JP2757979B2 - 核酸増幅の蛍光偏光検出方法 - Google Patents
核酸増幅の蛍光偏光検出方法Info
- Publication number
- JP2757979B2 JP2757979B2 JP7092404A JP9240495A JP2757979B2 JP 2757979 B2 JP2757979 B2 JP 2757979B2 JP 7092404 A JP7092404 A JP 7092404A JP 9240495 A JP9240495 A JP 9240495A JP 2757979 B2 JP2757979 B2 JP 2757979B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amplification
- detection probe
- target
- target sequence
- sda
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Lasers (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本出願は、1994年4 月18日付で出
願された米国特許第 08/229,281 号の一部係属出願であ
る。
願された米国特許第 08/229,281 号の一部係属出願であ
る。
【０００２】本発明は、核酸標識配列の増幅を検出する
ための方法、特に蛍光偏光による増幅の検出方法に関す
る。
ための方法、特に蛍光偏光による増幅の検出方法に関す
る。
【０００３】
【従来の技術】ストランド置換増幅（SDA ）はヘミ修飾
された識別部位にニックを入れる制限酵素の能力および
下流DNA 鎖を置換するポリメラーゼの能力を利用して標
的核酸を増幅することである（米国特許第 5,270,184
号、参考としてここに編入；ウォーカー(Walker)ら、19
92, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-396 ;ウォーカー
ら、1992. Nucl. Acids Res. 20, 1691 - 1696 ) 。SD
A のための標的物は制限エンドヌクレアーゼでの処理に
より生ずる核酸の断片に存在するかもしれないしまたは
SDA に適する標的物はプライマーの延長または置換によ
り生じるかもしれない。標的発生のこの二番目の型およ
びそれに続くSDA 反応の過程を図１に示す。標的物発生
方法( 図１の左側）はSDA に必要なニック可能な制限部
位が側面に位置する標的配列のコピーを作る。これらの
修飾された標的配列は、繰り返されるニック、ストラン
ド置換および置換したストランドの再プライマー化によ
り指数関数的に増幅する（図１の右側）。図１の明らか
な複雑性にもかかわらず、SDAは非常に簡単なプロトコ
ールで進行する：二重鎖標的DNA を制限酵素とポリメラ
ーゼを除く全ての試薬の存在下で熱変性する。次いで酵
素を添加すると、それ以上の反応操作を必要とせずに、
指数関数的増幅が一定の低下した温度で進行する。SDA
は一定の反応温度、通常約35-42 ℃で2 時間以内に標的
配列の108 倍の増幅が可能である。
された識別部位にニックを入れる制限酵素の能力および
下流DNA 鎖を置換するポリメラーゼの能力を利用して標
的核酸を増幅することである（米国特許第 5,270,184
号、参考としてここに編入；ウォーカー(Walker)ら、19
92, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-396 ;ウォーカー
ら、1992. Nucl. Acids Res. 20, 1691 - 1696 ) 。SD
A のための標的物は制限エンドヌクレアーゼでの処理に
より生ずる核酸の断片に存在するかもしれないしまたは
SDA に適する標的物はプライマーの延長または置換によ
り生じるかもしれない。標的発生のこの二番目の型およ
びそれに続くSDA 反応の過程を図１に示す。標的物発生
方法( 図１の左側）はSDA に必要なニック可能な制限部
位が側面に位置する標的配列のコピーを作る。これらの
修飾された標的配列は、繰り返されるニック、ストラン
ド置換および置換したストランドの再プライマー化によ
り指数関数的に増幅する（図１の右側）。図１の明らか
な複雑性にもかかわらず、SDAは非常に簡単なプロトコ
ールで進行する：二重鎖標的DNA を制限酵素とポリメラ
ーゼを除く全ての試薬の存在下で熱変性する。次いで酵
素を添加すると、それ以上の反応操作を必要とせずに、
指数関数的増幅が一定の低下した温度で進行する。SDA
は一定の反応温度、通常約35-42 ℃で2 時間以内に標的
配列の108 倍の増幅が可能である。
【０００４】蛍光偏光（FP）は蛍光分子の時間平均回転
運動の程度である。これは1920年代から知られており、
分子容および微小粘度の鋭敏な決定についての研究およ
び臨床的用途の両方に使用されてきた。FP技術は溶液中
の分子の回転特性の変化に基づく。すなわち、溶液中の
分子はこれらの異なった軸の回りを“ 回転（tumble)"
する傾向にある。より大きな分子（たとえば、より大き
な容積または分子量を有するもの）は、小さな分子より
も数少ない軸に沿ってさらにゆっくり回転する。それゆ
え、これらは励起と発光の間にあまり動かず、これによ
り発光が比較的高い偏光を示すことになる。これと反対
に、より小さな蛍光分子からの蛍光発光は、励起と発光
の間に一層回転することを示し、より多面的である（偏
光が小さい）。より小さな蛍光分子がより大きくまたは
さらにより固い立体配座をとる場合、その回転性は低下
しそして発光蛍光は比較的偏光するようになる。発光蛍
光の偏光度におけるこの変化を測定し、そして蛍光分子
の増加する大きさおよび／または固さの指標として使用
することができる。
運動の程度である。これは1920年代から知られており、
分子容および微小粘度の鋭敏な決定についての研究およ
び臨床的用途の両方に使用されてきた。FP技術は溶液中
の分子の回転特性の変化に基づく。すなわち、溶液中の
分子はこれらの異なった軸の回りを“ 回転（tumble)"
する傾向にある。より大きな分子（たとえば、より大き
な容積または分子量を有するもの）は、小さな分子より
も数少ない軸に沿ってさらにゆっくり回転する。それゆ
え、これらは励起と発光の間にあまり動かず、これによ
り発光が比較的高い偏光を示すことになる。これと反対
に、より小さな蛍光分子からの蛍光発光は、励起と発光
の間に一層回転することを示し、より多面的である（偏
光が小さい）。より小さな蛍光分子がより大きくまたは
さらにより固い立体配座をとる場合、その回転性は低下
しそして発光蛍光は比較的偏光するようになる。発光蛍
光の偏光度におけるこの変化を測定し、そして蛍光分子
の増加する大きさおよび／または固さの指標として使用
することができる。
【０００５】蛍光偏光技術において、最初に蛍光分子は
偏光した光により励起される。発光の偏光は、偏光した
励起光の平面と平行な発光の相対強度（i)と偏光した励
起光の平面と垂直な発光の相対強度（ii）を測定するこ
とにより決められる。大きさおよび／または固さにおけ
る変化のために生ずる回転速度の変化は、励起光の平面
と発光した蛍光の平面との関係における変化すなわち蛍
光偏光における変化を伴う。このような変化は、たとえ
ば、一重鎖オリゴヌクレオチドプローブが二重鎖になっ
た場合または核酸結合たんぱく質がオリゴヌクレオチド
と結合した場合、生じうる。蛍光異方性はFPと密接に関
係する。この技術はまた分子の回転速度における変化を
測定するが、しかし別の方程式を用いて計算される。偏
光および異方性は本発明に使用するための互換性のある
技術であると理解されるべきである。ここでは一般に用
語“蛍光偏光”が使用されるが、しかし蛍光異方性方法
も含むことは理解されるべきである。蛍光および異方性
の定常状態測定において、これらの値は以下の式に従っ
て計算される： P ( 偏光 ) = Ipa - Ipe/Ipa + Ipe r ( 異方性 ) = Ipa - Ipe/Ipa + 2Ipe （式中、Ipa は偏光した励起光の平面と平行な蛍光発光
の強度であり、Ipe は偏光した励起光の平面と垂直な蛍
光発光の強度である）。
偏光した光により励起される。発光の偏光は、偏光した
励起光の平面と平行な発光の相対強度（i)と偏光した励
起光の平面と垂直な発光の相対強度（ii）を測定するこ
とにより決められる。大きさおよび／または固さにおけ
る変化のために生ずる回転速度の変化は、励起光の平面
と発光した蛍光の平面との関係における変化すなわち蛍
光偏光における変化を伴う。このような変化は、たとえ
ば、一重鎖オリゴヌクレオチドプローブが二重鎖になっ
た場合または核酸結合たんぱく質がオリゴヌクレオチド
と結合した場合、生じうる。蛍光異方性はFPと密接に関
係する。この技術はまた分子の回転速度における変化を
測定するが、しかし別の方程式を用いて計算される。偏
光および異方性は本発明に使用するための互換性のある
技術であると理解されるべきである。ここでは一般に用
語“蛍光偏光”が使用されるが、しかし蛍光異方性方法
も含むことは理解されるべきである。蛍光および異方性
の定常状態測定において、これらの値は以下の式に従っ
て計算される： P ( 偏光 ) = Ipa - Ipe/Ipa + Ipe r ( 異方性 ) = Ipa - Ipe/Ipa + 2Ipe （式中、Ipa は偏光した励起光の平面と平行な蛍光発光
の強度であり、Ipe は偏光した励起光の平面と垂直な蛍
光発光の強度である）。
【０００６】FPは均等性であるので、この技術は物理的
操作により妨害されることなく溶液中の分子の相互反応
を研究するのに理想的である。それゆえ、蛍光偏光は、
一重鎖の蛍光標識化されたDNA をハイブリダイズして二
重鎖形へ転化することを調べるのに都合の良い方法であ
る（ムラカミ(Murakami)ら、 1991. Nucl. Acids Res.
19, 4097-4102)。一重鎖および二重鎖核酸立体配座の間
にこの二つの形を物理的に分離することなく区別するFP
の能力により、この技術が診断形式においてプローブの
ハイブリダイゼーションをモニターするための魅力的な
変法になった。ヨーロッパ特許公開第 0,382,433号は、
蛍光プローブをアンプリコンへハイブリダイズするか、
または蛍光標識物を蛍光標識化増幅プライマーの標的-
特異的延長により増幅生成物へ組み込むことにより、増
幅した標識配列を蛍光偏光検出することについて記載し
ている。PCT 特許公開第 WO 92/18650号は、蛍光プロー
ブのハイブリダイゼーションと組み合わせた蛍光偏光に
おける増加により増幅したRNA またはDNA標的配列を検
出する類似方法を記載している。
操作により妨害されることなく溶液中の分子の相互反応
を研究するのに理想的である。それゆえ、蛍光偏光は、
一重鎖の蛍光標識化されたDNA をハイブリダイズして二
重鎖形へ転化することを調べるのに都合の良い方法であ
る（ムラカミ(Murakami)ら、 1991. Nucl. Acids Res.
19, 4097-4102)。一重鎖および二重鎖核酸立体配座の間
にこの二つの形を物理的に分離することなく区別するFP
の能力により、この技術が診断形式においてプローブの
ハイブリダイゼーションをモニターするための魅力的な
変法になった。ヨーロッパ特許公開第 0,382,433号は、
蛍光プローブをアンプリコンへハイブリダイズするか、
または蛍光標識物を蛍光標識化増幅プライマーの標的-
特異的延長により増幅生成物へ組み込むことにより、増
幅した標識配列を蛍光偏光検出することについて記載し
ている。PCT 特許公開第 WO 92/18650号は、蛍光プロー
ブのハイブリダイゼーションと組み合わせた蛍光偏光に
おける増加により増幅したRNA またはDNA標的配列を検
出する類似方法を記載している。
【０００７】蛍光偏光は遷移状態FPまたは定常状態FPの
いずれかとしてモニターされる。遷移状態FPにおいて、
励起光源はサンプル上でフラッシュし、励起光源を止め
た後に発光光源の偏光を光電子増倍管上で回転すること
によりモニターする。これは蛍光が光の散乱により長く
衰えないので光の散乱による妨害を減少するが、しかし
蛍光強度はいくらか減少する。定常状態のFPでは、励起
光および発光のモニターを続ける（すなわち、励起光源
および光電子増倍管は連続してオンである）。この結
果、モニターする期間にわたって平均回転時間を測定す
ることになり、散乱光の作用を含む。
いずれかとしてモニターされる。遷移状態FPにおいて、
励起光源はサンプル上でフラッシュし、励起光源を止め
た後に発光光源の偏光を光電子増倍管上で回転すること
によりモニターする。これは蛍光が光の散乱により長く
衰えないので光の散乱による妨害を減少するが、しかし
蛍光強度はいくらか減少する。定常状態のFPでは、励起
光および発光のモニターを続ける（すなわち、励起光源
および光電子増倍管は連続してオンである）。この結
果、モニターする期間にわたって平均回転時間を測定す
ることになり、散乱光の作用を含む。
【０００８】本発明は、たとえばSDA のような核酸増幅
方法に使用するためのFPまたは蛍光異方性検出方法を提
供するものである。これまで、SDA 増幅標的配列は、32
P プローブを用いた増幅( ウォーカーら、1992. Nucl.
Acids Res., 前掲）または化学ルミネッセンス信号の発
生を用いたサンドイッチ型ハイブリダイゼーション検定
（スパルゴ(Spargo)ら、1993 .Molec.Cell.Probes 7,39
5- 404) により検出された。これらの検出形式は両方の
信号を測定する前に遊離および結合プローブを分離する
必要がある。しかしながら物理的に分離することなくFP
を用いて遊離および結合検出プローブを区別する能力
は、均質で密閉された系でSDA および増幅検出を行うこ
とが可能になる。さらに、一部ではSDA の発熱性の結果
として、SDA とFP検出を一工程で組み合わせることがで
きる（すなわち、即時増幅および検出）。密閉された均
質検定は操作工程および手順の複雑性を減らし、ならび
に実験室における増幅生成物の分散性の調節を向上し、
これにより標的DNA によるサンプルの偶然の汚染が原因
の誤った陽性の可能性を低下する。
方法に使用するためのFPまたは蛍光異方性検出方法を提
供するものである。これまで、SDA 増幅標的配列は、32
P プローブを用いた増幅( ウォーカーら、1992. Nucl.
Acids Res., 前掲）または化学ルミネッセンス信号の発
生を用いたサンドイッチ型ハイブリダイゼーション検定
（スパルゴ(Spargo)ら、1993 .Molec.Cell.Probes 7,39
5- 404) により検出された。これらの検出形式は両方の
信号を測定する前に遊離および結合プローブを分離する
必要がある。しかしながら物理的に分離することなくFP
を用いて遊離および結合検出プローブを区別する能力
は、均質で密閉された系でSDA および増幅検出を行うこ
とが可能になる。さらに、一部ではSDA の発熱性の結果
として、SDA とFP検出を一工程で組み合わせることがで
きる（すなわち、即時増幅および検出）。密閉された均
質検定は操作工程および手順の複雑性を減らし、ならび
に実験室における増幅生成物の分散性の調節を向上し、
これにより標的DNA によるサンプルの偶然の汚染が原因
の誤った陽性の可能性を低下する。
【０００９】ここに使用したある種の用語および熟語を
以下に定義する：増幅プライマーは、標的配列へハイブ
リダイズした隣接プライマーのプライマー延長または連
結により標的配列を増幅するためのプライマーである。
SDA による増幅に対しては、オリゴヌクレオチドプライ
マーはGC含有率が低いように、好ましくはプローブの全
ヌクレオチド組成の70 %未満であるように選択されるの
が好ましい。同様に、SDA に対しては、標的配列は第二
の構造を最小限にするために低いGC含有率を有するのが
好ましい。SDA 増幅プライマー（標的結合配列）の3 ´
末端は標的配列の3 ´末端でハイブリダイズする。標的
結合配列は増幅プライマーにおいて標的特異性を付与す
る。さらにSDA 増幅プライマーは、その5 ´末端近くに
制限エンドヌクレアーゼに対する識別部位を含む。識別
部位は、ウォーカーら( 1992. Proc. Natl.Acad. Sci.
およびNucl. Acids Res.前掲）により記載されているよ
うに、識別部位がヘミ修飾された場合、DNA 二重らせん
体の一本のストランドにニックを入れるであろう制限エ
ンドヌクレアーゼに対するものである。SDA 増幅プライ
マーはまた、当該技術で公知のように、一般に制限エン
ドヌクレアーゼ識別部位へ追加の配列5 ´を含み、適当
な制限エンドヌクレアーゼがその識別部位へ結合しそし
てニック後ポリメラーゼに対しプライマーとして働くよ
うにする。SDA 反応の大部分に対し、増幅プライマーは
標的配列の指数関数的増幅の原因となるものである。SD
A 増幅プライマーはまた、一対の増幅プライマーを二重
鎖配列の増幅に使用した場合、“ S "プライマー、た
とえばS1および S2 として言及される。標的の末端に対
し特別な配列の付着を必要としない他の増幅法に対し
て、増幅プライマーは一般に標的結合配列のみからな
る。
以下に定義する：増幅プライマーは、標的配列へハイブ
リダイズした隣接プライマーのプライマー延長または連
結により標的配列を増幅するためのプライマーである。
SDA による増幅に対しては、オリゴヌクレオチドプライ
マーはGC含有率が低いように、好ましくはプローブの全
ヌクレオチド組成の70 %未満であるように選択されるの
が好ましい。同様に、SDA に対しては、標的配列は第二
の構造を最小限にするために低いGC含有率を有するのが
好ましい。SDA 増幅プライマー（標的結合配列）の3 ´
末端は標的配列の3 ´末端でハイブリダイズする。標的
結合配列は増幅プライマーにおいて標的特異性を付与す
る。さらにSDA 増幅プライマーは、その5 ´末端近くに
制限エンドヌクレアーゼに対する識別部位を含む。識別
部位は、ウォーカーら( 1992. Proc. Natl.Acad. Sci.
およびNucl. Acids Res.前掲）により記載されているよ
うに、識別部位がヘミ修飾された場合、DNA 二重らせん
体の一本のストランドにニックを入れるであろう制限エ
ンドヌクレアーゼに対するものである。SDA 増幅プライ
マーはまた、当該技術で公知のように、一般に制限エン
ドヌクレアーゼ識別部位へ追加の配列5 ´を含み、適当
な制限エンドヌクレアーゼがその識別部位へ結合しそし
てニック後ポリメラーゼに対しプライマーとして働くよ
うにする。SDA 反応の大部分に対し、増幅プライマーは
標的配列の指数関数的増幅の原因となるものである。SD
A 増幅プライマーはまた、一対の増幅プライマーを二重
鎖配列の増幅に使用した場合、“ S "プライマー、た
とえばS1および S2 として言及される。標的の末端に対
し特別な配列の付着を必要としない他の増幅法に対し
て、増幅プライマーは一般に標的結合配列のみからな
る。
【００１０】バンパーまたは外部プライマーはSDA にお
いて使用されるプライマーであり、これはバンパープラ
イマーの延長が下流プライマーおよびその延長生成物を
置換するように増幅プライマーの標的配列上流へアニー
ルする。バンパープライマーはまた、一対のバンパープ
ライマーを使用して一対の増幅プライマーの延長生成物
を置換するするために使用する場合、“ B "プライマ
ー、たとえばB1およびB2 として言及される。バンパー
プライマーの延長は増幅プライマーの延長生成物を置換
するための一方法であるが、しかし加熱もまた好適であ
る。
いて使用されるプライマーであり、これはバンパープラ
イマーの延長が下流プライマーおよびその延長生成物を
置換するように増幅プライマーの標的配列上流へアニー
ルする。バンパープライマーはまた、一対のバンパープ
ライマーを使用して一対の増幅プライマーの延長生成物
を置換するするために使用する場合、“ B "プライマ
ー、たとえばB1およびB2 として言及される。バンパー
プライマーの延長は増幅プライマーの延長生成物を置換
するための一方法であるが、しかし加熱もまた好適であ
る。
【００１１】用語“ 標的 "または“ 標的配列 "は、
増幅プライマーにより増幅可能な核酸配列に関する。こ
れらは増幅されるべき最初の核酸配列、増幅されるべき
最初の核酸配列の相補的第二のストランド、および増幅
反応により作られる最初の配列のコピーのストランドの
いずれかを含む。これらのコピーはまた、増幅プライマ
ーがハイブリダイズする最初の標的配列のコピーを含む
という事実に基づいて増幅可能な標的配列としても働
く。
増幅プライマーにより増幅可能な核酸配列に関する。こ
れらは増幅されるべき最初の核酸配列、増幅されるべき
最初の核酸配列の相補的第二のストランド、および増幅
反応により作られる最初の配列のコピーのストランドの
いずれかを含む。これらのコピーはまた、増幅プライマ
ーがハイブリダイズする最初の標的配列のコピーを含む
という事実に基づいて増幅可能な標的配列としても働
く。
【００１２】増幅反応の間に生じる標的配列のコピー
は、増幅生成物、アンプライマーまたはアンプリコンと
して言及される。
は、増幅生成物、アンプライマーまたはアンプリコンと
して言及される。
【００１３】用語“延長生成物”は、鋳型として標的配
列を使用するポリメラーゼによりプライマーのハイブリ
ダイゼーションおよびプライマーの延長によりつくられ
る標的配列の一重鎖コピーに関する。
列を使用するポリメラーゼによりプライマーのハイブリ
ダイゼーションおよびプライマーの延長によりつくられ
る標的配列の一重鎖コピーに関する。
【００１４】
【発明の概略】本発明は、FPおよび蛍光染料を含む検出
プローブを用いた核酸増幅の検出方法を提供するもので
ある。増幅は、一重鎖検出プローブからの二重鎖蛍光生
成物の標的物依存性形成と関係するFPにおける増加とし
て検出される。一実施態様において、本発明はまた、二
重鎖DNA の形成の結果であるFPにおける増加の規模を強
化するために使用されうる新規技術に関する。この変化
の規模を強化することは、別の方法ではフルオレセイン
標識化オリゴヌクレオチドに対する一重鎖FP値と二重鎖
FP値の間に約20 mP の差があるだけなので有利である。
二重鎖DNA 結合たんぱく質を使用して一重鎖- 二重鎖転
化に関係するFPにおける増加を強化することができる。
一例として、二重鎖DNA 結合たんぱく質は制限エンドヌ
クレアーゼEcoRIであり、これはその天然の形において
これが結合しているDNA を切断するためにマグネシウム
を必要とする。マグネシウムがないと、 EcoRIは結合す
るが切断せず、これらの条件下で一重鎖- 二重鎖転化と
関係するFPにおける増加を強化する。第二の例として
は、DNA 結合たんぱく質は EcoRIの突然変異形、 EcoRI
(Gln111)であり、これはライト(Wright)らにより記載さ
れている(1989, J. Biol.Chem. 264, 11816-11821)。 E
coRI(Gln111)は二重鎖DNA へ天然 EcoRIよりしっかり結
合し、マグネシウムの存在下でさえ核酸を切断しない。
このたんぱく質の結合はまた、二重鎖形への転化を伴う
FPにおける増加を強化する。
プローブを用いた核酸増幅の検出方法を提供するもので
ある。増幅は、一重鎖検出プローブからの二重鎖蛍光生
成物の標的物依存性形成と関係するFPにおける増加とし
て検出される。一実施態様において、本発明はまた、二
重鎖DNA の形成の結果であるFPにおける増加の規模を強
化するために使用されうる新規技術に関する。この変化
の規模を強化することは、別の方法ではフルオレセイン
標識化オリゴヌクレオチドに対する一重鎖FP値と二重鎖
FP値の間に約20 mP の差があるだけなので有利である。
二重鎖DNA 結合たんぱく質を使用して一重鎖- 二重鎖転
化に関係するFPにおける増加を強化することができる。
一例として、二重鎖DNA 結合たんぱく質は制限エンドヌ
クレアーゼEcoRIであり、これはその天然の形において
これが結合しているDNA を切断するためにマグネシウム
を必要とする。マグネシウムがないと、 EcoRIは結合す
るが切断せず、これらの条件下で一重鎖- 二重鎖転化と
関係するFPにおける増加を強化する。第二の例として
は、DNA 結合たんぱく質は EcoRIの突然変異形、 EcoRI
(Gln111)であり、これはライト(Wright)らにより記載さ
れている(1989, J. Biol.Chem. 264, 11816-11821)。 E
coRI(Gln111)は二重鎖DNA へ天然 EcoRIよりしっかり結
合し、マグネシウムの存在下でさえ核酸を切断しない。
このたんぱく質の結合はまた、二重鎖形への転化を伴う
FPにおける増加を強化する。
【００１５】
【発明の詳細な記載】ストランド置換増幅標的発生およ
び増幅反応式を図１に示す。標的DNA を四つのプライマ
ー（B1、 B2 、S1および S2 ）の過剰の存在下に熱変性
する。S1および S2 は 3´末端に標的結合配列および標
的結合配列に対し5 ´の位置に制限エンドヌクレアーゼ
（たとえば、HincII- 5 ´GTTGAC) に対する識別部位を
含む増幅プライマーである。制限エンドヌクレアーゼ識
別部位は、一段高いボックスにより指定されている。簡
便性のために、以下の記載では例としてHincIIおよびエ
キソ- クレノウを使用するであろうが、しかしながらSD
A に使用することが知られている制限酵素およびエキソ
ヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼのいずれかで代えてもよ
い。
び増幅反応式を図１に示す。標的DNA を四つのプライマ
ー（B1、 B2 、S1および S2 ）の過剰の存在下に熱変性
する。S1および S2 は 3´末端に標的結合配列および標
的結合配列に対し5 ´の位置に制限エンドヌクレアーゼ
（たとえば、HincII- 5 ´GTTGAC) に対する識別部位を
含む増幅プライマーである。制限エンドヌクレアーゼ識
別部位は、一段高いボックスにより指定されている。簡
便性のために、以下の記載では例としてHincIIおよびエ
キソ- クレノウを使用するであろうが、しかしながらSD
A に使用することが知られている制限酵素およびエキソ
ヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼのいずれかで代えてもよ
い。
【００１６】S1および S2 は、側面に増幅されるべき領
域を有する二重鎖標的配列の反対の相補的ストランドに
ハイブリダイズする。B1および B2 は、標的結合配列だ
けからなり、S1および S2 に対して5 ´位でハイブリダ
イズする外部またはバンパープライマーである。約40℃
で標的へプライマーをアニール後、HincIIを大腸菌DNA
ポリメラーゼI のクレノウフラグメントのエキソヌクレ
アーゼ欠乏形( エキソ- クレノウ）とともに加える。こ
の時点で図１の左側における残りの標的発生工程は、一
回のカスケードとして進行する。標的配列の数を越える
多数のモルで存在するエキソ- クレノウは、 dGTP 、dC
TP、dUTP( またはTTP)およびdATPαS (デオキシアデノ
シン- 5 ′- [ α- チオ] トリホスフェート）を用いて
四つのプライマー全てを同時に延長する。S1および S2
は延長され、そしてこれらの延長生成物はB1および B2
の延長により置き換えられる。S1および S2 の置換され
た延長生成物(S1-ext およびS2-ext）は反対の増幅プラ
イマーの結合に対し標的として働く。さらに延長および
置換を一巡すると、各端部にヘミホスホロチオエートHi
ncII部位を有する二つの標的分画および一端部にのみヘ
ミホスホロチオエートHincIIを有するさらに長い二つの
標的分画が作られる（図１の左側下部）。ポリメラーゼ
により二つのストランドの一つにおいてdATPの代わりに
dATPαS を組み込むと、制限エンドヌクレアーゼが二重
らせん体の両方のストランドを開裂するよりむしろ一つ
のストランドにニックを入れる。“ ニッキング(Nickin
g) "とは二重鎖開裂と反対に二重鎖DNA の一つのスト
ランドを開裂することに関する。HincIIはヘミホスホロ
チオエートHincII識別部位の未修飾プライマーストラン
ドにニックを入れ、修飾された相補ストランドをそのま
まにする。次いでエキソ- クレノウはニックの3 ´末端
から延長し、新しく合成されたストランドの下流を置換
する。新規S1および S2 プライマーは置換されたストラ
ンドと結合し、延長される。これに続いて、図１の左側
下部での四つの二重らせん体が図１の右側に示す“ 定
常状態 "増幅サイクルへ集中するまでさらにニックおよ
びストランド置換工程を続ける。各SDA サイクルの間、
S1の3 ´末端が置換された標的ストランド T2 の3 ´末
端へハイブリダイズし、5 ´- 突出部を有する二重らせ
ん体を形成する。同様に、 S2 は置換された T1 と結合
する。エキソ- クレノウは、HincIIによりニックを入れ
られた二重らせん体製造ヘミホスホロチオエート識別部
位の奥まった3 ´末端を延長する。これらのニックおよ
び延長／置換工程は連続して循環する( 図１の右側にお
ける短くカーブしている矢印）。これはニックにおける
延長がニック可能なHincII識別部位を再度作ることがで
きるからである。S1- T2二重らせん体から置換されたス
トランドは T1 と同じである。同様に、S2 - T1 二重
らせん体からの置換ストランドはT2と同じである。した
がって、各置換されたT2は新規S1プライマーと結合し、
各置換された T1 は新規 S2 と結合するので、標的増幅
は指数関数的である（図１の右側に長くカーブした矢
印）。センスおよび抗センスストランドは細い線および
太い線により区別される。完全またはニックが入ったHi
ncII識別部位は、それぞれ一段高いボックスまたは反対
側の鎖の途切れ（┛┗）で表される。部分的HincII識別
部位（5 ′- GAC5 ′-GTC)は置換ストランドの5 ´末端
および3 ´末端に存在し、それぞれ（┗）および（┛）
で表される。
域を有する二重鎖標的配列の反対の相補的ストランドに
ハイブリダイズする。B1および B2 は、標的結合配列だ
けからなり、S1および S2 に対して5 ´位でハイブリダ
イズする外部またはバンパープライマーである。約40℃
で標的へプライマーをアニール後、HincIIを大腸菌DNA
ポリメラーゼI のクレノウフラグメントのエキソヌクレ
アーゼ欠乏形( エキソ- クレノウ）とともに加える。こ
の時点で図１の左側における残りの標的発生工程は、一
回のカスケードとして進行する。標的配列の数を越える
多数のモルで存在するエキソ- クレノウは、 dGTP 、dC
TP、dUTP( またはTTP)およびdATPαS (デオキシアデノ
シン- 5 ′- [ α- チオ] トリホスフェート）を用いて
四つのプライマー全てを同時に延長する。S1および S2
は延長され、そしてこれらの延長生成物はB1および B2
の延長により置き換えられる。S1および S2 の置換され
た延長生成物(S1-ext およびS2-ext）は反対の増幅プラ
イマーの結合に対し標的として働く。さらに延長および
置換を一巡すると、各端部にヘミホスホロチオエートHi
ncII部位を有する二つの標的分画および一端部にのみヘ
ミホスホロチオエートHincIIを有するさらに長い二つの
標的分画が作られる（図１の左側下部）。ポリメラーゼ
により二つのストランドの一つにおいてdATPの代わりに
dATPαS を組み込むと、制限エンドヌクレアーゼが二重
らせん体の両方のストランドを開裂するよりむしろ一つ
のストランドにニックを入れる。“ ニッキング(Nickin
g) "とは二重鎖開裂と反対に二重鎖DNA の一つのスト
ランドを開裂することに関する。HincIIはヘミホスホロ
チオエートHincII識別部位の未修飾プライマーストラン
ドにニックを入れ、修飾された相補ストランドをそのま
まにする。次いでエキソ- クレノウはニックの3 ´末端
から延長し、新しく合成されたストランドの下流を置換
する。新規S1および S2 プライマーは置換されたストラ
ンドと結合し、延長される。これに続いて、図１の左側
下部での四つの二重らせん体が図１の右側に示す“ 定
常状態 "増幅サイクルへ集中するまでさらにニックおよ
びストランド置換工程を続ける。各SDA サイクルの間、
S1の3 ´末端が置換された標的ストランド T2 の3 ´末
端へハイブリダイズし、5 ´- 突出部を有する二重らせ
ん体を形成する。同様に、 S2 は置換された T1 と結合
する。エキソ- クレノウは、HincIIによりニックを入れ
られた二重らせん体製造ヘミホスホロチオエート識別部
位の奥まった3 ´末端を延長する。これらのニックおよ
び延長／置換工程は連続して循環する( 図１の右側にお
ける短くカーブしている矢印）。これはニックにおける
延長がニック可能なHincII識別部位を再度作ることがで
きるからである。S1- T2二重らせん体から置換されたス
トランドは T1 と同じである。同様に、S2 - T1 二重
らせん体からの置換ストランドはT2と同じである。した
がって、各置換されたT2は新規S1プライマーと結合し、
各置換された T1 は新規 S2 と結合するので、標的増幅
は指数関数的である（図１の右側に長くカーブした矢
印）。センスおよび抗センスストランドは細い線および
太い線により区別される。完全またはニックが入ったHi
ncII識別部位は、それぞれ一段高いボックスまたは反対
側の鎖の途切れ（┛┗）で表される。部分的HincII識別
部位（5 ′- GAC5 ′-GTC)は置換ストランドの5 ´末端
および3 ´末端に存在し、それぞれ（┗）および（┛）
で表される。
【００１７】本発明増幅検出システムにおいて、蛍光標
識物を含む一重鎖オリゴヌクレオチド検出プローブをSD
A の間に標的依存法で二重鎖形へ転化する( 図２のＡお
よびＢ）。図２のＡおよびＢは同じ方法を説明するが、
しかしＡでは検出プローブの全ヌクレオチド配列は標的
配列と相補的であり、Bでは検出プローブのヌクレオチ
ドの一部は標的配列と相補的でない。以下に検討するよ
うに、検出プローブの非相補的部分はDNA 結合たんぱく
質に対する識別部位を含むかまたはFPが増加する結果と
なる構造的特徴である。図２Ｂにおいて、非相補的配列
または構造的特徴は黒い半円として示される。図２のＡ
およびＢの両方において、蛍光標識物は、太陽のような
記号で示される。
識物を含む一重鎖オリゴヌクレオチド検出プローブをSD
A の間に標的依存法で二重鎖形へ転化する( 図２のＡお
よびＢ）。図２のＡおよびＢは同じ方法を説明するが、
しかしＡでは検出プローブの全ヌクレオチド配列は標的
配列と相補的であり、Bでは検出プローブのヌクレオチ
ドの一部は標的配列と相補的でない。以下に検討するよ
うに、検出プローブの非相補的部分はDNA 結合たんぱく
質に対する識別部位を含むかまたはFPが増加する結果と
なる構造的特徴である。図２Ｂにおいて、非相補的配列
または構造的特徴は黒い半円として示される。図２のＡ
およびＢの両方において、蛍光標識物は、太陽のような
記号で示される。
【００１８】構造についての以下の言及は図２のＡおよ
びBの両方に関係する。増幅のFP検出のための蛍光検出
プローブのハイブリダイズ、延長および置換は、図１の
右側に示すSDA サイクルと同時に発生する。蛍光検出プ
ローブ(D) は二重鎖標的配列の二本の相補的ストランド
の一つまたはSDA プライマーの一つ( たとえば、S1）か
らの下流標的ストランドの置換された一重鎖コピーとハ
イブリダイズする。これは二重鎖検出プローブ( 構造式
I)の一つの供給源を提供する。増幅プライマー／標識複
合体は図１の右側に示したSDA サイクルの左上部に示す
複合体と同一であるが、図１ではこれは検出プローブを
持たずに描かれている。構造式I におけるプライマーお
よび検出プローブを次いでエキソ- クレノウポリメラー
ゼ（構造式II）により同時に延長し、その結果SDA に固
有のストランド置換反応と類似の方法で上流増幅プライ
マーS1の延長により検出プローブ延長生成物（構造式II
I)が置換される。置換された、一重鎖プローブ延長生成
物（構造式III)をもう一つのSDA プライマー（ S2 ）と
ハイブリダイズして複合体（構造式IV) を形成し、これ
はエキソ- クレノウポリメラーゼ延長により完全に二重
鎖となり、ここでも二重鎖蛍光検出プローブ（構造式V)
の供給源を提供する。構造式V は S2 におけるニック性
HincII部位のために線状SDA に対する鋳型である。鋳型
とし構造式Vを用いてニック、ポリメラーゼ延長および
ストランド置換すると、さらに蛍光検出プローブをハイ
ブリダイズした一重鎖( 構造式VI) が作られ、これを延
長すると構造式VII が生じる。構造式I 、構造式II、構
造式V および構造式VII は、標的特異的SDA を示す二重
鎖蛍光検出プローブの全ての形である。これらの構造の
各々は、標的物に依存する方法で一重鎖蛍光検出プロー
ブの二重鎖転化に関係するFPにおける増加に関与する。
図２のＢはどうやってこの同じ方法がまたDNA 結合たん
ぱく質識別部位または構造的特徴の二重鎖形（構造式V,
VIおよびVII)への転化となるかを示す。これらの構造式
は次いで二重鎖DNA 結合たんぱく質を結合し、検出プロ
ーブの二重鎖化に関係するFPの増加を強化する。
びBの両方に関係する。増幅のFP検出のための蛍光検出
プローブのハイブリダイズ、延長および置換は、図１の
右側に示すSDA サイクルと同時に発生する。蛍光検出プ
ローブ(D) は二重鎖標的配列の二本の相補的ストランド
の一つまたはSDA プライマーの一つ( たとえば、S1）か
らの下流標的ストランドの置換された一重鎖コピーとハ
イブリダイズする。これは二重鎖検出プローブ( 構造式
I)の一つの供給源を提供する。増幅プライマー／標識複
合体は図１の右側に示したSDA サイクルの左上部に示す
複合体と同一であるが、図１ではこれは検出プローブを
持たずに描かれている。構造式I におけるプライマーお
よび検出プローブを次いでエキソ- クレノウポリメラー
ゼ（構造式II）により同時に延長し、その結果SDA に固
有のストランド置換反応と類似の方法で上流増幅プライ
マーS1の延長により検出プローブ延長生成物（構造式II
I)が置換される。置換された、一重鎖プローブ延長生成
物（構造式III)をもう一つのSDA プライマー（ S2 ）と
ハイブリダイズして複合体（構造式IV) を形成し、これ
はエキソ- クレノウポリメラーゼ延長により完全に二重
鎖となり、ここでも二重鎖蛍光検出プローブ（構造式V)
の供給源を提供する。構造式V は S2 におけるニック性
HincII部位のために線状SDA に対する鋳型である。鋳型
とし構造式Vを用いてニック、ポリメラーゼ延長および
ストランド置換すると、さらに蛍光検出プローブをハイ
ブリダイズした一重鎖( 構造式VI) が作られ、これを延
長すると構造式VII が生じる。構造式I 、構造式II、構
造式V および構造式VII は、標的特異的SDA を示す二重
鎖蛍光検出プローブの全ての形である。これらの構造の
各々は、標的物に依存する方法で一重鎖蛍光検出プロー
ブの二重鎖転化に関係するFPにおける増加に関与する。
図２のＢはどうやってこの同じ方法がまたDNA 結合たん
ぱく質識別部位または構造的特徴の二重鎖形（構造式V,
VIおよびVII)への転化となるかを示す。これらの構造式
は次いで二重鎖DNA 結合たんぱく質を結合し、検出プロ
ーブの二重鎖化に関係するFPの増加を強化する。
【００１９】特定の二重鎖DNA 配列と結合するたんぱく
質のいずれかを使用して検出プローブの二重鎖形への転
化に関係するFPの増加を強化することもできる。これ
は、蛍光標識物の付着部位付近の位置の検出プローブの
ヌクレオチド配列において二重鎖DNA 結合たんぱく質に
対し好適な識別部位のヌクレオチド配列を含むことによ
り行われる。制限エンドヌクレアーゼ（たとえば、 Eco
RIおよび EcoRIの突然変異体）に対する識別部位はこの
目的に有用である。さらに、Trp リプレッサーたんぱく
質に対する識別部位（すなわち、Trp リプレッサーオペ
レーター配列）またはエストロゲンレセプターたんぱく
質のDNA 結合領域に対する識別配列（すなわち、エスト
ロゲン対応要素配列）が検出プローブの配列中に含ま
れ、Trp リプレッサーまたはエストロゲンレセプターと
結合時にFPの増加を強化することもある。また、FPの変
化は、その結果二重鎖DNA の回転をさらにゆっくりにさ
せる構造的特徴となるヌクレオチド配列、たとえば二重
鎖形において第三のオリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ズして三重らせん体構造を形成することのできる第三の
オリゴヌクレオチドに対する識別部位を含む検出プロー
ブを考案することにより強化される。
質のいずれかを使用して検出プローブの二重鎖形への転
化に関係するFPの増加を強化することもできる。これ
は、蛍光標識物の付着部位付近の位置の検出プローブの
ヌクレオチド配列において二重鎖DNA 結合たんぱく質に
対し好適な識別部位のヌクレオチド配列を含むことによ
り行われる。制限エンドヌクレアーゼ（たとえば、 Eco
RIおよび EcoRIの突然変異体）に対する識別部位はこの
目的に有用である。さらに、Trp リプレッサーたんぱく
質に対する識別部位（すなわち、Trp リプレッサーオペ
レーター配列）またはエストロゲンレセプターたんぱく
質のDNA 結合領域に対する識別配列（すなわち、エスト
ロゲン対応要素配列）が検出プローブの配列中に含ま
れ、Trp リプレッサーまたはエストロゲンレセプターと
結合時にFPの増加を強化することもある。また、FPの変
化は、その結果二重鎖DNA の回転をさらにゆっくりにさ
せる構造的特徴となるヌクレオチド配列、たとえば二重
鎖形において第三のオリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ズして三重らせん体構造を形成することのできる第三の
オリゴヌクレオチドに対する識別部位を含む検出プロー
ブを考案することにより強化される。
【００２０】前記に例示したように、検出プローブが蛍
光標識物を有することは本発明の必要なことではない。
本発明のある種の実施態様において検出プローブを標識
化しないことは当業者にとって明らかであろう。すなわ
ち、もし二重鎖DNA 結合たんぱく質が一重鎖- および二
重鎖形の間でFPにおける差の規模を増加するように含ま
れる場合、蛍光標識物は検出プローブより二重鎖DNA 結
合たんぱく質と連結するであろう。同様に、三重らせん
体の形成を用いてFPにおける変化の規模を増加する場
合、蛍光標識物を、非標識化検出プローブを含む二重鎖
構造にハイブリダイゼーションする第三のオリゴヌクレ
オチドと連結してもよい。この実施態様において、増幅
反応において非標識化検出プローブが存在する結果、標
識物に依存する方法で構造体V,VIおよびVII （図２のＢ
の) の非標識化の形となる。これらの構造体が二重鎖DN
A 結合たんぱく質または三重らせん体形成オリゴヌクレ
オチドのための二重鎖識別部位を含むので、二重鎖検出
プローブ構造体に対する蛍光標識化たんぱく質またはオ
リゴヌクレオチドの特異的結合がFPにおける変化規模を
増加し、FPによる検出に必要な蛍光標識物を提供する。
より小さな二重鎖DNA結合剤がFPの変化においてより大
きな効果を有するので、三重らせん体形成は多くのケー
スでたんぱく質結合より高い感受性検出システムである
ようである。
光標識物を有することは本発明の必要なことではない。
本発明のある種の実施態様において検出プローブを標識
化しないことは当業者にとって明らかであろう。すなわ
ち、もし二重鎖DNA 結合たんぱく質が一重鎖- および二
重鎖形の間でFPにおける差の規模を増加するように含ま
れる場合、蛍光標識物は検出プローブより二重鎖DNA 結
合たんぱく質と連結するであろう。同様に、三重らせん
体の形成を用いてFPにおける変化の規模を増加する場
合、蛍光標識物を、非標識化検出プローブを含む二重鎖
構造にハイブリダイゼーションする第三のオリゴヌクレ
オチドと連結してもよい。この実施態様において、増幅
反応において非標識化検出プローブが存在する結果、標
識物に依存する方法で構造体V,VIおよびVII （図２のＢ
の) の非標識化の形となる。これらの構造体が二重鎖DN
A 結合たんぱく質または三重らせん体形成オリゴヌクレ
オチドのための二重鎖識別部位を含むので、二重鎖検出
プローブ構造体に対する蛍光標識化たんぱく質またはオ
リゴヌクレオチドの特異的結合がFPにおける変化規模を
増加し、FPによる検出に必要な蛍光標識物を提供する。
より小さな二重鎖DNA結合剤がFPの変化においてより大
きな効果を有するので、三重らせん体形成は多くのケー
スでたんぱく質結合より高い感受性検出システムである
ようである。
【００２１】図２のＡ、Ｂおよび本発明のこれまでの記
載は例としてSDA を使用しているが、しかしながら本発
明はまたストランド置換ポリメラーゼを使用するかまた
は5′-3′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラー
ゼに対し置換されうる増幅方法のいずれにも適用可能で
ある。消化することなくDNA の下流ストランドを置換す
ることができるポリメラーゼの能力は、二重鎖蛍光検出
プローブの標識- 特異的発生を提供する増幅法の本質的
特徴である。このような増幅法の他の特徴、たとえば標
識配列の性質および増幅プライマーの構造的特徴は本発
明にとって重要ではない。本発明方法はしたがって、検
出方法が標的配列がRNA またはDNA であるかどうかに依
存するので、SDA 以外の等温増幅反応、たとえば自己支
持配列複製(Self-Sustained Sequence Replication(SS
R)) にも使用される。3SR において、二重鎖検出プロー
ブの標的依存性発生は一般に、SDA についての図２のＡ
およびＢに説明されているように生じる。T7 RNAポリメ
ラーゼは5 ′- 3 ′エキソヌクレアーゼ活性を欠く。逆
転写酵素の分解活性は、DNA へハイブリダイズされるRN
A においてのみ活性であるRNA アーゼ活性である。ガテ
リ(Guatelli)ら(1990, 87, 1874 -1878,図１参照）の3S
R 増幅反応式において、本発明の検出プローブはRNA標
的配列とハイブリダイズし、3 ′増幅プライマー“ A
"の延長により置換される。検出プローブはまた3SR 増
幅法において生じたDNA 標識配列へハイブリダイズす
る。いずれの場合も、延長された検出プローブは上流3
′( “ A"）または5 ′（“ B "）増幅プライマーが
延長される場合、ポリメラーゼにより置換される。次い
で、反対の増幅プライマーを検出プローブ延長生成物と
結合し延長し、蛍光標識化検出プローブを二重鎖形へ転
化する。T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含む検
出プローブ延長生成物は3SR により増幅可能であり検出
プローブの追加のコピーの供給源を提供する。
載は例としてSDA を使用しているが、しかしながら本発
明はまたストランド置換ポリメラーゼを使用するかまた
は5′-3′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラー
ゼに対し置換されうる増幅方法のいずれにも適用可能で
ある。消化することなくDNA の下流ストランドを置換す
ることができるポリメラーゼの能力は、二重鎖蛍光検出
プローブの標識- 特異的発生を提供する増幅法の本質的
特徴である。このような増幅法の他の特徴、たとえば標
識配列の性質および増幅プライマーの構造的特徴は本発
明にとって重要ではない。本発明方法はしたがって、検
出方法が標的配列がRNA またはDNA であるかどうかに依
存するので、SDA 以外の等温増幅反応、たとえば自己支
持配列複製(Self-Sustained Sequence Replication(SS
R)) にも使用される。3SR において、二重鎖検出プロー
ブの標的依存性発生は一般に、SDA についての図２のＡ
およびＢに説明されているように生じる。T7 RNAポリメ
ラーゼは5 ′- 3 ′エキソヌクレアーゼ活性を欠く。逆
転写酵素の分解活性は、DNA へハイブリダイズされるRN
A においてのみ活性であるRNA アーゼ活性である。ガテ
リ(Guatelli)ら(1990, 87, 1874 -1878,図１参照）の3S
R 増幅反応式において、本発明の検出プローブはRNA標
的配列とハイブリダイズし、3 ′増幅プライマー“ A
"の延長により置換される。検出プローブはまた3SR 増
幅法において生じたDNA 標識配列へハイブリダイズす
る。いずれの場合も、延長された検出プローブは上流3
′( “ A"）または5 ′（“ B "）増幅プライマーが
延長される場合、ポリメラーゼにより置換される。次い
で、反対の増幅プライマーを検出プローブ延長生成物と
結合し延長し、蛍光標識化検出プローブを二重鎖形へ転
化する。T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含む検
出プローブ延長生成物は3SR により増幅可能であり検出
プローブの追加のコピーの供給源を提供する。
【００２２】増幅の“ 即時 "モニターのための増幅サ
イクルの低温期間の間に蛍光偏光測定を行わなければな
らないとはいえ、本発明方法をポリメラーゼ鎖反応(PC
R) のモニターへ利用することもできる。ここでも、二
重鎖検出プローブの標的依存性発生についてのメカニズ
ムは一般に図２Ａおよび２Ｂに示すようである。5 ′-3
′エキソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼ（たとえば、
エキソ- クレノウ、BcaポリメラーゼまたはBst ポリメ
ラーゼ）を用いると、標的配列へハイブリダイズされた
PCR 増幅プライマーの延長は、延長された下流検出プロ
ーブを置換する。反対のPCR 増幅プライマーは検出プロ
ーブの延長生成物とハイブリダイズして延長され、その
結果一重鎖検出プローブが二重鎖形へ転化することにな
る。二重鎖検出プローブは次のサイクルにおいて一つの
増幅プライマーと一つの検出プローブのハイブリダイズ
および延長により増幅可能であり、二重鎖検出プローブ
の別の供給源を提供する。蛍光偏光または蛍光異方性の
増加を増幅生成物は二重鎖のままであるという条件下に
PCR 終結後または閉環プロトコールの低温点でPCR の間
に検出されうる。
イクルの低温期間の間に蛍光偏光測定を行わなければな
らないとはいえ、本発明方法をポリメラーゼ鎖反応(PC
R) のモニターへ利用することもできる。ここでも、二
重鎖検出プローブの標的依存性発生についてのメカニズ
ムは一般に図２Ａおよび２Ｂに示すようである。5 ′-3
′エキソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼ（たとえば、
エキソ- クレノウ、BcaポリメラーゼまたはBst ポリメ
ラーゼ）を用いると、標的配列へハイブリダイズされた
PCR 増幅プライマーの延長は、延長された下流検出プロ
ーブを置換する。反対のPCR 増幅プライマーは検出プロ
ーブの延長生成物とハイブリダイズして延長され、その
結果一重鎖検出プローブが二重鎖形へ転化することにな
る。二重鎖検出プローブは次のサイクルにおいて一つの
増幅プライマーと一つの検出プローブのハイブリダイズ
および延長により増幅可能であり、二重鎖検出プローブ
の別の供給源を提供する。蛍光偏光または蛍光異方性の
増加を増幅生成物は二重鎖のままであるという条件下に
PCR 終結後または閉環プロトコールの低温点でPCR の間
に検出されうる。
【００２３】検出プローブの一重鎖- 二重鎖転化は蛍光
偏光または蛍光異方性を測定することによりモニターさ
れる。プローブ形状（主にストランド化）の変化に伴う
排除容量が変化する結果、蛍光標識物に対する相関時間
（回転時間）が検出可能に増加することとなる。FP値に
おける同時に生じる変化は、選択された蛍光標識物の検
出のためにデザインされた遷移状態蛍光計（たとえばダ
イアトロン社製）または定常状態蛍光計（たとえば、ジ
ョリーインスツルメンツ）においてモニターされうる。
偏光測定は、これまで行われていたように、増幅後に行
われるが、本発明方法はまた最初に標的配列増幅の間に
蛍光偏光を“ 即時 "モニターすることができる。蛍光
の即時モニターは先行技術のもの以上に重要な利点をも
たらす。すなわち、これは実質的に即時の結果をもたら
し、これは定量的であり、感度が向上し（傾斜の変化を
分析することは一つの終点分析より正確である）、そし
てサンプルはそれ自体の内部標準として作用する。この
最後の利点は、サンプル粘度が終点読み取りにかなり影
響するので、臨床標本の分析にとって特に重要である。
偏光または蛍光異方性を測定することによりモニターさ
れる。プローブ形状（主にストランド化）の変化に伴う
排除容量が変化する結果、蛍光標識物に対する相関時間
（回転時間）が検出可能に増加することとなる。FP値に
おける同時に生じる変化は、選択された蛍光標識物の検
出のためにデザインされた遷移状態蛍光計（たとえばダ
イアトロン社製）または定常状態蛍光計（たとえば、ジ
ョリーインスツルメンツ）においてモニターされうる。
偏光測定は、これまで行われていたように、増幅後に行
われるが、本発明方法はまた最初に標的配列増幅の間に
蛍光偏光を“ 即時 "モニターすることができる。蛍光
の即時モニターは先行技術のもの以上に重要な利点をも
たらす。すなわち、これは実質的に即時の結果をもたら
し、これは定量的であり、感度が向上し（傾斜の変化を
分析することは一つの終点分析より正確である）、そし
てサンプルはそれ自体の内部標準として作用する。この
最後の利点は、サンプル粘度が終点読み取りにかなり影
響するので、臨床標本の分析にとって特に重要である。
【００２４】ハイブリダイズおよび非ハイブリダイズ
（すなわち、二重鎖および一重鎖）プローブは測定前に
分離しないので、標識物増幅のFPに基づく検出は一重鎖
蛍光検出プローブ二重鎖形へ明らかに転化することが必
要である。それゆえ、低い検出プローブ濃度は、これら
が標的増幅の与えられたレベルについて転化された検出
プローブのより高い割合を得る結果となるので高感度を
促進する（すなわち、最初は低い濃度の標的配列の増幅
検出）。しかしながら、低い検出プローブ濃度はSDA に
対し反応速度の挑戦(kinetic challenge) を提供する。
蛍光検出プローブは上流の増幅プライマー（S1）のハイ
ブリダイゼーションおよび延長の前に置換された標的ス
トランドへハイブリダイズされなければならない。S1延
長の反応速度は、S1ハイブリダイゼーションおよびポリ
メラーゼ結合割合により調節される。それゆえ、標識物
濃度が低い場合、S1延長の割合を減らし、蛍光検出プロ
ーブの予備ハイブリダイゼーションを促進するために通
常のSDA 反応条件（ウォーカーら、1992 ,Proc. Natl.A
cad. Sci. and Nucl. Acids Res., 前掲；ウォーカー、
1993, PCR Methods andApplications, 3, 1-6 )を変更
することが有用な場合もある。これはS1およびポリメラ
ーゼの濃度をそれぞれ10 nM - 1 μM および0.1-10単位
に調節することにより達成されうる。S1およびポリメラ
ーゼ濃度を低くするとSDA 割合が低くなる結果となり、
このため一般的SDA 反応時間を2-3 時間に延長すること
が必要であろう。感度が重要でない場合または比較的高
い標的物の初期濃度の定量化に対しては、蛍光検出プロ
ーブ濃度は増幅プライマーの濃度と同じくらい高い。
（すなわち、二重鎖および一重鎖）プローブは測定前に
分離しないので、標識物増幅のFPに基づく検出は一重鎖
蛍光検出プローブ二重鎖形へ明らかに転化することが必
要である。それゆえ、低い検出プローブ濃度は、これら
が標的増幅の与えられたレベルについて転化された検出
プローブのより高い割合を得る結果となるので高感度を
促進する（すなわち、最初は低い濃度の標的配列の増幅
検出）。しかしながら、低い検出プローブ濃度はSDA に
対し反応速度の挑戦(kinetic challenge) を提供する。
蛍光検出プローブは上流の増幅プライマー（S1）のハイ
ブリダイゼーションおよび延長の前に置換された標的ス
トランドへハイブリダイズされなければならない。S1延
長の反応速度は、S1ハイブリダイゼーションおよびポリ
メラーゼ結合割合により調節される。それゆえ、標識物
濃度が低い場合、S1延長の割合を減らし、蛍光検出プロ
ーブの予備ハイブリダイゼーションを促進するために通
常のSDA 反応条件（ウォーカーら、1992 ,Proc. Natl.A
cad. Sci. and Nucl. Acids Res., 前掲；ウォーカー、
1993, PCR Methods andApplications, 3, 1-6 )を変更
することが有用な場合もある。これはS1およびポリメラ
ーゼの濃度をそれぞれ10 nM - 1 μM および0.1-10単位
に調節することにより達成されうる。S1およびポリメラ
ーゼ濃度を低くするとSDA 割合が低くなる結果となり、
このため一般的SDA 反応時間を2-3 時間に延長すること
が必要であろう。感度が重要でない場合または比較的高
い標的物の初期濃度の定量化に対しては、蛍光検出プロ
ーブ濃度は増幅プライマーの濃度と同じくらい高い。
【００２５】上記のように、非標識化検出プローブの使
用は、蛍光標識化プローブの濃度を、たとえば向上した
感度のために低く維持することを望む場合でさえ、増幅
反応において用いられS1の迅速な延長を可能にする。こ
の実施態様において、検出プローブは蛍光的に標識化さ
れないばかりでなく、その5 ´末端付近に、二重鎖形
で、蛍光標識化された第三のオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズして三重らせん体を形成することのできる配
列を含む。非標識化検出プローブの二重鎖形への転化
（図２Ｂ- 構造式V,VIおよびVII の反応式に従う）は、
関係するFPの増加の検出のために、蛍光標識化された第
三のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズを可能にす
る。非標識化検出プローブはS1に匹敵する濃度で増幅反
応において存在することができ、これにより反応速度は
向上しそして構造式V,VIまたはVII への転化率がより迅
速になる。一旦これらの標的特異的二重鎖構造体が増幅
の間に形成されると、蛍光標識化された第三のオリゴヌ
クレオチドプローブはハイブリダイズし、FPの増加を強
化し特異的検出のために蛍光標識物を提供する。その蛍
光標識物を有する第三のオリゴヌクレオチドは必要とす
る感度に応じて高いかまたは低い濃度で存在し、二重鎖
検出プローブ生成物の生成効率を妨害しない。さらに、
この実施態様において、標識物が検出プローブと連結す
ることを望まれていない形状の場合、蛍光標識物が所望
により第三のオリゴヌクレオチドの3 ´末端と結合して
もよい。
用は、蛍光標識化プローブの濃度を、たとえば向上した
感度のために低く維持することを望む場合でさえ、増幅
反応において用いられS1の迅速な延長を可能にする。こ
の実施態様において、検出プローブは蛍光的に標識化さ
れないばかりでなく、その5 ´末端付近に、二重鎖形
で、蛍光標識化された第三のオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズして三重らせん体を形成することのできる配
列を含む。非標識化検出プローブの二重鎖形への転化
（図２Ｂ- 構造式V,VIおよびVII の反応式に従う）は、
関係するFPの増加の検出のために、蛍光標識化された第
三のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズを可能にす
る。非標識化検出プローブはS1に匹敵する濃度で増幅反
応において存在することができ、これにより反応速度は
向上しそして構造式V,VIまたはVII への転化率がより迅
速になる。一旦これらの標的特異的二重鎖構造体が増幅
の間に形成されると、蛍光標識化された第三のオリゴヌ
クレオチドプローブはハイブリダイズし、FPの増加を強
化し特異的検出のために蛍光標識物を提供する。その蛍
光標識物を有する第三のオリゴヌクレオチドは必要とす
る感度に応じて高いかまたは低い濃度で存在し、二重鎖
検出プローブ生成物の生成効率を妨害しない。さらに、
この実施態様において、標識物が検出プローブと連結す
ることを望まれていない形状の場合、蛍光標識物が所望
により第三のオリゴヌクレオチドの3 ´末端と結合して
もよい。
【００２６】図２のＡおよびＢに示す方法は、増幅反応
を妨害することなく、図１に表すSDAサイクルと同時に
生じる。検出プローブおよび増幅プライマーによる誤っ
たプライミングがニック可能なHincII部位一つだけの存
在（すなわち、蛍光検出プローブはニック可能なHincII
部位を含まない）のために指数関数的に増幅することが
できない延長生成物を発生させるので、蛍光検出プロー
ブの存在はSDA のバックグラウント反応を強化しない。
SDA は指数関数的増幅を支えるために、各々ニック可能
なHincII部位を含む二つのプライマーを必要とする。こ
のことは、いずれかの配列とハイブリダイゼーションし
延長されうるいずれかのオリゴヌクレオチドが増幅プラ
イマーとして働き、誤ってプライミングされた生成物を
指数関数的に増幅するポリメラーゼ鎖反応(Polymerase
Chain Reaction) と対照的である。SDA におけるバック
グラウント増幅は蛍光検出プローブを低濃度で使用する
場合（たとえば、50 pM - 10 nM)さらに減少する。
を妨害することなく、図１に表すSDAサイクルと同時に
生じる。検出プローブおよび増幅プライマーによる誤っ
たプライミングがニック可能なHincII部位一つだけの存
在（すなわち、蛍光検出プローブはニック可能なHincII
部位を含まない）のために指数関数的に増幅することが
できない延長生成物を発生させるので、蛍光検出プロー
ブの存在はSDA のバックグラウント反応を強化しない。
SDA は指数関数的増幅を支えるために、各々ニック可能
なHincII部位を含む二つのプライマーを必要とする。こ
のことは、いずれかの配列とハイブリダイゼーションし
延長されうるいずれかのオリゴヌクレオチドが増幅プラ
イマーとして働き、誤ってプライミングされた生成物を
指数関数的に増幅するポリメラーゼ鎖反応(Polymerase
Chain Reaction) と対照的である。SDA におけるバック
グラウント増幅は蛍光検出プローブを低濃度で使用する
場合（たとえば、50 pM - 10 nM)さらに減少する。
【００２７】本発明方法に、核酸を標識化するための当
該技術で公知のいずれの蛍光分子を使用してもよい（フ
ルオレセインおよびフルオレセイン誘導体たとえば、エ
オシン；ローダミンたとえばテキサスレッドおよびテト
ラメチルローダミン；シアニン染料たとえばチアゾール
オレンジ、オキサゾールイエローおよび米国特許第 4,9
57,870号および同第4,888,867 号に記載の類似染料；ピ
レン；ポルフィリン染料たとえば La Jolla ブルー）。
蛍光標識物は、標識物の蛍光寿命が蛍光染料を結合する
オリゴヌクレオチドの温度、粘度およびサイズすべてが
回転時間に影響を与えることを考慮した上で、測定する
相関時間と規模的に匹敵するように選択されるべきであ
る。たとえば、フルオレセイン（寿命ほぼ4 ナノ秒）お
よび LaJolla ブルー（寿命ほぼ2 ナノ秒）は両方とも
相関時間約0.1-100 ナノ秒の間に有用である。核酸結合
たんぱく質を蛍光標識物と結合するのに使用する場合、
測定される相関時間は一般に増加する。たとえば、遊離
フルオレセイン標識物の相関時間は約0.2 ナノ秒であ
る。蛍光標識物を一重鎖オリゴヌクレオチドと結合する
と相関時間は約0.4 ナノ秒まで増加し、二重鎖オリゴヌ
クレオチドと結合すると約2 ナノ秒までさらに増加す
る。 EcoRIと蛍光標識化二重鎖オリゴヌクレオチドを結
合することによりFPを強化すると、相関時間はまた約20
ナノ秒まで増加する。 La Jolla ブルー（デブリンら、
1993.Clin.Chem. 39, 1939-1943)は特に、生物学的サン
プルを増幅する場合、この染料は、臨床標本とともに比
較的低いバックグラウンド蛍光の領域である近- 赤外線
スペクトルで光を吸収しそして発光する（それぞれ、ピ
ーク最大約685 nmおよび705 nm）ので、蛍光検出プロー
ブを標識化するのに適する。
該技術で公知のいずれの蛍光分子を使用してもよい（フ
ルオレセインおよびフルオレセイン誘導体たとえば、エ
オシン；ローダミンたとえばテキサスレッドおよびテト
ラメチルローダミン；シアニン染料たとえばチアゾール
オレンジ、オキサゾールイエローおよび米国特許第 4,9
57,870号および同第4,888,867 号に記載の類似染料；ピ
レン；ポルフィリン染料たとえば La Jolla ブルー）。
蛍光標識物は、標識物の蛍光寿命が蛍光染料を結合する
オリゴヌクレオチドの温度、粘度およびサイズすべてが
回転時間に影響を与えることを考慮した上で、測定する
相関時間と規模的に匹敵するように選択されるべきであ
る。たとえば、フルオレセイン（寿命ほぼ4 ナノ秒）お
よび LaJolla ブルー（寿命ほぼ2 ナノ秒）は両方とも
相関時間約0.1-100 ナノ秒の間に有用である。核酸結合
たんぱく質を蛍光標識物と結合するのに使用する場合、
測定される相関時間は一般に増加する。たとえば、遊離
フルオレセイン標識物の相関時間は約0.2 ナノ秒であ
る。蛍光標識物を一重鎖オリゴヌクレオチドと結合する
と相関時間は約0.4 ナノ秒まで増加し、二重鎖オリゴヌ
クレオチドと結合すると約2 ナノ秒までさらに増加す
る。 EcoRIと蛍光標識化二重鎖オリゴヌクレオチドを結
合することによりFPを強化すると、相関時間はまた約20
ナノ秒まで増加する。 La Jolla ブルー（デブリンら、
1993.Clin.Chem. 39, 1939-1943)は特に、生物学的サン
プルを増幅する場合、この染料は、臨床標本とともに比
較的低いバックグラウンド蛍光の領域である近- 赤外線
スペクトルで光を吸収しそして発光する（それぞれ、ピ
ーク最大約685 nmおよび705 nm）ので、蛍光検出プロー
ブを標識化するのに適する。
【００２８】バックグラウンド蛍光はさらに定常状態蛍
光分光分析法よりむしろ遷移状態蛍光分光分析法を使用
することによりさらに最小化され、これにより光散乱の
関与を減少する。バックグラウンド蛍光を少なくすると
蛍光標識化検出プローブの濃度を低くすることができ、
これは、増幅した生成物の与えられた濃度に対し一重鎖
検出プローブのより高い割合を二重鎖形へ転化すること
を確実にすることにより検出感度を向上させる。しかし
ながら、検出プローブ濃度が低いと増幅した生成物レベ
ルの広い範囲にわたって検出プローブが飽和する結果と
なる。SDA 完了後にプローブが飽和している状態で行わ
れるFPの終点測定は、初期標的物レベルに関して厳密に
定量的ではないかもしれない。増幅反応が完了した後と
いうよりSDA の間に“ 即時 "FP測定することは、標的
物レベルがより高いサンプルが標的の少ないサンプルよ
りもより迅速にFPの増加を示すので検出プローブ飽和の
問題を克服する。勿論、FP増加の割合と初期標的物レベ
ルの間の相関関係は増幅の割合がほとんど同じであるサ
ンプルと比較した場合のみ妥当である。ここでも、臨床
標本について、その各々は異なったレベルのSDA 阻害剤
を含み、検定は厳密には定量的でないかもしれない。た
とえば、高い初期標的物の量を含みそして不十分なSDA
が行われたサンプルと低い初期標的物量を含むが高い割
合でSDA が行われていたサンプルを区別するのは難しい
かもしれない。それにもかかわらず、SDA の間にFPを即
時モニターすることは少なくとも初期標的物レベルの半
- 定量的評価をもたらす。定量化は、陽性対照物として
公知初期濃度の別の標的配列を含むことにより向上する
（ ウォーカーら、1994 ,Nucl. Acids Res.,22, 2670-
2677) 。陽性対照標的物はサンプル（すなわち、誤った
陰性に対する対照物）に対する一般的SDA 性能の指示剤
を提供するばかりでなく、これはまたサンプルにおける
標的物の初期量を定量化するための標準物を提供する。
光分光分析法よりむしろ遷移状態蛍光分光分析法を使用
することによりさらに最小化され、これにより光散乱の
関与を減少する。バックグラウンド蛍光を少なくすると
蛍光標識化検出プローブの濃度を低くすることができ、
これは、増幅した生成物の与えられた濃度に対し一重鎖
検出プローブのより高い割合を二重鎖形へ転化すること
を確実にすることにより検出感度を向上させる。しかし
ながら、検出プローブ濃度が低いと増幅した生成物レベ
ルの広い範囲にわたって検出プローブが飽和する結果と
なる。SDA 完了後にプローブが飽和している状態で行わ
れるFPの終点測定は、初期標的物レベルに関して厳密に
定量的ではないかもしれない。増幅反応が完了した後と
いうよりSDA の間に“ 即時 "FP測定することは、標的
物レベルがより高いサンプルが標的の少ないサンプルよ
りもより迅速にFPの増加を示すので検出プローブ飽和の
問題を克服する。勿論、FP増加の割合と初期標的物レベ
ルの間の相関関係は増幅の割合がほとんど同じであるサ
ンプルと比較した場合のみ妥当である。ここでも、臨床
標本について、その各々は異なったレベルのSDA 阻害剤
を含み、検定は厳密には定量的でないかもしれない。た
とえば、高い初期標的物の量を含みそして不十分なSDA
が行われたサンプルと低い初期標的物量を含むが高い割
合でSDA が行われていたサンプルを区別するのは難しい
かもしれない。それにもかかわらず、SDA の間にFPを即
時モニターすることは少なくとも初期標的物レベルの半
- 定量的評価をもたらす。定量化は、陽性対照物として
公知初期濃度の別の標的配列を含むことにより向上する
（ ウォーカーら、1994 ,Nucl. Acids Res.,22, 2670-
2677) 。陽性対照標的物はサンプル（すなわち、誤った
陰性に対する対照物）に対する一般的SDA 性能の指示剤
を提供するばかりでなく、これはまたサンプルにおける
標的物の初期量を定量化するための標準物を提供する。
【００２９】蛍光標識物は、標識物からの蛍光の発光ま
たは標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの
いずれも妨害しないように 検出プローブと共有結合す
るかまたは抱合する。標識物が形状変化に近いかまたは
含まれる場合FPの変化が起こるので、結合は形状変化が
予想される部位に近づくべきである。これは、検出プロ
ーブの5 ´末端かまたは内部位置のいずれかである。一
般的に、標識物は、3´末端はポリメラーゼによる延長
に利用されなければならないので検出プローブの3 ´末
端とは結合しない。より緊密な結合すなわち“ 束縛（t
ether) "、たとえば二重結合を含むものは、蛍光標識
物の回転時間を遅くし、より長い相関時間の測定を可能
にする。蛍光標識物は、オリゴヌクレオチドに対し結合
する標識物に使用するのに好適なリンカーまたは“ 束
縛（tether) "たとえばアミノ-エチル、アミノ- ヘキ
シルおよびアミノ- プロピル連結アーム（アップライド
バイオシステムズ、クロネチ、グレン リサーチ、デブ
リンら、前掲）を介して検出プローブに対し共有結合さ
れる。他のアミノリンカーはWO 92/18650 号に記載され
ている。標識物はまた、グッドチャイルド(Goodchild)
、1990. Bioconj.Chem. 1,165に一般的に記載されてい
るように、ピリミジンのC5またはプリンのC8でオリゴヌ
クレオチドへ結合される。フルオレセインはホスホロチ
オエートを含むオリゴヌクレオチドを合成し続いてヨー
ドアセトアミドフルオレセインと反応させることにより
内部的に結合される。
たは標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの
いずれも妨害しないように 検出プローブと共有結合す
るかまたは抱合する。標識物が形状変化に近いかまたは
含まれる場合FPの変化が起こるので、結合は形状変化が
予想される部位に近づくべきである。これは、検出プロ
ーブの5 ´末端かまたは内部位置のいずれかである。一
般的に、標識物は、3´末端はポリメラーゼによる延長
に利用されなければならないので検出プローブの3 ´末
端とは結合しない。より緊密な結合すなわち“ 束縛（t
ether) "、たとえば二重結合を含むものは、蛍光標識
物の回転時間を遅くし、より長い相関時間の測定を可能
にする。蛍光標識物は、オリゴヌクレオチドに対し結合
する標識物に使用するのに好適なリンカーまたは“ 束
縛（tether) "たとえばアミノ-エチル、アミノ- ヘキ
シルおよびアミノ- プロピル連結アーム（アップライド
バイオシステムズ、クロネチ、グレン リサーチ、デブ
リンら、前掲）を介して検出プローブに対し共有結合さ
れる。他のアミノリンカーはWO 92/18650 号に記載され
ている。標識物はまた、グッドチャイルド(Goodchild)
、1990. Bioconj.Chem. 1,165に一般的に記載されてい
るように、ピリミジンのC5またはプリンのC8でオリゴヌ
クレオチドへ結合される。フルオレセインはホスホロチ
オエートを含むオリゴヌクレオチドを合成し続いてヨー
ドアセトアミドフルオレセインと反応させることにより
内部的に結合される。
【００３０】FPは、好適な増幅プライマーおよび検出プ
ローブをデザインすることのできるいずれかの標的物の
増幅の検出にも使用される。代表的一実施態様におい
て、本発明検出方法は、結核菌標的配列の増幅のために
すでに開発されたSDA システムへ利用されうる（IS6110
- ウォーカーら、1992 , Nucl. Acids Res.,and Proc.
Natl.Acad. Sci., 前掲；スパルゴ(Spargo)ら、1993,
前掲）。異なった量の結核菌ゲノムDNA （IS6110標的配
列を含む）および蛍光検出プローブを含むサンプルを増
幅し、増幅をFPにおける増加により同時に検出した。結
核菌DNA を含む二つのサンプルは、その間にわたってFP
値における増加を示し、一方陰性対照物（結核菌DNA 0)
はFP値における著しい変化を示さなかった。さらに、結
核菌DNA を含むサンプルは、初期の結核菌DNA レベル
（すなわち、定量検出）を反映する時間に依存する方法
でFP値の増加を示した。この実験はSDA の即時検出シス
テムの有用性を示した。しかしながら、FPの検出に使用
されるダイアトロン蛍光計の現行のデザインは蛍光計に
おけるSDA 反応の注意深い実行を論理的に難しくする。
特に、現行ダイアトロン装置におけるサンプル温度のコ
ントロールはSDA 反応に最適ではなかった。したがっ
て、SDA はまた温度調節した水浴を用いて微小遠心分離
管において検出プローブの存在下に実施され、続いて蛍
光計におけるFP値の測定を行った。結核菌DNA を含むサ
ンプルは、結核菌ゲノム一つだけが標的物として存在す
る場合でも結核菌DNA を含まないサンプルより検出可能
な高いFP値を示した。FP値は一般に初期結核菌DNA のレ
ベルが増加すると増加するとはいえ、FP値は標的物投入
レベルの範囲を越えた最大のレベルまで達する傾向にあ
る。これは、感度を向上するために使用される検出プロ
ーブの低濃度によるためであり、その結果、検出プロー
ブの二重鎖形への完全な転化（プローブ飽和）につなが
る。
ローブをデザインすることのできるいずれかの標的物の
増幅の検出にも使用される。代表的一実施態様におい
て、本発明検出方法は、結核菌標的配列の増幅のために
すでに開発されたSDA システムへ利用されうる（IS6110
- ウォーカーら、1992 , Nucl. Acids Res.,and Proc.
Natl.Acad. Sci., 前掲；スパルゴ(Spargo)ら、1993,
前掲）。異なった量の結核菌ゲノムDNA （IS6110標的配
列を含む）および蛍光検出プローブを含むサンプルを増
幅し、増幅をFPにおける増加により同時に検出した。結
核菌DNA を含む二つのサンプルは、その間にわたってFP
値における増加を示し、一方陰性対照物（結核菌DNA 0)
はFP値における著しい変化を示さなかった。さらに、結
核菌DNA を含むサンプルは、初期の結核菌DNA レベル
（すなわち、定量検出）を反映する時間に依存する方法
でFP値の増加を示した。この実験はSDA の即時検出シス
テムの有用性を示した。しかしながら、FPの検出に使用
されるダイアトロン蛍光計の現行のデザインは蛍光計に
おけるSDA 反応の注意深い実行を論理的に難しくする。
特に、現行ダイアトロン装置におけるサンプル温度のコ
ントロールはSDA 反応に最適ではなかった。したがっ
て、SDA はまた温度調節した水浴を用いて微小遠心分離
管において検出プローブの存在下に実施され、続いて蛍
光計におけるFP値の測定を行った。結核菌DNA を含むサ
ンプルは、結核菌ゲノム一つだけが標的物として存在す
る場合でも結核菌DNA を含まないサンプルより検出可能
な高いFP値を示した。FP値は一般に初期結核菌DNA のレ
ベルが増加すると増加するとはいえ、FP値は標的物投入
レベルの範囲を越えた最大のレベルまで達する傾向にあ
る。これは、感度を向上するために使用される検出プロ
ーブの低濃度によるためであり、その結果、検出プロー
ブの二重鎖形への完全な転化（プローブ飽和）につなが
る。
【００３１】結核菌標的DNA を全く含まないサンプルは
一重鎖検出プローブのFP値特性を示した（この場合、フ
ルオレセインに対しては約40-45 mPおよび La Jolla ブ
ルー“ LJB "に対しては約60 mP)。これらの0 標的サ
ンプルについてFP値における観察された増加はいずれも
二つの筋から理論的に誘導される。第一に、少量の標的
DNA による偶然の汚染があるかもしれない。非常に少数
の標的分子の検出が可能になる程十分力強力なので、た
とえ数個の標的分子でも有する陰性サンプルの低レベル
の汚染はSDA のような増幅技術と関係する。第二に、0
標的サンプルにおける検出プローブはバックグラウンド
ハイブリダイゼーション（たとえば、試験サンプル中に
しばしば存在するヒトDNA に対し）を介しまたは検出プ
ローブにおいて一時的に形成されるヘアピンの延長のよ
うな偽のポリメラーゼ活性を介して直接二重鎖形へ転化
されるかもしれない。対照サンプルの二つの型は、0 標
的サンプルにおけるバックグラウンド信号の可能性のあ
る筋を説明するために分析された。対照サンプルの一つ
の型はSDA 反応においてdATPαS の代わりにdATPを含ん
でいた。dATPの置換はエキソ- クレノウによる検出プロ
ーブの非特異的延長を可能するが、しかしHincII部位の
二重鎖開裂を可能にすることによりSDA メカニズムをで
きなくした。第二の型の対照サンプルはエキソ- クレノ
ウを含まなかった。これはSDA およびいずれの非特異的
検出プローブ延長をできなくした。それゆえポリメラー
ゼを用いない対照物は非標的DNA を用いた検出プローブ
の非特異的直接のハイブリダイゼーションを明らかにす
る。これらの対照サンプルおよび 0標的サンプルの分析
は、検出プローブの非特異的ハイブリダイゼーションが
非常に低くそしてエキソ- クレノウでは仲介されないこ
とを示している。0 標的サンプルの増幅時に記録される
やや高いFP値は、多分、標的DNA による僅かな汚染を反
映しているのであろう。
一重鎖検出プローブのFP値特性を示した（この場合、フ
ルオレセインに対しては約40-45 mPおよび La Jolla ブ
ルー“ LJB "に対しては約60 mP)。これらの0 標的サ
ンプルについてFP値における観察された増加はいずれも
二つの筋から理論的に誘導される。第一に、少量の標的
DNA による偶然の汚染があるかもしれない。非常に少数
の標的分子の検出が可能になる程十分力強力なので、た
とえ数個の標的分子でも有する陰性サンプルの低レベル
の汚染はSDA のような増幅技術と関係する。第二に、0
標的サンプルにおける検出プローブはバックグラウンド
ハイブリダイゼーション（たとえば、試験サンプル中に
しばしば存在するヒトDNA に対し）を介しまたは検出プ
ローブにおいて一時的に形成されるヘアピンの延長のよ
うな偽のポリメラーゼ活性を介して直接二重鎖形へ転化
されるかもしれない。対照サンプルの二つの型は、0 標
的サンプルにおけるバックグラウンド信号の可能性のあ
る筋を説明するために分析された。対照サンプルの一つ
の型はSDA 反応においてdATPαS の代わりにdATPを含ん
でいた。dATPの置換はエキソ- クレノウによる検出プロ
ーブの非特異的延長を可能するが、しかしHincII部位の
二重鎖開裂を可能にすることによりSDA メカニズムをで
きなくした。第二の型の対照サンプルはエキソ- クレノ
ウを含まなかった。これはSDA およびいずれの非特異的
検出プローブ延長をできなくした。それゆえポリメラー
ゼを用いない対照物は非標的DNA を用いた検出プローブ
の非特異的直接のハイブリダイゼーションを明らかにす
る。これらの対照サンプルおよび 0標的サンプルの分析
は、検出プローブの非特異的ハイブリダイゼーションが
非常に低くそしてエキソ- クレノウでは仲介されないこ
とを示している。0 標的サンプルの増幅時に記録される
やや高いFP値は、多分、標的DNA による僅かな汚染を反
映しているのであろう。
【００３２】以下の実験例は本発明の特定の実施態様を
説明するために提供されるものであるが、しかし本発明
を限定するものではなく、本発明は特許請求の範囲によ
り限定される。実施例で使用されるオリゴヌクレオチド
の配列は、以下のとおりである； オリゴヌクレオチド配列 配列番号: 5′dGCATTATAGTACCTGTCTGTTGACACTGAGATCCCCT3 ′ 配列番号: 1 5′dTTGAATAGTCGGTTACTTGTTGACGGCGTACTCGACC3 ′ 配列番号: 2 5′dTGGACCCGCCAAC3 ′ 配列番号: 3 5′dCGCTGAACCGGAT3 ′ 配列番号: 4 5′dJB-dTGAAAGACGTTATCCACCATACGGATAG 3 ′ 配列番号: 5 5′F-dGGAATTCATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA3 ′ 配列番号: 6 5′F-dATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA 3 ′ 配列番号: 7 5′dTGAAAGACGACGTTATCCACCATACGGATGAATTCC 3 ′ 配列番号: 8 5′dTGAAAGACGTTATCCACCATACGGAT 3 ′ 配列番号: 9 （式中、LJB は La Jolla ブルーに対するオリゴヌクレ
オチドの結合を示し、Fはフルオレセインに対するオリ
ゴヌクレオチドの結合を示し、そしてイタリック体はHi
ncII識別部位（5 GTTGAC) または EcoRI識別部位(5 GAA
TTC)を示す。配列番号: 6 および配列番号: 8 は相補体
である。配列番号: 7 および配列番号: 9もまた相補体
である。
説明するために提供されるものであるが、しかし本発明
を限定するものではなく、本発明は特許請求の範囲によ
り限定される。実施例で使用されるオリゴヌクレオチド
の配列は、以下のとおりである； オリゴヌクレオチド配列 配列番号: 5′dGCATTATAGTACCTGTCTGTTGACACTGAGATCCCCT3 ′ 配列番号: 1 5′dTTGAATAGTCGGTTACTTGTTGACGGCGTACTCGACC3 ′ 配列番号: 2 5′dTGGACCCGCCAAC3 ′ 配列番号: 3 5′dCGCTGAACCGGAT3 ′ 配列番号: 4 5′dJB-dTGAAAGACGTTATCCACCATACGGATAG 3 ′ 配列番号: 5 5′F-dGGAATTCATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA3 ′ 配列番号: 6 5′F-dATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA 3 ′ 配列番号: 7 5′dTGAAAGACGACGTTATCCACCATACGGATGAATTCC 3 ′ 配列番号: 8 5′dTGAAAGACGTTATCCACCATACGGAT 3 ′ 配列番号: 9 （式中、LJB は La Jolla ブルーに対するオリゴヌクレ
オチドの結合を示し、Fはフルオレセインに対するオリ
ゴヌクレオチドの結合を示し、そしてイタリック体はHi
ncII識別部位（5 GTTGAC) または EcoRI識別部位(5 GAA
TTC)を示す。配列番号: 6 および配列番号: 8 は相補体
である。配列番号: 7 および配列番号: 9もまた相補体
である。
【００３３】
実施例１ FP値は、結核菌(M. tuberculosis) 標的DNA および La
Jolla ブルー標識化検出プローブ（配列番号: 5)を含む
サンプルのSDA 間の即時モニターをした。SDA反応条件
を変更して上述のように感度を向上し、dUTPを TTPに代
えて UDGを用いてアンプリコンを続いて不活化した。各
120 μl サンプルは50mM K2P04(pH 7.6)、7mM MgCl
2 、0.5mM dUTP, 0.2 mM各 dGTP 、 dCTP およびdATPα
S 、16%(v/v)グリセロール、0.1 mg/ml BSA 、0.001%
トゥィーン- 20、100 ngヒト胎盤DNA、100 nMプライマ
ーS1(配列番号: 2)、300 nMプライマー S2 (配列番号:
1)、25 nM 各プライマーB1および B2 （配列番号: 3 お
よび配列番号:4)、300 単位HincII（ニュー イングラ
ンド バイオラボズ）0.25単位エキソ-クレノウ（ユナ
イテッドステーツ バイオケミカル）、500 pM La Joll
a ブルー標識化検出プローブ（配列番号: 5)および結核
菌ゲノムDNA の図３で示す量を含む。本実施例における
反応は図２に相当し、検出プローブはS1の下流にハイブ
リダイズする。
Jolla ブルー標識化検出プローブ（配列番号: 5)を含む
サンプルのSDA 間の即時モニターをした。SDA反応条件
を変更して上述のように感度を向上し、dUTPを TTPに代
えて UDGを用いてアンプリコンを続いて不活化した。各
120 μl サンプルは50mM K2P04(pH 7.6)、7mM MgCl
2 、0.5mM dUTP, 0.2 mM各 dGTP 、 dCTP およびdATPα
S 、16%(v/v)グリセロール、0.1 mg/ml BSA 、0.001%
トゥィーン- 20、100 ngヒト胎盤DNA、100 nMプライマ
ーS1(配列番号: 2)、300 nMプライマー S2 (配列番号:
1)、25 nM 各プライマーB1および B2 （配列番号: 3 お
よび配列番号:4)、300 単位HincII（ニュー イングラ
ンド バイオラボズ）0.25単位エキソ-クレノウ（ユナ
イテッドステーツ バイオケミカル）、500 pM La Joll
a ブルー標識化検出プローブ（配列番号: 5)および結核
菌ゲノムDNA の図３で示す量を含む。本実施例における
反応は図２に相当し、検出プローブはS1の下流にハイブ
リダイズする。
【００３４】La Jolla ブルーをすでに記載のように
（デブリンら、前掲）オリゴヌクレオチド検出プローブ
の5 ´末端へ結合した。この検出プローブを結核菌ゲノ
ムに見られるIS6110要素のヌクレオチド985-1012位にハ
イブリダイズする(Nucl.AcidsRes. 1990. 18,188)。検
出プローブのハイブリダイゼーションの部位は増幅され
ている標識配列に含まれる（ヌクレオチド位置972-102
3) 。各サンプルについて、HincIIおよびエキソ- クレ
ノウ以外のすべての試薬を微量遠心分離管に準備し、サ
ンプルを沸騰水浴中で2 分間加熱し、次に水浴中40℃で
平衡化した。サンプルをガラス製の円筒形キュベット(
内径 4 mm,高さ23 mm)へ移し、蛍光計中40℃で平衡化
し、HincIIおよびエキソ- クレノウを添加した。SDA が
40℃で進行し、蛍光偏光値を記録した( デブリンら、19
93、前掲）。
（デブリンら、前掲）オリゴヌクレオチド検出プローブ
の5 ´末端へ結合した。この検出プローブを結核菌ゲノ
ムに見られるIS6110要素のヌクレオチド985-1012位にハ
イブリダイズする(Nucl.AcidsRes. 1990. 18,188)。検
出プローブのハイブリダイゼーションの部位は増幅され
ている標識配列に含まれる（ヌクレオチド位置972-102
3) 。各サンプルについて、HincIIおよびエキソ- クレ
ノウ以外のすべての試薬を微量遠心分離管に準備し、サ
ンプルを沸騰水浴中で2 分間加熱し、次に水浴中40℃で
平衡化した。サンプルをガラス製の円筒形キュベット(
内径 4 mm,高さ23 mm)へ移し、蛍光計中40℃で平衡化
し、HincIIおよびエキソ- クレノウを添加した。SDA が
40℃で進行し、蛍光偏光値を記録した( デブリンら、19
93、前掲）。
【００３５】本実施例では、SDA をディアトロン(Diatr
on) 遷移状態蛍光計中で行った。標的DNA の指示された
量を含む三つのサンプルについて時間の関数としてFP値
を記録した。FP値はミリ偏光単位（ mP ）として表され
た： FP（ mP ）=1000 [S(par) - S(per)] / [S(par) + S(pe
r) ] S(par) およびS(per)は、それぞれ平行(par) および垂
直S(per)位置で発光偏光子を用いた遷移状態蛍光信号が
最も高い信号- ノイズ比を有する蛍光減衰曲線の一部に
わたるカウントの総数を表す。図３は時間の関数として
のFP値のプロットである。蛍光偏光値が増加することに
より明らかなように、検出プローブの一重鎖- 二重鎖転
化は結核菌の初期濃度に依存することが分かった。高い
初期のとの標的を含むサンプルは低い初期濃度の標的を
含むものより迅速に転化した。これと対照的に、結核菌
標的DNA を欠いたサンプルはFP値がほとんど増えなかっ
た。
on) 遷移状態蛍光計中で行った。標的DNA の指示された
量を含む三つのサンプルについて時間の関数としてFP値
を記録した。FP値はミリ偏光単位（ mP ）として表され
た： FP（ mP ）=1000 [S(par) - S(per)] / [S(par) + S(pe
r) ] S(par) およびS(per)は、それぞれ平行(par) および垂
直S(per)位置で発光偏光子を用いた遷移状態蛍光信号が
最も高い信号- ノイズ比を有する蛍光減衰曲線の一部に
わたるカウントの総数を表す。図３は時間の関数として
のFP値のプロットである。蛍光偏光値が増加することに
より明らかなように、検出プローブの一重鎖- 二重鎖転
化は結核菌の初期濃度に依存することが分かった。高い
初期のとの標的を含むサンプルは低い初期濃度の標的を
含むものより迅速に転化した。これと対照的に、結核菌
標的DNA を欠いたサンプルはFP値がほとんど増えなかっ
た。
【００３６】実施例２ SDA 反応を実施例１に記載のように行うが、しかしFP値
をSDA 終了後に測定した。 La Jolla ブルー検出プロー
ブ（配列番号: 5)は500 または50pMでSDA の間に存在し
た。SDA は水浴中41℃に維持した微小遠心分離管中で3
時間進行し、EDTAを8 mMまで添加することにより終結し
た。サンプルをガラスシリンダキュベット( 内径 4 mm,
高さ23 mm)へ移し、ダイヤトロン遷移状態蛍光計におい
て読み取った。FP値(mP)は、様々なレベルの投入標的結
核菌DNA を含むサンプルについて取った。二つの別の対
照反応もまた含まれた。SDA の間にdATPαS に代わって
dATPを組み込んだものは、HincIIおよびエキソ- クレノ
ウに対する一般的酵素活性を支援するが、しかし標的の
増幅を支援しない。第二の対照物はエキソ- クレノウが
欠けている。
をSDA 終了後に測定した。 La Jolla ブルー検出プロー
ブ（配列番号: 5)は500 または50pMでSDA の間に存在し
た。SDA は水浴中41℃に維持した微小遠心分離管中で3
時間進行し、EDTAを8 mMまで添加することにより終結し
た。サンプルをガラスシリンダキュベット( 内径 4 mm,
高さ23 mm)へ移し、ダイヤトロン遷移状態蛍光計におい
て読み取った。FP値(mP)は、様々なレベルの投入標的結
核菌DNA を含むサンプルについて取った。二つの別の対
照反応もまた含まれた。SDA の間にdATPαS に代わって
dATPを組み込んだものは、HincIIおよびエキソ- クレノ
ウに対する一般的酵素活性を支援するが、しかし標的の
増幅を支援しない。第二の対照物はエキソ- クレノウが
欠けている。
【００３７】SDA の完了後、結果を図４に示す。結核菌
標的DNA を含むすべてのサンプルは、SDA の間に La Jo
lla ブルー標識化検出プローブの標的依存性一重鎖から
二重鎖への転化のための結核菌DNA を欠いたサンプルよ
り高いFP値を示した。検出プローブ500 pMを用いて、結
核菌DNA のレベルが低下するとFP値の変化は低下する方
向を示した。この規模の低下はもしあるならば、検出プ
ローブ50 pM で最低であり、プローブ飽和を支持する。
しかしながら、低検出プローブ濃度で得られる低い信号
- ノイズ比はまた正確さを危うくする。500 pM検出プロ
ーブを用いた結核菌DNA 0 のサンプルは、二つの対照サ
ンプル（ “dATP "および“ エキソ- クレノウ無し "）
より若干高いFP値を示し、たぶんこれはIS 6110 標的配
列の少量で偶然汚染されたせいであろう。IS 6110 は、
結核菌ゲノム1 個につき約10個のコピー中に存在し、標
的配列の量は汚染ゲノムが一つだけ存在する場合でさえ
SDAにより増幅可能である。二つの対照反応の分析は、d
ATPαS の代わりにdATPを含むサンプルおよびエキソ-
クレノウを欠いたサンプルに対する等しい蛍光偏光値に
より明らかなように、ポリメラーゼが非標的特異的法に
おいて一重鎖検出プローブを二重鎖形へ転化しないこと
を示した。
標的DNA を含むすべてのサンプルは、SDA の間に La Jo
lla ブルー標識化検出プローブの標的依存性一重鎖から
二重鎖への転化のための結核菌DNA を欠いたサンプルよ
り高いFP値を示した。検出プローブ500 pMを用いて、結
核菌DNA のレベルが低下するとFP値の変化は低下する方
向を示した。この規模の低下はもしあるならば、検出プ
ローブ50 pM で最低であり、プローブ飽和を支持する。
しかしながら、低検出プローブ濃度で得られる低い信号
- ノイズ比はまた正確さを危うくする。500 pM検出プロ
ーブを用いた結核菌DNA 0 のサンプルは、二つの対照サ
ンプル（ “dATP "および“ エキソ- クレノウ無し "）
より若干高いFP値を示し、たぶんこれはIS 6110 標的配
列の少量で偶然汚染されたせいであろう。IS 6110 は、
結核菌ゲノム1 個につき約10個のコピー中に存在し、標
的配列の量は汚染ゲノムが一つだけ存在する場合でさえ
SDAにより増幅可能である。二つの対照反応の分析は、d
ATPαS の代わりにdATPを含むサンプルおよびエキソ-
クレノウを欠いたサンプルに対する等しい蛍光偏光値に
より明らかなように、ポリメラーゼが非標的特異的法に
おいて一重鎖検出プローブを二重鎖形へ転化しないこと
を示した。
【００３８】実施例３ アップライド バイオシステムズ社(Applied Biosystem
s, Inc.)(ABI) 380 B型DNA 合成機およびABI 6-FAM ア
ミダイト(P/N 401527)を用いて、製造業者の手引き書に
従って、標準的手法により、5 ´- フルオレセイン標識
化オリゴヌクレオチドを調製した。フルオレセイン標識
化オリゴヌクレオチドを変性ゲル電気泳動により精製し
た。フルオレセインに対するFP値を、ジョリー コンサ
ルティング アンド リサーチ社( Jolley Consulting
and Reserch, Inc.)、イリノイ州60073 、ラウンドレー
ク、サークルドライブ、34469 N 製 FPM 1定常状態蛍光
計において記録した。この装置は最低サンプル容量1 ml
の使い捨て12×75 mm 試験管（フィッシャー）を使用す
る。
s, Inc.)(ABI) 380 B型DNA 合成機およびABI 6-FAM ア
ミダイト(P/N 401527)を用いて、製造業者の手引き書に
従って、標準的手法により、5 ´- フルオレセイン標識
化オリゴヌクレオチドを調製した。フルオレセイン標識
化オリゴヌクレオチドを変性ゲル電気泳動により精製し
た。フルオレセインに対するFP値を、ジョリー コンサ
ルティング アンド リサーチ社( Jolley Consulting
and Reserch, Inc.)、イリノイ州60073 、ラウンドレー
ク、サークルドライブ、34469 N 製 FPM 1定常状態蛍光
計において記録した。この装置は最低サンプル容量1 ml
の使い捨て12×75 mm 試験管（フィッシャー）を使用す
る。
【００３９】実施例４ 10 nMの配列番号: 8(配列番号: 6 の相補体) を有する
かまたは有さない10 nMの配列番号: 6 のサンプル(100
μl ）を、4 mM TAE,50mM NaCl,pH 7.8において調製し
た。 EcoRI識別部位を欠いたオリゴヌクレオチドを含む
対照サンプルを、同様に、配列番号: 7 とその補体（配
列番号: 9)を用いるかまたは用いないもので構築した。
これらのサンプルを37℃で30分間インキュベートし、55
mMNaCl、22 mM トリス- HCl(pH 7.5) 、0.7 mM K2PO
4( pH 7.4) 、1.1 mM EDTA 、0.7mMβメルカプトエタノ
ール、13μg/ml BAS、0.02% トリトンX-100 、7 % グリ
セロールを用いて1 mlまで希釈した。FP値をFPM-1 装置
において37℃で記録した。次いで、100,000 単位／ml E
coRI（ニュー イングランド バイオラボズ社）5μl
または1.6 μM EcoRI(Gln111)5 μl を添加し、指示し
た時間にFP値を読み取った。DNA 結合たんぱく質添加後
1 時間してから結果を図５に示す。
かまたは有さない10 nMの配列番号: 6 のサンプル(100
μl ）を、4 mM TAE,50mM NaCl,pH 7.8において調製し
た。 EcoRI識別部位を欠いたオリゴヌクレオチドを含む
対照サンプルを、同様に、配列番号: 7 とその補体（配
列番号: 9)を用いるかまたは用いないもので構築した。
これらのサンプルを37℃で30分間インキュベートし、55
mMNaCl、22 mM トリス- HCl(pH 7.5) 、0.7 mM K2PO
4( pH 7.4) 、1.1 mM EDTA 、0.7mMβメルカプトエタノ
ール、13μg/ml BAS、0.02% トリトンX-100 、7 % グリ
セロールを用いて1 mlまで希釈した。FP値をFPM-1 装置
において37℃で記録した。次いで、100,000 単位／ml E
coRI（ニュー イングランド バイオラボズ社）5μl
または1.6 μM EcoRI(Gln111)5 μl を添加し、指示し
た時間にFP値を読み取った。DNA 結合たんぱく質添加後
1 時間してから結果を図５に示す。
【００４０】配列番号: 6 がその補体（配列番号: 8)と
ハイブリダイズ時にFP値は45.6から64.1mPへ増加し、こ
れは18mPの変化に相当する。 EcoRIを含むとFPの変化を
強め、18 mP から133 mPへ増えた（181.2 - 48.2 = 133
mP)。 EcoRI(Gln111)はFPを185 mPまで増加した(242.1
- 57.3 = 185 mP) 。 EcoRI(Gln111)は EcoRIよりもFP
を大きく増加するばかりでなく、FPは長期間にわたって
安定であった。この効果は、 EcoRI(Gln111)のより緊密
な結合のためであり、そのため EcoRIと比べてその制限
部位からたんぱく質の分離が比較的少ない結果となっ
た。これと対照的に、二重鎖DNA 結合たんぱく質を添加
しても、たんぱく質に対する識別部位が存在しない（配
列番号: 7)場合、一重鎖から二重鎖形への転化を伴うFP
における増加を強めなかった。
ハイブリダイズ時にFP値は45.6から64.1mPへ増加し、こ
れは18mPの変化に相当する。 EcoRIを含むとFPの変化を
強め、18 mP から133 mPへ増えた（181.2 - 48.2 = 133
mP)。 EcoRI(Gln111)はFPを185 mPまで増加した(242.1
- 57.3 = 185 mP) 。 EcoRI(Gln111)は EcoRIよりもFP
を大きく増加するばかりでなく、FPは長期間にわたって
安定であった。この効果は、 EcoRI(Gln111)のより緊密
な結合のためであり、そのため EcoRIと比べてその制限
部位からたんぱく質の分離が比較的少ない結果となっ
た。これと対照的に、二重鎖DNA 結合たんぱく質を添加
しても、たんぱく質に対する識別部位が存在しない（配
列番号: 7)場合、一重鎖から二重鎖形への転化を伴うFP
における増加を強めなかった。
【００４１】実施例５ 結核菌DNA を含むサンプルにおいて蛍光検出プローブ
（配列番号: 6 または配列番号: 7)の存在下にSDA を行
った。配列番号: 7 は配列番号: 6 と同じ標的結合配列
を有するが、しかし配列番号: 6 に存在する EcoRI結合
部位を持たない。FP値は EcoRIまたは EcoRI(Gln111)を
添加する前および後に、SDA 反応が完了してから測定し
た。両方の二重鎖DNA 結合たんぱく質を配列番号: 7を
含むサンプルへ添加した。配列番号: 6 および配列番
号: 7 はSDA を受ける配列（ヌクレオチド972-1023位)
に含まれるIS 6110 要素のヌクレオチド985-1010位へハ
イブリダイズする。SDA 反応物（100 μl ）は、一般に
実施例２のように行うがしかし次のことを例外とする：
配列番号: 6 または配列番号: 7を配列番号: 5 の代わ
りに10 nM で含有した。S1（配列番号: 2 ）および S2
（配列番号: 1)の濃度はそれぞれ300 および50 nM であ
った。本実施例において、実施例１および図２における
本発明の説明と対照的に、検出プローブのハイブリダイ
ゼーションは S2より下流であった。また、エキソ- ク
レノウ1 単位を使用した。各SDA 反応物は106 個の結核
菌ゲノムを含むが、しかし10 mM EDTAを幾つかのサンプ
ルへ添加してSDA を阻害した（“ SDA 無し "の対
照）。SDA に続いて、サンプルを実施例４のように使い
捨て12×75 mm ガラス試験管（フィッシャー）中で1 ml
まで希釈し、37℃で20分間インキュベートした後、37℃
でFPMI装置においてFP値を記録した。最初のFP値を読み
取り、その後100,000 単位／ml EcoRI5 μl または1.6
μM EcoRI(Gln111)5 μl を添加した。次いで、サンプ
ルを37℃でインキュベートし、FP値を記録した。
（配列番号: 6 または配列番号: 7)の存在下にSDA を行
った。配列番号: 7 は配列番号: 6 と同じ標的結合配列
を有するが、しかし配列番号: 6 に存在する EcoRI結合
部位を持たない。FP値は EcoRIまたは EcoRI(Gln111)を
添加する前および後に、SDA 反応が完了してから測定し
た。両方の二重鎖DNA 結合たんぱく質を配列番号: 7を
含むサンプルへ添加した。配列番号: 6 および配列番
号: 7 はSDA を受ける配列（ヌクレオチド972-1023位)
に含まれるIS 6110 要素のヌクレオチド985-1010位へハ
イブリダイズする。SDA 反応物（100 μl ）は、一般に
実施例２のように行うがしかし次のことを例外とする：
配列番号: 6 または配列番号: 7を配列番号: 5 の代わ
りに10 nM で含有した。S1（配列番号: 2 ）および S2
（配列番号: 1)の濃度はそれぞれ300 および50 nM であ
った。本実施例において、実施例１および図２における
本発明の説明と対照的に、検出プローブのハイブリダイ
ゼーションは S2より下流であった。また、エキソ- ク
レノウ1 単位を使用した。各SDA 反応物は106 個の結核
菌ゲノムを含むが、しかし10 mM EDTAを幾つかのサンプ
ルへ添加してSDA を阻害した（“ SDA 無し "の対
照）。SDA に続いて、サンプルを実施例４のように使い
捨て12×75 mm ガラス試験管（フィッシャー）中で1 ml
まで希釈し、37℃で20分間インキュベートした後、37℃
でFPMI装置においてFP値を記録した。最初のFP値を読み
取り、その後100,000 単位／ml EcoRI5 μl または1.6
μM EcoRI(Gln111)5 μl を添加した。次いで、サンプ
ルを37℃でインキュベートし、FP値を記録した。
【００４２】二重鎖DNA 結合たんぱく質を添加して2 時
間後に、その結果を図６に示す。結核菌DNA のSDA を、
たんぱく質添加前の配列番号: 6 および配列番号: 7 に
対するFP値の増加として観察し、これは二重鎖形への転
化を示唆する。対照物配列番号: 7 に対するFP値は標的
結核菌配列のSDA 時21.3 mP から増加した。 EcoRI(Gln
111)を添加すると、配列番号: 6 （二重鎖 EcoRI識別部
位が生じている）を含む増幅したサンプルに対し一重鎖
および二重鎖形の間にFPにおける差の規模を89.4mPまで
増加した。このような効果は、配列番号: 7 含有サンプ
ルを増幅するために EcoRI(Gln111)を添加した時には見
られなかった。非増幅サンプル（ EcoRI部位は一重鎖の
ままである）において EcoRI(Gln111)を添加しても一重
鎖プローブ単独に対して予想された値以上にFPを増加す
ることにはならなかった。 EcoRIおよび EcoRI(Gln111)
の結合効果のみを分析した実施例４と比較して、 EcoRI
(Gln111)とのより長いインキュベーションが、FP値にお
ける増加の強化を観察するために本実施例において必要
であった。これは、SDA の条件下でたんぱく質結合方法
を幾らか阻害するためであろう。実施例４と対照的に、
EcoRIは二重鎖 EcoRI結合部位にもかかわらず、配列番
号: 6 のSDA 増幅時にFP値の増加を強化しなかった。
間後に、その結果を図６に示す。結核菌DNA のSDA を、
たんぱく質添加前の配列番号: 6 および配列番号: 7 に
対するFP値の増加として観察し、これは二重鎖形への転
化を示唆する。対照物配列番号: 7 に対するFP値は標的
結核菌配列のSDA 時21.3 mP から増加した。 EcoRI(Gln
111)を添加すると、配列番号: 6 （二重鎖 EcoRI識別部
位が生じている）を含む増幅したサンプルに対し一重鎖
および二重鎖形の間にFPにおける差の規模を89.4mPまで
増加した。このような効果は、配列番号: 7 含有サンプ
ルを増幅するために EcoRI(Gln111)を添加した時には見
られなかった。非増幅サンプル（ EcoRI部位は一重鎖の
ままである）において EcoRI(Gln111)を添加しても一重
鎖プローブ単独に対して予想された値以上にFPを増加す
ることにはならなかった。 EcoRIおよび EcoRI(Gln111)
の結合効果のみを分析した実施例４と比較して、 EcoRI
(Gln111)とのより長いインキュベーションが、FP値にお
ける増加の強化を観察するために本実施例において必要
であった。これは、SDA の条件下でたんぱく質結合方法
を幾らか阻害するためであろう。実施例４と対照的に、
EcoRIは二重鎖 EcoRI結合部位にもかかわらず、配列番
号: 6 のSDA 増幅時にFP値の増加を強化しなかった。
【００４３】実施例６ 実施例５におけるように配列番号: 6 または配列番号:
7 検出プローブを用いてSDA を行った。一連のサンプル
は、 EcoRI(Gln111)の SDA後- 添加を用いた結核菌標的
DNA の様々なレベルを含む。既に記載したように、配列
番号: 7検出プローブは EcoRI制限部位を持たず、 EcoR
I(Gln111)と結合しなかった。100,000結核菌ゲノムおよ
びdATPαS の代わりにdATPを含む対照反応もまた行っ
た。SDAに続いて、これらの100 μl サンプルを実施例
４に示すように緩衝液で1mlまで希釈し、20分間37℃で
インキュベートした。FP値をFPM-1 装置において記録し
た。最初のFP値読み取り後、1.6 μM EcoRI(Gln111) 5
μl を添加し、FP値を記録した。配列番号: 7 の結果
は、二重鎖DNA 結合たんぱく質の添加後1.5時間してか
ら図７に示す。添加後3.5 時間してからの配列番号: 6
の結果を、図８に示す。
7 検出プローブを用いてSDA を行った。一連のサンプル
は、 EcoRI(Gln111)の SDA後- 添加を用いた結核菌標的
DNA の様々なレベルを含む。既に記載したように、配列
番号: 7検出プローブは EcoRI制限部位を持たず、 EcoR
I(Gln111)と結合しなかった。100,000結核菌ゲノムおよ
びdATPαS の代わりにdATPを含む対照反応もまた行っ
た。SDAに続いて、これらの100 μl サンプルを実施例
４に示すように緩衝液で1mlまで希釈し、20分間37℃で
インキュベートした。FP値をFPM-1 装置において記録し
た。最初のFP値読み取り後、1.6 μM EcoRI(Gln111) 5
μl を添加し、FP値を記録した。配列番号: 7 の結果
は、二重鎖DNA 結合たんぱく質の添加後1.5時間してか
ら図７に示す。添加後3.5 時間してからの配列番号: 6
の結果を、図８に示す。
【００４４】配列番号: 6および配列番号: 7 の両方に
対し、 EcoRI(Gln111)の添加前結核菌DNA サンプル0 と
比較した結核菌DNA を含むすべてのサンプルについてよ
り高いFP値が観察された。dATPの代わりにdATPを含む陰
性の対照サンプル（図７および８において“ SDA 無し
"）と比較した0 結核菌DNA サンプルについて若干高い
FP値は、0 結核菌サンプルがいくつかの標的分子で若干
汚染されていることを示す。 EcoRI(Gln111)の添加は E
coRI識別部位を持たない配列番号: 7 （図７）ではなく
配列番号: 6(図８)についての結核菌検出の感度を強化
した。
対し、 EcoRI(Gln111)の添加前結核菌DNA サンプル0 と
比較した結核菌DNA を含むすべてのサンプルについてよ
り高いFP値が観察された。dATPの代わりにdATPを含む陰
性の対照サンプル（図７および８において“ SDA 無し
"）と比較した0 結核菌DNA サンプルについて若干高い
FP値は、0 結核菌サンプルがいくつかの標的分子で若干
汚染されていることを示す。 EcoRI(Gln111)の添加は E
coRI識別部位を持たない配列番号: 7 （図７）ではなく
配列番号: 6(図８)についての結核菌検出の感度を強化
した。
【００４５】実施例７ SDA 反応が二重鎖DNA の EcoRI開裂を活性化するマグネ
シウムを含むので、天然 EcoRIはSDA の間に存在するこ
とはできない。十分なEDTAがマグネシウム原子と配位す
ることができる場合、これをSDA 後に添加することがで
きる。対照的に、 EcoRI(Gln111)はマグネシウムの存在
下でさえDNA を開裂しない。SDA は配列番号: 6 および
EcoRI(Gln111)の両方の存在下に実施例６におけるよう
に行った。8 μM EcoRI(Gln111)1 μl を、HincIIおよ
びエキソ- クレノウの添加時にSDA 反応へ添加した。SD
A に続いて100 μl のサンプルを実施例４に示すような
適当な緩衝液で希釈した。37℃で20分間インキュベート
後、使い捨てガラス管を用いて、サンプルを19時間にわ
たってFPM 1 装置中で読み取った。図９にSDA の1時間
後の結果を示す。
シウムを含むので、天然 EcoRIはSDA の間に存在するこ
とはできない。十分なEDTAがマグネシウム原子と配位す
ることができる場合、これをSDA 後に添加することがで
きる。対照的に、 EcoRI(Gln111)はマグネシウムの存在
下でさえDNA を開裂しない。SDA は配列番号: 6 および
EcoRI(Gln111)の両方の存在下に実施例６におけるよう
に行った。8 μM EcoRI(Gln111)1 μl を、HincIIおよ
びエキソ- クレノウの添加時にSDA 反応へ添加した。SD
A に続いて100 μl のサンプルを実施例４に示すような
適当な緩衝液で希釈した。37℃で20分間インキュベート
後、使い捨てガラス管を用いて、サンプルを19時間にわ
たってFPM 1 装置中で読み取った。図９にSDA の1時間
後の結果を示す。
【００４６】結核菌ゲノム1000個以上を有するサンプル
において、増幅は結核菌ゲノム0 の対照物以上に検出可
能であった。この感度は実施例６で観察されたものより
低く、これは多分 EcoRI(GlnIII)によるSDA の一般的阻
害のためであろう。
において、増幅は結核菌ゲノム0 の対照物以上に検出可
能であった。この感度は実施例６で観察されたものより
低く、これは多分 EcoRI(GlnIII)によるSDA の一般的阻
害のためであろう。
【００４７】
配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GCATTATAGT ACCTGTCTGT TGACACTGAG ATCCCCT 37 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACGGCGTA CTCGACC 37 配列番号：３ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TGGACCCGCC AAC 13 配列番号：４ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 CGCTGAACCG GAT 13 配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TGAAAGACGT TATCCACCAT ACGGATAG 28 配列番号：６ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GGAATTCATC CGTATGGTGG ATAACGTCTT TCA 33 配列番号：７ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 ATCCGTATGG TGGATAACGT CTTTCA 26 配列番号：８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TGAAAGACGA CGTTATCCAC CATACGGATG AATTCC 36 配列番号：９ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TGAAAGACGT TATCCACCAT ACGGAT 26
【図１】SDA に対する標的物発生過程（左側）およびSD
A に対する標的配列の指数関数的増幅の為の反応過程
（右側）を示す。
A に対する標的配列の指数関数的増幅の為の反応過程
（右側）を示す。
【図２】Ａは、検出プローブが標的配列と完全に同一な
場合、SDA の間に標的物に依存する方法において生じる
様々な形の蛍光検出プローブを示す。Ｂは、検出プロー
ブが標的配列と部分的に同一な場合、たとえば検出プロ
ーブが二重鎖DNA 結合たんぱく質に対する識別部位（す
なわち、DNA 結合たんぱく質が結合するヌクレオチド配
列）を含む場合のSDA の間に標的に依存する方法におい
て生じる様々な形の蛍光検出プローブを示す。
場合、SDA の間に標的物に依存する方法において生じる
様々な形の蛍光検出プローブを示す。Ｂは、検出プロー
ブが標的配列と部分的に同一な場合、たとえば検出プロ
ーブが二重鎖DNA 結合たんぱく質に対する識別部位（す
なわち、DNA 結合たんぱく質が結合するヌクレオチド配
列）を含む場合のSDA の間に標的に依存する方法におい
て生じる様々な形の蛍光検出プローブを示す。
【図３】結核菌標的配列のSDA と関連するFPにおける増
加のグラフである。
加のグラフである。
【図４】結核菌標的配列の様々な初期量のSDA の後に得
られた蛍光偏光値のグラフである。
られた蛍光偏光値のグラフである。
【図５】その相補体へハイブリダイズすることにより一
重鎖オリゴヌクレオチドを二重鎖形へ転化する場合、 E
coRIまたは EcoRI(Gln111)を添加することによりFPにお
ける増加の強化を示すグラフである。
重鎖オリゴヌクレオチドを二重鎖形へ転化する場合、 E
coRIまたは EcoRI(Gln111)を添加することによりFPにお
ける増加の強化を示すグラフである。
【図６】標的配列の増幅の間に検出プローブを二重鎖形
へ転化する場合、 EcoRI(Gln111)の添加によるFPにおけ
る増加の強化を示すグラフである。
へ転化する場合、 EcoRI(Gln111)の添加によるFPにおけ
る増加の強化を示すグラフである。
【図７】EcoRI識別部位を含まない検出プローブを用い
て、 EcoRI(Gln111)の増幅後の添加を用いた様々な初期
量の標的配列の増幅時に得られたFP値を説明するグラフ
である。
て、 EcoRI(Gln111)の増幅後の添加を用いた様々な初期
量の標的配列の増幅時に得られたFP値を説明するグラフ
である。
【図８】EcoRI識別部位を含む検出プローブを用いて、
EcoRI(Gln111)の増幅後の添加で標的配列の様々な初期
量の増幅時に得られたFP値を説明するグラフである。
EcoRI(Gln111)の増幅後の添加で標的配列の様々な初期
量の増幅時に得られたFP値を説明するグラフである。
【図９】増幅の間に存在する EcoRI(Gln111)を用いた結
核菌標的配列の増幅間に検出プローブの二重鎖形への転
化に関係するFPにおける増加を示すグラフである。
核菌標的配列の増幅間に検出プローブの二重鎖形への転
化に関係するFPにおける増加を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョージ・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，マウント・ボ ラス・ロード 209 (56)参考文献 特開 平６−43159（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−75958（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−276947（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】 以下の工程： a) 標的配列の第一のストランドへハイブリダイズする
SDAのための第一の増幅プライマー、および第一の増幅
プライマーの標的配列下流の第一のストランドへハイブ
リダイズする蛍光標識化一重鎖検出プローブをSDA 反応
に含め； b) 標的配列上の第一の増幅プライマーおよび検出プロ
ーブを延長し、これにより（i) 第一の増幅プライマー
を延長することにより標的配列の第一のストランドから
置換された検出プローブ延長生成物を作りそして（ii）
標的配列を増幅し； c) 標的配列の第一のストランドに相補的な標的配列の
第二のストランドへハイブリダイズする、SDA のための
第二の増幅プライマーを延長生成物へハイブリダイズ
し； d) 第二の増幅プライマーを延長し、これにより検出プ
ローブ延長生成物を二重鎖形へ転化し；そして e) 蛍光偏光を測定することにより標的増幅を検出す
る； からなるストランド置換増幅反応（SDA ）における二重
鎖核酸標的配列の増幅を検出する方法。 - 【請求項２】 検出プローブを La Jolla ブルーまたは
フルオレセインで標識化する請求項１の方法。 - 【請求項３】 遷移状態蛍光偏光により増幅の間に蛍光
偏光を測定する請求項１の方法。 - 【請求項４】 定常状態または遷移状態の蛍光偏光によ
り標識増幅後、蛍光偏光を測定する請求項１の方法。 - 【請求項５】 さらに、測定した蛍光偏光から標的配列
の初期濃度を定量化する請求項１の方法。 - 【請求項６】 検出プローブが核酸結合たんぱく質につ
いての識別部位を含む請求項１の方法。 - 【請求項７】 以下の工程： a) 標的配列の第一のストランドとハイブリダイズする
第一の増幅プライマー、および第一の増幅プライマーの
標的配列下流の第一のストランドとハイブリダイズする
蛍光標識化検出プローブを増幅反応に含め； b) 標的配列上の第一の増幅プライマーおよび検出プロ
ーブを延長し、これにより（i)第一の増幅プライマーの
延長により標的配列の第一のストランドから置換される
検出プローブ延長生成物を作り、そして(ii)標的配列を
増幅し； c) 標的配列の第一のストランドに相補的な標的配列の
第二のストランドへハイブリダイズする第二の増幅プラ
イマーを検出プローブ延長生成物とハイブリダイズし； d) 第二の増幅プライマーを延長し、これにより検出プ
ローブ延長物を二重鎖形へ転化し；そして e) 蛍光偏光を測定することにより標的増幅を検出す
る； からなる増幅反応における核酸標的配列の増幅を検出す
る方法。 - 【請求項８】 増幅反応がSDA である請求項７の方法。
- 【請求項９】 増幅反応がPCR である請求項７の方法。
- 【請求項１０】 増幅反応が3SR である請求項７の方
法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US229281 | 1994-04-18 | ||
| US08/229,281 US5547861A (en) | 1994-04-18 | 1994-04-18 | Detection of nucleic acid amplification |
| US08/311,474 US5593867A (en) | 1994-04-18 | 1994-09-23 | Fluorerscence polarization detection of nucleic acid amplication |
| US311474 | 1994-09-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0838199A JPH0838199A (ja) | 1996-02-13 |
| JP2757979B2 true JP2757979B2 (ja) | 1998-05-25 |
Family
ID=26923151
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7092404A Expired - Fee Related JP2757979B2 (ja) | 1994-04-18 | 1995-04-18 | 核酸増幅の蛍光偏光検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0678581B1 (ja) |
| JP (1) | JP2757979B2 (ja) |
| AT (1) | ATE197071T1 (ja) |
| BR (1) | BR9501583A (ja) |
| CA (1) | CA2145719C (ja) |
| DE (1) | DE69519122T2 (ja) |
| ES (1) | ES2152995T3 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5550025A (en) * | 1995-07-19 | 1996-08-27 | Becton, Dickinson And Company | Detection of hydrophobic amplification products by extraction into an organic phase |
| US5641633A (en) * | 1995-11-15 | 1997-06-24 | Becton, Dickinson And Company | Fluorescence polarization detection of nucleic acids |
| US5800989A (en) * | 1995-11-15 | 1998-09-01 | Becton, Dickinson And Company | Method for detection of nucleic acid targets by amplification and fluorescence polarization |
| WO1997021832A1 (de) * | 1995-12-08 | 1997-06-19 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuremolekülen in niedriger konzentration |
| DE19545965A1 (de) * | 1995-12-08 | 1997-06-12 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in niedriger Konzentration |
| GB9609441D0 (en) * | 1996-05-04 | 1996-07-10 | Zeneca Ltd | Process |
| EP0822261B1 (en) * | 1996-07-29 | 2002-07-03 | Academia Sinica | Methods for rapid antimicrobial susceptibility testing |
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| AUPQ495700A0 (en) * | 2000-01-05 | 2000-02-03 | Johnson & Johnson Research Pty. Limited | Method for concurrent amplification and real time detection of polymorphic nucleic acid sequences |
| FR2878254B1 (fr) * | 2004-11-22 | 2010-08-20 | Bio Rad Pasteur | Composition pour l'amplification d'acides nucleiques |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0275958A (ja) * | 1988-09-13 | 1990-03-15 | Kao Corp | Ｄｎａ検出法 |
| ATE169341T1 (de) * | 1988-12-09 | 1998-08-15 | Amrad Corp Ltd | Amplifizierter dns-assay |
| GB8902689D0 (en) * | 1989-02-07 | 1989-03-30 | Ici Plc | Assay method |
| AU8997991A (en) * | 1991-01-31 | 1992-08-06 | Becton Dickinson & Company | Exonuclease mediated strand displacement amplification |
| JPH0643159A (ja) * | 1991-02-20 | 1994-02-18 | Toyobo Co Ltd | 固定化ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法 |
| EP0533906A4 (en) * | 1991-04-11 | 1994-09-28 | Baxter Diagnostics Inc | Detection of dna/rna by fluorescence polarization |
| US5994056A (en) * | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| WO1993009250A1 (en) * | 1991-11-01 | 1993-05-13 | Adelaide Children's Hospital | Solid phase amplification process |
| EP0567635B1 (en) * | 1991-11-15 | 2000-05-31 | Igen International, Inc. | Rapid assays for amplification products |
| US5270184A (en) * | 1991-11-19 | 1993-12-14 | Becton, Dickinson And Company | Nucleic acid target generation |
| DE4234086A1 (de) * | 1992-02-05 | 1993-08-12 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen |
-
1995
- 1995-03-28 CA CA002145719A patent/CA2145719C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-03 EP EP95104930A patent/EP0678581B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-03 ES ES95104930T patent/ES2152995T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-03 DE DE69519122T patent/DE69519122T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-04-03 AT AT95104930T patent/ATE197071T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-04-13 BR BR9501583A patent/BR9501583A/pt active Search and Examination
- 1995-04-18 JP JP7092404A patent/JP2757979B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2145719C (en) | 1998-06-30 |
| JPH0838199A (ja) | 1996-02-13 |
| ES2152995T3 (es) | 2001-02-16 |
| DE69519122T2 (de) | 2001-03-22 |
| CA2145719A1 (en) | 1995-10-19 |
| ATE197071T1 (de) | 2000-11-15 |
| EP0678581A1 (en) | 1995-10-25 |
| BR9501583A (pt) | 1995-11-14 |
| DE69519122D1 (de) | 2000-11-23 |
| EP0678581B1 (en) | 2000-10-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5593867A (en) | Fluorerscence polarization detection of nucleic acid amplication | |
| AU705824B2 (en) | Fluorescence polarization detection of nucleic acids | |
| AU705743B2 (en) | Fluorescence polarization detection of nucleic acid amplification | |
| Afonina et al. | Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence | |
| JP4457001B2 (ja) | ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法 | |
| JP4527789B2 (ja) | 増加した標的特異的ｔｍを持つ修飾オリゴヌクレオチドを用いた核酸配列の検出および増幅のための方法 | |
| EP0623682B1 (en) | Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions | |
| JP2788786B2 (ja) | 増幅生成物の迅速アッセイ | |
| JP3600333B2 (ja) | オリゴヌクレオチドの長さの変化の検出方法 | |
| AU2012374566B2 (en) | Polymerase chain reaction detection system using oligonucleotides comprising a phosphorothioate group | |
| EP2167691B1 (en) | Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample | |
| WO2006045009A2 (en) | Triplex probe compositions and methods for polynucleotide detection | |
| JP2004532044A (ja) | 検出システム | |
| JP2757979B2 (ja) | 核酸増幅の蛍光偏光検出方法 | |
| JP2001515734A (ja) | 非競合的共増幅法 | |
| JP3970816B2 (ja) | バックグラウンドを下げる蛍光ハイブリダイゼーションプローブ | |
| JP4628625B2 (ja) | 蛍光エネルギー移動を含む標的核酸を検出するための増幅方法 | |
| AU705637B2 (en) | Detection of nucleic acid amplification | |
| US20040214176A1 (en) | Multiplexed DNA assays using structure-specific endonucleases | |
| JP2004121252A (ja) | 改良ｆｒｅｔ法 | |
| US20070269803A1 (en) | Fluorogenic Nucleic Acid Probes Including Lna for Methods to Detect and/or Quantify Nucleic Acid Analytes | |
| US6440675B1 (en) | Methods for selecting primers | |
| WO2022136023A1 (en) | A solution for detection of a viral rna sequence | |
| CA2705852A1 (en) | Photoinduced electron transfer (pet) primer for nucleic acid amplification | |
| CA2516306A1 (en) | Compositions and methods for polynucleotide sequence detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |