JPH0862222A - 光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘導方法。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】（１）光化学反応による、ボロン酸基を有する
化合物の担体への共有結合方法を提供する。 （２）光化学反応により、ボロン酸基を有する化合物を
共有結合させた担体を用いた、グリコヘモダロビンの分
画定量方法、およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃｔｏｒ
Ｃｅｌｌの誘導方法を提供する。 （３）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用い
た、グリコヘモグロビンの分画定量方法、およびＬｙｍ
ｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様
活性およびＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘導方法を提
供する。 【構成】光化学反応により、ボロン酸基を有する化合物
を共有結合させた担体、側鎖にボロン酸基を有する高分
子化合物、および測定試薬よりなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、第一に、ボロン酸基を
有する化合物を光化学反応により不溶性担体に共有結合
する方法に関する。本発明は第二に、当該担体を用い
た、グリコヘモグロビンの分画定量方法およびＬｙｍｐ
ｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活
性およびＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘導方法に関す
る。本発明は第三に、側鎖にボロン酸基を有する高分子
化合物を用いた、グリコヘモグロビンの分画定量方法お
よびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉ
ｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘
導方法に関する。

【従来の技術とその問題点】

【０００２】（ｉ）ボロン酸基を有する化合物を共有結
合させた不溶性担体を用いたグリコヘモダロビンの分画
定量方法 末梢血中のグルコースは、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ_０）
のベータ鎖のＮ末端とシッフ結合することにより、不安
定なアルジミン（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ）となる。この反
応は可逆反応で、生成したアルジミンが元のグルコース
とヘモグロビンＡ（ＨｂＡ_０）に分解する場合と、アル
ジミンが更にアマドリ転換し、安定なケトアミン（Ｈｂ
Ａｌｃ）になる場合がある。現在、グリコヘモグロビン
（ＨｂＡｌｃ）値が、糖病の血糖コソトロールの指標と
して有用であると認識され、臨床領域で広く利用されて
いる。血液中には、へモグロビンＡ（ＨｂＡ_０）、アル
ジミン（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ）、グリコヘモグロビン
（ＨｂＡｌｃ）が存在し、この内、アルジミン（ｐｒｅ
−ＨｂＡｌｃ）は、採血時の血糖値、採血後のグルコー
スの消費等の原因により、値が変動し易い為、グリコヘ
モグロビン（ＨｂＡｌｃ）のみを分別定量することが望
まれている。グリコヘモダロビン（ＨｂＡｌｃ）の定量
方法には、エレクトロフォーカシング法、比色法、アフ
ィニティークロマトグラフィー法、ＨＰＬＣ法、ＥＩＡ
法等がある。現在汎用されているＨＰＬＣ法には、 （１）アルジミン（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ）とグリコヘモ
グロビン（ＨｂＡｌｃ）とが混在する検体をクロマト処
理時間を長くすることにより、両者を分離する方法。 （２）検体の前処理により、アルジミン（ｐｒｅ−Ｈｂ
Ａｌｃ）を除去し、クロマト処理時間を短縮する方法。 がある。アルジミン（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ）の除去方法
には、 （ａ）赤血球にグルコースを消費させ、アルジミン（ｐ
ｒｅ−ＨｂＡｌｃ）を分解する方法。 （ｂ）グルコースを受け取る物質を添加し、アルジミン
（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ）を分解する方法。 （ｃ）強力なアロステリックエフェクターを添加し、可
逆的に結合しているグルコースを追い出し、アルジミン
（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ） を分解する方法。 がある。この様に、ＨＰＬＣ法は汎用されてはいるが、
高価な機器の購入が必要であり、煩雑な前処理が必須で
あること、１時間当たりの処理検体数が少ないこと等、
解決すべき問題が多い。アフィニティークロマトグラフ
ィー法の測定操作は、 （１）資料調製液で調製した検体を３−アミノフェニル
ボロン酸を固定化したアガロースを充填したヵラムに添
加Ｌ、グリコヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）のｃｉｓ−ジ
オール基とアガロースに結合した３−アミノフェニルボ
ロン酸と五員環を形成させる。 （２）緩衝液でアガロースを洗浄することにより、グリ
コヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）以外のヘモグロビンを流
出させる。 （３）溶出用緩衝液でグリコヘモグロビン（ＨｂＡｌ
ｃ）を溶出させる。 （４）グリコヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）画分の吸光
度、非グリコヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）画分の吸光度
を測定する。 （５）計算によりグリコヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）量
を算出する。 であり、 （１）正確で特異性の高い測定値が得られる。 （２）アルジミン（ｐｒｅ−ＨｂＡｌｃ）の影響がな
い。 （３）胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）、異常ヘモグロビ
ン（ＨｂＳ，ＨｂＣ）の影響がない。 という特長がある。しかしながら、アフィニティークロ
マトダラフィーを用いる方法である為、測定操作を自動
化させることが困難であるという難点がある。本発明の
発明者は、既に、グルタルアルデヒド法およびアミド化
法により、担体に３−アミノフェニルボロン酸を共有結
合させた不溶性担体を用いたグリコヘモグロビン（Ｈｂ
Ａｌｃ）の定量方法を発明し、出願に及んでいる。今
回、本発明の発明者は、光反応により、ボロン酸基を有
する化合物を担体に共有結合させる方法と、側鎖にボロ
ン酸基を有する高分子化合物を用いたグリコヘモグロビ
ン（ＨｂＡｌｃ）の定量方法を考案し出願に及んだ。

【０００３】（ｉｉ）ボロソ酸基を有する化合物を固定
化した担体を用いたリンパ球の活性化 を疫担当細胞を刺激して、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）細胞を誘導す
る養子免疫療法が知られている。ＬＡＫ細胞は、Ｃｌａ
ｓｓｉｃａｌ ＮＫ細胞に抵抗性を示す腫瘍細胞のみな
らず、自己の新鮮腫瘍細胞に対しても細胞障害性を示
し、広いスペクトラムを持つＫｉｌｌｅｒ細胞であるこ
とが示されている。しかしながらＬＡＫ療法には、過剰
に投与するｒ−ＩＬ−２による体内貯留、長時間のｉｎ
ｖｉｔｒｏ培養により異物化、大型化したリンパ球に
よる肺動脈閉塞、煩雑な操作手順による感染の問題があ
る。今回、本発明の発明者は、光化学反応によりボロソ
酸基を有する化合物を共有結合させた担体を用いて、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで免疫担当細胞と共に培養する方法およ
び、側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用いて、
ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫担当細胞と共に培養する方法
が、共に、リガンドであるボロン酸基を有する化合物の
剥離の問題を克服することが可能であることを見い出
し、出願に及んだ。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、 （１）ボロン酸基を有する化合物を光化学反応により共
有結合させた不溶性担体 （２）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物 を提供することにより、従来法であるグルタルアルデヒ
ド法、アミド化法の欠点であるリガンド（ボロン酸基を
有する化合物）の剥離の問題のない、グリコヘモダロビ
ンの分画定量方法およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃｔ
ｏｒ Ｃｅｌｌの誘導方法を提供することに関する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従来の担体へのリガンド
の固定化方法には、 １）リガンドが部分的な修飾を受けることにより、リガ
ンドの高次構造や活性中心等が部分的に破壊される恐れ
がある。 ２）リガンドの自由な動きが制限されることにより、被
検検体との相互作用が起こりにくくなり、その結果リガ
ンドの活性の低下が起こる。 ３）リガンドに優れた活性と安定性を与える固定化条件
を見つけることが困難である。 ４）リガンドを非特異吸着により固定化した場合には、
リガンドが剥離し易い。 等の欠点があった。一方、フェニルアジド基は、紫外線
照射により高反応性の中間体であるナイトレンを経由
し、近傍の炭素等と共有結合することが知られている
（吉本薫：フォトポリマーハンドブック：工業調査会１
９８９）。また、人工臓器に生体適合性を付与する方法
として、材料表面の改質方法（特願、平２−２０６５７
３）が知られている。同方法は、デバイスの表面にアジ
ド基を介して、アルブミン等の蛋白質を共有結合させる
ことにより、生体適合性を付与する方法である。

【０００６】本発明の発明者は、このフェニルアジド基
の紫外線照射法を、ボロン酸基を有する化合物の強固な
結合に応用すること、更に、側鎖にボロン酸基を有する
高分子化合物をグリコヘモグロビンの分画定量に用いる
ことを考案した。即ち、本発明の発明者は、グリコヘモ
グロビンの分画定量およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃ
ｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘導方法について鋭意検討した結
果、 １）不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗布
した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布し、更に光を
照射することからなるホロン酸基を有する化合物の共有
結合方法。 ２）不溶性担体の表面に_０−ニトロベンジルエステル基
を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカル
ボキシル基を生成させ、更に、水溶性縮合剤を用いて、
ボロン酸基を有する化合物を化学結合させる方法とから
なるボロン酸基を有する化合物の共有結合方法。 ３）緩衝液中でｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ
ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることにより、フェ
ニルアジド基を導入したボロン酸基を有する化合物を被
固定化担体に塗布した後、更に光を照射することことか
らなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方法。 によりリガンドであるボロン酸基を有する化合物を担体
に容易に、強固に共有結合できることを発見し、本発明
を完成した。本発明の発明者は更に、 ４）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用いて、
グリコヘモグロビンを分画定量する方法。 ５）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢血
リンパ球とをｉｎ ｖｉｔｒにより培養し、Ｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性
およびＥｆｆｅｃｔ Ｃｅｌｌを誘導する方法。 ６）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢血
リンパ球とリンホカインとをｉｎ ｖｉｔｒｏにより培
養し、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋ
ｉｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌを
誘導する方法。 が、グリコヘモグロビンの分画定量およびＬｙｍｐｈｏ
ｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性お
よびＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌ１の誘導に極めて有効で
あることを見い出した。

【０００７】

【発名の効果】本発明は、 （ａ）不溶性担体の表面にアジド基を有する化合物を塗
布した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布し、更に光
を照射することからなる、ボロン酸基を有する化合物の
共有結合方法。 （ｂ）不溶性担体の表面に_０−ニトロベンジルエステル
基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射によりカ
ルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を用いてボ
ロン酸基を有する化令物を化学結合させる方法とからな
るボロン酸基を有する化合物の共有結合方法 （ｃ）緩衝液中で ｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘ
ｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることにより、
フェニルアジド基を導入したボロン酸基を有する化合物
を被固定化担体に塗布した後、更に光を照射することこ
とからなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方
法。 （ｄ）（ａ）または、（ｂ）または、（ｃ）の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合したことを特
徴とする、不溶性担体および実験器具。 （ｅ）（ａ）または、（ｂ）または、（ｃ）の方法によ
り調製した不溶性担体を用いて、グリコヘモグロビンを
分画定量する方法。 （ｆ）（ａ）または、（ｂ）または、（ｃ）の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合した不溶性担
体と、末梢血リンパ球とリンホカインとをｉｎｖｉｔｒ
ｏにより培養し、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性を誘導する方法。 （ｇ）（ａ）または、（ｂ）または、（ｃ）の方法によ
り、ボロン酸基を有する化合物を共有結合した不溶性担
体と、末梢血リンパ球とをｉｎ ｖｉｔｒｏにより培養
し、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌを誘導する方法。 （ｈ）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物を用い
て、グリコヘモグロビンを分画定量する方法。 （ｊ）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢
血リンパ球とリンホカインとをｉｎ ｖｉｔｒｏにより
培養し、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｋｉｌｌｅｒ様活性を誘導する方法。 （ｉ）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物と、末梢
血リンパ球とをｉｎｖｉｔｒｏにより培養し、Ｅｆｆｅ
ｃｔｏｒ Ｃｅｌｌを誘導する方法。 よりなる。本発明に関わる共有結合方法により、ボロン
酸基を有する化合物の活性を失うことなく、ボロン酸基
を有する化合物を容易に、堅固に共有結合することが可
能になる。また、本発明に関わる共有結合方法により、
ボロン酸基を有する化合物を共有結合Ｌた実験器具か
ら、ボロン酸基を有する化合物を剥離させることなく、
グリコヘモダロビンを分画定量することや、リンパ球を
活性化することが可能となる。

【０００８】本発明では、最初に担体表面にアジド基を
有するポリマーや、低分子化合物を塗布する。使用する
ポリマーとしては、アジド基を導入したスチレン、アジ
ド基を含有するメタクリレート類等のビニルモノマー単
独重合体、アジド基含有モノマーとスチレン、アクリル
アミド等のアジド基を含有しないビニルモノマーとの共
重合体が考えられるが、安定性を考慮すると、スチレ
ン、メチルメタクリレート、ジメチルアクリルアミドと
の共重合体が特に好ましい。これらの共重合体における
アジド基の割合は、モル比で１０〜２０％ 存在するこ
とが好ましい。前記ポリマーの分子量は、数平均分子量
で１００，０００以上であることが好ましい。また、ア
ジド基を有する低分子化合物としては、ビスアジド化合
物や、イオン性基等が考えられるが、必ずしもこれらに
限定されるものではない。これらのアジド基を有する低
分子化合物では、ボロン酸基を有する化合物を安定に固
定化させる為に、アジド基を２個以上含有することが望
まれる。ボロン酸基を有する化合物を固定化する材料と
しては、プラスチック（ポリビニルアルコール、セルロ
ース、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、メタクリ
ル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリイソプロピルア
クリルアミド、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフォン
等）、ガラス、セラミック、繊維、紙、合成紙、中空
糸、金属等が考えられるが、これらに限定される訳では
なく、また、それらの形状、表面の状態等には、何等制
限はない。

【０００９】アジド基を有する化合物は、ボリマーで
も、低分子化合物であっても、揮発性有機溶媒に溶解
し、被固定化表面に塗布、乾燥することにより実施する
ことが可能である。塗布により、形成される皮膜の厚さ
は、ポリマーの場合は、０．１〜３．０ｕｍであること
が好ましい。低分子の場合は、分子層が複数になる様に
塗布することが好ましい。ボロン酸基を有する化合物を
被固定化担体に存在させる方法には、ボロン酸基を有す
る化合物の溶液に被固定化担体を浸漬し、ボロン酸基を
有する化合物を被固定化担体に吸着させる方法が考えら
れる。

【００１０】次に、ボロン酸基を有する化合物の存在す
る被固定化担体に紫外線を照射することにより、短時間
で固定化が完了する。使用される光源としては、水銀灯
等が考えられる。ボロン酸基を有する化合物の水溶液ま
たは、コロイド溶液または、懸濁液に被固定化担体を浸
漬し、ボロン酸基を有する化合物を被固定化担体に吸着
させた後に紫外線を照射する場合には、必ずしも溶液を
乾燥させる必要はない。紫外線照射に特に限定される条
件はないが、被固定化ボロン酸基を有する化合物を防御
する為には、３２０ｎｍ よりも長波長の光を照射する
ことが好ましい。紫外線を照射した後、固定化されなか
ったボロン酸基を有する化合物は洗浄により除去する。
洗浄に使用される溶媒にも特に制限はない。

【００１１】以上の操作からなる本発明によれば、ボロ
ン酸基を有する化合物と塗布したポリマー間との共有結
合、更に、塗布したボリマー間とポリマー内との架橋が
生成する為、被固定化担体が安定して存在し続ける。被
固定化担体がプラスチックの場合には、被固定化担体の
表面と塗布したボロン酸基を有する化合物との間に共有
結合が生成する為、被固定化担体が更に安定して存在し
続ける。アジド基を有する化合物が低分子化合物である
場合にも、化学療法剤と塗布した低分子化合物間との共
有結合、更に、塗布した低分子化合物間の架橋が生成す
る為、被固定化担体が安定して存在し続ける。

【００１２】本発明で光反応によらずに合成される、側
鎖にボロン酸基を有する高分子化合物としては、 １）ポリ（ｍ−アクルルアミドフェニルボロン酸−ＣＯ
−Ｎ−ビニルピロリドン）とポリビニルアルコールの複
合体、 ２）アクリル酸と３−アミノフェニルボロン酸ヘミサル
ファイトとの縮合により合成される３−アクリルアミド
フェニルボロン酸、 ３）メタクリルアミドフェニルボロン酸とアクリルアミ
ドとＮ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）の共重合
体、 ４）ボロン酸基を有するポリマーとポリビニルアルコー
ルからなる相互侵入高分子網目ゲル 等が考えられるが、必ずしもこれらに限定される訳では
ない。

【００１３】

【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。 《実施例１．》 ｉ）アジドスチレンの合成 エタノール−濃塩酸混液２０ｍｌに、３−ニトロスチレ
ン５ｇ を懸濁させ、更に、エタノールに溶解したＳｎ
Ｃｌ_３２Ｈ_２Ｏ溶液を激しく攪拌しながら添加し、室温
で一夜、反応させた。ＮａＯＨにより中和し、固体成分
を濾別し、濾液より生成物をエーテル抽出した。エーテ
ル層をＭｇＳＯ_４で乾燥した後、濃硫酸を加え、中間体
をた。同中間体を１０％硫酸溶液１０ｍｌに溶解、氷冷
しｌＮのＮａＮＯ_２水溶液を添加した。２時間後に，Ｎ
ａＮ_３水溶液を添加し、室温に戻した後、３時間攪拌し
た。酢酸エチルにより抽出し、拍出液を０．１Ｎ Ｎａ
ＨＣＯ_３水溶液と精製水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４を添加
し、乾燥した。溶媒を留去し、クロロホルム／ヘキサン
（１／４）混合溶媒に溶解し、シリカゲルカラムで精製
した。溶媒を留去し、３−アジドスチレンを得た。 ｉｉ）アジドスチレン−スチレン共重合体の合成 アジドスチレン１モルとスチレン４モルとをベンゼンで
５倍に希釈し、０．０１当量のＮ，Ｎ，アゾゼスイソブ
チロニトリル（ＡＩＢＮ）を添加、脱気、封管し、６０
℃で４時間重合した。放冷後、メタノール中に注ぎ、沈
殿したアジドスチレン−スチレン共重合体を回収した。
得られた共重合体の数平均分子量は、１０万であった。 ｉｉｉ）３−アミノフェニルボロン酸を共有結合したＰ
ＥＴ、フィルムの調製前記方法により合成したアジドス
チレン−スチレン共重合体をアセトンに溶解し、１％溶
液を調製した。この溶液１００ｍｌを１ｍ^２のポリエチ
レンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムの両面に塗布、
乾燥し、アジドスチレン−スチレン共重合体の皮膜を形
成した。リン酸緩衝液に１％の割合で溶解した３−アミ
ノフェニルボロン酸溶液に、前記処理をしたＰＥＴフィ
ルムを１時間浸潰し、３−アミノフェニルボロン酸を吸
着させ、高圧水銀灯を用いて、紫外線を１分間照射し
た。次に、当該ＰＥＴフィルムを精製水で水洗、乾燥し
た。

【００１４】《実施例２．》 ３−アミノフェニルボロン酸を共有結合したＰＥＴフィ
ルムを用いたグリコヘモダロビンの定量 （１）実施例１．で調製した３−アミノフェニルボロン
酸を共有結合したＰＥＴフィルムを１ｃｍ^２四方に切断
した。 （２）（１）のＰＥＴフィルム各１枚を小試験管に分取
した。 （３）（２）の小試験管にリン酸緩衝液各１ｍｌを分取
した。 （４）（３）の小試験管に溶血させた被検検体各２００
μｌを分取し、３７℃で３０分間反応させた。 （５）（４）の小試験管中のＰＥＴフィルムをリン酸緩
衝液２ｍｌで３回洗浄した。 （６）新規に小試験管中を準備し、テトラメチルベンジ
ジン溶液各２ｍｌを分注し、濾紙で充分に水切りした、
（５）の小試験管中のＦＥＴフィルムを移し、３７℃で
３０分間反応させた。 （７）（６）の小試験管に反応停止液各１ｍｌを分注
し、反応を停止した。 （８）（７）の小試験管の溶液の３７０ｎｍの吸光度を
測定した。 （８）標準グリコヘモダロビンを用いて、同様の操作を
行ない、検量線を描いた。 （９）（８）の検量線から、被検検体中のグリコヘモグ
ロビンを求めた。

【００１５】《実施例３．》 ｉ）アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレートの合
成 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１００ｍｌに
ｐ−アジド安息香酸１０ｇを溶解、氷冷し、トリエチル
アミン３．５ｍｌを添加し、更に、クロロ蟻酸イソブチ
ル８．３ｍｌを添加した。次に、ＤＭＴ３００ｍｌにヒ
ドロキシルエチルメタクリレート５．２ｍｌを溶解し、
前記溶液に添加し、６０℃で５時間攪拌した。溶媒を留
去し、酢酸エチルを添加、抽出し，１０％クエン酸水溶
液、精製水、４％ＮａＨＣＯ_３水溶液で順次洗浄し、無
水ＮａＳＯ_４を添加、乾燥した。溶媒を留去した後、ク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムで精製した。溶
媒を留去し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレ
ートを得た。 ｉｉ）アジドベンゾイルオキシニチルメタクリレート−
メチルメタクリレート共重合体の合成 前記方法により合成したアジドベソゾイルオキシエチル
メタクリレート１ｍｏｌとメチルメタクリレート４ｍｏ
ｌとをＤＭＦで２倍に希釈し，０、０１等量のＡＩＢＮ
を添加、脱気、封管し、６０℃で３時間重合した。冷却
後、大量のエチルエーテルに注ぎ、沈殿したアジドベン
ゾイルオキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレ
ート重合体を得た。得られた共重合体の数平均分子量は
１５万であった。 ｉｉｉ）３−アミノフェニルボロン酸共有結合フラスコ
の調製 前記方法により合成したアジドベンゾイルオキシエチル
メタクリレート−メチルメタクリレート共重合体をアセ
トンに溶解し、１％溶液を調製した。この溶液各３０μ
ｌをポリアクリルアミド製フラスコの内面に塗布、乾燥
し、アジドベンゾイルオキシエチルメタクリレート−メ
チルメタクリレート共重合体の皮膜を形成した。前記処
理をしたポリアクリルアミド製フラスコの内面に、リン
酸緩衝液に０．０１％の割合で溶解した３−アミノフェ
ニルボロン酸溶液２００μｌを添加し、３−アミノフェ
ニルボロン酸溶液を吸着させ、電子線加速器（加速電圧
２ＭｅＷ、電子線電流１ｍＡ）を用いて、電子線を３０
秒間照射した。次に、当該ポリアクリルアミド製フラス
コを精製水で水洗、乾燥した。

【００１６】《実施例４．》 Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘導 末梢血から沈殿法に従い、末梢血リンパ球を分離した。
次に、抗ＣＤ４抗体固定化フラスコを用いて、ＣＤ４^＋
末梢血リンパ球を分離し、実施例３で調製した３−アミ
ノフェニルホウ酸固定化フラスコを用いて、自己血しょ
うと共に２時間培養した。２時間後に前記操作により得
られた細胞（１×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）と、ラジ
オアイソトープ（^５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウム）標識
した、ヒト子宮頚部癌由来Ｈｅｌａ細胞（Ｈｅｌａ−Ｓ
３：１×１０^２ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）と、ｐｏｋｅｐｅ
ｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ（１μｇ／ｍｌ）とをｍｉｃｒｏ
ｔｅｓｔ ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌに取り、炭酸ガス培養
器で８時間培養した。キラー活性の検量は、リンパ球浮
遊液の代りにＲＰＭｌ１６４０培地を添加したものを０
％、リンパ球浮遊液の代りに２％ＳＤＳを添加したもの
を１００％とした。キラー活性の検量の結果、８時間後
にｍｉｃｒｏｔｏｓｔ ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌ内のＨｅ
ｌａ細胞は消滅し、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘導
が確認された。

【００１７】《実施例５．》 ３−アミノフェニルボロン酸固定化不織布の調製 ラジカル重合により、２−（４−アジドベンゾイルオキ
シ）エチルメタクリレート：スチレン：_０−ニロベンジ
ルアクリレートの三元共重合体（仕込モル比３：６：１
（以下ＰＡＳＮ）を合成した。デュポン社製不織布（Ｓ
ｏｎｔａｌａ ８００５）に、前記ＰＡＳＮを塗布、薄
膜を形成した後、紫外線を照射した。次に当該不織布に
０．０１％の３−アミノフェニルボロン酸と水溶性カル
ボジイミドを含有するリン酸緩 衝液に浸漬し、３７℃
で１６時間反応させた。次に当該不織布を１ＭのＮａＣ
ｌ水溶液およびリン酸緩衝液で、洗浄乾燥した。

【００１８】《実施例６．》 ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌ
ｅｒ様活性の誘導 実施例５で調製した３−アミノフェニルボロン酸固定化
不織布１０ｇを容量１０ｍｌのカラムに充填した。次
に、当該カラムを３％のストレプマイシンを含有するリ
ン酸緩衝液で充分に洗浄した後、パイロジェンフリーの
精製水で充分に洗浄し、無菌的に乾燥した。続いて、三
方活栓、ペリスタポンプ、当該カラム、エアーチャンバ
ーの順にシリコンチューブでつないで、回路を作成し
た。次に、当該回路をガンマ線滅菌した。リンパ球浮遊
液を１×１０^７個／ｍｌに調製し、その２０ｍｌを三方
活栓から回路内へ注入した。流量０．５ｍｌ／ｍｉｒ
で、リンパ球浮遊液を３−アミノフェニルボロン酸固定
化不織布充填カラムを通して、３０分間接触刺激した。
３０分間の接触刺激後リンパ球を回収し、３７℃５％Ｃ
Ｏ_２下で２４時間培養後Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とし、Ｋ
−５６２細胞とＤａｕｄｉ細胞をターゲットとして、そ
の細胞傷害活性をクロミウム放出試験で評価した。対照
群として、無処置のリンパ球を用い、また細胞傷害活性
をｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌ
ｌｅｒ Ｃｅｌｌと比較検討する為、リンパ球浮遊液を
１×１０^７個／ｍｌに調整し、ｒｉｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｌｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ＴＧＰ−３＝武田薬品
製）１ｕｎｉｔ／ｍｌと共に培養したものを調製した。
細胞傷害活性は次の式で計算した。 ％ｃｙｔｏｔｏｘｌｃｉｔｙ＝（実験測定値−自然放出
量）／（最大放出量−自然放出量）×１００ ナチュラルキラーセルに感受性のＫ−５６２ 細胞を標
的細胞として用いた場合、３−アミノフェニルボロン酸
固定化不織布充填カラムの刺激により、強い細胞傷害性
が確認できた（Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ ５０：ｃｙｔｏｔ
ｏｘｉｃｉｔｙ＝６０％）。ＩＬ−２添加培養群（Ｅ／
Ｔｒａｔｉｏ ５０：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝４０
％）と比較しても、より強い細胞傷害性の誘導が可能で
あった。ナチュラルキラーセルに非感受性のＤａｕｄｉ
細胞を標的細胞として用いた場合も、強い細胞傷害性の
誘導が可能であったことから（Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ ５
０：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝３６％）、ナチュラル
キラー活性の増強のみならず、ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−
ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｌｌｅｒ様活性の誘導も可能で
あった。

【００１９】《実施例７．》 ボロン酸基を有する相互侵入高分子網目ゲルの合成 ポリビニルアルコール（ＰＶＡ：分子量２．０００）を
グルタルアルデヒドを触媒として硫酸を用いて架橋した
後、メタクリルアミドフェニルボロン酸（ＭＡＰＢ）１
０ｍｏｌ−％、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）９
０ｍｏｌ−％ポリエチレングリコールジアクリレート
（ＰＥＧＤＡＡ：ｎ＝１４）９０ｍｏｌ−％を含むジメ
チルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）溶液をしみ込ませ、６
０℃で１２時間加熱して重合した。得られたゲルから末
反応モノマーを除去した後、ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ＝３／
１、ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ＝１／１、ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ＝１
／３、の各溶液中に各々一日づつ浸漬した後、蒸留水中
に保存した。ゲル中のボロン酸基の含量はプラズマ発光
分析により求めた。

【００２０】《実施例８．》 ボロン酸基を有する相互侵入高分子網目ゲルを用いたグ
リコヘモグロビンの定量 （１）実施例７で調製した相互侵入高分子網目ゲルを１
ｃｍ^２四方に切断した。 （２）（１）の相互侵入高分子網目ゲル各１枚を小試験
管に分取した。 （３）（２）の小試験管にリン酸緩衝液各１ｍｌを分取
した。 （４）（３）の小試験管に溶血させた被検検体各２０
０）μｌを分取し、３７℃で３０分間反応させた。 （５）（４）の小試験管中の相互侵入高分子網目ゲルを
リン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。 （６）新規に小試験管中を準備し、テトラメチルベンジ
ジン溶液各２ｍｌを分注し、濾紙で充分に水切りした、
（５）の小試験管中の相互侵入高分子網目ゲルを移し、
３７℃で３０分間反応させた。 （７）（６）の小試験管に反応停止液各１ｍｌを分注
し、反応を停止した。 （８）（７）の小試験管の溶液の３７０ｎｍの吸光度を
測定した。 （８）標準グリコヘモグロビンを用いて、同様の操作を
行ない、検量線を描いた。 （９）（８）の検量線から、被検検体中のグリコヘモグ
ロビンを求めた。

【００２１】《実施例９．》 ｉ）メタクリルアミド−３−フェニルボロン酸（ＭＡＰ
Ｂ）の合成 ３−アミノフェニルボロン酸１／２硫酸塩（Ｓｈｉｇｍ
ａ社製）０．１ｍｏｌ、メタクリル酸（和光純薬製）
０．１ｍｏｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ）を３００ｍｌの精製水に溶
解し、氷水浴で冷却した。次に、ＮａＯＨでｐＨを４．
７に調整し、１時間攪拌した後、ジェチルエーテルを用
いて抽出を行ない、減圧乾燥した。熱水から結晶化さ
せ、メタクリルアミド−３−フェニルボロン酸の白色針
状晶を得た（収率約５０％）。 ｉｉ）ハイドロゲルビーズの調製 ７．１×１０^−３ｍｏｌのメタクリルアミドフェニルボ
ロン酸、１．６×１０^−１ｍｏｌのアクリルアミド、
９．４×１０^−３ｍｏｌのＮ，Ｎ’−メチレンビス（ア
クリルアミド）を１４４ｍｌの精製水溶解し、更に、
０．６ｇ／ｍｌのアンモニウムパーオキソジスルフェー
ト０．８ｍｌを添加した。この溶液を４．８ｍｌのソル
ビタンセスキオリエートを含む９６０ｍｌのトルエン：
クロロホルム（３７：１１）溶液に滴下し、窒素雰囲気
下、７２℃で１時間攪拌した。重合したビーズはトルエ
ン、エタノール、精製水で洗浄し、凍結乾燥した。

【００２２】《実施例１０．》 ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｌｌｅ
ｒ様活性の誘導 実施例９で調製したハイドロゲルビーズ０．５ｇを７０
ｍｌの精製水を用いて、膨潤した。続いてＲＰＭＩ １
６４０培地で置換した。当該ビーズ１ｍｌをポリスチレ
製フラスコに分取し、ＣＤ４^＋末梢血リンパ球（２×１
０^７個）、自己血しょうと共に１０分間培養した。ピペ
ッティングにより、リンパ球を分離し、遠心回収後、１
０％自己血ＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄し、２×
１０^６個／ｍｌで３０分間接触刺激した。３０分間の接
触刺激後リンパ球を回収し、３７℃５％ＣＯ下で２４時
間培養後 Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とし、Ｋ−５６２細胞
とＤａｕｄｉ細胞をターゲットとして、その細胞傷害活
性をクロミウム放出試験で評価した。対照群として、無
処置のリンパ球を用い、また細胞傷害活性をｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒｅｅｌ
ｌと比較検討する為、リンパ球浮遊液を１×１０^７個／
ｍｌに調製し、ｒｉｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｌ
ｅｕｋｉｎ−２（ＴＧＰ−３：武田薬品製）１ｕｎｉｔ
／ｍｌと共に培養したものを調製した。細胞傷害活性は
次の式で計算した。 ％ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝（実験測定値−自然放
出量）／（最大放出量−自然放出量）×１００ ナチュラルキラーセルに感受性のＫ−５６２ 細胞を標
的細胞として用いた場合ハイドロゲルビーズの刺激によ
り、強い細胞傷害性が確認できた（Ｅ／Ｔｒａｔｉｏ
５０：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝６５％）。ＩＬ−２
添加培養群と比較しても、より強い細胞傷害性の誘導が
可能であった（Ｅ／Ｔｒａｔｉｏ ５０：Ｃｙｔｏｔｏ
ｄｅｉｔｙ＝３８％）。ナチュラルキラーセルに非感受
性のＤａｕｄｉ細胞を標的細胞として用いた場合も、強
い細胞傷害性の誘導が可能であった（Ｅ／Ｔ ｒａｔｉ
ｏ ５０：Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝３２％）ことか
ら、ナチュラルキラー活性の増強のみならず、ｌｙｍｐ
ｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｌｌｅｒ様活性
の誘導も可能であった。

【００２３】

【発明の効果】本発明にかかわる （１）ボロン酸基を有する化合物を光化学反応により共
有結合させた不溶性担体 および （２）側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物 により、従来法であるダルタルアルデヒド法、アミド化
法の欠点であるリガンド（ボロン酸基を有する化合物）
の剥離の問題のない、ダソコヘモグロビンの分画定量方
法およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ
Ｋｉｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃｔｏｒｅｌｌの誘
導方法を提供することが可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (54)【発明の名称】 光化学反応による、ボロン酸基を有する化合物の担体への共有結合方法と、ボロン酸基を有する 担体を用いたグリコヘモグロビンの分画定量方法、およびＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａ ｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性およびＥｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌの誘導方法。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性担体の表面にアジド基を有する化
   合物を塗布した後、ボロン酸基を有する化合物を塗布
   し、更に光を照射することからなる、ボロン酸基をもつ
   化合物の共有結合方法。
2. 【請求項２】 不溶性担体の表面に_０−ニトロベンジル
   エステル基を持つ共重合体の薄膜を形成した後、光照射
   によりカルボキシル基を生成させ、更に水溶性縮合剤を
   用いてボロン酸基を有する化合物を化学結合させる方法
   とからなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結合方
   法。
3. 【請求項３】 緩衝液中でＰ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｏｙ
   ｌｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅと反応させることに
   より、フェニルアジド基を導入したボロン酸基を有する
   化合物を被固定化担体に塗布した後、更に光を照射する
   ことことからなる、ボロン酸基を有する化合物の共有結
   合方法。
4. 【請求項４】 請求項１、または請求項２、または請求
   項３記載の方法により、ボロン酸基を有する化合物を共
   有結合したことを特徴とする、不溶性担体および実験器
   具。
5. 【請求項５】 請求項１、または請求項２、または請求
   項３記載の方法により調製した不溶性担体を用いて、グ
   リコヘモダロビンを分画定量する方法。
6. 【請求項６】 請求項１、または請求項２、または請求
   項３記載の方法によりボロン酸基を有する化合物を共有
   結合した不溶性担体と、末梢血リンパ球とリンホカイソ
   とをｉｎ ｖｉｔｒｏにより培養し、Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
   ｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性を誘導
   する方法。
7. 【請求項７】 請求項１、または請求項２、または請求
   項３記載の方法によりボロン酸基を有する化合物を共有
   結合した不溶性担体と、末梢血リンパ球とをｉｎ ｖｉ
   ｔｒｏにより培養し、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌを誘
   導する方法。
8. 【請求項８】 側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物
   を用いて、グリコヘモグロビンを分画定量する方法。
9. 【請求項９】 側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物
   と、末梢血リンパ球とリンホカインとをｉｎ ｖｉｔｒ
   ｏにより培養し、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａ
   ｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ様活性を誘導する方法。
10. 【請求項１０】側鎖にボロン酸基を有する高分子化合物
    と、末梢血リンパ球とをｉｎ ｖｉｔｒｏにより培養
    し、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌを誘導する方法。