JPH0892288A - Ｇ１停止解除蛋白、それをコードする核酸塩基配列及び該蛋白の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細胞サイクルを制御する蛋白及びそれをコー
ドする遺伝子。 【構成】 特定の配列を有する、動物細胞のＧ１停止状
態を解除することができる蛋白、それをコードする遺伝
子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は細胞、特に動物細胞の細
胞サイクルの停止状態を解除することができる蛋白、そ
れをコードする塩基配列及びその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞は増殖するときにＧ₁→Ｓ→Ｇ₂
→Ｍ→Ｇ₁の段階に分かれた細胞増殖周期に従って段階
移行し、増殖していく。また、静止状態といわれる増殖
を停止した状態ではＧ₀状態であり、増殖刺激を受ける
ことによりＧ₀→Ｇ₁と移行してその後細胞増殖周期が開
始される。そのコントロールは生体機能を維持する上で
きわめて重要である。このサイクルがどんどん回ること
が必要な場合としては生体内では組織を新たに作り出し
ていくときである。また、細胞を医療的・工業的目的に
より体外で増殖を図るとき、この増殖サイクルが調子良
く回る必要がある。一方生体内で組織が充分構築された
後では多くの組織細胞は増殖が停止しているかきわめて
緩徐に進むだけである。

【０００３】生体内でこのような制御の異常が発生して
いる場合の例としては腫瘍があるが、この場合はサイク
ルが停止し得ずに増殖サイクルが進行するため異常な細
胞増殖が惹起されているものである。

【０００４】一方培養細胞においても増殖の制御やその
異常は種々知られている。例えば特に異常を有さない培
養細胞は３３℃から３９．５℃の温度範囲で充分な栄養
の存在下細胞密度があまり高くない条件で培養すると順
調な増殖がみられるが、栄養が枯渇すると増殖がＧ₁で
停止してしまう、いわゆるＧ１停止（Ｇ１アレスト）が
生じる。また細胞によっては細胞密度が高くなると同様
に細胞増殖が停止し、これは接触阻害と称される。また
例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン等の突然変異誘起剤で処理することにより突然変異
を起こした細胞の中にはいわゆる細胞周期の温度感受性
変異細胞が存在し、これは３３℃付近ではＧ１停止は起
こらず増殖サイクルは回るが、３９℃に温度を上げると
Ｇ１停止が生じてしまうものである。

【０００５】

【発明の構成】本発明は、上記Ｇ１停止を解除すること
ができる蛋白及びそれをコ−ドする核酸塩基配列並びに
該蛋白の製造方法である。即ち、本発明は （１）下記アミノ酸配列又はその１又は複数のアミノ酸
が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列を有する動物細
胞のＧ１停止を解除しうる蛋白、

【０００６】

【化３】 Met Lys Lys Glu His Val Leu 1 5 His Cys Gln Phe Ser Ala Trp Tyr Pro Phe Phe Arg Gly Val Thr Ile 10 15 20 Lys Ser Val Ile Leu Pro Leu Pro Gln Asn Val Lys Asp Tyr Leu Leu 25 30 35 Asp Asp Gly Thr Leu Val Val Ser Gly Arg Asp Asp Pro Pro Thr His 40 45 50 55 Ser Gln Pro Asp Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Ile Gln Trp Ser Asp 60 65 70 Asp Glu Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ala Pro Glu Phe Pro Glu Phe Ala 75 80 85 Thr Lys Val Gln Glu Pro Ile Asn Ser Leu Gly Gly Ser Val Phe Pro 90 95 100 Lys Leu Asn Trp Ser Ala Pro Arg Asp Ala Tyr Trp Ile Ala Met Asn 105 110 115 Ser Ser Leu Lys Cys Lys Thr Leu Ser Asp Ile Phe Leu Leu Phe Lys 120 125 130 135 Ser Ser Asp Phe Ile Thr Arg Asp Phe Thr Gln Pro Phe Ile His Cys 140 145 150 Thr Asp Asp Ser Pro Asp Pro Cys Ile Glu Tyr Glu Leu Val Leu Arg 155 160 165 Lys Trp Cys Glu Leu Ile Pro Gly Ala Glu Phe Arg Cys Phe Val Lys 170 175 180 Glu Asn Lys Leu Ile Gly Ile Ser Gln Arg Asp Tyr Thr Gln Tyr Tyr 185 190 195 Asp His Ile Ser Lys Gln Lys Glu Glu Ile Arg Arg Cys Ile Gln Asp 200 205 210 215 Phe Phe Lys Lys His Ile Gln Tyr Lys Phe Leu Asp Glu Asp Phe Val 220 225 230 Phe Asp Ile Tyr Arg Asp Ser Arg Gly Lys Val Trp Leu Ile Asp Phe 235 240 245 Asn Pro Phe Gly Glu Val Thr Asp Ser Leu Leu Phe Thr Trp Glu Glu 250 255 260 Leu Ile Ser Glu Asn Asn Leu Asn Gly Asp Phe Ser Glu Val Asp Ala 265 270 275 Gln Glu Gln Asp Ser Pro Ala Phe Arg Cys Thr Asn Ser Glu Val Thr 280 285 290 295 Val Gln Pro Ser Pro Tyr Leu Ser Tyr Arg Leu Pro Lys Asp Phe Val 300 305 310 Asp Leu Ser Thr Gly Arg Asp Ala His Lys Leu Ile Asp Phe Leu Lys 315 320 325 Leu Lys Arg Asn Gln Gln Glu Asp Asp 330 335 （２）上記項（１）の蛋白をコードする核酸塩基配列、
（３）下記配列の暗号鎖を有する核酸塩基配列、

【０００７】

【化４】 AXG AAG AAG GAG CAX GXG CXX CAC XGC CAG XXC XCC GCG XGG XAC CCG XXC XXC CGA GGC GXX ACC AXC AAG AGX GXC AXX CXX CCA CXX CCX CAG AAX GXG AAG GAX XAX XXA CXC GAX GAX GGA ACX CXG GXG GXX XCA GGA AGG GAX GAX CCA CCA ACA CAX XCX CAG CCA GAC AGX GAX GAX GAA GCA GAA GAA AXA CAG XGG XCX GAX GAX GAG AAC ACA GCC ACG CXX ACG GCA CCA GAA XXX CCX GAG XXX GCC ACX AAA GXC CAG GAA CCX AXC AAX XCC CXC GGG GGC AGX GXC XXX CCX AAG CXX AAX XGG AGX GCC CCA AGG GAX GCG XAX XGG AXA GCA AXG AAX AGX XCX CXG AAA XGX AAA ACC CXC AGC GAC AXC XXX CXG CXX XXC AAG AGX XCC GAX XXC AXC ACX CGX GAC XXC ACX CAG CCG XXX AXX CAX XGX ACX GAX GAX XCX CCA GAX CCA XGX AXA GAA XAX GAG CXC GXX CXC CGA AAA XGG XGX GAA XXG AXX CCX GGG GCX GAG XXX CGA XGX XXX GXC AAG GAA AAC AAG CXX AXX GGX AXX XCX CAA AGA GAC XAC ACA CAA XAC XAX GAX CAX AXX XCX AAA CAA AAG GAA GAA AXX CGC AGA XGC AXA CAA GAC XXX XXC AAG AAA CAC AXA CAG XAC AAA XXC XXA GAX GAA GAC XXX GXG XXC GAX AXA XAC AGA GAC AGX AGG GGG AAG GXG XGG CXC AXX GAC XXX AAX CCA XXX GGX GAA GXC ACA GAX XCA CXG CXG XXC ACC XGG GAA GAA CXG AXA XCX GAG AAC AAC XXA AAC GCC GAX XXX AGX GAA GXX GAC GCX CAA GAG CAG GAX XCC CCA GCX XXC CGX XGC ACA AAC AGX GAA GXG ACA GXC CAG CCC AGC CCC XAX XXG AGX XAC CGG CXA CCC AAG GAC XXX GXA GAC CXC XCX ACX GGG AGG GAC GCX CAC AAG CXA AXA GAC XXC CXX AAG CXG AAG AGA AAX CAG CAG GAG GAC GAC ［但し、ＸはＴ又はＵを表す］、及び（４）上記項
（２）又は（３）記載の核酸塩基配列を基にして宿主細
胞内でポリペプチドを生合成させることを特徴とする、
動物細胞のＧ１停止を解除しうる蛋白の製造方法であ
る。

【０００８】本発明の蛋白を３Ｙ１ｔｓＤ１２３やＳＶ
−３Ｙ１ｔｓＤ１２３細胞中で発現させると本来これら
の細胞が持っていた非許容温度（約３９℃）でのＧ１停
止という特性が消失する。この蛋白は本発明の遺伝子が
コードする分子量約４．２万の蛋白質である。本蛋白や
それをコードする遺伝子を用いれば細胞のＧ１停止を解
除して所望の細胞増殖を行わせることができる。また本
蛋白に対する抗体やアンチセンス遺伝子を用いることに
より望ましくない細胞増殖を停止させることができる。

【０００９】また本発明の関係する重要な性質として、
非許容温度における生存性がある。３Ｙ１ｔｓＤ１２３
は非許容温度でＧ１停止が生じる。この細胞にＳＶ４０
ラージＴ遺伝子やアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を導入す
ると非許容温度でＧ１停止が生ぜず、３日以内に細胞死
が生ずる。３Ｙ１ｔｓＤ１２３で突然変異を起こした遺
伝子はこのように興味有る性質と関係しており、癌化な
どと密接な関係が示唆されている。本発明ではＳＶ４０
で形質転換した３Ｙ１ｔｓＤ１２３を使用し、この興味
有る現象に関与する遺伝子を明らかにしたものであり、
本遺伝子の導入だけで上記と同じ効果を発揮させること
ができる。

【００１０】本発明の遺伝子は温度感受性株を利用し、
非許容温度においてヒト包皮由来ｃＤＮＡライブライー
を細胞に導入することにより所望の遺伝子を検索するこ
とにより達成した。驚くべき事であるが通常の方法では
自然の復帰突然変異が当該操作で誘導されるためか、目
的とする遺伝子をクローニングするための細胞を得るこ
とが全くできなかった。本発明者はこの復帰突然変異の
影響を除く方法を鋭意検討することにより目的の細胞を
見い出すに至った。即ち、細胞の制御には様々な要因が
関与しており、３Ｙ１ｔｓＤ１２３細胞を使用した場合
には本遺伝子の効果を形質で検出しようとしたとき環境
要因の影響から分離して本遺伝子の形質への効果を検出
することが困難である。それに対し、３Ｙ１ｔｓＤ１２
３をＳＶ４０で形質転換することにより、本遺伝子の細
胞形質に対する効果を顕在化させ得ることを利用するこ
とにより本遺伝子のクローニングを成功なさしめたもの
である。かくして当該方法を利用してクローニングする
事により候補遺伝子として約１．７キロベースのｃＤＮ
Ａを得た。驚くべき事に該遺伝子産物は単独で動物細胞
のＧ１停止を３Ｙ１ｔｓＤ１２３株の非許容温度で解除
するにも関わらず、血清不足による細胞周期停止に関し
ては発現が変動しなかったことから、血清不足による細
胞周期停止には関係していない事が示唆されるものであ
る。取得した遺伝子は全く類似のものが知られていない
新規なものであり、血清による細胞周期停止とはおそら
く関係が薄いなど既知のものでは全く知られていなかっ
た興味有る性質を持つものである。

【００１１】

【実施例】

１．細胞の培養 ＳＶ−３Ｙ１ｔｓＤ１２３細胞株や他の細胞は１０％Ｃ
Ｏ₂雰囲気下、１０％牛胎児血清を添加したダルベッコ
修飾イーグル培地（ＤＥＭ）で培養が行われている。温
度感受性変異株は許容温度として３３．８℃±０．１
℃、非許容温度として３９．８℃±０．１℃をもって培
養された。その他の株は３７℃で培養された。

【００１２】３Ｙ１ｔｓＤ１２３細胞株（理化学研究所
細胞開発銀行 ＲＣＢ０３１３）はラット線維芽細胞株
３Ｙ１を突然変異誘起剤Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンで処理することにより得られる突
然変異株中より許容温度ではＧ１停止が生じないが非許
容温度ではＧ１停止が生じるような細胞株として取得さ
れた（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０巻１７ー２８頁、１
９８４年）。３Ｙ１ｔｓＤ１２３株をＳＶ４０により形
質転換することによりＳＶ−３Ｙ１ｔｓＤ１２３細胞が
得られた（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１０巻２９ー３６頁、
１９８４）。

【００１３】２．ｃＤＮＡ遺伝子導入と温度耐性形質転
換株の取得 形質転換にはｐｃＤ２Ｂａｓｉｎｇｅｒヒト包皮ｃＤＮ
Ａライブラリー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，２
７４５−２７５２）を使用した。このライブラリー中の
ｃＤＮＡはＳＶ−４０の遺伝子要素に基づくヒトｃＤＮ
Ａ転写用遺伝子配列の支配下にヒト包皮由来ｃＤＮＡを
保持しており、そのプラスミド中にはその他にＳＶ４０
複写開始点、Ｇ４１８耐性を与えるネオマイシン耐性遺
伝子が含まれるとともに、大腸菌内でも遺伝子操作が実
施できるようにｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺
伝子、大腸菌用転写開始点を含んでいる。またｃＤＮＡ
部分はＢａｍＨＩ消化により切り出すことが可能であ
る。ｃＤＮＡ導入は対数増殖期細胞（１０⁶細胞／８．
６ｃｍ培養皿）に対して、２０μｇの該ｃＤＮＡライブ
ラリープラスミドを用い、ｐＨ６．９にてリン酸カルシ
ウム法にて実施した（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
７，２７４５−２７５２）。形質転換後３％ＣＯ₂雰囲
気下で１５時間培養した。細胞を１３．７ｃｍ培養皿に
播種し直した後許容温度で１日培養し、その後４００μ
ｇＧ４１８存在下で９日間、３日毎に培地を交換しなが
ら許容温度で培養し薬剤耐性株をスクリーニングした。
その後非許容温度に移し、３ないし４日毎に培地を交換
しながらＧ４１８存在下１０日間培養した。さらに、非
許容温度で培養を継続することにより温度感受性から突
然変異形質を失い非許容温度でもＧ１停止の生じない細
胞株（以下温度耐性株と称する）を取得した。

【００１４】このようにして得られた温度耐性株を培養
後ＳＤＳ−ＲＮａｓｅ−プロテイナーゼＫ処理により溶
解、ＲＮＡ分解を行った後、エタノールにてＤＮＡを沈
殿させ、これをガラス棒を用いることにより回収した。
回収したＤＮＡを新たなＳＶ３Ｙ１ｔｓＤ１２３細胞に
リン酸カルシウム法により導入した。この操作により得
られた温度耐性株を第２次温度耐性株として用いた。

【００１５】３． 第２次温度耐性株よりの導入遺伝子
の取得 １０⁶細胞の第２次温度耐性株と２×１０⁶細胞のＣＯＳ
−１細胞を８．６ｃｍ培養皿で許容温度で１日共培養し
た。その後細胞を２ｇのポリエチレングリコール（分子
量１０００）を含むＤＥＭ培地２ｍＬで１分間処理し、
続いて許容温度で３日間培養した。この操作によりＣＯ
Ｓ−１細胞と第２次温度耐性株を融合させた。使用した
ｃＤＮＡライブラリーの各ＤＮＡは実施例２に記載した
ような特徴を持っており、ＳＶ４０転写開始点の働きに
より当該ＤＮＡを染色体に組み込んでいるような第２次
温度耐性株をＣＯＳ−１細胞と融合させることにより染
色体中に組み込まれたｃＤＮＡが染色体外ＤＮＡとして
切り出されて来るという特徴を持っている。

【００１６】以上の処理を行った細胞をＨｉｒｔ溶液
（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５，１０ｍＭＥ
ＤＴＡ，０．６％ＳＤＳ）０．５ｍＬで処理することに
より穏やかに細胞を溶解し、染色体外ＤＮＡとなってい
るＤＮＡを上清より回収した。ＤＮＡは大腸菌ＨＢ１０
１株に導入することによりプラスミドとして回収した。
全部で５クローン回収されたが、そのうち２クローンは
インサートが失われており、また他の２クローンはｎｅ
ｏ遺伝子の部分が欠失していると考えられるクローンで
あった。残りの１クローンを調べたところネオマイシン
耐性遺伝子と目的のｃＤＮＡ遺伝子を含むようなプラス
ミドでありｐ２Ｒ４２−１と命名した。またこの目的と
するｃＤＮＡ遺伝子をＤ１２３と命名した。

【００１７】４． ｐ２Ｒ４２−１上の該遺伝子の確認 ｐ２Ｒ４２ー１をＢａｍＨＩで消化すると１．７キロベ
ースと３．５キロベース、及び０．６キロベースの断片
を与える。これらの断片を分取後電気泳動しｐ２Ｒ４２
ー１及びｐ２Ｒ４２−１のｃＤＮＡをのせているプラス
ミドのみをそれぞれプローブとしてサザン分析を行うこ
とにより、１．７キロベース断片が目的ｃＤＮＡを含む
ものであると決めた（図１）。

【００１８】５． ｐ２Ｒ４２ー１による３Ｙ１ｔｓＤ
１２３の温度耐性株への変換 ｐ２Ｒ４２−１を３Ｙ１ｔｓＤ１２３細胞に導入し、Ｇ
４１８耐性になった株を選択した。

【００１９】

【表１】

【００２０】表１に示されるようにＧ４１８耐性になっ
た株の４０％が温度耐性株の形質を示した。Ｇ４１８耐
性株の内、温度感受性形質が残った株と温度耐性になっ
た株をそれぞれサザン分析した。当該細胞より抽出した
ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで消化後１％アガ
ロースゲルで電気泳動し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕ
ｓ膜に転写することによりサザン分析を実施した。ハイ
ブリダイゼーションにはｐ２Ｒ４２−１のＤ１２３遺伝
子を含む１．７キロべースＢａｍＨＩ断片を³²Ｐで標識
したものを用いた。温度耐性となった株では１．７キロ
ベース断片がハイブリバンドとして検出され、一方温度
感受性株ではこのバンドが検出されなかった（図２）。

【００２１】６． ノーザンブロット分析 ＨＥＬ細胞及び３Ｙ１細胞から抽出した全ＲＮＡ１０μ
ｇを用い、ナイロン膜に転写後、³²Ｐで標識したｐ２Ｒ
４２−１ １．７キロベース断片をＤＮＡをプローブと
して分析を実施した（図４）。３Ｙ１，ＨＥＬ細胞とも
発現がみられた。

【００２２】７． 塩基配列解析 Ｄ１２３を含むプラスミドｐ２Ｒ４２−１をＢａｍＨＩ
で消化後目的遺伝子をｐＵＣ１１８にサブクローニング
し、Deletion kit for Kilo Sequence（宝酒造）を用い
て欠失遺伝子のシリーズを作成し塩基配列決定に用い
た。塩基配列決定はＤｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｃｙｃｌｅ
Ｋｉｔを用いＡＢＩ３７３シーケンサ（アプライドバイ
オシステムズ）を使用して行った。

【００２３】８． 大腸菌による該蛋白の融合蛋白とし
ての発現 Ｄ１２３のオープンリーディングフレームを含む１．１
キロベースＰｖｕII−ＥｃｏＯ１０９Ｉ断片をＢａｍＨ
Ｉリンカーと合成ヌクレオチド配列を用いてｐＥＴ３ａ
プラスミドにインフレームになるように接続しＴ７プロ
モーターの支配下でＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１株にて融合蛋
白として発現させた。この合成遺伝子が目的のフレーム
で蛋白を翻訳することは塩基配列上で確認した（図
３）。

【００２４】９． ウサギポリクロナル抗体の取得 ニュージーランド白ウサギを４週間間隔で４回５００μ
ｇの該融合蛋白で免疫し、最終免疫より１週間後に血清
を回収してウェスタンブロッティングに用いた。

【００２５】１０． ウェスタンブロッティング分析 ＨＥＬ細胞及び３Ｙ１細胞は５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，
２ｍＭ，２％ＳＤＳ，１％メルカプトエタノール，１０
％グリセリン，２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
リドで溶解させ、１２％ＳＤＳ−アクリルアミドゲルで
電気泳動後ハイボンドＣ（アマーシャム）膜に転写して
ウェスタンブロッティング分析を実施した。ＨＥＬ細胞
及び３Ｙ１細胞で発現がみられた。血清による０〜２５
時間の増殖刺激によって³Ｈ−チミジンを取り込む細胞
の累積割合は次第に増加したが、発現レベルは余り変化
しなかった（図４）。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３３６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ホモ サピエンス 配列 Met Lys Lys Glu His Val Leu 1 5 His Cys Gln Phe Ser Ala Trp Tyr Pro Phe Phe Arg Gly Val Thr Ile 10 15 20 Lys Ser Val Ile Leu Pro Leu Pro Gln Asn Val Lys Asp Tyr Leu Leu 25 30 35 Asp Asp Gly Thr Leu Val Val Ser Gly Arg Asp Asp Pro Pro Thr His 40 45 50 55 Ser Gln Pro Asp Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Ile Gln Trp Ser Asp 60 65 70 Asp Glu Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ala Pro Glu Phe Pro Glu Phe Ala 75 80 85 Thr Lys Val Gln Glu Pro Ile Asn Ser Leu Gly Gly Ser Val Phe Pro 90 95 100 Lys Leu Asn Trp Ser Ala Pro Arg Asp Ala Tyr Trp Ile Ala Met Asn 105 110 115 Ser Ser Leu Lys Cys Lys Thr Leu Ser Asp Ile Phe Leu Leu Phe Lys 120 125 130 135 Ser Ser Asp Phe Ile Thr Arg Asp Phe Thr Gln Pro Phe Ile His Cys 140 145 150 Thr Asp Asp Ser Pro Asp Pro Cys Ile Glu Tyr Glu Leu Val Leu Arg 155 160 165 Lys Trp Cys Glu Leu Ile Pro Gly Ala Glu Phe Arg Cys Phe Val Lys 170 175 180 Glu Asn Lys Leu Ile Gly Ile Ser Gln Arg Asp Tyr Thr Gln Tyr Tyr 185 190 195 Asp His Ile Ser Lys Gln Lys Glu Glu Ile Arg Arg Cys Ile Gln Asp 200 205 210 215 Phe Phe Lys Lys His Ile Gln Tyr Lys Phe Leu Asp Glu Asp Phe Val 220 225 230 Phe Asp Ile Tyr Arg Asp Ser Arg Gly Lys Val Trp Leu Ile Asp Phe 235 240 245 Asn Pro Phe Gly Glu Val Thr Asp Ser Leu Leu Phe Thr Trp Glu Glu 250 255 260 Leu Ile Ser Glu Asn Asn Leu Asn Gly Asp Phe Ser Glu Val Asp Ala 265 270 275 Gln Glu Gln Asp Ser Pro Ala Phe Arg Cys Thr Asn Ser Glu Val Thr 280 285 290 295 Val Gln Pro Ser Pro Tyr Leu Ser Tyr Arg Leu Pro Lys Asp Phe Val 300 305 310 Asp Leu Ser Thr Gly Arg Asp Ala His Lys Leu Ile Asp Phe Leu Lys 315 320 325 Leu Lys Arg Asn Gln Gln Glu Asp Asp 330 335

【００２７】配列番号：２ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ，ＲＮＡ 起源： 生物名：ホモ サピエンス 配列 AXG AAG AAG GAG CAX GXG CXX CAC XGC CAG XXC XCC GCG XGG XAC CCG XXC XXC CGA GGC GXX ACC AXC AAG AGX GXC AXX CXX CCA CXX CCX CAG AAX GXG AAG GAX XAX XXA CXC GAX GAX GGA ACX CXG GXG GXX XCA GGA AGG GAX GAX CCA CCA ACA CAX XCX CAG CCA GAC AGX GAX GAX GAA GCA GAA GAA AXA CAG XGG XCX GAX GAX GAG AAC ACA GCC ACG CXX ACG GCA CCA GAA XXX CCX GAG XXX GCC ACX AAA GXC CAG GAA CCX AXC AAX XCC CXC GGG GGC AGX GXC XXX CCX AAG CXX AAX XGG AGX GCC CCA AGG GAX GCG XAX XGG AXA GCA AXG AAX AGX XCX CXG AAA XGX AAA ACC CXC AGC GAC AXC XXX CXG CXX XXC AAG AGX XCC GAX XXC AXC ACX CGX GAC XXC ACX CAG CCG XXX AXX CAX XGX ACX GAX GAX XCX CCA GAX CCA XGX AXA GAA XAX GAG CXC GXX CXC CGA AAA XGG XGX GAA XXG AXX CCX GGG GCX GAG XXX CGA XGX XXX GXC AAG GAA AAC AAG CXX AXX GGX AXX XCX CAA AGA GAC XAC ACA CAA XAC XAX GAX CAX AXX XCX AAA CAA AAG GAA GAA AXX CGC AGA XGC AXA CAA GAC XXX XXC AAG AAA CAC AXA CAG XAC AAA XXC XXA GAX GAA GAC XXX GXG XXC GAX AXA XAC AGA GAC AGX AGG GGG AAG GXG XGG CXC AXX GAC XXX AAX CCA XXX GGX GAA GXC ACA GAX XCA CXG CXG XXC ACC XGG GAA GAA CXG AXA XCX GAG AAC AAC XXA AAC GCC GAX XXX AGX GAA GXX GAC GCX CAA GAG CAG GAX XCC CCA GCX XXC CGX XGC ACA AAC AGX GAA GXG ACA GXC CAG CCC AGC CCC XAX XXG AGX XAC CGG CXA CCC AAG GAC XXX GXA GAC CXC XCX ACX GGG AGG GAC GCX CAC AAG CXA AXA GAC XXC CXX AAG CXG AAG AGA AAX CAG CAG GAG GAC GAC ［但し、ＸはＴ又はＵを表す］

【００２８】配列番号：３ 配列の長さ：１５５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源： 生物名：ホモ サピエンス 配列 TGCGTTTAGG GCGAAGACGG AGTTGTAAAC TTCTTAAAAT TCCTCTCTCG ACACTTCGGT 60 AATTCCTCTT TCGAGACTAA AGCTCTTTTT GTATGCGTGT GTGTCAAGCG TATGCCCCGG 120 ATTCTCCTCC GCTTCCTTTT CTCGGTCTTC CTTCTTGCTT TAGGGACCGG AAGAGTCCTT 180 GAACCAAAAT AGCTCGGCGG GCACTTCCGG GGCCGGCGCC CAGAGTTCCG GGAGGGTGCA 240 GGCAGGAGAG GGAAAGGCAG CAGCGGCGGC AGCTGGAGG ATG AAG AAG GAG CAT GTG CTT 300 Met Lys Lys Glu His Val Leu 1 5 CAC TGC CAG TTC TCC GCG TGG TAC CCG TTC TTC CGA GGC GTT ACC ATC 348 His Cys Gln Phe Ser Ala Trp Tyr Pro Phe Phe Arg Gly Val Thr Ile 10 15 20 AAG AGT GTC ATT CTT CCA CTT CCT CAG AAT GTG AAG GAT TAT TTA CTC 396 Lys Ser Val Ile Leu Pro Leu Pro Gln Asn Val Lys Asp Tyr Leu Leu 25 30 35 GAT GAT GGA ACT CTG GTG GTT TCA GGA AGG GAT GAT CCA CCA ACA CAT 444 Asp Asp Gly Thr Leu Val Val Ser Gly Arg Asp Asp Pro Pro Thr His 40 45 50 55 TCT CAG CCA GAC AGT GAT GAT GAA GCA GAA GAA ATA CAG TGG TCT GAT 492 Ser Gln Pro Asp Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Ile Gln Trp Ser Asp 60 65 70 GAT GAG AAC ACA GCC ACG CTT ACG GCA CCA GAA TTT CCT GAG TTT GCC 540 Asp Glu Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ala Pro Glu Phe Pro Glu Phe Ala 75 80 85 ACT AAA GTC CAG GAA CCT ATC AAT TCC CTC GGG GGC AGT GTC TTT CCT 588 Thr Lys Val Gln Glu Pro Ile Asn Ser Leu Gly Gly Ser Val Phe Pro 90 95 100 AAG CTT AAT TGG AGT GCC CCA AGG GAT GCG TAT TGG ATA GCA ATG AAT 636 Lys Leu Asn Trp Ser Ala Pro Arg Asp Ala Tyr Trp Ile Ala Met Asn 105 110 115 AGT TCT CTG AAA TGT AAA ACC CTC AGC GAC ATC TTT CTG CTT TTC AAG 684 Ser Ser Leu Lys Cys Lys Thr Leu Ser Asp Ile Phe Leu Leu Phe Lys 120 125 130 135 AGT TCC GAT TTC ATC ACT CGT GAC TTC ACT CAG CCG TTT ATT CAT TGT 732 Ser Ser Asp Phe Ile Thr Arg Asp Phe Thr Gln Pro Phe Ile His Cys 140 145 150 ACT GAT GAT TCT CCA GAT CCA TGT ATA GAA TAT GAG CTC GTT CTC CGA 780 Thr Asp Asp Ser Pro Asp Pro Cys Ile Glu Tyr Glu Leu Val Leu Arg 155 160 165 AAA TGG TGT GAA TTG ATT CCT GGG GCT GAG TTT CGA TGT TTT GTC AAG 828 Lys Trp Cys Glu Leu Ile Pro Gly Ala Glu Phe Arg Cys Phe Val Lys 170 175 180 GAA AAC AAG CTT ATT GGT ATT TCT CAA AGA GAC TAC ACA CAA TAC TAT 876 Glu Asn Lys Leu Ile Gly Ile Ser Gln Arg Asp Tyr Thr Gln Tyr Tyr 185 190 195 GAT CAT ATT TCT AAA CAA AAG GAA GAA ATT CGC AGA TGC ATA CAA GAC 924 Asp His Ile Ser Lys Gln Lys Glu Glu Ile Arg Arg Cys Ile Gln Asp 200 205 210 215 TTT TTC AAG AAA CAC ATA CAG TAC AAA TTC TTA GAT GAA GAC TTT GTG 972 Phe Phe Lys Lys His Ile Gln Tyr Lys Phe Leu Asp Glu Asp Phe Val 220 225 230 TTC GAT ATA TAC AGA GAC AGT AGG GGG AAG GTG TGG CTC ATT GAC TTT 1020 Phe Asp Ile Tyr Arg Asp Ser Arg Gly Lys Val Trp Leu Ile Asp Phe 235 240 245 AAT CCA TTT GGT GAA GTC ACA GAT TCA CTG CTG TTC ACC TGG GAA GAA 1068 Asn Pro Phe Gly Glu Val Thr Asp Ser Leu Leu Phe Thr Trp Glu Glu 250 255 260 CTG ATA TCT GAG AAC AAC TTA AAC GCC GAT TTT AGT GAA GTT GAC GCT 1116 Leu Ile Ser Glu Asn Asn Leu Asn Gly Asp Phe Ser Glu Val Asp Ala 265 270 275 CAA GAG CAG GAT TCC CCA GCT TTC CGT TGC ACA AAC AGT GAA GTG ACA 1164 Gln Glu Gln Asp Ser Pro Ala Phe Arg Cys Thr Asn Ser Glu Val Thr 280 285 290 295 GTC CAG CCC AGC CCC TAT TTG AGT TAC CGG CTA CCC AAG GAC TTT GTA 1212 Val Gln Pro Ser Pro Tyr Leu Ser Tyr Arg Leu Pro Lys Asp Phe Val 300 305 310 GAC CTC TCT ACT GGG AGG GAC GCT CAC AAG CTA ATA GAC TTC CTT AAG 1260 Asp Leu Ser Thr Gly Arg Asp Ala His Lys Leu Ile Asp Phe Leu Lys 315 320 325 CTG AAG AGA AAT CAG CAG GAG GAC GAC Leu Lys Arg Asn Gln Gln Glu Asp Asp 330 335 TGATGAGCGT ACTGTAACTG GAGAAGAGCA 1317 GGCCCCGCCC CACCGCTCCG GGAGCTGCTC ATCAGCCGCA ACTTCCTGCC GACCCTGATG 1377 CGGGTGGGCC GAGGAGTGTG GACATCAGCC ACTTTTTATA TTCATGTACA TTCACCTG5G 1437 GAAAAAAACG GAGCGACTTT GCTACTTGTA AAAATAACAT AATAAATAGA TCTTAAACAT 1497 AGGAAAACCA TACTGTTCTG ATAATAAAAT GCTTTCTATG AAATAAAAAAAAA AAAAAAA 1557

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ）ｐ２Ｒ４２−１をＢａｍＨＩで消化した後
電気泳動しエチディウムブロミドで染色したもの Ｂ）ｐ２Ｒ４２−１の３．５キロベースＢａｍＨＩ断片
を電気泳動しサザン分析を行ったもの Ｃ）ｐ２Ｒ４２−１の１．７キロベースＢａｍＨＩ断片
を電気泳動しサザン分析を行ったもの

【図２】３Ｙ１ｔｓＤ１２３にｐ２Ｒ４２−１を導入し
て温度耐性となった株（１ＲＲ，２ＲＲ，３Ｒ，４Ｒ）
についてＤＮＡをＢａｍＨＩ消化の後サザン分析を行っ
たもの（電気泳動図）

【図３】大腸菌で生産した融合蛋白の免疫染色分析（電
気泳動図）

【図４】ＨＥＬ細胞及び３Ｙ１細胞でのＤ１２３遺伝子
の発現（電気泳動図） Ａ）Ｄ１２３をプローブとしたノーザン分析 Ｂ）ヒトβアクチンをプローブとしたノーザン分析 Ｃ）ウェスタンブロッティング分析 ［横軸：刺激時間（Ｈｒ）］

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｍ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記アミノ酸配列又はその１又は複数の
   アミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列を有す
   る動物細胞のＧ１停止を解除しうる蛋白。 【化１】 Met Lys Lys Glu His Val Leu 1 5 His Cys Gln Phe Ser Ala Trp Tyr Pro Phe Phe Arg Gly Val Thr Ile 10 15 20 Lys Ser Val Ile Leu Pro Leu Pro Gln Asn Val Lys Asp Tyr Leu Leu 25 30 35 Asp Asp Gly Thr Leu Val Val Ser Gly Arg Asp Asp Pro Pro Thr His 40 45 50 55 Ser Gln Pro Asp Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Ile Gln Trp Ser Asp 60 65 70 Asp Glu Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ala Pro Glu Phe Pro Glu Phe Ala 75 80 85 Thr Lys Val Gln Glu Pro Ile Asn Ser Leu Gly Gly Ser Val Phe Pro 90 95 100 Lys Leu Asn Trp Ser Ala Pro Arg Asp Ala Tyr Trp Ile Ala Met Asn 105 110 115 Ser Ser Leu Lys Cys Lys Thr Leu Ser Asp Ile Phe Leu Leu Phe Lys 120 125 130 135 Ser Ser Asp Phe Ile Thr Arg Asp Phe Thr Gln Pro Phe Ile His Cys 140 145 150 Thr Asp Asp Ser Pro Asp Pro Cys Ile Glu Tyr Glu Leu Val Leu Arg 155 160 165 Lys Trp Cys Glu Leu Ile Pro Gly Ala Glu Phe Arg Cys Phe Val Lys 170 175 180 Glu Asn Lys Leu Ile Gly Ile Ser Gln Arg Asp Tyr Thr Gln Tyr Tyr 185 190 195 Asp His Ile Ser Lys Gln Lys Glu Glu Ile Arg Arg Cys Ile Gln Asp 200 205 210 215 Phe Phe Lys Lys His Ile Gln Tyr Lys Phe Leu Asp Glu Asp Phe Val 220 225 230 Phe Asp Ile Tyr Arg Asp Ser Arg Gly Lys Val Trp Leu Ile Asp Phe 235 240 245 Asn Pro Phe Gly Glu Val Thr Asp Ser Leu Leu Phe Thr Trp Glu Glu 250 255 260 Leu Ile Ser Glu Asn Asn Leu Asn Gly Asp Phe Ser Glu Val Asp Ala 265 270 275 Gln Glu Gln Asp Ser Pro Ala Phe Arg Cys Thr Asn Ser Glu Val Thr 280 285 290 295 Val Gln Pro Ser Pro Tyr Leu Ser Tyr Arg Leu Pro Lys Asp Phe Val 300 305 310 Asp Leu Ser Thr Gly Arg Asp Ala His Lys Leu Ile Asp Phe Leu Lys 315 320 325 Leu Lys Arg Asn Gln Gln Glu Asp Asp 330 335
2. 【請求項２】 請求項１の蛋白をコードする核酸塩基配
   列。
3. 【請求項３】 下記配列の暗号鎖を有する核酸塩基配
   列。 【化２】 AXG AAG AAG GAG CAX GXG CXX CAC XGC CAG XXC XCC GCG XGG XAC CCG XXC XXC CGA GGC GXX ACC AXC AAG AGX GXC AXX CXX CCA CXX CCX CAG AAX GXG AAG GAX XAX XXA CXC GAX GAX GGA ACX CXG GXG GXX XCA GGA AGG GAX GAX CCA CCA ACA CAX XCX CAG CCA GAC AGX GAX GAX GAA GCA GAA GAA AXA CAG XGG XCX GAX GAX GAG AAC ACA GCC ACG CXX ACG GCA CCA GAA XXX CCX GAG XXX GCC ACX AAA GXC CAG GAA CCX AXC AAX XCC CXC GGG GGC AGX GXC XXX CCX AAG CXX AAX XGG AGX GCC CCA AGG GAX GCG XAX XGG AXA GCA AXG AAX AGX XCX CXG AAA XGX AAA ACC CXC AGC GAC AXC XXX CXG CXX XXC AAG AGX XCC GAX XXC AXC ACX CGX GAC XXC ACX CAG CCG XXX AXX CAX XGX ACX GAX GAX XCX CCA GAX CCA XGX AXA GAA XAX GAG CXC GXX CXC CGA AAA XGG XGX GAA XXG AXX CCX GGG GCX GAG XXX CGA XGX XXX GXC AAG GAA AAC AAG CXX AXX GGX AXX XCX CAA AGA GAC XAC ACA CAA XAC XAX GAX CAX AXX XCX AAA CAA AAG GAA GAA AXX CGC AGA XGC AXA CAA GAC XXX XXC AAG AAA CAC AXA CAG XAC AAA XXC XXA GAX GAA GAC XXX GXG XXC GAX AXA XAC AGA GAC AGX AGG GGG AAG GXG XGG CXC AXX GAC XXX AAX CCA XXX GGX GAA GXC ACA GAX XCA CXG CXG XXC ACC XGG GAA GAA CXG AXA XCX GAG AAC AAC XXA AAC GCC GAX XXX AGX GAA GXX GAC GCX CAA GAG CAG GAX XCC CCA GCX XXC CGX XGC ACA AAC AGX GAA GXG ACA GXC CAG CCC AGC CCC XAX XXG AGX XAC CGG CXA CCC AAG GAC XXX GXA GAC CXC XCX ACX GGG AGG GAC GCX CAC AAG CXA AXA GAC XXC CXX AAG CXG AAG AGA AAX CAG CAG GAG GAC GAC ［但し、ＸはＴ又はＵを表す］
4. 【請求項４】請求項２又は３記載の核酸塩基配列を基に
   して宿主細胞内でポリペプチドを生合成させることを特
   徴とする、動物細胞のＧ１停止を解除しうる蛋白の製造
   方法。