤＮＡ結合性蛋
白質を使用しうる。したがってｔＳＤＡ条件下では、い
かなる二本鎖ＤＮＡ特異的結合性蛋白質もＦＰの変化を
増大させるために有効である。
【００５２】ＦＰの変化が増大したことの証拠は、ｅｘ
ｏ-クレノーポリメラーゼ添加前ですら明らかであっ
た。同様な効果はシグナルプライマーを相補的オリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズさせる模擬ＳＤＡ反応にお
いても観察された。ＢｓｏＢＩおよびＢｃａの不在下
で、ハイブリダイゼーションに際してＦＰが約５５ｍＰ
から７０ｍＰに増大した。ＢｓｏＢＩおよびＢｃａの添
加により、ハイブリダイゼーションに伴ってＦＰが約１
２５ｍＰに増大した。これらの結果は予想外であった。
一般的ＳＤＡは、ＦＰを同様に３７℃で測定した場合、
配列特異性の二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を添加しないと
増大を示さなかったからである。模擬ＳＤＡ反応の結
果、および表７の高標的試料においてポリメラーゼ添加
前にｍＰ値が７０ｍＰより大きいという所見は、増幅反
応中に存在する二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質がＦＰの変化
を増大させる作用もすることを示唆する。さらに、ｔＳ
ＤＡを最大標的増幅時間（一般に約１５分）より延長す
ると、蛍光偏光は減少し始める。これは増幅反応におい
て非特異的バックグラウンド生成物が増加し始める時点
でもある。
ｏ-クレノーポリメラーゼ添加前ですら明らかであっ
た。同様な効果はシグナルプライマーを相補的オリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズさせる模擬ＳＤＡ反応にお
いても観察された。ＢｓｏＢＩおよびＢｃａの不在下
で、ハイブリダイゼーションに際してＦＰが約５５ｍＰ
から７０ｍＰに増大した。ＢｓｏＢＩおよびＢｃａの添
加により、ハイブリダイゼーションに伴ってＦＰが約１
２５ｍＰに増大した。これらの結果は予想外であった。
一般的ＳＤＡは、ＦＰを同様に３７℃で測定した場合、
配列特異性の二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を添加しないと
増大を示さなかったからである。模擬ＳＤＡ反応の結
果、および表７の高標的試料においてポリメラーゼ添加
前にｍＰ値が７０ｍＰより大きいという所見は、増幅反
応中に存在する二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質がＦＰの変化
を増大させる作用もすることを示唆する。さらに、ｔＳ
ＤＡを最大標的増幅時間（一般に約１５分）より延長す
ると、蛍光偏光は減少し始める。これは増幅反応におい
て非特異的バックグラウンド生成物が増加し始める時点
でもある。
【００５３】実施例４ クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｒａｍｙｄｉａ ｔｒ
ａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体（ＥＢ）中の標的配列を
増幅させる好熱性ＳＤＡ反応を、下記を含有する１ｍＬ
容量中で実施した：５ｍＭ ＭｇＣｌ2（シグマ）、各
０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ（ファルマシ
ア）、１．４ｍＭ ｄＣＴＰαＳ（ユナイテッド・ステ
ーツ・バイオケミカルズ）、２０μｇ／ｍＬ非アセチル
化ウシ血清アルブミン（ニュー・イングランド・バイオ
ラボズ）、１ｎｇ／μＬヒト胎盤ＤＮＡ（シグマ）、４
０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．６）、５％（ｖ／ｖ）グ
リセリン、３％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．７５μＭプラ
イマーＳ1、０．１８７５μＭプライマーＳ2、１０ｎＭ
５−ＤＴＡＦ標識シグナルプライマー、０．０７５μ
ＭのプライマーＢ1およびＢ2、３．２単位／μＬ Ｂｓ
ｏＢＩ（ニュー・イングランド・バイオラボズ）、０．
２５単位／μＬエキソヌクレアーゼ欠失Ｂｓｔ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（モレキュラー・バイオロジー・リソーシ
ズ）、および０−１０6のクラミジア基本小体（Ｅ
Ｂ）。標的を含有しない反応にも増幅が起こりえないこ
とを保証するために１０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを装
入した。
ａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体（ＥＢ）中の標的配列を
増幅させる好熱性ＳＤＡ反応を、下記を含有する１ｍＬ
容量中で実施した：５ｍＭ ＭｇＣｌ2（シグマ）、各
０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ（ファルマシ
ア）、１．４ｍＭ ｄＣＴＰαＳ（ユナイテッド・ステ
ーツ・バイオケミカルズ）、２０μｇ／ｍＬ非アセチル
化ウシ血清アルブミン（ニュー・イングランド・バイオ
ラボズ）、１ｎｇ／μＬヒト胎盤ＤＮＡ（シグマ）、４
０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．６）、５％（ｖ／ｖ）グ
リセリン、３％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．７５μＭプラ
イマーＳ1、０．１８７５μＭプライマーＳ2、１０ｎＭ
５−ＤＴＡＦ標識シグナルプライマー、０．０７５μ
ＭのプライマーＢ1およびＢ2、３．２単位／μＬ Ｂｓ
ｏＢＩ（ニュー・イングランド・バイオラボズ）、０．
２５単位／μＬエキソヌクレアーゼ欠失Ｂｓｔ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（モレキュラー・バイオロジー・リソーシ
ズ）、および０−１０6のクラミジア基本小体（Ｅ
Ｂ）。標的を含有しない反応にも増幅が起こりえないこ
とを保証するために１０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを装
入した。
【００５４】ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｔポリメラーゼ、ＢＳＡ
およびＭｇＣｌ2の添加前に、反応物を９５℃に５分間
加熱して、標的ＤＮＡを変性させた。標的の変性後に、
試料（８００μＬ）をＳＬＭ ８１００蛍光光度計のキ
ュベットに移し、５３．５℃で１０分間平衡化した。２
００μＬの酵素配合物（１００μＬの５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、２０μＬの２
５単位／μＬ Ｂｓｔポリメラーゼ、２０μＬの１６０
単位／μＬ ＢｓｏＢＩ、および４０μＬの１Ｘ ＮＥ
Ｂ２（ニュー・イングランド・バイオラボズ）の添加に
より増幅を開始した。モノクロメーターを通してＬ−ｏ
ｐｔｉｃｓを用いて２分毎にＦＰを監視した。励起波長
は４９４ｎｍであり、発光波長は５２０ｎｍであった。
これらはフルオレセインおよび５−ＤＴＡＦに最適なも
のである。
およびＭｇＣｌ2の添加前に、反応物を９５℃に５分間
加熱して、標的ＤＮＡを変性させた。標的の変性後に、
試料（８００μＬ）をＳＬＭ ８１００蛍光光度計のキ
ュベットに移し、５３．５℃で１０分間平衡化した。２
００μＬの酵素配合物（１００μＬの５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、２０μＬの２
５単位／μＬ Ｂｓｔポリメラーゼ、２０μＬの１６０
単位／μＬ ＢｓｏＢＩ、および４０μＬの１Ｘ ＮＥ
Ｂ２（ニュー・イングランド・バイオラボズ）の添加に
より増幅を開始した。モノクロメーターを通してＬ−ｏ
ｐｔｉｃｓを用いて２分毎にＦＰを監視した。励起波長
は４９４ｎｍであり、発光波長は５２０ｎｍであった。
これらはフルオレセインおよび５−ＤＴＡＦに最適なも
のである。
【００５５】結果を図１に示す。これは標的（１０6Ｅ
Ｂ）を含有する反応において経時的にＦＰが増大するこ
とを示す。この反応において最大△ｍＰは約１６１．４
であり、この初期濃度において標的は約６−８分で検出
可能となった。標的およびＥＤＴＡを含有しない反応は
ＦＰの増大を示さなかった。反応をＦＰＭ−１蛍光光度
計で監視した場合にも△ｍＰは同様であった。ただし偏
光値は異なっていた。
Ｂ）を含有する反応において経時的にＦＰが増大するこ
とを示す。この反応において最大△ｍＰは約１６１．４
であり、この初期濃度において標的は約６−８分で検出
可能となった。標的およびＥＤＴＡを含有しない反応は
ＦＰの増大を示さなかった。反応をＦＰＭ−１蛍光光度
計で監視した場合にも△ｍＰは同様であった。ただし偏
光値は異なっていた。
【００５６】比較しうる温度で実施したプローブハイブ
リダイゼーション試験の結果に基づけば、ｔＳＤＡなど
の好熱性増幅反応において有意の偏光増大を検出しうる
ことは予想外であった。本発明者らは、これらの反応条
件下では増幅に用いたポリメラーゼが二本鎖二次増幅生
成物の安定化剤としても機能し、高温増幅温度に典型的
な一本鎖性の増大がこれによって低下または阻止される
と考える。二本鎖構造の安定化が高温での増幅依存性偏
光増大を維持し、場合によっては増強すらすると思われ
る。
リダイゼーション試験の結果に基づけば、ｔＳＤＡなど
の好熱性増幅反応において有意の偏光増大を検出しうる
ことは予想外であった。本発明者らは、これらの反応条
件下では増幅に用いたポリメラーゼが二本鎖二次増幅生
成物の安定化剤としても機能し、高温増幅温度に典型的
な一本鎖性の増大がこれによって低下または阻止される
と考える。二本鎖構造の安定化が高温での増幅依存性偏
光増大を維持し、場合によっては増強すらすると思われ
る。
【００５７】
【００５８】配列番号：１ 配列の長さ：３４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： TAGAGTCTTCAAATATCAGAGCTTTACCTAACAA 34
【００５９】配列番号：２ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： ATCCGTATGG TGGATAACGT CTTTCA 26
【００６０】配列番号：３ 配列の長さ：４０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGTCTACT GAGATCCCCT 40
【００６１】配列番号：４ 配列の長さ：４０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： ACCGCATCGA ATGCATCTCT CGGGTAAGGC GTACTCGACC 40
【００６２】配列番号：５ 配列の長さ：１３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： CGCTGAACCG GAT 13
【００６３】配列番号：６ 配列の長さ：１３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列： TCCACCCGCC AAC 13
【図１】５３．５℃における標的配列増幅のリアルタイ
ム検出を示す。
ム検出を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 (72)発明者 ジー・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・ボラ ス・ロード 209 (72)発明者 パトリシア・アン・スピアーズ アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27615，ローリー，カロリンジアン・コー ト 8605
Claims (10)
- 【請求項１】 核酸標的配列を検出するための方法であ
って、 ａ）蛍光標識を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを標的配
列に約４５−７５℃で二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質の存在
下にハイブリダイズさせ、そして； ｂ）標的配列を、一本鎖オリゴヌクレオチドから二本鎖
形への変換に伴う蛍光偏光の変化により検出することを
含む方法。 - 【請求項２】 一本鎖オリゴヌクレオチドが、標的配列
にハイブリダイズした際に二本鎖形に変換されるプロー
ブである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ハイブリダイズしたプローブを、蛍光偏
光の変化を検出する前に標的配列上で伸長させる、請求
項２に記載の方法。 - 【請求項４】 標的配列を増幅させ、二本鎖ＤＮＡ結合
性蛋白質が標的配列を増幅させるために用いるポリメラ
ーゼである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 一本鎖オリゴヌクレオチドが、標的増幅
依存性様式で二本鎖形に変換されるシグナルプライマー
である、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 蛍光偏光の変化を検出する前に第２の二
本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質を添加する、請求項４に記載の
方法。 - 【請求項７】 一本鎖オリゴヌクレオチドが増幅プライ
マーである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が二本鎖形オ
リゴヌクレオチド中の特異的認識配列に結合する、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項９】 二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が制限エンド
ヌクレアーゼである、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 二本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質が配列非特
異的に二本鎖形オリゴヌクレオチドに結合する、請求項
１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/559,508 US5641633A (en) | 1995-11-15 | 1995-11-15 | Fluorescence polarization detection of nucleic acids |
| US559508 | 2000-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09187276A true JPH09187276A (ja) | 1997-07-22 |
| JP3045085B2 JP3045085B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=24233852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8304465A Expired - Fee Related JP3045085B2 (ja) | 1995-11-15 | 1996-11-15 | 核酸の蛍光偏光検出法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5641633A (ja) |
| EP (1) | EP0774515A3 (ja) |
| JP (1) | JP3045085B2 (ja) |
| KR (1) | KR970028548A (ja) |
| AU (1) | AU705824B2 (ja) |
| CA (1) | CA2189941C (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11196883A (ja) * | 1997-11-04 | 1999-07-27 | Becton Dickinson & Co | 増幅によるクラミジア・トラコマティスの分析およびクラミジア・トラコマティスの核酸の検出 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5804395A (en) * | 1995-12-01 | 1998-09-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Fluorescence polarization assays of enzymes and substrates therefore |
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| US6469311B1 (en) | 1997-07-16 | 2002-10-22 | Molecular Devices Corporation | Detection device for light transmitted from a sensed volume |
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
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| WO2000050877A1 (en) | 1999-02-23 | 2000-08-31 | Ljl Biosystems, Inc. | Frequency-domain light detection device |
| WO2000006990A2 (en) | 1998-07-27 | 2000-02-10 | Ljl Biosystems, Inc. | Apparatus and methods for time-resolved spectroscopic measurements |
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