JPH09121854A - ヒルジン含有培養培地中のカルボキシペプチダーゼｙを不活性化する方法 - Google Patents
ヒルジン含有培養培地中のカルボキシペプチダーゼｙを不活性化する方法Info
- Publication number
- JPH09121854A JPH09121854A JP8214892A JP21489296A JPH09121854A JP H09121854 A JPH09121854 A JP H09121854A JP 8214892 A JP8214892 A JP 8214892A JP 21489296 A JP21489296 A JP 21489296A JP H09121854 A JPH09121854 A JP H09121854A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hirudin
- culture medium
- section
- cpy
- heating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims description 25
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 18
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 abstract description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 2
- IUVCFHHAEHNCFT-INIZCTEOSA-N 2-[(1s)-1-[4-amino-3-(3-fluoro-4-propan-2-yloxyphenyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl]ethyl]-6-fluoro-3-(3-fluorophenyl)chromen-4-one Chemical compound C1=C(F)C(OC(C)C)=CC=C1C(C1=C(N)N=CN=C11)=NN1[C@@H](C)C1=C(C=2C=C(F)C=CC=2)C(=O)C2=CC(F)=CC=C2O1 IUVCFHHAEHNCFT-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- -1 hirudin Chemical class 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 トランスフォームされた酵母の発酵によって
製造されるヒルジン含有培養培地中におけるヒルジンの
分解の原因となるのＣＰＹを、突然変異および／または
遺伝子工学的方法によって産生株を変化させることなく
あるいは化学阻害剤の作用によって溶液を汚染すること
なく、不活性化する方法の提供。 【解決手段】 トランスフォームされた酵母の発酵によ
って製造されるヒルジン含有培養培地中のカルボキシペ
プチダーゼＹを不活性化する方法において、加熱セクシ
ョン、保持セクションおよび冷却セクションを有する管
状装置を貫流する培養培地を８０〜１００℃の温度に連
続的に加熱することからなる方法。
製造されるヒルジン含有培養培地中におけるヒルジンの
分解の原因となるのＣＰＹを、突然変異および／または
遺伝子工学的方法によって産生株を変化させることなく
あるいは化学阻害剤の作用によって溶液を汚染すること
なく、不活性化する方法の提供。 【解決手段】 トランスフォームされた酵母の発酵によ
って製造されるヒルジン含有培養培地中のカルボキシペ
プチダーゼＹを不活性化する方法において、加熱セクシ
ョン、保持セクションおよび冷却セクションを有する管
状装置を貫流する培養培地を８０〜１００℃の温度に連
続的に加熱することからなる方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、トランスフォーム
された酵母の発酵によって製造されるヒルジン含有培養
培地中におけるカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）を
不活性化する方法に関する。
された酵母の発酵によって製造されるヒルジン含有培養
培地中におけるカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）を
不活性化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】本来ヒル（Hirudo medicinalis）から単
離されたポリペプチドであるヒルジンは、広範な治療的
可能性を有する高度に特異的なトロンビンインヒビター
である［F. Markwardt, Biomed. Biochim. Acta 44 (19
85) 1007-1013］。しかしながら、その所要量は、トラ
ンスフォームされた微生物を用いる遺伝子操作法によっ
てのみ製造できる。正しくフォールディングされ完全に
活性なヒルジンの製造には、宿主生物としてサッカロミ
セス属酵母（Saccharomyces cerevisiae）が適当である
ことが見出されている（EP A1 168 342、EP A1 200 65
5）。
離されたポリペプチドであるヒルジンは、広範な治療的
可能性を有する高度に特異的なトロンビンインヒビター
である［F. Markwardt, Biomed. Biochim. Acta 44 (19
85) 1007-1013］。しかしながら、その所要量は、トラ
ンスフォームされた微生物を用いる遺伝子操作法によっ
てのみ製造できる。正しくフォールディングされ完全に
活性なヒルジンの製造には、宿主生物としてサッカロミ
セス属酵母（Saccharomyces cerevisiae）が適当である
ことが見出されている（EP A1 168 342、EP A1 200 65
5）。
【０００３】遺伝子操作による組換えペプチドおよびタ
ンパク質の製造のための使用がとくに好ましい酵母、Sa
ccharomyces cerevisiaeは、酵素カルボキシペプチダー
ゼＹ（ＣＰＹ）を形成する。この酵素は、タンパク質の
Ｃ末端から各種のアミノ酸を非特異的に切断し、したが
ってタンパク質のカルボキシ末端の配列の決定に使用で
きる。当然、この酵素はまた、酵母中で発現された価値
のあるタンパク質、たとえばヒルジンのような薬理活性
化合物を、製造過程、とくにクロマトグラフィー精製時
に分解することもできる。これは副生物の形成と収率の
低下を招き、重要な問題になる場合がある。さらにそれ
がプレパレーション中、たとえば凍結乾燥物中になお痕
跡でも存在すると、高純度生成物の安定性を低下させ
る。
ンパク質の製造のための使用がとくに好ましい酵母、Sa
ccharomyces cerevisiaeは、酵素カルボキシペプチダー
ゼＹ（ＣＰＹ）を形成する。この酵素は、タンパク質の
Ｃ末端から各種のアミノ酸を非特異的に切断し、したが
ってタンパク質のカルボキシ末端の配列の決定に使用で
きる。当然、この酵素はまた、酵母中で発現された価値
のあるタンパク質、たとえばヒルジンのような薬理活性
化合物を、製造過程、とくにクロマトグラフィー精製時
に分解することもできる。これは副生物の形成と収率の
低下を招き、重要な問題になる場合がある。さらにそれ
がプレパレーション中、たとえば凍結乾燥物中になお痕
跡でも存在すると、高純度生成物の安定性を低下させ
る。
【０００４】この問題の解決法の一つには、ＣＰＹ活性
を様々な方法によって抑制または消失させた突然変異酵
母株の使用がある（たとえば、EP 390.607、EP 341 215
およびGB 2 249 096）。しかしながら、これらの方法
は、酵母株に比較的大きな変化を必要とし、微生物の増
殖挙動および／または生理学的安定性に限界を生じる可
能性がある。
を様々な方法によって抑制または消失させた突然変異酵
母株の使用がある（たとえば、EP 390.607、EP 341 215
およびGB 2 249 096）。しかしながら、これらの方法
は、酵母株に比較的大きな変化を必要とし、微生物の増
殖挙動および／または生理学的安定性に限界を生じる可
能性がある。
【０００５】ＣＰＹは化学的インヒビター、たとえばフ
ェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によっ
ても阻害できる。この種類の化学的阻害は、少なくとも
医薬的に活性化合物の場合には、時には検出できない部
分的誘導体化を招来することもあるので望ましくない。
ェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によっ
ても阻害できる。この種類の化学的阻害は、少なくとも
医薬的に活性化合物の場合には、時には検出できない部
分的誘導体化を招来することもあるので望ましくない。
【０００６】またＣＰＹの熱不安定性が報告されている
（Kuhnら：“Isolation and PartialCharacterization
of an Acid Carboxypeptidase from Yeast", Biochemis
try,13巻, 19号, 3871-3877頁, 1974）。すなわち、６
８℃、pH７.０における５分間の熱処理でＣＰＹは完全
に不活性化される。もっと低い温度では部分的不活性化
を招くのみである。
（Kuhnら：“Isolation and PartialCharacterization
of an Acid Carboxypeptidase from Yeast", Biochemis
try,13巻, 19号, 3871-3877頁, 1974）。すなわち、６
８℃、pH７.０における５分間の熱処理でＣＰＹは完全
に不活性化される。もっと低い温度では部分的不活性化
を招くのみである。
【０００７】酵母、Saccharomyces cerevisiae によっ
て発現され、培養培地中に分泌される７,０００ダルト
ンのタンパク質であるヒルジンは、これに反して、著し
い熱安定性を有する（Jui-Yoa Chang：“Stability of
Hirudin, a Thrombin-specificInhibitor", The Journa
l of Biological Chemistry, 266巻，17号, 10839-1084
3頁, 1991）。すなわち、たとえば９５℃、pH＝８.０で
３０分間処理したのちにもなお、初期の活性の９５％が
回服される。他方、ヒルジンは遊離のＣ末端を有し、し
たがって、ＣＰＹによる酵素的攻撃に対して実質的に無
防備に暴露される。
て発現され、培養培地中に分泌される７,０００ダルト
ンのタンパク質であるヒルジンは、これに反して、著し
い熱安定性を有する（Jui-Yoa Chang：“Stability of
Hirudin, a Thrombin-specificInhibitor", The Journa
l of Biological Chemistry, 266巻，17号, 10839-1084
3頁, 1991）。すなわち、たとえば９５℃、pH＝８.０で
３０分間処理したのちにもなお、初期の活性の９５％が
回服される。他方、ヒルジンは遊離のＣ末端を有し、し
たがって、ＣＰＹによる酵素的攻撃に対して実質的に無
防備に暴露される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】これに対して、本発明
の目的は、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ、熱不安
定性）とヒルジン（熱安定性）の対照的な性質を利用
し、ヒルジンを高度に保持させながら、トランスフォー
ムされた酵母の発酵によって製造されるヒルジン含有培
養培地中のＣＰＹを不活性化する方法を提供することに
ある。
の目的は、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ、熱不安
定性）とヒルジン（熱安定性）の対照的な性質を利用
し、ヒルジンを高度に保持させながら、トランスフォー
ムされた酵母の発酵によって製造されるヒルジン含有培
養培地中のＣＰＹを不活性化する方法を提供することに
ある。
【０００９】トランスフォームされた酵母からのヒルジ
ン含有発酵培地に関するガラスフラスコ中での本発明者
ら自身の実験室での実験により、６０℃の温度はＣＰＹ
をその酵素の不活性前駆体から見掛け上活性化すること
が見出された。これは、ヒルジンの暴露されたＣ末端に
対するＣＰＹの酵素的攻撃の増大およびＣ末端が短縮さ
れたヒルジンの形成を招来する。他方、８０℃では既
に、ヒルジンの化学的分解の結果としての副生物形成の
増大が起こる。１０分間を要して７０℃に加熱し、つい
で２０分間の不活性化時間を設け、続いて室温に冷却す
ると、ＣＰＹの不活性化と高いヒルジンの回収率が達成
される。
ン含有発酵培地に関するガラスフラスコ中での本発明者
ら自身の実験室での実験により、６０℃の温度はＣＰＹ
をその酵素の不活性前駆体から見掛け上活性化すること
が見出された。これは、ヒルジンの暴露されたＣ末端に
対するＣＰＹの酵素的攻撃の増大およびＣ末端が短縮さ
れたヒルジンの形成を招来する。他方、８０℃では既
に、ヒルジンの化学的分解の結果としての副生物形成の
増大が起こる。１０分間を要して７０℃に加熱し、つい
で２０分間の不活性化時間を設け、続いて室温に冷却す
ると、ＣＰＹの不活性化と高いヒルジンの回収率が達成
される。
【００１０】確実な不活性化と同時に生成物の高度な保
持のためのこの種の狭い温度／時間限界は、問題なく工
業的方法に移し変えることは不可能であり、しかも、決
定された加熱および冷却時間を工業的にたとえば攪拌タ
ンク中で実行することは、それらの容量依存性により、
きわめて困難である、今回、貫流熱交換器中における連
続処理によれば、かなり広い安全処理領域が得られるこ
とを見出した。
持のためのこの種の狭い温度／時間限界は、問題なく工
業的方法に移し変えることは不可能であり、しかも、決
定された加熱および冷却時間を工業的にたとえば攪拌タ
ンク中で実行することは、それらの容量依存性により、
きわめて困難である、今回、貫流熱交換器中における連
続処理によれば、かなり広い安全処理領域が得られるこ
とを見出した。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明はしたがって、ト
ランスフォームされた酵母の発酵によって製造されるヒ
ルジン含有培養培地中におけるカルボキシペプチダーゼ
Ｙを不活性化する方法において、加熱セクション、保持
セクションおよび冷却セクションを有する管状装置を貫
流する培養培地を８０〜１００℃の温度、好ましくは８
５〜９５℃、とくに好ましくは８５℃の温度に連続的に
加熱することからなる方法に関する。
ランスフォームされた酵母の発酵によって製造されるヒ
ルジン含有培養培地中におけるカルボキシペプチダーゼ
Ｙを不活性化する方法において、加熱セクション、保持
セクションおよび冷却セクションを有する管状装置を貫
流する培養培地を８０〜１００℃の温度、好ましくは８
５〜９５℃、とくに好ましくは８５℃の温度に連続的に
加熱することからなる方法に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明を以下に、とくにその好ま
しい実施態様について詳細に説明する。
しい実施態様について詳細に説明する。
【００１３】ＣＰＹを不活性化する装置は、最も単純な
実施態様においては、培養培地を好ましい温度範囲まで
移行させる加熱セクションとして静的ミキサーが装着さ
れていてもよい加熱可能な管部たとえば貫流熱交換器、
培養培地を好ましい温度範囲に保持する保持または不活
性化セクションとして絶縁管部および培養培地を室温に
冷却する冷却セクションとして冷却管部たとえば貫流熱
交換器からなる。
実施態様においては、培養培地を好ましい温度範囲まで
移行させる加熱セクションとして静的ミキサーが装着さ
れていてもよい加熱可能な管部たとえば貫流熱交換器、
培養培地を好ましい温度範囲に保持する保持または不活
性化セクションとして絶縁管部および培養培地を室温に
冷却する冷却セクションとして冷却管部たとえば貫流熱
交換器からなる。
【００１４】本発明の方法によれば、装置の加熱セクシ
ョンにおける培養培地の平均滞留時間は、４０〜６０秒
であることが好ましくい。
ョンにおける培養培地の平均滞留時間は、４０〜６０秒
であることが好ましくい。
【００１５】平均滞留時間は装置の設計と流速によって
設定される。装置は最初、脱イオンろ過水を用いて始動
させる。加熱セクションの終末端において好ましい温度
に到達したならば直ちに、流入液を水から培養培地に変
更する。
設定される。装置は最初、脱イオンろ過水を用いて始動
させる。加熱セクションの終末端において好ましい温度
に到達したならば直ちに、流入液を水から培養培地に変
更する。
【００１６】培養培地の不活性化後、この系内における
生成物の喪失を最小限にするため、続いて脱イオンろ過
水での操作条件下に装置を空運転する。こののちに初め
て熱の供給を停止する。
生成物の喪失を最小限にするため、続いて脱イオンろ過
水での操作条件下に装置を空運転する。こののちに初め
て熱の供給を停止する。
【００１７】７０℃の温度は、ＣＰＹの活性を急激に増
大させ同時にヒルジンの分解を増加させる。７５℃では
なおＣＰＹの初期値の約２％の残留活性が、また８０℃
においては約０.５％の活性が認められる。８５〜９５
℃の温度では初期の活性は約０.１％に低下し、生成物
の収率は９５％を与え、定量的な収率が得られる場合も
ある。この方法によって処理された生成物溶液は安定
で、さらに酵素的分解を示すことはない。温度＞１００
℃になると、化学的分解による高率な生成物の喪失を生
じる。
大させ同時にヒルジンの分解を増加させる。７５℃では
なおＣＰＹの初期値の約２％の残留活性が、また８０℃
においては約０.５％の活性が認められる。８５〜９５
℃の温度では初期の活性は約０.１％に低下し、生成物
の収率は９５％を与え、定量的な収率が得られる場合も
ある。この方法によって処理された生成物溶液は安定
で、さらに酵素的分解を示すことはない。温度＞１００
℃になると、化学的分解による高率な生成物の喪失を生
じる。
【００１８】用いられる培養培地は予備的にしか精製さ
れないので、不活性化すべき溶液中には、生成物のほか
に様々な他のタンパク質／副生成物および核酸ならびに
他の有機および無機成分がまだ存在する。熱交換を妨害
して温度を低下させることがある熱交換表面における沈
着および焼着を防止するために、本発明の方法における
装置の加熱セクションは好ましくは、内部表面は連続し
て機械的に清掃される熱交換器から構成される。
れないので、不活性化すべき溶液中には、生成物のほか
に様々な他のタンパク質／副生成物および核酸ならびに
他の有機および無機成分がまだ存在する。熱交換を妨害
して温度を低下させることがある熱交換表面における沈
着および焼着を防止するために、本発明の方法における
装置の加熱セクションは好ましくは、内部表面は連続し
て機械的に清掃される熱交換器から構成される。
【００１９】とくに好ましくは、市販品を入手可能でた
とえば果汁または発酵製品の滅菌に工業的に使用されて
いるいわゆる表面スクレープ熱交換器が用いられる。こ
れらの装置では、合成樹脂製のスクレーパーが加熱管の
内部のシャフト上で作動し、遠心力によって管壁に押し
つけられ、その結果として焼着は絶えず除去される。し
かしながら、熱交換の内部表面における沈着および焼着
を防止する他のすべての装置が本発明の方法に使用でき
る。
とえば果汁または発酵製品の滅菌に工業的に使用されて
いるいわゆる表面スクレープ熱交換器が用いられる。こ
れらの装置では、合成樹脂製のスクレーパーが加熱管の
内部のシャフト上で作動し、遠心力によって管壁に押し
つけられ、その結果として焼着は絶えず除去される。し
かしながら、熱交換の内部表面における沈着および焼着
を防止する他のすべての装置が本発明の方法に使用でき
る。
【００２０】本発明の方法においては、トランスフォー
ムされた酵母からの、とくに好ましくはSaccharomyces
cerevisiaeからのヒルジン含有培養培地が用いられる。
ムされた酵母からの、とくに好ましくはSaccharomyces
cerevisiaeからのヒルジン含有培養培地が用いられる。
【００２１】培養培地のpHは好ましくは６.２〜６.５で
ある。
ある。
【００２２】所望により、培養培地は装置の加熱セクシ
ョンにおいてマイクロ波によって加熱することができ
る。
ョンにおいてマイクロ波によって加熱することができ
る。
【００２３】本発明は、組換えヒルジン、とくにSaccha
romyces cerevisiae内で発現されたヒルジンを含有する
培養培地中のカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）の不
活性化に使用される。
romyces cerevisiae内で発現されたヒルジンを含有する
培養培地中のカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ）の不
活性化に使用される。
【００２４】ヒルジンは、少なくとも１０,０００ AT-U
／mgの比活性を有するペプチドトロンビン阻害剤を意味
すると理解され、これらは種Hirudo medicinalisの既知
のイソヒルジンから誘導され、これらの本質的な特徴、
とくに３つのジスルフィド橋の特徴的な結合を有する
［J.Dobtら, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366(1985)379-
385］、(EP A1 158 564、EP A1 168 342、DE 34 45 51
7、EP A2 193 175、EP A1200 655、EP A1 158 986、EP
A1 209 061、DE 33 42 199、EP A1 171 024をたとえば
参照）。
／mgの比活性を有するペプチドトロンビン阻害剤を意味
すると理解され、これらは種Hirudo medicinalisの既知
のイソヒルジンから誘導され、これらの本質的な特徴、
とくに３つのジスルフィド橋の特徴的な結合を有する
［J.Dobtら, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366(1985)379-
385］、(EP A1 158 564、EP A1 168 342、DE 34 45 51
7、EP A2 193 175、EP A1200 655、EP A1 158 986、EP
A1 209 061、DE 33 42 199、EP A1 171 024をたとえば
参照）。
【００２５】これはとくに、EP A1 171 024、EP A1 158
986およびEP A1 209 061に記載のヒルジンを意味する
ものと理解される。
986およびEP A1 209 061に記載のヒルジンを意味する
ものと理解される。
【００２６】本発明の方法はとくに、EP 0 324 712に開
示されているアミノ酸配列を有するヒルジン誘導体（[L
eu1,Thr2]−６３−デスルホヒルジン）を含有する培養
培地中のＣＰＹの不活性化に用いるのが好ましい。
示されているアミノ酸配列を有するヒルジン誘導体（[L
eu1,Thr2]−６３−デスルホヒルジン）を含有する培養
培地中のＣＰＹの不活性化に用いるのが好ましい。
【００２７】ここに開示されたこの不活性化方法の採用
により、全く初めて、突然変異および／または遺伝子工
学的方法によって産生株を変化させることなく、あるい
は化学阻害剤の作用によって溶液を汚染することなく、
ヒルジン含有溶液の後処理および精製を行うことが可能
になったのである。
により、全く初めて、突然変異および／または遺伝子工
学的方法によって産生株を変化させることなく、あるい
は化学阻害剤の作用によって溶液を汚染することなく、
ヒルジン含有溶液の後処理および精製を行うことが可能
になったのである。
【００２８】
【実施例】以下の実施例は、 トランスフォームされた
酵母の発酵によって産生されて、EP0 324 712に開示さ
れたアミノ酸配列をもつヒルジン誘導体（[Leu1,Thr2]
−６３−デスルホヒルジン）を含有する培養培地に関す
るものである。しかしながら、他のヒルジン、とくに冒
頭に言及したヒルジンについても同様の有利な結果を得
ることができる。
酵母の発酵によって産生されて、EP0 324 712に開示さ
れたアミノ酸配列をもつヒルジン誘導体（[Leu1,Thr2]
−６３−デスルホヒルジン）を含有する培養培地に関す
るものである。しかしながら、他のヒルジン、とくに冒
頭に言及したヒルジンについても同様の有利な結果を得
ることができる。
【００２９】一般的な説明：沈殿の結果として濁ってい
て温度Ｔ≦１０℃に冷却された不活性化すべき溶液を酢
酸または水酸化ナトリウム溶液によりpH＝６.４±０.１
に調整する。ヒーターとしてAPV Crepacoからの１ＨＯ
−６４８Ｓ／ＣＰ５０８型表面スクレープ熱交換器、保
持セクションおよびクーラーからなる熱不活性化装置
を、ついで、脱イオンろ過水（精製水）を用いて操作温
度まで運転する。熱交換器の個々のセクションにおける
平均滞留時間を選ばれた流速によって設定し、追跡実験
を用いて決定する（蛍光染料を脈動的に添加することお
よび蛍光センサーを用いる検出）。ヒーターの末端で所
望の温度（±１℃）が達成されたならば直ちに、流入液
を水から生成物溶液に交換する。溶液の不活性化後、こ
の系内における生成物の喪失を最小限にするため、続い
て脱イオンろ過水（精製水）での操作条件下に装置を空
運転し、こののちに初めて熱の供給を停止する。懸濁液
をろ過して、熱処理中に沈積した沈殿を分離する。
て温度Ｔ≦１０℃に冷却された不活性化すべき溶液を酢
酸または水酸化ナトリウム溶液によりpH＝６.４±０.１
に調整する。ヒーターとしてAPV Crepacoからの１ＨＯ
−６４８Ｓ／ＣＰ５０８型表面スクレープ熱交換器、保
持セクションおよびクーラーからなる熱不活性化装置
を、ついで、脱イオンろ過水（精製水）を用いて操作温
度まで運転する。熱交換器の個々のセクションにおける
平均滞留時間を選ばれた流速によって設定し、追跡実験
を用いて決定する（蛍光染料を脈動的に添加することお
よび蛍光センサーを用いる検出）。ヒーターの末端で所
望の温度（±１℃）が達成されたならば直ちに、流入液
を水から生成物溶液に交換する。溶液の不活性化後、こ
の系内における生成物の喪失を最小限にするため、続い
て脱イオンろ過水（精製水）での操作条件下に装置を空
運転し、こののちに初めて熱の供給を停止する。懸濁液
をろ過して、熱処理中に沈積した沈殿を分離する。
【００３０】ＣＰＹの濃度は以下に記載するＥＬＩＳＡ
を用いて測定する。ＣＰＹ ＥＬＩＳＡは原理的には本
技術分野の熟練者に知られた方法によって行われる（文
献：P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immu
noassays，in Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology, Burdon，R. H., van Knippen
berg, P. H.編，15巻，Elsevier, 1985）。
を用いて測定する。ＣＰＹ ＥＬＩＳＡは原理的には本
技術分野の熟練者に知られた方法によって行われる（文
献：P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immu
noassays，in Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology, Burdon，R. H., van Knippen
berg, P. H.編，15巻，Elsevier, 1985）。
【００３１】以下の特殊試薬を使用する。 コーティング緩衝液： ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ０.３１５ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １.２ｇ ナトリウムアジド ０.５ｇ 水で全容１リットルとする。 ブロック緩衝液：ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)１ｇ／１
リットルＰＢＳ(リン酸緩衝食塩溶液) ＭＳＴＢ緩衝液： ＭＯＰＳ(モルホリノプロパンスルホン酸) １０.４５ｇ ＳＤＳ １.０ｇ Triton Ｘ−１００ １.０ｇ ＢＳＡ １２.５ｇ 水で全容５００mlとし、ＮａＯＨでpH７.４に調整する。 洗浄緩衝液：０.５ｇのTween ２０／１リットルのＰＢ
Ｓ 接合緩衝液：Enzygnost(登録商標)用のMikrobiol、Behr
ingwerke Marburg、注文番号OUWW ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）：Enzygnost(登録商
標)用Combipack付加試薬／TBM，Behringwerke Marburg,
注文番号 OUVP 10／11 ＣＰＹ：カルボキシペプチダーゼ(酵母)１３５U/mg、た
とえばServa Heidelberg注文番号 16137 コーティング抗体：ヒツジ抗−ＣＰＹ、本技術の熟練者
に知られた方法により調製 検出抗体：ウサギ抗−ＣＰＹ、本技術の熟練者に知られ
た方法により調製、ペルオキシダーゼにより標識
リットルＰＢＳ(リン酸緩衝食塩溶液) ＭＳＴＢ緩衝液： ＭＯＰＳ(モルホリノプロパンスルホン酸) １０.４５ｇ ＳＤＳ １.０ｇ Triton Ｘ−１００ １.０ｇ ＢＳＡ １２.５ｇ 水で全容５００mlとし、ＮａＯＨでpH７.４に調整する。 洗浄緩衝液：０.５ｇのTween ２０／１リットルのＰＢ
Ｓ 接合緩衝液：Enzygnost(登録商標)用のMikrobiol、Behr
ingwerke Marburg、注文番号OUWW ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）：Enzygnost(登録商
標)用Combipack付加試薬／TBM，Behringwerke Marburg,
注文番号 OUVP 10／11 ＣＰＹ：カルボキシペプチダーゼ(酵母)１３５U/mg、た
とえばServa Heidelberg注文番号 16137 コーティング抗体：ヒツジ抗−ＣＰＹ、本技術の熟練者
に知られた方法により調製 検出抗体：ウサギ抗−ＣＰＹ、本技術の熟練者に知られ
た方法により調製、ペルオキシダーゼにより標識
【００３２】操作：マイクロテストプレートを、コーテ
ィング抗体（コーティング緩衝液中５μｇ／ml、１００
μｌ／ウエル）で満たし、１０℃において少なくとも７
日間インキュベートする。ついでコーティング溶液を除
去し、ブロック緩衝液２００μｌ／ウエルを加えてプレ
ートを３７℃で９０分間インキュベートする。次に、Ｃ
ＰＹサンプルを適用する。各実験に標準系列（ＭＳＴＢ
緩衝液中、ＣＰＹ １μｇ／ml〜０.００２ng／ml、１：
３希釈）を包含させる。未知サンプルを期待されるＣＰ
Ｙ濃度の関数としてＭＳＴＢ緩衝液中に希釈する。ブロ
ック緩衝液を除去したのち、全サンプルをプレートに１
００μｌ／ウエルで適用する。次に、プレートを３７℃
で９０分間インキュベートする。プレートをついで洗浄
緩衝液で３回洗浄する。検出抗体を適当な方法によっ
て、たとえば、Mikrobiol緩衝液＋１％標準ウサギ血清
中１：１０,０００に希釈し、ついでその１００μｌを
各ウエルにピペットで加える。次にプレートを３７℃で
９０分間インキュベートしたのち洗浄緩衝液で３回洗浄
する。結合したペルオキシダーゼはEnzygnost（登録商
標）用Combipack付加試薬／ＴＢＭからの試薬を用いて
検出する。すなわちＴＭＢ色素原を緩衝液／基質中１：
２０に希釈し、室温に加熱する。この１００μｌをプレ
ートの各ウエルに添加する。ついでプレートを室温で３
０分間インキュベートし、光の作用に対して保護する。
次に１００μｌの０.５ ＭＨ2ＳＯ4を加えて反応を停止
させ、発色をプレート光度計中において４５０nmで測定
する。未知サンプル中のＣＰＹ濃度は適当なコンピュー
タープログラム、たとえばTecnomara, FernwaldからのK
ineticCalc（登録商標）を用いて、標準系列に基づいて
計算される。
ィング抗体（コーティング緩衝液中５μｇ／ml、１００
μｌ／ウエル）で満たし、１０℃において少なくとも７
日間インキュベートする。ついでコーティング溶液を除
去し、ブロック緩衝液２００μｌ／ウエルを加えてプレ
ートを３７℃で９０分間インキュベートする。次に、Ｃ
ＰＹサンプルを適用する。各実験に標準系列（ＭＳＴＢ
緩衝液中、ＣＰＹ １μｇ／ml〜０.００２ng／ml、１：
３希釈）を包含させる。未知サンプルを期待されるＣＰ
Ｙ濃度の関数としてＭＳＴＢ緩衝液中に希釈する。ブロ
ック緩衝液を除去したのち、全サンプルをプレートに１
００μｌ／ウエルで適用する。次に、プレートを３７℃
で９０分間インキュベートする。プレートをついで洗浄
緩衝液で３回洗浄する。検出抗体を適当な方法によっ
て、たとえば、Mikrobiol緩衝液＋１％標準ウサギ血清
中１：１０,０００に希釈し、ついでその１００μｌを
各ウエルにピペットで加える。次にプレートを３７℃で
９０分間インキュベートしたのち洗浄緩衝液で３回洗浄
する。結合したペルオキシダーゼはEnzygnost（登録商
標）用Combipack付加試薬／ＴＢＭからの試薬を用いて
検出する。すなわちＴＭＢ色素原を緩衝液／基質中１：
２０に希釈し、室温に加熱する。この１００μｌをプレ
ートの各ウエルに添加する。ついでプレートを室温で３
０分間インキュベートし、光の作用に対して保護する。
次に１００μｌの０.５ ＭＨ2ＳＯ4を加えて反応を停止
させ、発色をプレート光度計中において４５０nmで測定
する。未知サンプル中のＣＰＹ濃度は適当なコンピュー
タープログラム、たとえばTecnomara, FernwaldからのK
ineticCalc（登録商標）を用いて、標準系列に基づいて
計算される。
【００３３】実施例１ 不活性化温度への加熱、不活性化および室温への冷却
は、装置の設計によって（スループット４００リットル
／ｈ±２０リットル／ｈ）それぞれ、６０秒（平均滞留
時間）にセットアップした。以下に掲げる結果は次の平
均滞留時間を用いて得られた。 加熱セクション：５０秒 不活性セクション：２８秒 冷却セクション：１２秒
は、装置の設計によって（スループット４００リットル
／ｈ±２０リットル／ｈ）それぞれ、６０秒（平均滞留
時間）にセットアップした。以下に掲げる結果は次の平
均滞留時間を用いて得られた。 加熱セクション：５０秒 不活性セクション：２８秒 冷却セクション：１２秒
【００３４】
【表１】 試薬のＣＰＹ濃度はＥＬＩＳＡによって検出した。この
試験の検出限界は０.５ng／mlである。
試験の検出限界は０.５ng／mlである。
【００３５】実施例２ スループットを変動させることにより、一般的説明の項
に記載の装置における加熱セクションに様々な滞留時間
をセットした。加熱セクションの末端および不活性化セ
クションにおける温度は85℃とした。表２には、培養培
地を処理した後ＥＬＩＳＡによって定量されたＣＰＹ濃
度を加熱セクションにおける平均滞留時間と対比して掲
げる。
に記載の装置における加熱セクションに様々な滞留時間
をセットした。加熱セクションの末端および不活性化セ
クションにおける温度は85℃とした。表２には、培養培
地を処理した後ＥＬＩＳＡによって定量されたＣＰＹ濃
度を加熱セクションにおける平均滞留時間と対比して掲
げる。
【００３６】
【表２】
【００３７】実施例３ ヒルジン含有培養培地を、一般的説明の項に記載の方法
によって各種の温度で処理し、滅菌ろ過（０.２μmのフ
ィルター）後のヒルジン含量を各場合について直ちにお
よびサンプルを２〜８℃に８日間保存後に、ＨＰＬＣ
［条件：静止相：LiChrosphere（登録商標）３００ Ｒ
Ｐ−１８、１０μm（Merck）；移動相Ａ：アセトノトリ
ル１６００ml／二重蒸留水４００ml／トリフルオロ酢酸
２ml；移動相Ｂ：二重蒸留水２０００ml／トリフルオロ
酢酸２ml；勾配Ａ／Ｂ＝２０：８０％〜８０：２０％；
流速：１.５ml／分；Ｔ＝４５℃］により定量した。結
果は表３に示す。
によって各種の温度で処理し、滅菌ろ過（０.２μmのフ
ィルター）後のヒルジン含量を各場合について直ちにお
よびサンプルを２〜８℃に８日間保存後に、ＨＰＬＣ
［条件：静止相：LiChrosphere（登録商標）３００ Ｒ
Ｐ−１８、１０μm（Merck）；移動相Ａ：アセトノトリ
ル１６００ml／二重蒸留水４００ml／トリフルオロ酢酸
２ml；移動相Ｂ：二重蒸留水２０００ml／トリフルオロ
酢酸２ml；勾配Ａ／Ｂ＝２０：８０％〜８０：２０％；
流速：１.５ml／分；Ｔ＝４５℃］により定量した。結
果は表３に示す。
【００３８】
【表３】
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 イエルク・メラー ドイツ連邦共和国65812バートゾーデン. アードルフ−コルピング−シユトラーセ18 (72)発明者 ヴオルフガング・ウルマー ドイツ連邦共和国65817エプシユタイン. ウンターデンウルメン６
Claims (8)
- 【請求項１】 トランスフォームされた酵母の発酵によ
って製造されるヒルジン含有培養培地中のカルボキシペ
プチダーゼＹを不活性化する方法において、加熱セクシ
ョン、保持セクションおよび冷却セクションを有する管
状装置を貫流する培養培地を８０〜１００℃の温度に連
続的に加熱することからなる方法。 - 【請求項２】 温度は８５〜９５℃である請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】 温度は８５℃である請求項２に記載の方
法。 - 【請求項４】 装置の加熱セクションにおける培養培地
の平均滞留時間は４０〜６０秒である請求項１〜３の一
つに記載の方法。 - 【請求項５】 装置の加熱セクションは内表面から付着
物が絶えず機械的に除去されている貫流熱交換器からな
る請求項１〜４の一つに記載の方法。 - 【請求項６】 トランスフォームされた酵母は Sacchar
omyces cerevisiaeである請求項１〜５の一つに記載の
方法。 - 【請求項７】 培養培地のpHは６.２〜６.５である請求
項１〜６の一つに記載の方法。 - 【請求項８】 培養培地はマイクロ波の作用により加熱
される請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19529997A DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1995-08-16 | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE19529997:3 | 1995-08-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121854A true JPH09121854A (ja) | 1997-05-13 |
| JP3233582B2 JP3233582B2 (ja) | 2001-11-26 |
Family
ID=7769532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21489296A Expired - Fee Related JP3233582B2 (ja) | 1995-08-16 | 1996-08-15 | ヒルジン含有培養培地中のカルボキシペプチダーゼｙを不活性化する方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5866399A (ja) |
| EP (1) | EP0758655B1 (ja) |
| JP (1) | JP3233582B2 (ja) |
| KR (1) | KR100458338B1 (ja) |
| AT (1) | ATE231166T1 (ja) |
| AU (1) | AU705341B2 (ja) |
| CA (1) | CA2183406C (ja) |
| DE (2) | DE19529997C1 (ja) |
| DK (1) | DK0758655T3 (ja) |
| ES (1) | ES2189845T3 (ja) |
| HK (1) | HK1012013A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120258519A1 (en) * | 2011-04-10 | 2012-10-11 | Therapeutic Proteins Inc. | Protein Harvesting |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4256590A (en) * | 1977-05-09 | 1981-03-17 | Exxon Research & Engineering Co. | Modified heteropolysaccharides and their preparation |
| US4299848A (en) * | 1979-06-08 | 1981-11-10 | International Telephone And Telegraph Corporation | Modified enzyme system to inhibit bread firming method for preparing same and use of same in bread and other bakery products |
| US4455290A (en) * | 1981-04-02 | 1984-06-19 | Research Corporation | Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1 |
| US4632780A (en) * | 1981-07-10 | 1986-12-30 | Seidah Nabil G | N-terminal fragment of human pro-opiomelanocortin and process therefor |
| IT1157340B (it) | 1982-11-29 | 1987-02-11 | F I M A | Dispositivo per collegare amovibilamente utensili abrasivi all'albero di levigatrici e simili |
| CA1341417C (fr) | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| DE3438296A1 (de) | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| DE3506992A1 (de) | 1985-02-27 | 1986-08-28 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Modifizierte hirudine, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| EP0324712B1 (de) | 1985-04-11 | 1993-04-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Hirudin-Derivat |
| FR2593518B1 (fr) | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
| AU614121B2 (en) | 1988-05-04 | 1991-08-22 | Novartis Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| FR2645175B1 (fr) | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| JP2543235B2 (ja) * | 1990-06-29 | 1996-10-16 | 松下電器産業株式会社 | Ｉｃカ―ドアダプタ |
| GB2249096A (en) | 1990-10-11 | 1992-04-29 | Ciba Geigy | Saccharomyces cerevisiae strains lacking carboxypeptidase yscY activity for expression of proteins at high yields |
| CA2100618A1 (en) * | 1992-07-29 | 1994-01-30 | Janice L. Bryson | Egg pasteurization |
-
1995
- 1995-08-16 DE DE19529997A patent/DE19529997C1/de not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-08-05 EP EP96112611A patent/EP0758655B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-05 AT AT96112611T patent/ATE231166T1/de active
- 1996-08-05 DE DE59610052T patent/DE59610052D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-05 ES ES96112611T patent/ES2189845T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-05 DK DK96112611T patent/DK0758655T3/da active
- 1996-08-12 US US08/695,434 patent/US5866399A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-14 KR KR1019960033769A patent/KR100458338B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-08-14 AU AU62061/96A patent/AU705341B2/en not_active Ceased
- 1996-08-15 CA CA002183406A patent/CA2183406C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-15 JP JP21489296A patent/JP3233582B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-11 HK HK98113228A patent/HK1012013A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2189845T3 (es) | 2003-07-16 |
| KR970010785A (ko) | 1997-03-27 |
| CA2183406C (en) | 2008-07-08 |
| JP3233582B2 (ja) | 2001-11-26 |
| DK0758655T3 (da) | 2003-04-14 |
| EP0758655B1 (de) | 2003-01-15 |
| HK1012013A1 (en) | 1999-07-23 |
| DE59610052D1 (de) | 2003-02-20 |
| DE19529997C1 (de) | 1997-04-10 |
| EP0758655A1 (de) | 1997-02-19 |
| ATE231166T1 (de) | 2003-02-15 |
| US5866399A (en) | 1999-02-02 |
| CA2183406A1 (en) | 1997-02-17 |
| AU6206196A (en) | 1997-03-06 |
| KR100458338B1 (ko) | 2005-01-27 |
| AU705341B2 (en) | 1999-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Van Dyck et al. | A single‐stranded DNA binding protein required for mitochondrial DNA replication in S. cerevisiae is homologous to E. coli SSB. | |
| EP0205475B2 (en) | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and dna sequences useful for same | |
| JP2004518444A (ja) | 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質 | |
| CA2025070C (en) | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homgeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
| JP2004507270A (ja) | 組換えヒト副甲状腺ホルモンを生産する形質転換酵母及び該ホルモンの生産方法 | |
| US6090585A (en) | Human collagenase inhibitor sequence, recombinant vector system for using same and recombinant-DNA method for the manufacture of same | |
| JPH09121854A (ja) | ヒルジン含有培養培地中のカルボキシペプチダーゼｙを不活性化する方法 | |
| US5565349A (en) | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase | |
| Kawaguchi et al. | Purification and some properties of a Haim-sensitive α-amylase from newly isolated Bacillus sp. No. 195 | |
| EP0435725B1 (en) | DNA having the genetic information of phospholipase D and its use | |
| JP2916206B2 (ja) | 生理活性ペプチド | |
| US5231010A (en) | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
| US4977085A (en) | Cloning and expression of yeast STE13 and Dpp2 genes encoding dipeptidyl aminopeptidase A and B | |
| JPH0616716B2 (ja) | 酵母におけるヒトｐｓｔｉの製造法 | |
| US5871956A (en) | Recombinant methods for production of serine inhibitors and DNA sequences useful for same | |
| Lindberg et al. | Characterization and comparison of a Neurospora crassa RNase purified from cultures undergoing each of three different states of derepression | |
| Kadokura et al. | Physiological and biochemical analysis of the effects of alkaline phosphatase overproduction in Escherichia coli | |
| JP2916205B2 (ja) | 生理活性ペプチド | |
| JP3164181B2 (ja) | 新規発現ベクタ−、該発現ベクタ−を保有する微生物、該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| US5304471A (en) | Process for producing foreign protein in Escherichia coli | |
| CA1340971C (en) | Metalloproteinase inhibitor sequence recombinant vector system for using the same and recombinant-dna method for the manufacture of same | |
| JP3887054B2 (ja) | 酵素の回収及び精製方法 | |
| JPS63237789A (ja) | プロアポリポタンパク質遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体 | |
| Richardson | The amino acid sequence of the tryptic peptides of the f1 bacteriophage coat protein: a thesis submitted to Massey University of the Manawatu in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science in Biochemistry | |
| Richardson | THE AMINO ACID SEQUENCE OF THE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20010814 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |