JPH0853353A - ミズカビ病防止組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 魚類のミズカビ病を防止する安全で有効な組
成物を提供することを目的とする。 【構成】 ポリフェノール類を含有することを特徴とす
るミズカビ病の防止組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、魚類のミズカビ病を防
止する組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ミズカビ病は、水生菌、特に腐生カビが
魚卵や魚体に寄生して起こる魚類の代表的な疾病であ
り、淡水域の養殖魚で大きな問題となっている。ミズカ
ビ病の予防・治療としては、ふ化槽の魚卵の場合、腐生
カビが寄生しやすい死卵を取り除くか、採卵後からマラ
カイトグリーン、メチレンブルー、２−アミド−３−
〔（β−アミノエチル）チオ〕プロピオフェノン誘導
体、ベンゾチアゾリルアゾ化合物またはホルマリンで薬
浴する方法（特開昭５５−８９２５９号、特公昭６１−
６００４１号）が知られており、これらのうちでマラカ
イトグリーンが有効な方法として使用されている。マラ
カイトグリーンはトリフェニールメタン系色素の一種で
あり、あらゆるふ化場や養殖場で使用され、その有効濃
度は、魚卵では処理液中に対し５〜１０ｐｐｍ（１週間
に２回、１回の処理は１時間）である。このため、全体
では大量のマラカイトグリーンが使用され、その後は環
境へ流出することとなる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このマ
ラカイトグリーンに発ガン性や突然変異原性のあること
が判明したため使用が禁止された。ミズカビ病の特効薬
が他に皆無であることおよび中和することによりマラカ
イトグリーンが塩を形成し除去することが容易となるた
めと、使用後酸性溶液でマラカイトグリーンを中和する
ことを条件に使用が認められている。しかしマラカイト
グリーンの溶液を中和してもその毒性は変わらないこと
からヒトのみならず、環境汚染につながっていることは
明白である。いまだにマラカイトグリーンに代わる有効
な薬剤は見出されていない。またミズカビ病に感染した
卵を取り除く方法も行われているがかなりの手間を要す
ること、死卵が発生する頃には、ふ化槽全体にミズカビ
が広まり他の魚卵にすでに感染している可能性が強く予
防は不可能となる問題がある。このような状況下、これ
ら薬剤に代わる安全で、ミズカビ病に対して効果的な物
質の開発が強く求められている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するため鋭意研究した結果、ツバキ科の植物等か
ら得られるポリフェノール類、特に（＋）−カテキン，
（＋）−ガロカテキン，（−）−ガロカテキンガレー
ト，（−）−エピカテキン，（−）−エピカテキンガレ
ート，（−）−エピガロカテキン，（−）−エピガロカ
テキンガレート，遊離型テアフラビン，テアフラビンモ
ノガレートＡ，テアフラビンモノガレートＢおよびテア
フラビンジガレート等の化合物が上記ミズカビ病に対し
顕著な防止効果の発揮されることをはじめて見出し、本
発明を完成した。すなわち、本発明はポリフェノール類
を含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物に関
するものである。

【０００５】ポリフェノール類が各種微生物に対して抗
菌作用を示すことについては、例えば、各種乳酸菌に対
する抗菌性（西山ら、農化、４９巻、１２号、６２９〜
６３３頁、１９７５年）、哺乳動物の病原菌に対する抗
菌性（Ryu.Eら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｚｏｏｎ、７巻、１６４
〜１７０頁、１９８０年）および下痢性細菌に対する抗
菌性（戸田ら、日本細菌学会誌、４４巻、４号、６６９
〜６７２頁、１９８９年）などが知られている。また水
産分野への茶の成分の応用として、細菌性魚病への予防
・治療効果（特開平４−１０３５３７号）および魚類甲
殻類の養殖用飼料、養殖方法および治療方法（特開平５
−３０８９０８号）などが開示されている。上述の各種
報告の中には、カビに対する抗菌性についての報告もあ
るが、本発明のミズカビ病の原因菌は同じ真菌類には属
するものの、水中でのみ生育可能であり、その生活環、
宿主への感染経路など非常に特殊であり、酸素要求性の
高い通常の真菌類とは全く異なる菌類である。従って、
このような特殊な魚類のミズカビ病に対して茶のポリフ
ェノール類が、顕著な感染防止効果を発揮することはこ
れまで全く知られてはおらず、本発明者らがはじめて明
らかにした知見である。以下、本発明について詳述す
る。

【０００６】本発明のミズカビ病とは、水生菌、特に腐
生カビが魚卵や魚体またはえらに寄生して起こる魚類の
疾病を指し、例えば、サケ、マスの卵のミズカビ病、サ
ケ、マス、アマゴ、ヤマメのミズカビ病、ウナギ、コ
イ、アユのワタカブリ病等である。その他クルマエビの
フザリウム病、マス類の真菌性肉芽腫症、マス類稚魚の
内臓真菌症、イクチオフヌス病、デルモシスチジウム
症、ブランキオマイセス症等である。すなわちその病原
体は、フハイカビ類、ミズカビ類、フシミズカビ類であ
る。また対象となる魚類は、ウナギ、サケ・マス類、ア
ユ、キンギョ、フナ、ボラ、テラピア等である。

【０００７】本発明のポリフェノール類とは、ツバキ科
植物等の葉から水、温水、熱水あるいは有機溶剤により
抽出し得られるポリフェノール類を指し、特に（＋）−
カテキン，（＋）−ガロカテキン，（−）−ガロカテキ
ンガレート，（−）−エピカテキン，（−）−エピカテ
キンガレート，（−）−エピガロカテキン，（−）−エ
ピガロカテキンガレート，遊離型テアフラビン，テアフ
ラビンモノガレートＡ，テアフラビンモノガレートＢお
よびテアフラビンジガレート等のポリフェノール化合物
である。ポリフェノール類の調製法の一例は、特許（特
開平２−６４９９号，特開昭６３−２１４１８３号）等
に詳細に開示されている。また、茶葉もしくは緑茶、ウ
ーロン茶、紅茶等のツバキ科植物を原料とした飲料製造
時に多量に廃棄される抽出残渣をそのまま、または粉砕
等の処理を行ったものもミズカビ病防止組成物として用
いても差し支えない。さらには、他の原料起源のものも
しくは化学合成品でも差し支えない。得られたこれらの
ポリフェノール類を本発明に用いる場合は単独で、もし
くは二種以上の混合物として、さらにはポリフェノール
類を含む粗抽出物でも使用できる。

【０００８】本発明品を使用する際は、有効成分である
茶抽出物をそのまま薬浴用として飼育水に溶解したりし
て使用することもできる。また、場合によっては本発明
のミズカビ防止組成物を、そのままかまたは通常用いら
れている飼料に添加して経口的に投与することも有効で
ある。また、使用方法により溶液状、粒状、粉状、ゲル
状、半固形、固形などの形態で使用できる。さらには、
有効成分である茶抽出物が飼育水や飼料中に溶解、また
は分散しやすいように界面活性剤を併用することができ
る。界面活性剤としては、大豆レシチン、卵黄レシチ
ン、酵素分解レシチン、各種サポニン（キラヤ、ユッ
カ、ビート、茶、杜仲茶など）などの食品用の天然界面
活性剤、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂
肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、などの界面活性
剤が使用できる。これらの界面活性剤を併用することに
より、飼育水などへの溶解・分散が向上するのはもちろ
ん、ポリフェノール類のミズカビ病の防止効果が促進さ
れる。本発明品の有効濃度は、ポリフェノール類換算で
最終の使用濃度が１日当り0.005 〜10％が好ましく、0.
005 ％より少ない投与量では効果が弱く、10％以上の濃
度では魚卵のふ化や魚の成長に悪影響を及ぼす可能性が
あることから好ましくない。

【０００９】

【作用】本発明の茶抽出物がいかなる作用によりミズカ
ビ病の防止効果を示しているかはいまだ不明であるが、
一般に茶の有効成分であるポリフェノール類は蛋白質結
合能のあることが知られていることから、本発明のポリ
フェノール類もミズカビ病の原因となる各種腐生菌の細
胞膜又は細胞中のタンパク質に結合し、菌の細胞壁等に
損傷を与えることにより繁殖を抑制するものと推測され
る。以下、実施例および試験例により詳述する。

【００１０】

【実施例】

実施例１ 市販緑茶１ｋｇに水、約15リットルを加え撹拌し、80℃
で３時間抽出した。濾過により得られた抽出液を濃縮乾
固し、緑茶の熱水抽出物350 ｇタンニン類として１２５
ｇを得た（酒石酸鉄法にてタンニン類として38％）。 実施例２ 実施例１で得た熱水抽出物350 ｇに水８リットルを加え
溶解後、ヘキサンおよびクロロホルムで順次分配した。
分配後の水層に酢酸エチル10リットルを加えて激しく撹
拌・静置後、酢酸エチル層を分離し、酢酸エチルを留去
後、乾燥し酢酸エチル可溶画分70ｇを得た（タンニン類
として５２ｇ）。本酢酸エチル可溶画分の各ポリフェノ
ール化合物の割合は（＋）−カテキン3.5％，（＋）−
ガロカテキン14.8％，（−）−ガロカテキンガレート1
1.6％，（−）−エピカテキン7％，（−）−エピカテキ
ンガレート4.6％，（−）−エピガロカテキン15％およ
び（−）−エピガロカテキンガレート18.0％である。

【００１１】実施例３ 実施例２で得られた酢酸エチル可溶画分10ｇをシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（溶媒、クロロホルム：メ
チルアルコール、20： 1，10： 1，ｖ／ｖ）、セファデ
ックスＬＨ−20カラムクロマトグラフィー（溶媒，メチ
ルアルコール）、リサイクルＨＰＬＣ（日本分析工業製
ＬＣ−908 ，ＧＳ−320 カラム，溶媒メチルアルコー
ル）を順次用いることにより、（＋）−カテキン0.3
ｇ，（＋）−ガロカテキン1.22ｇ，（−）−ガロカテキ
ンガレート0.9 ｇ，（−）−エピカテキン0.5ｇ，
（−）−エピカテキンガレート0.38ｇ，（−）−エピガ
ロカテキン1.2ｇ，および（−）−エピガロカテキンガ
レート1.5ｇのポリフェノール化合物を得た。 実施例４ 市販緑茶１ｋｇを85℃の熱水20リットルで30分撹拌しな
がら抽出し、茶葉を濾過により除き17リットルの抽出液
を得た。この液を限外濾過装置（ＤＤＳ社製，膜タイプ
ＧＲ−８１ＰＰ、分画分子量6000）を用いて通過液15リ
ットルを得た。濃縮残液に水５リットルを加え同様に操
作し、通過液６リットルを得た。両液を合わせ逆浸透膜
（ＤＤＳ社製，膜タイプＨＣ−50）により濃縮し１リッ
トルとし、35％のタンニン類を含む本発明品233 ｇを得
た。

【００１２】実施例５ 実施例４で得られた濃縮品を吸着樹脂（Duolite S-876
，住友化学社製）を充填したカラムに流し吸着させ、
脱イオン水で洗浄後、樹脂の５倍量の50％エタノールに
て溶出し、減圧濃縮によりエタノールを留去し、濃厚水
溶液となし、その後常法により凍結乾燥し、74.5％、タ
ンニン類を含む本発明品70ｇを得た。得られたタンニン
類の成分組成は、（＋）−カテキン3.5％，（＋）−ガ
ロカテキン14.8％，（−）−ガロカテキンガレート11.6
％，（−）−エピカテキン7％，（−）−エピカテキン
ガレート4.6％，（−）−エピガロカテキン15％および
（−）−エピガロカテキンガレート18.0％である。 実施例６ 市販のインスタント紅茶100 ｇを熱湯３リットルで１時
間抽出後、室温にまで冷却し濾過により抽出液を得た。
抽出液に等量のクロロホルムを加え分画する。分画によ
り得た水層部を等量のメチルイソブチルケトンにて抽出
し、得られたメチルイソブチルケトン層を濃縮乾固し粗
テアフラビンとして本発明品2.5ｇを得た。

【００１３】実施例７ 実施例１で得られた緑茶の熱水抽出物１００ｇを、２％
キラヤサポニン液２００ｍｌに溶解後、スプレードライ
して本発明品１０１ｇを得た。 実施例８ 実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇ
に、２％ユッカサポニン液２００ｍｌを加え、ホモミキ
サーで乳化し本発明品２４５ｍｌを得た。

【００１４】実施例９ 実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇ
に、２％の茶サポニン液２００ｍｌを加え、ホモミキサ
ーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。 実施例１０ 実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇ
に、２％のビートサポニン液２００ｍｌを加え、ホモミ
キサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。

【００１５】実施例１１ 実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇ
に、２％杜仲茶サポニン液２００ｍｌを加え、ホモミキ
サーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。 実施例１２ 実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇ
に、１％グリセリンモノカプリル酸エステル液２００ｍ
ｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを
得た。

【００１６】実施例１３ 実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇ
に、１％のポリグリセリン脂肪酸エステル液（太陽化学
社製、商品名サンソフトＱ−１４Ｓ）２００ｍｌを加
え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。 実施例１４ 実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに
１％ショ糖脂肪酸エステル液２００ｍｌを加え、ホモミ
キサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。

【００１７】試験例１．急性毒性試験 ｄｄｙ系マウスを１群10匹として、各群に生理的食塩水
に懸濁した実施例５および６で得られた本発明品を恒温
（23±1 ℃）、恒湿（55±5 ％）の条件下で経口投与
し、リッチフィールド・ウイルコックンソン（Litchfie
ld-wilcoxon ）法によりＬＤ５０を求めた結果、それぞ
れ雌で3.1 および3.5 ｇ／ｋｇ以上、雄で５および5.5
ｇ／ｋｇ以上であった。 試験例２．細胞毒性試験 ＭＡ104 細胞（サル腎細胞）を1.2 ×１０⁵ ｃｅｌｌ／
ｔｕｂｅになるように10％ＦＣＳ含有ＢＨＫｃｅｌｌ培
地（抗生物質無添加）に添加した。これに実施例５およ
び６で得た本発明品を５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよ
び0.5 μｇ／ｍｌになるように添加し、37℃で４日間培
養し、細胞増殖を調べた。その結果、増殖曲線は生理的
食塩水だけを加えたコントロールと同様であり細胞毒性
は全く認められなかった。

【００１８】試験例３．変異原性試験 実施例５および６で得られた本発明品を用いサルモネラ
（ネズミチフス菌）におけるヒスチジン要求性から非要
求性への復帰試験を目的とするエームス（Ａｍｅｓ）テ
ストを行った。検定菌として、サルモネラ・チフィリウ
ムＴＡ100 およびＴＡ98を用い、直接試験と代謝活性試
験を実施した。その結果、直接試験と代謝活性試験にお
ける変異コロニーの増加は認められず、変異原性を有し
ない（陰性）と判断された。 試験例４ 実施例５で得られた本発明品のサケ受精卵のふ化に対す
る毒性試験を実施した。目合い５ｍｍ（１０×２０×１
０ｃｍ）のバスケットに実施例５の本発明品を５０、２
０、１０、１、０．１、０ｇ／リットルとなるように処
理溶液を調整し、それぞれにサケ受精卵５０粒入れ、１
回当たり１時間浸漬し、この操作を１週間間隔で４回繰
り返して処理した。浸漬処理後、流水条件に戻しふ化ま
で観察し、ふ化率より毒性の有無を判定した。結果を表
１に示した。

【００１９】

【表１】

【００２０】表１より明らかなように本発明の有効成分
であるポリフェノール化合物はサケ受精卵のふ化に何等
影響を及ぼさず、ふ化後の稚魚にも異常は認められなか
った。 試験例５ 実施例１、２、４〜１４で得られた本発明品のサケ受精
卵のミズカビ病に対する防止試験を実施した。目合い５
ｍｍ（１０×２０×１０ｃｍ）のバスケットを多数用意
し、それぞれにサケ受精卵５０粒と故意に衝撃を与えて
へい死させた死卵５０粒を混合してセットした。死卵を
加えたのはミズカビを自然発生させるためである。流水
量毎分約２００ｍｌ中にバスケットを設置して受精卵を
１時間インキュベートし感染させた。実施例１、２、４
〜１４で得られた本発明品の濃度を２０、１０、５、
２、１、０．４、０．２、０．１、０ｇ／リットルとし
た処理溶液を調整し、各濃度ごとに２バスケットを設け
た。各溶液にバスケットごと１回当り１時間浸漬し、こ
の操作を１週間間隔で４回繰り返して処理した。浸漬処
理後、流水条件に戻し、５週間インキュベートしてミズ
カビ病の発生状況をふ化まで観察した。なお、供試した
受精卵は卵質の差をできるかぎり小さくするために１尾
のサケから採卵したものを受精直後から用いた。ミズカ
ビ病の防止効果はふ化率から判断し、結果の表示は予め
加えた死卵数を計数から除き、２バスケットの合算で行
った。結果を表２に示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】表２に結果より、本発明の茶成分はミズカ
ビ病に対する防止効果は明かである。 試験例６ 実施例５で得られた本発明のポリフェノール類のフナに
対する毒性を試験した。本発明の茶成分を１、０．１、
０．０１、０ｇ／リットルとした処理溶液を調整し、１
群１０尾のフナ（体重平均３０ｇ）を各濃度の溶液に浸
漬処理し、経時的に魚の行動を観察し、さらに１時間後
の生存数を測定した。結果を表３に示した。

【００２３】

【表３】

【００２４】表３から明らかなように０．０１〜１ｇ／
リットルの濃度の溶液への浸漬では魚の行動および生存
に影響を及ぼさなかった。 試験例７ 実施例５で得られた茶成分を用いシラスウナギのミズカ
ビ病に対する防止試験を行った。シラスウナギ１００尾
をミズカビ病の発生した飼育水に約１時間浸漬感染後、
実施例５で得られたポリフェノール類を０．５、０．
２、０．１、０．０５、０ｇ／リットル濃度とした処理
溶液中に２０尾づつ、１時間浸漬し通常の飼育水に戻し
た。その後、ミズカビ病の発生状況を目視もしくは顕微
鏡にて観察し、ミズカビ病発生率にて表示した。結果を
表４に示す。

【００２５】

【表４】

【００２６】表４の結果より、本発明の茶抽出物はウナ
ギのミズカビ病に対する防止効果は明らかである。 本発明の実施態様を挙げれば以下の通りである。 （１）ポリフェノール類を含有することを特徴とするミ
ズカビ病防止組成物。 （２）ポリフェノール類が茶の熱水抽出物である前記
（１）記載のミズカビ病防止組成物。 （３）ポリフェノール類が茶の熱水抽出物の酢酸エチル
可溶成分である前記（１）記載のミズカビ病防止組成
物。 （４）ポリフェノール類が（＋）−カテキン、（＋）−
ガロカテキン、（−）−ガロカテキンガレート、（−）
−エピカテキン、（−）−エピカテキンガレート、
（−）−エピガロカテキンおよび（−）−エピガロカテ
キンガレートである前記（１）記載のミズカビ病防止組
成物。 （５）ポリフェノール類が（＋）−カテキン、（＋）−
ガロカテキン、（−）−エピカテキンおよび（−）−エ
ピガロカテキンである前記（１）記載のミズカビ病防止
組成物。 （６）ポリフェノール類が（−）−ガロカテキンガレー
ト、（−）−エピカテキンガレート、および（−）−エ
ピガロカテキンガレートである前記（１）記載のミズカ
ビ病防止組成物。 （７）ポリフェノール類が（−）−エピガロカテキンガ
レートである前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。 （８）緑茶の熱水抽出物に大豆レシチンまたは卵黄レシ
チンを併用することを特徴とするミズカビ病防止組成
物。 （９）緑茶の熱水抽出物および酵素分解レシチンを含有
することを特徴とするミズカビ病防止組成物。 （１０）（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、
（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキ
ン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロ
カテキン、（−）−エピガロカテキンガレートおよびキ
ラヤサポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防
止組成物。

【００２７】（１１）（＋）−カテキン、（＋）−ガロ
カテキン、（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エ
ピカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−
エピガロカテキン、（−）−エピガロカテキンガレート
およびユッカサポニンを含有することを特徴とするミズ
カビ病防止組成物。 （１２）（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、
（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキ
ン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロ
カテキン、（−）−エピガロカテキンガレートおよび茶
サポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組
成物。 （１３）ポリフェノール類およびビートサポニンを含有
することを特徴とするミズカビ病防止組成物。 （１４）ポリフェノール類およびビートサポニンを含有
することを特徴とするミズカビ病防止組成物。 （１５）ポリフェノール類および杜仲茶サポニンを含有
することを特徴とするミズカビ病防止組成物。 （１６）ポリフェノール類およびグリセリン脂肪酸エス
テルを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成
物。 （１７）ポリフェノール類およびポリグリセリン脂肪酸
エステルを含有することを特徴とするミズカビ病防止組
成物。 （１８）ポリフェノール類およびショ糖脂肪酸エステル
を含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。 （１９）茶の粉末を含有することを特徴とするミズカビ
病防止組成物。 （２０）緑茶の抽出残渣を含有することを特徴とするミ
ズカビ病防止組成物。 （２１）ミズカビがフハイカビ類、ミズカビ類、フシミ
ズカビ類である前記（１）記載のミズカビ病防止組成
物。

【００２８】

【発明の効果】本発明のミズカビ病防止組成物は魚卵や
魚体に発生するミズカビ病を防止する。しかも、その有
効成分が通常われわれが飲用に供している茶の成分であ
ることからその安全性は極めて高く、マラカイトグリー
ン等の毒性が懸念されている状況において本発明品をミ
ズカビ病の防止に使用することは産業上有用であると考
えられる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリフェノール類を含有することを特徴
   とするミズカビ病防止組成物。
2. 【請求項２】 ポリフェノール類が（＋）−カテキン，
   （＋）−ガロカテキン，（−）−ガロカテキンガレー
   ト，（−）−エピカテキン，（−）−エピカテキンガレ
   ート，（−）−エピガロカテキン，（−）−エピガロカ
   テキンガレート，遊離型テアフラビン，テアフラビンモ
   ノガレートＡ，テアフラビンモノガレートＢおよびテア
   フラビンジガレートからなる化合物群より選ばれる一種
   または二種以上の成分であることを特徴とする請求項１
   記載のミズカビ病防止組成物。