JPH069692A - 新規ペプチド、該ペプチドをコードする組換えｄｎａおよび該組換えｄｎａにより形質転換された微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】養殖産業分野において有用な新規ペプチド、新
規ペプチドをコードする組換えＤＮＡおよび組換えＤＮ
Ａにより形質転換された微生物を提供する。 【構成】チョウザメの成長促進活性を有する活性ペプチ
ドを主要構成成分として含む、新規なペプチドを開示す
る。また、このペプチドをコードする組換えＤＮＡを開
示する。また、この組換えＤＮＡにより形質転換された
微生物を開示する。微生物を用いて組換えＤＮＡを発現
させることにより、新規ペプチドを大量に合成できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチド、特
に、チョウザメ科チョウザメ属に属する魚類の成長ホル
モンから得られる生理活性を有するペプチドに関する。
また、本発明は、該ペプチドをコードする組換えＤＮ
Ａ、および、この組換えＤＮＡにより形質転換された微
生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】動植物等のような天然物中には、生体に
対する活性を有する物質が多く含まれている。それらの
一つである成長ホルモンは、脊椎動物の脳下垂体から分
泌されるペプチドであり、その主な生理作用は、成長促
進効果であることが知られている。

【０００３】成長ホルモンペプチド（以下、ホルモンと
記す）は、例えば、同じ魚類のものであっても、科又は
属が異なれば、そのペプチドの構造が異なる。また、ホ
ルモンの生理活性にも種に対する特異性があることが知
られている。即ち、特定の魚種に特有なホルモンを投与
する方が、他の魚種のホルモンを投与した場合よりも、
成長促進効果が著しいことが知られている。

【０００４】従って、新たな薬剤の開発に必要な知見を
提供するために、特定の魚種のホルモンを見つけ出し、
単離し且つその構造を確認することは、そのホルモンの
新しい利用方法を見つけることと共に非常に重要であ
る。

【０００５】従来、下等脊椎動物、特に魚類の成長ホル
モンペプチドの構造が決定されている。例えば、例えば
シロザケ及びウナギの成長ホルモンペプチドの構造が決
定され、養殖産業分野において幅広い用途が期待されて
いる。

【０００６】一方、チョウザメは、古くから食用として
用いられ、またその卵が「キャビア(caviar)」として珍
重されている。このチョウザメの成長ホルモンが抽出さ
れ、その活性が明らかとなっている(Farmer,S.W.,Hayas
hida,T.Papkoff,H.,and Polenov.A.L (1981) Endocrino
logy 108,377-381) 。

【０００７】

【課題を解決するための手段】しかしながら、Farmer e
t alの文献では、チョウザメの成長ホルモンのペプチド
構造が決定されていないので、新たな薬剤を開発するた
めの十分な知見を開示していない。また、チョウザメは
天然の漁獲に依存しているため、これらから抽出して得
られるホルモンだけでは、養殖産業で利用するには量的
に不十分である

【０００８】以上のように、チョウザメの成長ホルモン
ペプチドのペプチド構造を決定し、これに基づいて、こ
のペプチドをコードする遺伝子を見出し、さらにこの遺
伝子により形質転換された微生物を用いて、前記ホルモ
ンの工業的量産を可能にし、養殖産業分野で有用な薬剤
を開発することが望まれている。

【０００９】本発明は、かかる点に鑑みてなされたもの
であり、チョウザメ科チョウザメ属に属する魚類に対す
る成長促進作用を有する新規なペプチド、この新規なペ
プチドをコードする組換えＤＮＡ、および、この組換え
ＤＮＡにより形質転換された微生物を提供する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の物理化学
的性質を有する新規ペプチド（Ｉ）を提供する。 (1) ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って測定した分子量が約２２，０００ダルトンである。 (2) ｐＨ３〜１０の２w/w ％の両性担体を含有するゲ
ルを用いた等電点ゲル電気泳動により求めた等電点が
６．０である。 (3) ０．６v/v ％のフェノールを含有する６Ｎ塩酸を
用いた加水分解を行った後に定量したアミノ酸の構成が
次の通りである。 構成アミノ酸 含有量(mol/mol) Cys 4.2 Asp 19.8 Glu 19.2 Ser 18.6 Gly 7.2 His 2.9 Arg 10.0 Thr 9.7 Ala 9.9 Pro 7.0 Tyr 8.2 Val 10.2 Met 4.6 Ile 6.2 Leu 25.7 Phe 12.1 Trp 0.7 Lys 13.3 また、本発明は、次の物理化学的性質を有する新規ペプ
チド（II）を提供する。 (1) ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
って測定した分子量が約２２，０００ダルトンである。 (2) ｐＨ３〜１０の２w/w ％の両性担体を含有するゲ
ルを用いた等電点ゲル電気泳動により求めた等電点が
６．１である。 (3) ０．６v/v ％のフェノールを含有する６Ｎ塩酸を
用いた加水分解を行った後に定量したアミノ酸の構成が
次の通りである。 構成アミノ酸 含有量(mol/mol) Cys 4.1 Asp 19.9 Glu 19.3 Ser 18.5 Gly 7.2 His 2.8 Arg 9.9 Thr 9.8 Ala 9.3 Pro 7.0 Tyr 8.1 Val 10.7 Met 5.5 Ile 6.3 Leu 25.9 Phe 12.3 Trp 0.8 Lys 12.4 上記の本発明の新規ペプチド（Ｉ），(II)は、夫々、以
下のアミノ酸配列（１）に示すペプチド（ａ），（ｂ）
を主要構成成分として含有する。

【００１１】このアミノ酸配列（１）中、143 番目のXa
a がLys 、151 番目のXbb がAsp 及び153 番目のXcc が
Ala を示す（以下、ペプチド（ａ）という）か、又は、
143番目のXaa がMet 、151 番目のXbb がAsn 及び153
番目のXcc がVal （以下、ペプチド（ｂ）という）を示
す。 アミノ酸配列（１） Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 165 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190 また、本発明は、アミノ酸配列（１）に示すアミノ酸配
列を有するペプチド（ａ）または（ｂ）をコードする組
換えＤＮＡを提供する。また、本発明は、上述のペプチ
ド（ａ）又は（ｂ）をコードする組換えＤＮＡを含有す
る染色体およびこの組換えＤＮＡに対応するｃＤＮＡを
提供する。さらに、本発明は、ペプチド（ａ）又は
（ｂ）をコードする組換えＤＮＡにより形質転換した微
生物を提供する。以下、本発明をさらに詳細に説明す
る。本発明の新規ペプチド（Ｉ）又は（II）（以下、本
ペプチドともいう）は、次のようにして単離し、その構
造を決定した。

【００１２】まず、チョウザメの脳下垂体のアルカリ抽
出物を、順次、通常のゲル濾過および高速液体クロマト
グラフィーに付すことにより、本ペプチドを純粋な形で
単離し精製することができる。

【００１３】本ペプチドのアミノ酸配列は、適当な化学
試薬および酵素を使用してこのペプチドを切断した後に
エドマン法により決定した。この結果から、本ペプチド
（Ｉ）又は（II）が、上記ペプチド（ａ）又は（ｂ）
を、主要構成成分、即ち、活性部位として含有すること
がわかった。

【００１４】また、本発明の新規ペプチド（Ｉ）又は
（II）は、これらのペプチドを投与したチョウザメの稚
魚の体長および体重の変化を調べると、体長および体重
の両方について著しい成長促進効果を有することが認め
られる。

【００１５】一方、本発明の組換えＤＮＡにより形質転
換した微生物を用いてこのＤＮＡを発現させることによ
り、本発明のペプチド（Ｉ）又は（II）を製造できる。
すなわち、本ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、以下
に示す本ペプチドをコードする組換えＤＮＡの塩基配列
（１）を決定した。 AATTC ATG TAC CCG ATG ATC CCG CTG AGC TCT CTG TTC ACT AAC 44 G TAC ATG GGC TAC TAG GGC GAC TCG AGA GAC AAG TGA TTG GCA GTT CTG CGT GCT CAG TAC CTG CAT CAG CTG GCT GCT GAC ATC 89 CGT CAA GAC GCA CGA GTC ATG GAC GTA GTC GAC CGA CGA CTG TAG TAC AAA GAC TTC GAA CGT ACT TAC ATG CCG AAC GAA CAG CGT CAT 134 ATG TTT CTG AAG CTT GCA TGA ATG TAC GGC TTG CTT GTC GCA GTA TCT TCT AAA AAC TCT CCG TCT GCT TTC TGC TAC TCT GAA ACT ATC 179 AGA AGA TTT TTG AGA GGC AGA CGA AAG ACG ATG AGA CTT TGA TAG CCG GCT CCG ACT GGT AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCT GAC GTT 224 GGC CGA GGC TGA CCA TTT CTG CTT CGA GTC GTC GCA AGA CTG CAA GAA CTG CTG CAA TTC TCT CTG GCT CTG ATC CAG TCT TGG ATC TCT 269 CTT GAC GAC GTT AAG AGA GAC CGA GAC TAG GTC AGA ACC TAG AGA CCG CTG CAG TCT CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC TCT CTG GTT TTC 314 GGC GAC GTC AGA GAC AGA GCA CAA AAG TGG TTG AGA GAC CAA AAG CTG ACT TCT GAC CGT GTA TTC GAG AAA CTG AAA GAC CTG GAA GAA 359 GAC TGA AGA CTG GCA CAT AAG CTC TTT GAC TTT CTG GAC CTT CTT GGT ATC GTT GCT CTG ATG CGT GAC CTG GGT GAA GGT GGT TTC GGT 404 CCA TAG CAA CGA GAC TAC GCA CTG GAC CCA CTT CCA CCA AAG CCA TCT TCT ACT CTG CTG AAA CTG ACA TAT GAC AAA TTC GAC GTT AAC 449 AGA AGA TGA GAC GAC TTT GAC TGT ATA CTG TTT AAG CTG CAA TTG CTG CGT AAC GAC GAC GCA CTG TTC AAA AAC TAC GGT CTA CTG TCT 494 GAC GCA TTG CTG CTG CGT GAC AAG TTT TTG ATG CCA GAT GAC AGA TGC TTC AAA AAA GAC ATG CAT AAA GTT GAA ACT TAC CTG AAA GTT 539 ACG AAG TTT TTT CTG TAC GTA TTT CAA CTT TGA ATG GAC TTT CAA ATG AAA TGC CGT CGT TTC GTT GAA TCT AAC TGC ACT CTG TAGCTCG 585 TAC TTT ACG GCA GCA AAG CAA CTT AGA TTG ACG TGA GAC ATCGAGC AGA 592 TCT TCGA

【００１６】この塩基配列から適当な部位の配列を選定
し、合成ＤＮＡ法に従って、１０塩基以上、好ましくは
１５塩基以上の長さのＤＮＡフラグメントを合成する。
次に、得られたＤＮＡフラグメントを常法に従ってリン
酸化し且つ互いに連結して、二本鎖ＤＮＡを得る。得ら
れた二本鎖ＤＮＡを適当な制限酵素で切断することによ
り、本発明の組換えＤＮＡが得られる。

【００１７】ここで、ＤＮＡフラグメントの合成に用い
た合成ＤＮＡ法としては、例えば、トリエステル法また
はホスホルアミダイト法が挙げられる。これらのうち、
収率が良いのでホスホルアミダイト法が好ましい。

【００１８】得られたＤＮＡフラグメントは化学合成さ
れたものであるため、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴ
Ｐという）等のリン酸をＤＮＡフラグメントの5'-OH 末
端に転移させることが必要である。例えば、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてＤＮＡフラグメントの5'-O
H 末端をリン酸化することができる。また、ＤＮＡフラ
グメントは、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用い且つフラグメ
ンントＤＮＡのアニーリングにより連結できる。また、
本発明の組換えＤＮＡは次の手順 (i)〜(iii) により合
成できる。 (i) チョウザメの脳下垂体内に存在する成長ホルモン
ペプチドのｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製す
る。

【００１９】(ii) 上述のペプチド（ａ）又は（ｂ）の
アミノ酸配列に基づいて化学合成した部分ＤＮＡフラグ
メントをプローブとして用い、工程(i) で得たｃＤＮＡ
ライブラリーからこのプローブとハイブリダイズするｃ
ＤＮＡを含むクローンを常法に従って検索する。 (iii) 工程(ii)で検索されたクローンから本発明の組
換えＤＮＡを合成する。

【００２０】上述の本発明の組換えＤＮＡを、ベクター
の代表例である適当なプラスミドに組み込み（リクロー
ニング）、組み込んだプラスミドＤＮＡを、ハナハン法
(Hanahan,D.1983 Studies on transformation of Esche
richia coli with PlasmidsJ.Mol.Biol.166 557) によ
りコンピテントセル化した大腸菌 (JM105)等の微生物に
挿入することにより、本発明の微生物を得ることができ
る。本発明の微生物を用いて組換えＤＮＡを発現させる
ことにより、本発明のペプチド、即ち、チョウザメの成
長ホルモンペプチドを大量に得ることができる。

【００２１】なお、後述の実施例において製造した本発
明の微生物は、１９９２年４月１７日付で通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託番号FERM P-12923とし
て寄託している。

【００２２】

【実施例】次に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。 実施例１（新規ペプチドの製造）

【００２３】産卵前の体重１１〜１６ｋｇのチョウザメ
から脳下垂体を摘出し、凍結乾燥した。脱脂した脳下垂
体０．２０ｇを５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）および１５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）を含む５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩
衝液（ｐＨ９．０）でホモジナイズし、４℃で２時間撹
拌した。次に、撹拌した溶液を１０，０００×ｇで３０
分間遠心し、不溶の残留物を除いた上清５ｍｌを得た。

【００２４】得られた上清を、直接、ゲル濾過（カラ
ム：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００，２．４６×１００
ｃｍ）に付した。カラムを平衡させた後、溶出を５０ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、２
０℃，１６ｍｌ／時間の流速で行った。この溶出液は波
長２８０ｎｍでの吸光度を測定することによりモニター
し、６つの主なゲル濾過画分を得た。

【００２５】得られた第４番目のゲル濾過画分１３．５
ｍｇを、さらに５０％アセトニトリル含有０．１％トリ
フロロ酢酸で平衡させたＴＳＫゲルを用いた逆相高速液
体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ，
０．４６×２５ｃｍ，粒子径；５μｍ）に付した。溶出
は、比例勾配５０〜８０％のアセトニトリルを含有する
０．１％トリフロロ酢酸溶液を用い、４０℃，１ｍｌ／
分の流速で行った。溶出液は波長２２０ｎｍで吸光度を
測定し、得られた主な画分を凍結乾燥した。このように
して得られた二つの画分を夫々ＧＨＩおよびＧＨIIとし
た。ＧＨＩおよびＧＨIIは、それぞれ１．１ｍｇおよび
１．０ｍｇ得られた。次に、ＧＨＩおよびＧＨIIの分子
量、等電点、アミノ酸構成を調べた。 実験例１（分子量）

【００２６】Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムを用
いたゲル濾過およびＴＳＫゲルを用いた逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ，０．４
６×２５ｃｍ）により単一物であることが確認された。
本発明の新規ペプチドの分子量を、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法と
記す）によって測定した。この結果、ＧＨＩおよびＧＨ
IIの分子量は、両方とも約２２，０００ダルトンであっ
た。 実験例２（等電点）

【００２７】ＧＨＩおよびＧＨIIを、ｐＨ３〜１０のア
ンホライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）２％入りのゲルを用
いた等電点ゲル電気泳動に付した。この後、得られたゲ
ルを、クマシーブリリアントブルー Ｇ−２５０ ０．
０４％および過塩素酸３．５％を含む混合溶液で染色
し、ＧＨＩおよびＧＨIIの等電点を求めた。その結果、
ＧＨＩおよびＧＨIIの等電点は、夫々６．０および６．
１であった。 実験例３（アミノ酸構成）

【００２８】本発明の新規ペプチドを、０．６％フェノ
ールを含有する６Ｎ塩酸を用いて１１０℃で２４時間加
水分解を行った後、フェニルイソチオシアネートと反応
させフェニルチオカルバミル・アミノ酸誘導体とした。
この誘導体を、ＴＳＫゲルを用いた逆相高速液体クロマ
トグラフィー（カラム：ＯＤＳ−８０ＴＭ，０．４６×
２５ｃｍ，粒子径；５μｍ）を用いて、比例勾配（０．
１４Ｍ−酢酸ナトリウム：アセトニトリル）により、Ｇ
ＨＩおよびＧＨIIの構成アミノ酸を定量した。また、シ
ステイン（Ｃｙｓ）については過ギ酸酸化法にて確認し
た。この結果を表１に示す。

【００２９】

【表１】 実験例４（アミノ酸配列決定およびＮ末端アミノ酸の同
定） (1) アミノ酸配列決定

【００３０】本発明の新規ペプチドを、リシルエンドペ
プチダーゼ（条件：Ｅ／Ｓ＝１／６０，０．１Ｍ炭酸水
素アンモニウム，ｐＨ８．０，３７℃，４時間）、１０
０ｍｏｌの臭化シアン（条件：７０％ギ酸，室温・暗
所，１８時間）およびトリプシン（条件：Ｅ／Ｓ＝１／
６０，０．２Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ８．０，３７
℃，４時間）を用いて分解した。分解されたペプチド断
片の混合物をＴＳＫゲルを用いた逆相高速液体クロマト
グラフィー（カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ，０．４６×２
５ｃｍ，粒子径；５μｍ）に付し、ペプチド断片を吸収
波長２１０ｎｍで検出して分離した。得られた断片は、
逐次、アプライド・バイオシステムズ社製の気相プロテ
イン・シーケンサー ４７０Ａに付して、自動的にペプ
チドＮ末端からアミノ酸に切断した。次いで、得られた
アミノ酸について、Ｃ８逆相カラム（専修化学社製，Ｓ
ＥＱ−４，０．４６×３０ｃｍ）を用いた比例勾配
［０．０４Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）：アセト
ニトリル）の逆相高速液体クロマトグラフィー（スペク
トラ フィジックス社製，ＳＰ８１００システム）によ
る分析を行った。アミノ酸の同定および個々のペプチド
断片の配列の判定は、溶出量および定量値に基づいて判
定した。また、個々のペプチド断片のアミノ酸配列の結
果から、相互に重複する配列を重ね合わせて全体の配列
を決定した。 (2) Ｎ末端アミノ酸の同定 ＤＮＳ法を用いてＮ末端アミノ酸の同定を行った。この
結果、ＧＨＩ、ＧＨIIのＮ末端のアミノ酸はともにチロ
シン（Ｔｙｒ）であった。以上の工程(1),(2) の結果か
ら、ペプチドＧＨＩ、ＧＨIIが、上述のアミノ酸配列を
有するペプチド（ａ）および（ｂ）であると決定した。

【００３１】しかし、本発明の新規ペプチドは、活性を
示すために必須な部分と活性の発現には直接関係しない
部分とを含むことができるので、ペプチドＧＨＩおよび
ＧＨIIと同一なアミノ酸配列を有するペプチドは本発明
の範囲に含まれる。

【００３２】また、ペプチドＧＨＩおよびＧＨIIの生理
活性を、これらのペプチドをチョウザメの稚魚に投与し
て、その成長促進効果について検討した。この結果、こ
れらのペプチドはチョウザメに対して著しい成長促進効
果が認められた。

【００３３】次に、本発明の新規ペプチドをコードする
組換えＤＮＡの合成およびこの組換えＤＮＡにより形質
転換された微生物を作製し、本発明の新規ペプチドの合
成を行った。 実施例２ 組換えＤＮＡの合成 １．フラグメントの合成

【００３４】本発明の組換えＤＮＡを合成するために、
塩基配列（１）で表される塩基配列を有するＤＮＡの部
分構造を有し、下記塩基配列（２）〜（４５）で表され
る塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれＤＮＡフラ
グメント２〜４５、または単にまとめてＤＮＡフラグメ
ントという。）を、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシ
ステム社製、３８０Ａ）を用いて、ホスホルアミダイト
法により合成した。 塩基配列（２） AATTCATGTA CCCGATGATC CCGCTG 26 塩基配列（３） ATCATCGGGT ACATG 15 塩基配列（４） AGCTCTCTGT TCACTAACGC AGTTCT 26 塩基配列（５） CGTTAGTGAA CAGAGAGCTC AGCGGG 26 塩基配列（６） GCGTGCTCAG TACCTGCATC AGCTGG 26 塩基配列（７） ATGCAGGTAC TGAGCACGCA GAACTG ２６ 塩基配列（８） CTGCTGACAT CTACAAAGAC TTCG 24 塩基配列（９） TTTGTAGATG TCAGCAGCCA GCTG 24 塩基配列（１０） AACGTACTTA CATGCCGAAC GAACAG 26 塩基配列（１１） TTCGGCATGT AAGTACGTTC GAAGTC 26 塩基配列（１２） CGTCATTCTT CTAAAAACTC TCCG 24 塩基配列（１３） TTTTTAGAAG AATGACGCTG TTCG 24 塩基配列（１４） TCTGCTTTCT GCTACTCTGA AACTAT 26 塩基配列（１５） AGAGTAGCAG AAAGCAGACG GAGAG 25 塩基配列（１６） CCCGGCTCCG ACTGGTAAAG ACG 23 塩基配列（１７） ACCAGTCGGA GCCGGGATAG TTTC 24 塩基配列（１８） AAGCTCAGCA GCGTTCTGAC GTTGAAC 27 塩基配列（１９） GTCAGAACGC TGCTGAGCTT CGTCTTT 27 塩基配列（２０） TGCTGCAATT CTCTCTGGCT CTGAT 25 塩基配列（２１） CCAGAGAGAA TTGCAGCAGT TCAAC 25 塩基配列（２２） CCAGTCTTGG ATCTCTCCGC TGCA 24 塩基配列（２３） GCGGAGAGAT CCAAGACTGG ATCAGAG 27 塩基配列（２４） GTCTCTGTCT CGTGTTTTCA CCAACTCTC 29 塩基配列（２５） GGTGAAAACA CGAGACAGAG ACTGCA 26 塩基配列（２６） TGGTTTTCCT GACTTCTGAC CGTGTATTC 29 塩基配列（２７） GGTCAGAAGT CAGGAAAACC AGAGAGTT 28 塩基配列（２８） GAGAAACTGA AAGACCTGGA AGAAGGTAT 29 塩基配列（２９） CTTCCAGGTC TTTCAGTTTC TCGAATACAC 30 塩基配列（３０） CGTTGCTCTG ATGCGTGACC TGGGTGAAG 29 塩基配列（３１） CAGGTCACGC ATCAGAGCAA CGATACCTT 29 塩基配列（３２） GTGGTTTCGG TTCTTCTACT CTGCTGAAAC 30 塩基配列（３３） CAGAGTAGAA GAACCGAAAC CACCTTCACC 30 塩基配列（３４） TGACATATGA CAAATTCGAC GTTAACCT 28 塩基配列（３５） GTCGAATTTG TCATATGTCA GTTTCAG 27 塩基配列（３６） GCGTAACGAC GACGCACTGT TCAAAAACT ２９ 塩基配列（３７） GAACAGTGCG TCGTCGTTAC GCAGGTTAAC 30 塩基配列（３８） ACGGTCTACT GTCTTGCTTC AAAAAAGAC 29 塩基配列（３９） TTGAAGCAAG ACAGTAGACC GTAGTTTTT 29 塩基配列（４０） ATGCATAAAG TTGAAACTTA CCTGAAAGT 29 塩基配列（４１） GTAAGTTTCA ACTTTATGCA TGTCTTTT 28 塩基配列（４２） TATGAAATGC CGTCGTTTCG TTGAATCT 28 塩基配列（４３） AACGAAACGA CGGCATTTCA TAACTTTCAG 30 塩基配列（４４） AACTGCACTC TGTAGCTCGA GA 22 塩基配列（４５） AGCTTCTCGA GCTACAGAGT GCAGTTAGAT TC 32

【００３５】夫々のＤＮＡフラグメントの精製では、ま
ず、得られた保護基を有するＤＮＡ塩基及び５’水酸基
の保護基を有するオリゴヌクレオチドを含むアンモニア
溶液を５５℃、５時間加熱して、ＤＮＡ塩基の保護基を
外した。減圧留去してアンモニアを除去した後、逆相高
速液体クロマトグラフィーに付して、５’水酸基の保護
基のみ付いたオリゴヌクレオチドを分取した。得られた
フラクションを、８０％酢酸により、室温で１５〜３０
分間処理して、５’水酸基の保護基を除去した。減圧留
去後、ゲル濾過カラム（セファデックス（商品名）Ｇ２
５）で脱塩して、夫々のフラグメントを得た。 ２．ＤＮＡフラグメントのリン酸化

【００３６】工程１の操作により得られたＤＮＡフラグ
メント２〜４５を含む溶液各４００pmolを、夫々１００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ塩化マ
グネシウム、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ
ＡＴＰからなる混合液に加えた。更に、この溶液に、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２０単位（東洋紡製）を
加えて、３７℃、１時間３０分反応させた。反応終了
後、６５℃、１５分加熱して反応溶液中の酵素を不活化
した。 ３．ＤＮＡフラグメントの結合 (1) ＤＮＡフラグメント２〜２３について

【００３７】まず、工程２の操作により得られたリン酸
化したＤＮＡフラグメント２〜２３の溶液各８０ｐｍｏ
ｌ相当量を混合し、９０℃、３分間加熱した後、ゆっく
り冷却して、アニールさせた。冷却後、この反応液に１
ｍＭの濃度となるようにＡＴＰを加えて、Ｔ４−ＤＮＡ
リガーゼ７００単位（宝酒造社製）を用いて、１６℃、
２０時間反応させた。これに制限酵素ＥｃｏＲＩ ８０
単位および制限酵素ＰｓｔＩ １２０単位を加えて、３
７℃、２時間反応させた後、反応液を５％アクリルアミ
ドゲル電気泳動で分離することにより、約２８０ｂｐの
塩基配列（１）に示す塩基配列を有するＤＮＡの部分構
造を有する２本鎖ＤＮＡフラグメント（以下、Ｓ１−１
という）を切り出し、０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡからなる液に浸し、３７℃、１４時間溶出
した。溶出液を、ＮＡＰ−５カラム（ファルマシア・エ
ル・ビー・ケー・バイオテクノロジー社製）で脱塩し
た。 (2) ＤＮＡフラグメント２４〜４５について

【００３８】工程２で得たリン酸化したＤＮＡフラグメ
ント２４〜４５をそれぞれ含む溶液各８０ｐｍｏｌ相当
量を用いる以外は、工程３の(1) と同様に処理すること
により、約３１０ｂｐの塩基配列（１）に示す塩基配列
を有するＤＮＡの部分構造を有する２本鎖ＤＮＡフラグ
メント（以下、Ｓ１−２という。）を得た。 ４．ベクターＤＮＡの調製

【００３９】プラスミドpKK223-3（ファルマシア社製）
２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII で切断した
後、０．７％低融点アガロースゲルを用いた電気泳動に
付し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色した
後、約４．５ｋｂからなるベクターＤＮＡ（以下、pKK2
23-3-E-Hという。）を得た。 ５．プラスミドの構築

【００４０】pKK223-3-E-H、Ｓ１−１およびＳ１−２を
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ３５０単位（宝酒造社製）を用い
て反応させて、本発明のＤＮＡを有するプラスミド（以
下、pKK223-3-GH という。）を得た。更に、−７０℃で
冷凍保存しておいた形質転換用大腸菌株ＪＭ１０５の菌
体を融解し、この懸濁液２００μｌに、pKK223-3-GHを
１０ｎｇを添加した。氷冷下で３０分間反応させた後、
この懸濁液に４２℃で９０秒間ヒートショックを与え、
さらに２分間氷冷した。ＳＯＣ培地８００μｌを添加
し、３７℃で１時間培養した後に、この懸濁液を０．１
ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレート
上にまき、３７℃で一夜培養し、pKK223-3-E-H、Ｓ１−
１およびＳ１−２からなるpKK223-3-GH を有する形質転
換体（以下、JM105/pKK223-3-GH という。）を得た。こ
のJM105/pKK223-3-GH からプラスミドＤＮＡを分離し、
制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII にて切断した後、１
％アガロースゲルを用いた電気泳動に付した。エチジウ
ムブロマイド染色によりプラスミドフラグメントが５９
６ｂｐの長さを有していることが確認された。

【００４１】このフラグメントのＤＮＡシーケンスは、
ダイ デオキシ ターミネータ タク シークエンシン
グキット（Dye Deoxy Terminator Taq Seqensing Kit；
アプライドバイオシステム社製）並びにモデル３７３Ａ
ＤＮＡ シーケンシングシステム（アプライドバイオ
システム社製）を用いて調べた。この結果、このフラグ
メントが、上述の塩基配列（１）に示す塩基配列を有す
るＤＮＡであることが確認された。また、このフラグメ
ントが、開始コドン、アミノ酸配列（１）に示すアミノ
酸配列を有するペプチド（ａ）または（ｂ）をコードす
るＤＮＡおよび終止コドンを有する完全な塩基配列であ
ることが確認できた。 実験例５ チョウザメの成長ホルモンペプチドの発現

【００４２】形質転換体JM105/pKK223-3-GH を、Ｌ−培
地中で、３７℃で８時間培養した。形質転換された菌体
を培養液から遠心分離により回収した。さらに、回収し
た菌体をＳＤＳサンプル緩衝液により溶菌させ、次い
で、１５％ポリアミドゲル電気泳動に付して、タンパク
質を分離した。

【００４３】分離されたタンパク質を電気泳動的にニト
ロセルロース紙の上に転写させた。次に、このタンパク
質を、チョウザメの成長ホルモンに対して７１．１％の
相同性を有する抗ラット成長ホルモンのウサギ抗血清、
及び、アルカリ性ホスファターゼが結合した抗ウサギＩ
ｇＧを用いて分析した。この結果、形質転換体JM105/pK
K223-3-GH の発現により得られたペプチドが、分子量が
約２２，０００ダルトンであって天然のチョウザメから
単離および精製された成長ホルモンと同じ位置にバンド
を示すことが確認された。

【００４４】

【発明の効果】本発明の新規ペプチド、該ペプチドをコ
ードする組換えＤＮＡおよび該組換えＤＮＡにより形質
転換された微生物によれば、チョウザメの成長促進作用
を有する新規なペプチドを提供すると共に、この新規な
ペプチドを工業的に大量に生産し且つ安定に供給でき
る。この結果、養殖産業分野での成長ホルモンの利用お
よび有用な薬剤の開発を可能する等顕著な効果を奏す
る。

【００４５】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１９０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Asp Asp Ala Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 165 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190 配列番号：２ 配列の長さ：１９０ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Met Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Asn Asp Val Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 165 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190 配列番号：３ 配列の長さ：５９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．５９２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTC ATG TAC CCG ATG ATC CCG CTG AGC TCT CTG TTC ACT AAC 44 G TAC ATG GGC TAC TAG GGC GAC TCG AGA GAC AAG TGA TTG GCA GTT CTG CGT GCT CAG TAC CTG CAT CAG CTG GCT GCT GAC ATC 89 CGT CAA GAC GCA CGA GTC ATG GAC GTA GTC GAC CGA CGA CTG TAG TAC AAA GAC TTC GAA CGT ACT TAC ATG CCG AAC GAA CAG CGT CAT 134 ATG TTT CTG AAG CTT GCA TGA ATG TAC GGC TTG CTT GTC GCA GTA TCT TCT AAA AAC TCT CCG TCT GCT TTC TGC TAC TCT GAA ACT ATC 179 AGA AGA TTT TTG AGA GGC AGA CGA AAG ACG ATG AGA CTT TGA TAG CCG GCT CCG ACT GGT AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCT GAC GTT 224 GGC CGA GGC TGA CCA TTT CTG CTT CGA GTC GTC GCA AGA CTG CAA GAA CTG CTG CAA TTC TCT CTG GCT CTG ATC CAG TCT TGG ATC TCT 269 CTT GAC GAC GTT AAG AGA GAC CGA GAC TAG GTC AGA ACC TAG AGA CCG CTG CAG TCT CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC TCT CTG GTT TTC 314 GGC GAC GTC AGA GAC AGA GCA CAA AAG TGG TTG AGA GAC CAA AAG CTG ACT TCT GAC CGT GTA TTC GAG AAA CTG AAA GAC CTG GAA GAA 359 GAC TGA AGA CTG GCA CAT AAG CTC TTT GAC TTT CTG GAC CTT CTT GGT ATC GTT GCT CTG ATG CGT GAC CTG GGT GAA GGT GGT TTC GGT 404 CCA TAG CAA CGA GAC TAC GCA CTG GAC CCA CTT CCA CCA AAG CCA TCT TCT ACT CTG CTG AAA CTG ACA TAT GAC AAA TTC GAC GTT AAC 449 AGA AGA TGA GAC GAC TTT GAC TGT ATA CTG TTT AAG CTG CAA TTG CTG CGT AAC GAC GAC GCA CTG TTC AAA AAC TAC GGT CTA CTG TCT 494 GAC GCA TTG CTG CTG CGT GAC AAG TTT TTG ATG CCA GAT GAC AGA TGC TTC AAA AAA GAC ATG CAT AAA GTT GAA ACT TAC CTG AAA GTT 539 ACG AAG TTT TTT CTG TAC GTA TTT CAA CTT TGA ATG GAC TTT CAA ATG AAA TGC CGT CGT TTC GTT GAA TCT AAC TGC ACT CTG TAGCTCG 585 TAC TTT ACG GCA GCA AAG CAA CTT AGA TTG ACG TGA GAC ATCGAGC AGA 592 TCT TCGA 配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGTA CCCGATGATC CCGCTG 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCATCGGGT ACATG 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCTCTCTGT TCACTAACGC AGTTCT 配列番号：７ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTTAGTGAA CAGAGAGCTC AGCGGG 配列番号：８ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGTGCTCAG TACCTGCATC AGCTGG 配列番号：９ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCAGGTAC TGAGCACGCA GAACTG 配列番号：１０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCTGACAT CTACAAAGAC TTCG 配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGTAGATG TCAGCAGCCA GCTG 配列番号：１２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACGTACTTA CATGCCGAAC GAACAG 配列番号：１３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCGGCATGT AAGTACGTTC GAAGTC 配列番号：１４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCATTCTT CTAAAAACTC TCCG 配列番号：１５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTTTAGAAG AATGACGCTG TTCG 配列番号：１６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCTGCTTTCT GCTACTCTGA AACTAT 配列番号：１７ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGAGTAGCAG AAAGCAGACG GAGAG 25 配列番号：１８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCGGCTCCG ACTGGTAAAG ACG 配列番号：１９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACCAGTCGGA GCCGGGATAG TTTC 配列番号：２０ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAGCTCAGCA GCGTTCTGAC GTTGAAC 配列番号：２１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCAGAACGC TGCTGAGCTT CGTCTTT 配列番号：２２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCTGCAATT CTCTCTGGCT CTGAT 配列番号：２３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCAGAGAGAA TTGCAGCAGT TCAAC 配列番号：２４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCAGTCTTGG ATCTCTCCGC TGCA 配列番号：２５ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGGAGAGAT CCAAGACTGG ATCAGAG 配列番号：２６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCTCTGTCT CGTGTTTTCA CCAACTCTC 配列番号：２７ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTGAAAACA CGAGACAGAG ACTGCA 配列番号：２８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGTTTTCCT GACTTCTGAC CGTGTATTC 配列番号：２９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTCAGAAGT CAGGAAAACC AGAGAGTT 28 配列番号：３０ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGAAACTGA AAGACCTGGA AGAAGGTAT 29 配列番号：３１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCAGGTC TTTCAGTTTC TCGAATACAC 30 配列番号：３２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTTGCTCTG ATGCGTGACC TGGGTGAAG 29 配列番号：３３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGTCACGC ATCAGAGCAA CGATACCTT 配列番号：３４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGGTTTCGG TTCTTCTACT CTGCTGAAAC 配列番号：３５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGAGTAGAA GAACCGAAAC CACCTTCACC 配列番号：３６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGACATATGA CAAATTCGAC GTTAACCT 配列番号：３７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCGAATTTG TCATATGTCA GTTTCAG 配列番号：３８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGTAACGAC GACGCACTGT TCAAAAACT 29 配列番号：３９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAACAGTGCG TCGTCGTTAC GCAGGTTAAC 配列番号：４０ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACGGTCTACT GTCTTGCTTC AAAAAAGAC 配列番号：４１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTGAAGCAAG ACAGTAGACC GTAGTTTTT 配列番号：４２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCATAAAG TTGAAACTTA CCTGAAAGT 配列番号：４３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAAGTTTCA ACTTTATGCA TGTCTTTT 配列番号：４４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGAAATGC CGTCGTTTCG TTGAATCT 配列番号：４５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACGAAACGA CGGCATTTCA TAACTTTCAG 配列番号：４６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACTGCACTC TGTAGCTCGA GA 配列番号：４７ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCTTCTCGA GCTACAGAGT GCAGTTAGAT TC

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 月井 裕二 茨城県稲敷郡阿見町吉原3586 株式会社ツ ムラ内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の物理化学的性質を有する新規ペプチ
   ド（Ｉ）。 (1) ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
   って測定した分子量が約２２，０００ダルトンである。 (2) ｐＨ３〜１０の２w/w ％の両性担体を含有するゲ
   ルを用いた等電点ゲル電気泳動により求めた等電点が
   ６．０である。 (3) ０．６v/v ％のフェノールを含有する６Ｎ塩酸を
   用いた加水分解を行った後、定量したアミノ酸の構成が
   次の通りである。 構成アミノ酸 含有量(mol/mol) Cys 4.2 Asp 19.8 Glu 19.2 Ser 18.6 Gly 7.2 His 2.9 Arg 10.0 Thr 9.7 Ala 9.9 Pro 7.0 Tyr 8.2 Val 10.2 Met 4.6 Ile 6.2 Leu 25.7 Phe 12.1 Trp 0.7 Lys 13.3
2. 【請求項２】 以下のアミノ酸配列を有するペプチドを
   主要構成成分として含有する請求項１記載の新規ペプチ
   ド（Ｉ）。 Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Asp Asp Ala Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 165 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190
3. 【請求項３】 次の物理化学的性質を有する新規ペプチ
   ド（II）。 (1) ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
   って測定した分子量が約２２，０００ダルトンである。 (2) ｐＨ３〜１０の２w/w ％の両性担体を含有するゲ
   ルを用いて等電点ゲル電気泳動により求めた等電点が
   ６．１である。 (3) ０．６v/v ％のフェノールを含有する６Ｎ塩酸を
   用いた加水分解を行った後に定量したアミノ酸の構成が
   次の通りである。 構成アミノ酸 含有量(mol/mol) Cys 4.1 Asp 19.9 Glu 19.3 Ser 18.5 Gly 7.2 His 2.8 Arg 9.9 Thr 9.8 Ala 9.3 Pro 7.0 Tyr 8.1 Val 10.7 Met 5.5 Ile 6.3 Leu 25.9 Phe 12.3 Trp 0.8 Lys 12.4
4. 【請求項４】 以下のアミノ酸配列を有するペプチドを
   主要構成成分として含有する請求項３記載の新規ペプチ
   ド（II）。 Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Met Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Asn Asp Val Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 165 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190
5. 【請求項５】 以下のアミノ酸配列を有するペプチドを
   主要構成成分として含有する新規ペプチド。 Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 165 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190 （上記アミノ酸配列中、143 番目のXaa がLys 、151 番
   目のXbb がAsp 及び153番目のXcc がAla を示すか、又
   は、143 番目のXaa がMet 、151 番目のXbb がAsn 及び
   153 番目のXcc がVal を示す。）
6. 【請求項６】 以下のアミノ酸配列を有するペプチドを
   コードする組換えＤＮＡ。 Tyr Pro Met Ile Pro Leu Ser Ser Leu Phe Thr Asn Ala Val Leu 5 10 15 Arg Ala Gln Tyr Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Ile Tyr Lys Asp 20 25 30 Phe Glu Arg Thr Tyr Met Pro Asn Glu Gln Arg His Ser Ser Lys 35 40 45 Asn Ser Pro Ser Ala Phe Cys Tyr Ser Glu Thr Ile Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Gly Lys Asp Glu Ala Gln Gln Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu 65 70 75 Gln Phe Ser Leu Ala Leu Ile Gln Ser Trp Ile Ser Pro Leu Gln 80 85 90 Ser Leu Ser Arg Val Phe Thr Asn Ser Leu Val Phe Leu Thr Ser 95 100 105 Asp Arg Val Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Val 110 115 120 Ala Leu Met Arg Asp Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Ser Ser Thr 125 130 135 Leu Leu Lys Leu Thr Tyr Asp Xaa Phe Asp Val Asn Leu Arg Asn 140 145 150 Xbb Asp Xcc Leu Phe Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser Cys Phe Lys 155 160 165 Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Lys Val Met Lys Cys 170 175 180 Arg Arg Phe Val Glu Ser Asn Cys Thr Leu 185 190 （上記アミノ酸配列中、143 番目のXaa がLys 、151 番
   目のXbb がAsp 及び153番目のXcc がAla を示すか、又
   は、143 番目のXaa がMet 、151 番目のXbb がAsn 及び
   153 番目のXcc がVal を示す。）
7. 【請求項７】 下記塩基配列を含む請求項６記載の組換
   えＤＮＡ。 AATTC ATG TAC CCG ATG ATC CCG CTG AGC TCT CTG TTC ACT AAC 44 G TAC ATG GGC TAC TAG GGC GAC TCG AGA GAC AAG TGA TTG GCA GTT CTG CGT GCT CAG TAC CTG CAT CAG CTG GCT GCT GAC ATC 89 CGT CAA GAC GCA CGA GTC ATG GAC GTA GTC GAC CGA CGA CTG TAG TAC AAA GAC TTC GAA CGT ACT TAC ATG CCG AAC GAA CAG CGT CAT 134 ATG TTT CTG AAG CTT GCA TGA ATG TAC GGC TTG CTT GTC GCA GTA TCT TCT AAA AAC TCT CCG TCT GCT TTC TGC TAC TCT GAA ACT ATC 179 AGA AGA TTT TTG AGA GGC AGA CGA AAG ACG ATG AGA CTT TGA TAG CCG GCT CCG ACT GGT AAA GAC GAA GCT CAG CAG CGT TCT GAC GTT 224 GGC CGA GGC TGA CCA TTT CTG CTT CGA GTC GTC GCA AGA CTG CAA GAA CTG CTG CAA TTC TCT CTG GCT CTG ATC CAG TCT TGG ATC TCT 269 CTT GAC GAC GTT AAG AGA GAC CGA GAC TAG GTC AGA ACC TAG AGA CCG CTG CAG TCT CTG TCT CGT GTT TTC ACC AAC TCT CTG GTT TTC 314 GGC GAC GTC AGA GAC AGA GCA CAA AAG TGG TTG AGA GAC CAA AAG CTG ACT TCT GAC CGT GTA TTC GAG AAA CTG AAA GAC CTG GAA GAA 359 GAC TGA AGA CTG GCA CAT AAG CTC TTT GAC TTT CTG GAC CTT CTT GGT ATC GTT GCT CTG ATG CGT GAC CTG GGT GAA GGT GGT TTC GGT 404 CCA TAG CAA CGA GAC TAC GCA CTG GAC CCA CTT CCA CCA AAG CCA TCT TCT ACT CTG CTG AAA CTG ACA TAT GAC AAA TTC GAC GTT AAC 449 AGA AGA TGA GAC GAC TTT GAC TGT ATA CTG TTT AAG CTG CAA TTG CTG CGT AAC GAC GAC GCA CTG TTC AAA AAC TAC GGT CTA CTG TCT 494 GAC GCA TTG CTG CTG CGT GAC AAG TTT TTG ATG CCA GAT GAC AGA TGC TTC AAA AAA GAC ATG CAT AAA GTT GAA ACT TAC CTG AAA GTT 539 ACG AAG TTT TTT CTG TAC GTA TTT CAA CTT TGA ATG GAC TTT CAA ATG AAA TGC CGT CGT TTC GTT GAA TCT AAC TGC ACT CTG TAGCTCG 585 TAC TTT ACG GCA GCA AAG CAA CTT AGA TTG ACG TGA GAC ATCGAGC AGA 592 TCT TCGA
8. 【請求項８】 請求項６記載の組換えＤＮＡを含む染色
   体。
9. 【請求項９】 請求項６記載の組換えＤＮＡに対応する
   ｃＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項６記載の組換えＤＮＡにより形
    質転換した微生物。