KR100458338B1 - 히루딘-함유 배양브로쓰에서 카복시펩티다아제y를 불활성화하는 방법 - Google Patents
히루딘-함유 배양브로쓰에서 카복시펩티다아제y를 불활성화하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100458338B1 KR100458338B1 KR1019960033769A KR19960033769A KR100458338B1 KR 100458338 B1 KR100458338 B1 KR 100458338B1 KR 1019960033769 A KR1019960033769 A KR 1019960033769A KR 19960033769 A KR19960033769 A KR 19960033769A KR 100458338 B1 KR100458338 B1 KR 100458338B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- culture broth
- hirudin
- cpy
- heating
- temperature
- Prior art date
Links
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 title abstract description 28
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 title abstract description 28
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 title abstract description 26
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 title abstract description 26
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 25
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 18
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002956 ash Substances 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002918 Fraxinus excelsior Nutrition 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 150000002410 histidine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Abstract
본 발명은, 가열부, 보유부 및 냉각부를 구비한 관형 장치에서 유동시키면서 배양 브로쓰를 80 내지 100℃, 바람직하게는 85 내지 95℃, 특히 바람직하게는 85℃의 온도까지 연속 가열하는 것을 포함하는, 형질전환 효모를 발효시켜 생산한 히루딘-함유 배양 브로쓰내 카복시펩티다아제 Y를 불활성화하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 형질전환 효모를 발효시켜 생산한 히루딘-함유 배양 브로쓰내의 카복시펩티다아제 Y(CPY)를 불활성화하는 방법에 관한 것이다.
거머리 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 처음으로 분리된 폴리펩티드 히루딘은 광범위한 치료적 잠재력이 있는 매우 특이한 트롬빈 억제제이다[참조: F. Markwardt, Biomed. Biochim. Acta 44 (1985) 1007-1013]. 그러나, 필요한 양은 형질전환된 미생물로 유전공학적 방법에 의해서만 생산될 수 있다. 효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)는, 정확히 배가되고(folded) 완전히 활성인 히루딘을 생산하기 위한 숙주 유기체로서 적합하다[참조: EP A1 168 342, EP A1 200 655].
재조합 펩티드 및 단백질의 유전공학적 생산을 위해 특히 바람직하게 사용되는 효모 사카로마이세스 세레비시에는, 효소 카복시펩티다아제 Y(CPY)를 형성한다. 이 효소는 단백질의 C-말단으로부터 비특이적으로 다양한 아미노산을 절단하고, 그럼으로써 단백질의 카복시-말단 서열을 결정하기위해 사용될 수 있다. 분명히, 이효소는 생산 과정동안, 특히 크로마토그래피 정제동안 효모에서 발현되는 가치 있는 단백질(예: 히루딘과 같은 생리학적으로 활성인 화합물)을 파괴할 수도 있다. 이는 부산물을 형성시키고 상당한 정도로 수율을 감소시킬 수 있다. 또한, 이는 제제 중, 예를 들면 동결건조물 중 미량으로 존재하는 경우에도, 고순도의 생성물의 안정성을 감소시킬 수 있다.
문제의 한 해결책은 CPY 활성이 다양한 방법에 의해 억제되거나 제거된 돌연변이 효모 균주를 사용하는 것이다[참조: EP 390 676, EP 341 215 및 GB 2 249 096]. 그러나, 이들 방법은 효모 균주에서 비교적 큰 변화를 필요로 하고 미생물의 성장 행동 및/또는 생리학적 안정성을 제한할 수 있다.
CPY는 또한 화학적 억제제, 예를 들어 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)에 의해 억제될 수 있다. 이러한 유형의 화학 억제제는 종종 측정할 수 없는 부분적인 유도체화를 초래할 수 있기 때문에 적어도 약제학적 활성 화합물의 경우에 바람직하지 않다.
또한, CPY의 열적 불안정성이 서술되어 있다[참조: Kuhn 등., " 효모로부터 산 카복시펩티다아제의 분리 및 부분적인 특성화", Biochemistry, Vol.13, No.19, pp3871-3877, 1974]. 그러므로, 68℃, pH=7.0에서 5분간의 가열처리는 CPY의 완전한 불활성화를 유도하고; 더 낮은 온도는 부분적인 불활성화를 유도한다.
효모 사카로마이세스 세레비시에에 의해 발현되어 배양 배지내로 분비되는 7,000 달톤 단백질 히루딘은 열적 안정성이 현저하므로[참조:Jui-Yoa Chang: "트롬빈-특이성 억제제 히루딘의 안정성" , The Journal of Biological Chemistry, Vol.266, No.17, pp10839-10843, 1991]; 예를 들어 95℃, pH8.0에서 30분 동안 처리 후에도 초기 활성의 95%가 여전히 회복된다. 반면, 히루딘은 유리 C 말단을 가지고 있어 CPY의 효소적인 공격에 대해 노출되어 실질적으로 보호되지 못한다.
본 발명의 목적은 CPY의 특성(열적 불안정성) 및 히루딘의 특성(열적 안정성)이 상반되는 것을 이용하여, 형질전환된 효모를 발효시켜 생산한 히루딘-함유 배양 브로쓰에서 히루딘은 고도로 보유하면서 카복시펩티다아제(CPY)를 불활성화하는 방법을 제공하는 것이다.
유리 플라스크에서 형질전환된 효모로부터 히루딘-함유 발효 브로쓰에 대한 실험실 실험으로 60℃의 온도는 효소의 불활성 전구체로부터 분명히 CPY를 불활성화시킨다는 것을 발견하였다. 이는 히루딘의 노출된 C 말단에 대한 강화된 효소적 CPY 공격을 유도하고 C 말단이 단축된 히루딘의 형성을 유도한다. 반면, 80℃는 히루딘을 화학적으로 붕괴시켜 부산물 형성을 증가시킨다. 10분에 걸쳐 70℃까지 가열하고 후속적으로 20분동안 불활성화시킨 후 후속적으로 실온으로 냉각시키면 CPY가 불활성화되고 히루딘의 회수율이 높아진다.
생성물을 고도로 보유하면서 믿을 수 있도록 불활성화시키기위한 이러한 좁은 범위의 온도/시간 방책은 산업적인 방법의 적용에서 문제없이 전환될수없고, 더욱이 측정된 가열 및 냉각 시간은 이들의 용적 의존성으로 인해 예를 들어 교반되는 탱크내에서 산업적으로 수행하기에 매우 어려웠다. 본 발명에 이르러, 통류형(flow-through)가열 교환기내에서의 연속 처리로 상당히 광범위하고 안전한공정 영역을 초래할 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 방법은, 가열부, 보유부 및 냉각부를 갖는 관형 장치를 통해 유동시키면서 배양 브로쓰를 80 내지 100℃, 바람직하게는 85 내지 95℃, 특히 바람직하게는 85℃의 온도까지 연속적으로 가열함을 포함하는, 형질전환된 효모를 발효시킴으로써 생산되는 히루딘-함유 배양 브로쓰에서 카복시펩티다아제 Y를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기에 상세히 서술되고, 특히 이의 바람직한 실시양태로 서술된다.
CPY를 불활성화 시키기 위한 장치는, 가장 단순한 실시양태에서, 이 관형 장치는, 배양 브로쓰가 바람직한 범위의 온도로 가열되는 가열부로서 스태틱 믹서(예컨대, 통류형 열교환기)가 구비된 가열관; 보유부 또는 불활성부로서 배양 브로쓰가 바람직한 온도범위로 유지되는 절연관; 및 냉각부로서 배양 브로쓰가 실온으로 냉각되는 냉각관(예컨대, 통류형 열교환기)을 포함합니다.
본 발명에 따른 방법에서, 장치의 가열부에서 배양 브로쓰의 평균 잔류 시간은 바람직하게는 40 내지 60초이다.
평균 잔류 시간은 장치 디자인 및 유속에 의해 설정될 수 있다. 이 장치는 먼저 탈염(demineralized) 여과수를 가지고 시작한다. 가열부의 말단에서 바람직한 온도 범위에 도달하면, 유입류를 물에서 배양 브로쓰로 바꾼다.
배양 브로쓰를 불활성화시킨 후에는 이 시스템내 생성물의 손실을 최소화하기 위해 탈염 여과수로 작동 조건하에서 장치를 공 작동시킨다. 이렇게 한 후에야 열을 차단한다.
70℃의 온도는 히루딘의 붕괴를 증가시키며 CPY의 활성을 급격히 증가시킨다. 75℃에서, 원래 값의 대략 2%의 CPY 잔류 활성이 여전히 관찰되고, 80℃에서 대략 0.5%의 값이 관찰된다. 85℃ 내지 95℃의 온도는 초기 활성을 대략 0.1%로 감소시키고; 생성물의 수율이 95%이며; 심지어 정량적 수율이 종종 수득된다. 이러한 방식으로 처리된 생성물 용액은 안정하고 더 이상의 효소적 붕괴를 보이지 않는다. 단지 100℃미만의 온도에서만 화학적 붕괴가 높은 생성물 손실을 유도한다.
사용된 배양 브로쓰는 단지 예비적으로 정제되기 때문에 생성물뿐만 아니라 다양한 기타 단백질/부산물 및 핵산 및 기타 유기 및 무기 성분이 불활성화 되는 용액중에 여전히 존재한다. 열교환기 표면상에 열 전달을 방해하고 온도를 감소시킬 수 있는 침전 및 재가 쌓이는 것을 방지하기위해, 본 발명에 따른 장치의 가열부는 바람직하게 내부 표면이 연속적으로 기계적으로 세척되는 열교환기를 포함한다.
특히 바람직하게, 예를 들어 과일 쥬스 또는 유제품을 저온살균 처리하기 위해 시판되고있고 산업적으로 사용되는 소위 스크레이프 표면(scraped surface) 열교환기가 사용된다. 이 장치에서 합성수지로 만들어진 스크레퍼는 가열관내 샤프트상에서 가동되고 원심력에 의해 관벽상으로 가압되어, 그 결과 재가 계속적으로 제거된다. 그러나, 내부 열교환기 표면상의 침전 및 재를 방지하기위한 모든 다른 장치가 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 형질전환된 효모, 특히 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시에로부터의 히루딘-함유 배양 브로쓰가 사용된다.
배양 브로쓰의 pH는 바람직하게는 6.2 내지 6.5이다.
임의로, 배양 브로쓰는 극초단파에 의해 장치의 가열부에서 가열될 수 있다.
본 발명은 히루딘, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시에에서 발현되는 히루딘을 포함하는 배양 브로쓰에서 카복시펩티다아제 Y(CPY)를 불활성화시키기위해 사용된다.
히루딘은 히루도 메디시날리스종의 공지된 이소히루딘으로부터 유도되고 이들의 본질적인 구조적 특성, 특히 3개의 디설피드 브릿지의 특징적인 연결을 갖는, 적어도 10,000AT-U/mg의 특이 활성을 갖는 펩티드 트롬빈 억제제를 의미한다[참조: J. Dodt등, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366(1985) 379-385, EP A1 158 564, EP A1 168 342, DE 34 45 517, EP A2 193 175, EP A1 200 655, EP A1 158 986, EP A1 209 061, DE 33 42 199, EP A1 171 024].
특히, 문헌[참조: EP A1 171 024, EP A1 158 986 및 EP A1 209 061]에서 서술된 바와 같은 히루딘을 의미한다.
본 발명의 방법은 특히 바람직하게는 EP 0 324 712에 기재된 아미노산 서열을 갖는 히루딘 유도체([Leu1, Thr2]-63-데설포히루딘)를 함유하는 배양 브로쓰에서 CPY를 불활성화시키기위해 사용된다.
[실시예]
하기 실시예는 형질전환된 효모를 발효시킴으로써 생산되고 EP 0 324 712에 서술된 아미노산 서열을 갖는 히루딘 유도체([Leu1, Thr2]-63-데설포히루딘)를 함유하는 배양 브로쓰에 관한 것이다. 그러나, 동일한 유익한 결과가 기타 히루딘, 특히 처음에 언급된 히루딘으로도 수득될 수 있다.
일반적인 지침:
침전의 결과로 흐려지고 온도 T가 10℃이하로 냉각된 불활성화시킬 용액을 아세트산 또는 수산화나트륨 용액으로 pH가 6.4±0.1이 되도록 조정한다. 가열기로서의 APV Crepaco사 제품, Type 1HO-648S/CP 508인 스크레이프 표면 열교환기, 보유부 및 냉각기를 포함하는 열 불활성화를 위한 장치를 광물질소실된 여과수(정제수)로 작동온도 이하에서 운전한다. 열교환기내 개개 섹션에서 평균 잔류 시간을 선택된 유속으로 설정하고 트레이스 실험(형광 염료의 펄스 첨가 및 형광 감광기를 사용한 검출)을 사용하여 측정한다. 가열기의 말단에서 목적하는 온도(±1℃)에 도달하면 유입류를 물에서 생성물 용액으로 바꾼다. 용액의 불활성화 후, 시스템내에서 생성물의 소실을 최소화하기위해 이 장치를 광물질소실된 여과수(정제수)로 작동 조건하에서 다시 공 운전한 후 가열을 정지한다. 현탁액을 가열 처리에서 침된 침전물을 분리하기위해 여과한다.
CPY 농도를 ELISA로 측정한다.
CPY ELISA를 원칙적으로 당업계에 공지된 방법으로 수행한다[참조: P.Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, in LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology(Burdon,R.H., van Knippenberg,P.H., Eds.) Vol.15, Elsevier 1985].
물 1ℓ로 제조된 코팅 완충액(NaH2PO4·2H2O 0.315g, Na2HPO4·2H2O 1.2g 및 나트륨 아지드 0.5g), 물 500㎖로 제조되고 NaOH로 pH가 7.4로 조정된 차단 완충액(소 혈청 알부민(BSA) 1g/ℓPBS(포스페이트 완충된 염수)) 및 MSTB 완충액(MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 10.45g, SDS 1.0g, 트리톤 X-100 1.0g 및 BSA 12.5g), 세척 완충액(PBS 1l당 트윈 20 0.5g), 공액 완충액(EnzygnostR에 대한 Mikrobiol, Behringwerke Marburg, Order No. OUWW), TMB(테트라메틸벤지딘)(EnzygnostR/TMB에 대한 콤비펙(combipack) 부가 시약, Behringwerke Marburg, Order No.OUVP 10/11), CPY(카복시펩티다아제(효모), 135U/mg, 예:Serva Heidelberg, Order No.16137), 코팅 항체(양 항-CPY, 당업계에서 공지된 방법에 의해 제조됨) 및 검출 항체(토끼 항-CPY, 당업계에서 공지된 방법에 의해 제조됨, 과산화효소로 표지됨)가 특수 시약으로 사용된다.
방법:
마이크로 테스트 플레이트를 코팅 항체로 충전시키고(코팅 완충액중 5㎍/ml, 100㎕/웰) 7일 이상동안 10℃에서 인큐베이션한다. 코팅 용액을 제거하고 차단 완충액 200㎕/웰을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 90분동안 인큐베이션한다. 이후 CPY 샘플을 적용시킨다. 각 실험에서, 표준 시리즈를 포함한다(MSTB 완충액중 1㎍/ml-0.002ng/ml의 CPY, 1:3 희석물). 미지의 샘플은 기대된 CPY 농도의 함수로서 MSTB 완충액에 예비희석시킨다. 차단 완충액을 제거한 후, 모든 샘플을 플레이트에 100㎕/웰로 적용한다. 플레이트를 37℃에서 90분동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척한다. 검출 항체를 적합한 방식, 예를 들어 Mikrobiol 완충액+1% 표준 토끼 혈청에 1:10,000으로 희석하고 이중 100㎕를 각 웰 내로 피펫팅한다. 플레이트를 37℃에서 90분동안 인큐베이션하고 세척 완충액으로 3회 세척한다. 결합된 과산화효소를 Enzygnost?/TMB에 대한 콤비펙 부가 시약으로부터 시약을 사용하여 검출한다: TMB 크로모겐을 완충액/기질중에 1:20으로 희석시키고 실온으로 가온한다. 이중 100㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 30분동안 인큐베이션하고 빛으로부터 보호한다. 반응을 0.5M H2SO4100㎕를 첨가함으로써 정지시키고 발색 반응을 450nm에서 플레이트 광측정기에서 측정한다. 미지의 샘플중 CPY 농도를 테크노마라, 페른발트(Tecnomara, Fernwald)사의 KinetiCalc?와 같은 적절한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 표준 시리즈를 기본으로 하여 계산한다.
실시예 1
불활성화 온도까지 가열, 불활성화 상태로 보유 및 실온으로의 냉각은 장치 디자인(처리량 400 1/h ±20 1/h)에 의해 각각 60초까지로 맞춘다. 하기 기록된 결과를 하기 평균 잔류 시간을 사용하여 수득한다.
가열부: 50초
보유부: 28초
냉각부: 12초d
[표 1]
다양한 온도에서 CPY의 불활성화
샘플의 CPY 농도를 ELISA로 측정한다. 이 시험의 검출 한계는 0.5ng/ml이다.
실시예 2
처리량을 변화시킴으로써 일반적인 지침에서 서술된 장치의 가열부에서 잔류 시간을 다양하게 맞춘다. 가열부의 말단 및 보유부에서의 온도는 85℃이다. 표2에서 배양 브로쓰의 처리후 ELISA에 의해 측정된 CPY 농도를 가열부에서 평균 잔류 시간과 비교하여 기록한다.
[표 2]
85℃에서 불활성화후 CPY 농도(변동 평균 잔류시간 또는 가열 시간)
실시예 3
히루딘-함유 배양 브로쓰를 일반적인 지침에서 서술된 방법에 따라 다양한 온도에서 처리하고, 멸균 여과(0.2㎛ 필터)후 히루딘 함량을, 즉시 및 샘플을 8일 동안 2 내지 8℃에서 저장 후 각 경우에 HPLC(조건: 정지상: LiChrospher?300 RP-18, 10㎛(Merck); 이동상 A: 아세토니트릴 1600ml/2회 증류수 400ml/트리플루오로아세트산 2ml; 이동상 B: 2회 증류수 2000ml/트리플루오로아세트산 2ml; 구배: A/B=20:80%-80:20%; 유속:1.5ml/분; T=45℃)로 측정한다. 결과를 표3에 나타낸다.
[표 3]
본원에서 서술된 이 불활성화 방법을 사용함으로써, 히루딘 함유 용액의 후처리 및 정제가 돌연변이 및/또는 유전공학적 방법에 의한 생산 균주의 변화 없이 또는 화학억제제의 작용에 의한 용액의 오염 없이 최초로 가능하게 되었다.
Claims (8)
- 가열부, 보유부 및 냉각부를 구비한 관형 장치에서 배양 브로쓰를 유동시키면서 80 내지 100℃로 연속 가열하는 것을 포함하는, 형질전환 효모를 발효시켜 생산한 히루딘-함유 배양 브로쓰에서 카복시펩티다아제 Y를 불활성화하는 방법.
- 제1항에 있어서, 온도가 85 내지 95℃인 방법.
- 제2항에 있어서, 온도가 85℃인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 장치의 가열부에서 배양 브로쓰의 평균 잔류 시간이 40 내지 60초인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 장치의 가열부가 내부 표면이 기계적으로 연속 세척되는 통류형 열교환기를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 형질전환된 효모가 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 브로쓰의 pH가 6.2 내지6.5인 방법.
- 제1항에 있어서, 배양 브로쓰가 극초단파의 작용에 의해 가열되는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19529997A DE19529997C1 (de) | 1995-08-16 | 1995-08-16 | Verfahren zur Inaktivierung von Carboxypeptidase Y in hirudinhaltigen Kulturbrühen |
| DE19529997.3 | 1995-08-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR970010785A KR970010785A (ko) | 1997-03-27 |
| KR100458338B1 true KR100458338B1 (ko) | 2005-01-27 |
Family
ID=7769532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019960033769A KR100458338B1 (ko) | 1995-08-16 | 1996-08-14 | 히루딘-함유 배양브로쓰에서 카복시펩티다아제y를 불활성화하는 방법 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5866399A (ko) |
| EP (1) | EP0758655B1 (ko) |
| JP (1) | JP3233582B2 (ko) |
| KR (1) | KR100458338B1 (ko) |
| AT (1) | ATE231166T1 (ko) |
| AU (1) | AU705341B2 (ko) |
| CA (1) | CA2183406C (ko) |
| DE (2) | DE19529997C1 (ko) |
| DK (1) | DK0758655T3 (ko) |
| ES (1) | ES2189845T3 (ko) |
| HK (1) | HK1012013A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120258519A1 (en) * | 2011-04-10 | 2012-10-11 | Therapeutic Proteins Inc. | Protein Harvesting |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4256590A (en) * | 1977-05-09 | 1981-03-17 | Exxon Research & Engineering Co. | Modified heteropolysaccharides and their preparation |
| US4299848A (en) * | 1979-06-08 | 1981-11-10 | International Telephone And Telegraph Corporation | Modified enzyme system to inhibit bread firming method for preparing same and use of same in bread and other bakery products |
| US4455290A (en) * | 1981-04-02 | 1984-06-19 | Research Corporation | Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1 |
| US4632780A (en) * | 1981-07-10 | 1986-12-30 | Seidah Nabil G | N-terminal fragment of human pro-opiomelanocortin and process therefor |
| IT1157340B (it) | 1982-11-29 | 1987-02-11 | F I M A | Dispositivo per collegare amovibilamente utensili abrasivi all'albero di levigatrici e simili |
| CA1341417C (fr) | 1984-03-27 | 2003-01-21 | Paul Tolstoshev | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| DE3438296A1 (de) | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445517C2 (de) | 1984-12-13 | 1993-11-18 | Ciba Geigy | Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins |
| DE3506992A1 (de) | 1985-02-27 | 1986-08-28 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Modifizierte hirudine, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| EP0324712B1 (de) | 1985-04-11 | 1993-04-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Hirudin-Derivat |
| FR2593518B1 (fr) | 1985-05-02 | 1989-09-08 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees |
| DE3689525D1 (de) | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
| AU614121B2 (en) | 1988-05-04 | 1991-08-22 | Novartis Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| FR2645175B1 (fr) | 1989-03-31 | 1994-02-18 | Transgene Sa | Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche |
| JP2543235B2 (ja) * | 1990-06-29 | 1996-10-16 | 松下電器産業株式会社 | Ｉｃカ―ドアダプタ |
| GB2249096A (en) | 1990-10-11 | 1992-04-29 | Ciba Geigy | Saccharomyces cerevisiae strains lacking carboxypeptidase yscY activity for expression of proteins at high yields |
| CA2100618A1 (en) * | 1992-07-29 | 1994-01-30 | Janice L. Bryson | Egg pasteurization |
-
1995
- 1995-08-16 DE DE19529997A patent/DE19529997C1/de not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-08-05 EP EP96112611A patent/EP0758655B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-05 AT AT96112611T patent/ATE231166T1/de active
- 1996-08-05 DE DE59610052T patent/DE59610052D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-05 ES ES96112611T patent/ES2189845T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-05 DK DK96112611T patent/DK0758655T3/da active
- 1996-08-12 US US08/695,434 patent/US5866399A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-14 KR KR1019960033769A patent/KR100458338B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-08-14 AU AU62061/96A patent/AU705341B2/en not_active Ceased
- 1996-08-15 CA CA002183406A patent/CA2183406C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-15 JP JP21489296A patent/JP3233582B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-11 HK HK98113228A patent/HK1012013A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2189845T3 (es) | 2003-07-16 |
| KR970010785A (ko) | 1997-03-27 |
| JPH09121854A (ja) | 1997-05-13 |
| CA2183406C (en) | 2008-07-08 |
| JP3233582B2 (ja) | 2001-11-26 |
| DK0758655T3 (da) | 2003-04-14 |
| EP0758655B1 (de) | 2003-01-15 |
| HK1012013A1 (en) | 1999-07-23 |
| DE59610052D1 (de) | 2003-02-20 |
| DE19529997C1 (de) | 1997-04-10 |
| EP0758655A1 (de) | 1997-02-19 |
| ATE231166T1 (de) | 2003-02-15 |
| US5866399A (en) | 1999-02-02 |
| CA2183406A1 (en) | 1997-02-17 |
| AU6206196A (en) | 1997-03-06 |
| AU705341B2 (en) | 1999-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ferreira et al. | Isolation of bradykinin-potentiating peptides from Bothrops jararaca venom | |
| Bricas et al. | The Cell Wall Peptidoglycan of Bacillus megaterium KM. I. Studies on the Stereochemistry of α, α'-Diaminopimelic Acid | |
| CN100365125C (zh) | 来源于酵母的新型细胞壁锚定蛋白及其基因和使用其的细胞表面表达系统 | |
| US5270176A (en) | Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin | |
| CN115109131B (zh) | 一种多克隆抗体在制备鉴别微孢子虫试剂中的应用 | |
| DK165750B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af humant gamma-interferonlignende polypeptid, polydeoxyribonucleotid, der koder for polypeptidet, plasmid indeholdende polydeoxyribonucleotidet samt en vaert for dette plasmid | |
| KR100458338B1 (ko) | 히루딘-함유 배양브로쓰에서 카복시펩티다아제y를 불활성화하는 방법 | |
| JP2004507270A (ja) | 組換えヒト副甲状腺ホルモンを生産する形質転換酵母及び該ホルモンの生産方法 | |
| KR100291528B1 (ko) | 딕티오스텔륨 디펩티딜아미노펩티다아제 | |
| US5486470A (en) | Purified herpes simplex virus protease and methods of purification | |
| Rocque et al. | Replication-associated activities of purified human papillomavirus type 11 E1 helicase | |
| AU636370B2 (en) | Metalloproteinase inhibitor sequence recombinant vector system for using same and recombinant-dna method for the manufacture of same | |
| CN112481236B (zh) | 一种重组蛋白INP-AidH及其制备方法和应用 | |
| US5190875A (en) | Peptide amidase and the use thereof | |
| JPH0880196A (ja) | タンナーゼ遺伝子を含有するｄｎａ断片、新規な組み換え体プラスミド、タンナーゼの製造方法およびプロモーター | |
| KR950010817B1 (ko) | 사카로미세스 세레비시아에에서 재조합 인간 psti의 제법 | |
| EP0444605A2 (en) | Angiotensin converting enzyme inhibitor, method for preparing it, composition containing the same and use thereof | |
| Rosenthal et al. | Characterization of the presumed peptide cross-links in the soluble peptidoglycan fragments synthesized by protoplasts of Streptococcus faecalis | |
| US4977085A (en) | Cloning and expression of yeast STE13 and Dpp2 genes encoding dipeptidyl aminopeptidase A and B | |
| JP3164181B2 (ja) | 新規発現ベクタ−、該発現ベクタ−を保有する微生物、該微生物を用いる有用物質の製造法 | |
| Lindberg et al. | Characterization and comparison of a Neurospora crassa RNase purified from cultures undergoing each of three different states of derepression | |
| JPH09275982A (ja) | エステル分解酵素遺伝子およびそれを用いるエステル分解酵素の製造法 | |
| CA1340971C (en) | Metalloproteinase inhibitor sequence recombinant vector system for using the same and recombinant-dna method for the manufacture of same | |
| Richardson | The amino acid sequence of the tryptic peptides of the f1 bacteriophage coat protein: a thesis submitted to Massey University of the Manawatu in partial fulfilment of the requirements for the degree of Master of Science in Biochemistry | |
| JPH06253883A (ja) | Ｃ型肝炎ウィルスエンベロ−プ蛋白質の 製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| A201 | Request for examination | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121109 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131031 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |