JPH08510715A

JPH08510715A - フィブロネクチン及び関連コラーゲン−結合性タンパク質のペプチド阻害剤

Info

Publication number: JPH08510715A
Application number: JP6512452A
Authority: JP
Inventors: ディー．ロバーツ，デビッド; シー．クルツ，ヘンリー; エム．サイプス，ジョン; ゴー，ネン−ファ; ネグレ，エリック
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-09
Publication date: 1996-11-12
Anticipated expiration: 2021-06-28
Also published as: DE69326016D1; JP2006028195A; ATE183196T1; CA2148383A1; EP0669937A1; AU683234B2; JP3789931B2; WO1994011395A1; EP0669937B1; US5491130A; AU5669594A; US5849701A; DE69326016T2

Abstract

(57)【要約】フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインに結合するヒト内皮細胞トロンボスポンジンの第二タイプ１反復から得られたペプチドを単離し、そして合成により製造した。本ペプチドを、フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン-結合性タンパク質に結合させて、フィブロネクチン-依存性細胞接着を阻害し、そしてフィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインと相同性を共有する他のタンパク質のコラーゲンとの相互作用を阻害するために、使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】フィブロネクチン及び関連コラーゲン-結合性タンパク質のペプチド阻害剤発明の分野本発明は、トロンボスポンジン（thrombospondin）とフィブロネクチン（fibr onectin）との相互作用を仲介するトロンボスポンジンのドメインから誘導されたペプチドであって、フィブロネクチンに特異的に結合し且つフィブロネクチンのコラーゲンへの結合を阻害するペプチドに、並びにこれらのペプチドを含む医薬組成物に、そしてこれらのペプチドを使用してフィブロネクチンのコラーゲンへの結合を阻害する方法に、関する。発明の背景トロンボスポンジンは、多くの巨大分子、例えば、フィブロネクチン（Lahav ，et al.，1984，Cell 31:253-262; Lahav，et al．1984，Eur．J．Biochem．14 5:151-156）、ヘパリン（Lawler，et al．1981，Thromb．Res．22:267-279）及びコラーゲン（Lahav，et al．1984，Cell 31:253-262，Mumby，et al.，1984 J ．Cell．Biol．98:646-652）と相互作用することができる多-官能性タンパク質である。これらの分子のすべてが、その細胞外マトリックスの構成成分であり、これは、トロンボスポンジンがそのマトリックスへの沈着の後に他のマトリックス成分と複合体を形成することを示唆している。 Gelder and Brownは、トロンボスポンジンがゼラチンとフィブロネクチンとの相互作用を阻害すること示している（Gelder，F.B．and Brown，S.T．1987，J． Lab．Clin．Med．110:548-557）。血小板トロンボスポンジン及び未同定であるが生物学的に類似の血漿タンパク質は、フィブロネクチンのゼラチン-結合活性を阻害することが示された；しかしながら、その相互作用の原因であるトロンボスポンジンのドメイン又は配列は、未だ知られていない。この相互作用領域は、そのフィブリン結合性ドメインとフィブロネクチン上で異なる部位であると含意され（Homandberg，G.A．and Kramer-Bjer ke，J．1987，Thromb．Res．48:329-335）、そしてトロンボスポンジンの少なくとも２の別個のドメインがフィブロネクチンに結合することが示された（Dardik ，R．and Lahaw，J．1989，Eur．J．Biochem．185:581-588）。フィブロネクチンとヘパリンは、トロンボスポンジンの27kDa断片への結合について競合し、これは、これらの２つのタンパク質がトロンボスポンジンのN-末端ドメイン内に共通又は密に配向された結合部位を共有することを示唆している。トロンボスポンジンは、フィブロネクチン・マトリックスに付着した内皮細胞の病巣接触接着を破壊することも示されている（Murphy-Ullrich，J.E.，and Hook，M．1989，J． Cell．Biol．109:1309-1319）。この効果の機構は、知られていないが、硫酸化多糖類によるトロンボスポンジンの活性の阻害は、トロンボスポンジンのヘパリン-結合性ドメインが関連していることを示唆している。トロンボスポンジンからの多数の生物学的に活性なペプチドが同定され、そして単離されている。２つのペプチド、ArgGlyAspAla（Lawyer，J．and Hynes，R. O．1986，J．Cell Biol．103:1635-1641）及びValThrCysGly（Prater，et al.， 1991，J．Cell Biol．112:1031-1040）は、細胞表面上のタンパク質レセプタとトロンボスポンジンとの相互作用のためのリガンドであると提案されている。トロンボスポンジンのペプチドTrpSerProTrpSer（Guo，et al．1992，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，89:3040-3044）は、ヘパリン及びスルファチドに結合する。しかしながら、フィブロネクチン又は関連コラーゲン結合性タンパク質に結合することができるトロンボスポンジン・ペプチドは知られていない。フィブロネクチンは、細胞付着及び転移を含む様々な細胞接触過程に関連している。フィブロネクチンは、フィブロネクチンの”ゼラチン結合性ドメイン”を通じてコラーゲンと相互作用し、そしてコラーゲンとフィブロネクチンとの間のこの相互作用は、細胞外マトリックスの組織化及び支持体上でのこれらの細胞の挙動に基本的なものである（Vaberi，et al.，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，75:4944-4948）。フィブロネクチンは、様々な腫瘍及び癌細胞を含む多くの細胞の付着及び転移に本質的なものである。従って、高いアフィニティーをもってフィブロネクチン又は関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するであろうフィブロネクチンの阻害剤についての必要性が存在する。特に、コラーゲン・マトリックスへのフィブロネクチン-依存性細胞接着を防ぎ、そしてフィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインとの相同性を共有する他のタンパク質とコラーゲンとの相互作用を阻害するための、フィブロネクチン又は関連コラーゲン-結合性タンパク質に結合するであろうような阻害剤についての必要性が存在する。それ故、本発明の目的は、コラーゲン・マトリックスへのフィブロネクチン- 依存性細胞接着を防ぎ、そしてそのフィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質とコラーゲンとの相互作用を阻害するために、フィブロネクチン又はそのフィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質に特異的に且つ特異的なアフィニティーをもって結合する配列をもつ高く有効なペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、フィブロネクチン又はそのフィブロネクチン・ゼラチン-結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質に対して高いアフィニティーをもつ少なくとも１のペプチドを含む医薬組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、治療の必要な患者においてフィブロネクチン又はそのフィブロネクチン・ゼラチン-結合性ドメインとの相同性を有する他のタンパク質への結合方法を提供する。本発明のこれらの及び他の目的は、以下の説明及び好ましい態様から並びに添付図面の助けによりさらに明確になるであろう。図面の簡単な説明図１は、フィブロネクチンの各固定化されたトロンボスポンジン・ペプチド、すなわち、SerHisTrpSerProTrpSerSer（配列番号８）（●）；LysArgPheLysGlnA spGlyGlyTrpSerHisTrpSerProTrpSerSer（配列番号７）（○）;LysArgPheLysGlnA spGlyGlyTrpSerHisTrpSerPro（配列番号５）（▲）;GlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）（△）;及びGlyGlyTrpSerHisTrpSerPro（配列番号４）（■）へのフィブロネクチンの結合のグラフである。図２は、合成ペプチドによるトロンボスポンジン・ペプチドGlyGlyTrpSerHisT rp（配列番号１）へのフィブロネクチン結合の阻害の特異性のグラフである。パネルA中：ペプチドは、GlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）（●）;GlyGlyTrpSer LysTrp（配列番号９）（▲）;GlyGlyTyrSerHlsTrp（配列番号10）（■）；及びG IyGlyTrpSerHisTyr（配列番号11）（▼）であり；パネルB中:GlyGlyTrpSerHisTr p（配列番号１）（●）;GlyGlyTrpThrHisTrp（配列番号12）（▲）;GlyGlyTyrTr pHisTrp（配列番号13）（■）；及びGlyTrpSerHisTrp（配列番号14）（+）及びA spGlyTrpSerHisTrp（配列番号15）（□）である。図３は、可溶性フィブロネクチン、トロンボスポンジン及びペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）による、トロンボスポンジン・ペプチド GlyGlyTrpSerHisTrpへのフィブロネクチン結合の阻害のグラフであり、GlyGlyTr pSerHisTrp（配列番号１）（●）、フィブロネクチン（▲）及びトロンボスポンジン（■）である。図４は、フィブロネクチンのタンパク質分解断片：30kDaゼラチン-結合性ドメイン（●）、31kDaフィブリン-結合性ドメイン（○）、40kDaヘパリン-合性ドメイン（▲）、120kDa細胞-結合性ドメイン（△）及び無傷のフィブロネクチン（ ■）による、トロンボスポンジン・ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpへのフィブロネクチン結合の阻害のグラフである。図５は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）によるゼラチンへのフィブロネクチン結合の阻害のグラフである。図６（A）は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）（●）;GlyGlyTrpS erLysTrp（配列番号９）又はTrpSerHisTrpSerPro（配列番号２）によるゼラチンへのフィブロネクチン-仲介メラノーマ細胞A2058接着の阻害の棒グラフである。図６（B）は、本発明に係るペプチドによる固定化フィブロネクチンへのA2058 細胞の直接的接着の阻害の棒グラフである。図７は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）;GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）又はTrpSerHisTrpSerPro（配列番号２）によるゼラチンへのフィブロネクチン-仲介癌腫細胞MDA4355接着の阻害の棒グラフである。図７（B）は、本発明に係るペプチドによるフィブロネクチンへのMDA435s細胞の直接的接着の阻害の棒グラフである。図８は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）;GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）;TrpSerHisTrpSerPro（配列番号２）又はGlyArgGlyAspSer（配列番号16）による生来の１型コラーゲンへの胸癌腫細胞 MDA435sのフィブロネクチン-仲介物質接着の阻害の棒グラフである。図９は、ペプチド（配列番号１）によるゼラチナーゼ活性の阻害の棒グラフである。発明の要約本発明者らは、フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーをもつ生物学的に活性なペプチドであって配列HisTrp及び少なくとも１の他のトリプトファン残基を含む少なくとも５のアミノ酸の配列をもつものを、単離、精製、及び特徴付けし、又は合成及び特徴付けした。本発明の好ましい態様においては、本ペプチドは、配列XaaHisTrp｛ここで、Xaaがセリン、トレオニン及びアラニンから選ばれたアミノ酸である。｝を含む。さらに好ましくは、本ペプチドは、ヘキサペプチドGlyGlyTrpXaaHisTrp｛ここで、Xaa が先に定義したものと同じである。｝を含む配列をもつ。本発明の特に好ましい態様においては、本ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の中の１をもつペプチドである。最も好ましいのは、ヘキサペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）である。本発明の他の態様においては、フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン-結合性タンパク質に結合するための医薬組成物であって本発明に係る少なくとも１のペプチドの有効量及び医薬として許容される賦形剤又は担体を含むものが提供される。本発明の好ましい態様においては、本医薬組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選ばれたペプチドの中の１の有効量並びに医薬として許容される賦形剤又は担体を含む。より好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、配列番号１をもつヘキサペプチドである。本発明の他の態様においては、治療の必要な患者においてフィブロネクチン又は他のコラーゲン-結合性タンパク質に結合する方法であって、フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインについての特異的結合アフィニティーをもち、そして配列HisTrp及び少なくとも１の他のトリプトファン残基を含む少なくとも５のアミノ酸を含むペプチドの有効量をそのような患者に投与するような方法が、提供される。本発明の好ましい態様においては、本ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から選ばれた配列をもつペプチドである。最も好ましいには、そのペプチドがヘキサペプチド配列番号１であるような方法である。用語”コラーゲン-結合性ペプチド”は、本明細書中、コラーゲンに特異的に結合し又はこれと相互作用することができるドメインをもつタンパク質について記載するために使用される。用語”フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメイン”は、本明細書中、ゼラチンと哺乳類フィブロネクチンとの相互作用の部位である哺乳類フィブロネクチンのアミノ酸配列について記載するために使用される。この”ゼラチン”は、変性コラーゲンを定義するために使用される。用語”フィブロネクチンについての特異的結合アフィニティー”は、本明細書中、飽和ペプチド条件下ペプチドへのフィブロネクチンの少なくとも１重量%の結合を意味するために使用される。記号（+）は、フィブロネクチンへの、１〜５%の結合を示し、（++）は、５超〜50%の結合を示し、そして（+++）は、50超の結合を示す。アミノ酸のための１文字コード及び本明細書中に使用されるその対応３文字コードを以下に示す： W=Trp K=Lys Y=Tyr P=Pro D=Asp R=Arg F=Phe Q=Gln E=Glu T=Thr G=Gly S=Ser A=Ala 発明の詳細な説明本発明に係るペプチドは、細胞外マトリックス・タンパク質トロンボスポンジンから誘導される。特に、本ペプチドは、マトリックス接着タンパク質フィブロネクチンとトロンボスポンジンとの相互作用を仲介するドメインの中の１から誘導される。本発明に係るペプチドは、トロンボスポンジンの第二の１型反復（th e second type１ repeat）から誘導される。トロンボスポンジンは、トロンボスポンジンへの細胞の付着に関係した３つのドメインを含むモジュールの接着糖タンパク質である。キモトリプシン分解性50kDaペプチドから成るトロンボスポンジンの１領域は、２つのマラリア・タンパク質に相同な57残基セグメントの３つの１型反復を含む（Lawler J．and Hynes ，R.O．1986，J．Cell．Biol．103: 1635-1648）。第二の１型反復のアミノ酸配列は、引用により本明細書中に取り込まれる。本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインと直接に相互作用する。フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインは、ゼラチンとフィブロネクチンとの相互作用に必要である。本発明に係る特定の且つ好ましい配列は、表１中に表され、そして様々な分野の公知方法の中のいずれかにより作られることができる。このようなペプチド合成法は、例えば、固相ペプチド合成、発現ベクター内でそのペプチドをエンコードしているDNAのクローニングを含む遺伝子操作技術、及びトロンボスポンジンからのそのペプチドの直接的な単離、を含む。表１は、本発明に係るペプチド（FN結合性+、++、+++）に相同性を有しながら必須His-Trp（H-W）配列を含まない他のペプチド（FN結合性-）をも含む。本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインに特異的に結合する。本ペプチドのフィブロネクチン-結合に責任を負う配列は、ヘパリン-結合性ペプチドとして先に同定されたペプチド内に含まれるが、フィブロネクチンに結合するのに最適な配列は、ほんの弱いヘパリン-結合活性をもつ（U.S.P．出願07/801,812）。さらに特に、トロンボスポンジンの第二１型反復の一部を含んで成る17アミノ酸ペプチド（ペプチド246）（配列番号７）（KRFKQDG GWSHWSPWSS）は、フィブロネクチンについての強いアフィニティーを示し、そしてゼラチンへのフィブロネクチン結合及びゼラチン・マトリックスへのフィブロネクチン-仲介細胞接着の有効な阻害剤である。フィブロネクチンへの本ペプチドの結合は、ペプチド246のアミノ末端の塩基性残基を必要としない。なぜなら、これらの残基を欠いたペプチド256（GGWSHWSPWSS）（配列番号６）もフィブロネクチンに結合するからである。その正確な位置における少なくとも２のトリプトファン残基が結合のために必要である。ペプチド246（配列番号18）の中央のトリプトファン残基（残基９）が結合のために必要である。なぜなら、このトリプトファン残基を欠いた類似のペプチド（259）は結合するのに失敗するからである（表１及び図１）。この17 アミノ酸ペプチド246（配列番号７）から誘導された重複ペプチドの中で、GlyGl yTrpSerHisTrp（配列番号１）をもつペプチドは、最も強い結合活性をもつ（図１及び表１）。本発明に係るペプチドの中で最も好ましいのは、配列GlyGlyTrpS erHisTrp（配列番号１）をもつヘキサペプチドである。本発明に係るペプチドは、連続して生じるヒト・トロンボスポンジン・アミノ酸から誘導される配列を含むことができる。好ましくは、この連続して生じるアミノ酸配列は、アミノ酸394-420及び424-450から選ばれる。特に好ましいのは、その連続的アミノ酸410-420及び424-434である。トロンボスポンジンの第二１型反復から誘導された幾つかのペプチドの結合活性を図１中に示す。100μg/mlの飽和ペプチド濃度において、50%超の添加フィブロネクチンが本発明に係る固定化ペプチドに結合される。ペプチド配列GlyGlyTr pSerHisTrp（配列番号１）から成るヘキサペプチドは、その同一配列又は無傷のトロンボスポンジンを含むより大きなペプチドよりも良好にフィブロネクチンに結合し、これは、その６残基配列がトロンボスポンジンにおいて部分的に暗号に関するものであることを示している。本発明に係るペプチドが有効なフィブロネクチン結合のための完全なヘキサペプチド配列を含むことは必要でないが、そのペプチドがそのヘキサペプチドと幾つかの配列相同性を共有することが必要である。そのヘキサペプチドの２つのトリプトファン残基とHis残基が本発明に係るペプチド内で必須である。なぜなら、類似アミノ酸による保存的置換でさえそのペプチドに不活性を付与するからである（図２）。好ましくは、セリン残基が存在するが、それは必須ではない。最適結合は、セリン残基を含んで成るペプチドにより得られる（図2B）。トレオニン残基によるそのセリン残基の保存的置換は、約５倍活性を減少させ、そしてアラニン残基によるそのセリン残基の置換は、そのトレオニン・アナログよりも僅かに高い阻害定数をもつ活性ペプチドを作り出す。２つのグリシン残基の存在は、１つだけのグリシン残基をもつペプチド・アナログに比較して活性をより強く増強する（図2B）。アラニンによるグリシン残基又はアスパラギン酸によるグリシン残基の両方の保存的置換は、活性を無くさせる。好ましくは、このペプチドは、２つのグリシン残基を含んで成るが、１又は両方のグリシン残基を欠いたペプチドは本発明の範囲内にある。従って、本発明に係るペプチドは、少なくとも５つのアミノ酸残基の配列をもつ、これは、少なくとも２つのトリプトファン残基を含み、その中の少なくとも１は、配列HisTrp（HW）として存在し、ここで、このペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン-結合性部位についての特異的な結合アフィニティーをもつ。より好ましくは、配列XaaHisTrpを含む少なくとも５のアミノ酸残基をもつペプチドであり、ここで、Xaaはセリン、トレオニン及びアラニンから選ばれたアミノ酸であり、そしてその５つのアミノ酸は少なくとも２つのTrp残基をもつ。さらにより好ましくは、ヘキサペプチドGlyGlyTrpXaaHisTrpであり、ここで、Xaaはセリン、トレオニン及びアラニンである。本発明の特に好ましい態様においては、本発明に係るペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から独立して選ばれた配列をもつペプチドである。最も好ましいのは、ペプチド配列番号１である。本発明に係るペプチドは、特異的な結合アフィニティーをもってフィブロネクチンに結合するために溶液中で適当なコンホメーションを保持する。その上、本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンのゼラチン-結合性部位に特異的に結合し、そして好ましくは、飽和懸濁条件下で少なくとも5%の結合アフィニティーをもつ。本発明のペプチドは、ゼラチンへのフィブロネクチン結合及びゼラチン・マトリックスへのフィブロネクチン-仲介細胞接着の有効な阻害剤である。フィブロネクチンは、正常な発達の間に細胞の相互作用及び細胞外マトリックス組み立てを仲介物質する重要な細胞外マトリックス成分である。それは、恒常性及び外傷治癒にも参加し、そして細胞とのフィブロネクチンの相互作用を阻害するペプチドが動物モデルにおいて腫瘍転移を阻害することが証明されている（ Humphries，M．J．Olden，K and Yamada，K.，（1986）Science 233，467-470）。本発明は、新たなクラスのフィブロネクチン機能阻害剤を提示する。本発明に係るペプチドは、フィブロネクチンに特異的に結合し、そしてフィブロネクチンのための細胞表面インテグリン・レセプタとではなくコラーゲンとのフィブロネクチンの相互作用を阻害する。このように、これらのペプチドは、腫瘍形成、転移、外傷修復及び恒常性に関連する細胞マトリックス相互作用の調節において利用可能である。例えば、本ペプチドは、固定化ゼラチンへのヒト胸癌腫細胞系MDA-MB-435のフィブロネクチン- 依存性接着を阻害する。本発明に係るペプチドによるこれらの癌細胞の接着の阻害は、フィブロネクチン結合活性を欠いた相同なペプチドが接着を阻害することに失敗するということにおいて特異的である（図6-A）6-B及び7参照）。先に述べたように、ヘキサペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）との部分的な配列相同性だけが、ゼラチンへのフィブロネクチン結合を阻害するために必要である。様々なタンパク質における活性部位を含んで成る相同な配列の存在は、そのフィブロネクチン-結合性ドメインに相同なドメインを含む他のタンパク質の活性が本発明に係るペプチドにより調節されることができるということを示唆している。例えば、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-2及びマトリックス・メタロプロテイナーゼがそのフィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインと相同性を共有するようなタンパク質は、本発明に係るペプチドにより調節されることができる。トロンボスポンジン遺伝子ファミリーにおいてフィブロネクチン-結合性ヘキサペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号1）の高程度の保存が存在する。この配列は、マウス及びヒトThbsI遺伝子の第二1型反復内で及びマウス及びニワトリからのThbs2遺伝子内で完全に保存されている（Laherty，et al．1992，J．Biol ．Chem．267: 3274-3281）。このサーチ配列GlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）を使用したSwiss-Protデータ・ベースのサーチは、類似の配列をもつ幾つかの他のタンパク質を産生した（表II参照）。Epstein-Barrウイルス・リボヌクレオチド・レダクターゼは、最も相同な配列、GlyG lyTrpPheHisTrp（配列番号18）を含んでいる。脊椎動物のアセチルコリン・レセプタ配列の中で高く保存されているニコチン・アセチルコリン・レセプタのα- サブユニットも、配列GlyTrpLysHisTrp（配列番号19）を通じて上記ヘキサペプチドとの配列相同性を共有している。配列GlyTrpLysHisTrp（配列番号19）を含むアセチルコリン・レセプタのペプチドは、そのレセプタへのアセチルコリン結合において役割を演じている。さらに、他の類似配列、TrpSerXTrpSerは、有効な”結合性（binding）”配列として同定されている（Miyazaki，et al．1991; Embo J.，3191-3197; Yoshimura，et al．1992，J．Biol．Chem．267: 11619-11 625）。この部位と相互作用するリガンドは同定されていないが、そのコンセンサス配列の突然変異後のレセプタのプロセシング又は活性の損失は、タンパク質の折り畳み、細胞内プロセシング、又はシグナル変換に関連する細胞因子が有効なリガンドであることを示唆している。本発明に係る少なくとも１のペプチドの治療的有効量を含む組成物を、本分野において公知のいずれかの方法により調製する。例えば、本組成物を、本発明に係る少なくとも１のペプチドと医薬として許容される担体又は賦形剤、例えば、無菌生理食塩水、リンゲル液、リンゲル乳酸塩又は5%デキストロースとの混合物を形成することにより調製する。本ペプチドを、投与に望ましい調製物の形態に依存して様々な担体化合物と混合することができる。他の態様においては、本発明に係るペプチドを、好適な担体ポリドとの化学的結合を、標的細胞の表面タンパク質に対する抗体への付着により特定の細胞を標的化するために使用することができる。ペプチド投与の様々な方法が当業者に知られている。このような投与方法は、非限定的に、表面適用、経口及び非経口的経路、関節内注射、持続性放出を介しての皮下注射、静脈内注射又は他の医薬デリバリー法、を含むことができる。本発明に係るペプチドの適当な投与量は、その個々の患者により提示される症状に依存するであろう。熟練した医学研究者は、生理学的な活性と競合するのに必要な適当な投与量を決定することができるであろう。しかしながら、一般的には、約１μg〜100μg/体重1kg/日の量の上記生物学的活性ペプチドが有用であるはずである。以下の実施例を、本発明の原理及び実施をより十分に説明するために提供する。本実施例は、いずれの方法によるかを問わず本発明の範囲を限定することを意図されていない。実施例１本実施例は、フィブロネクチンへの本発明に係るペプチドの結合について説明する。フィブロネクチンを、記載されたような（Ariyama，et al．1985，J．Biol．C hem．260: 4492-4500）血小板-減少血漿から単離し、そして記載されたような（ Roberts，et al．1987，J．Cell．Biol．104:131-139）Iodogen（Pierce Chemic al Co.，Rockford，ILL）を使用してヨード化した。ペプチドを、ヒト内皮細胞トロンボスポンジンのためのcDNA配列から演繹されたヒト・トロンボスポンジンの配列に対応して合成した（C Lawyer and Hynes， 1986，J．Cell．Biol．103:1635-1648）。ペプチドを、標準的なMerrifield固相合成プロトコール及びt-Boc 化学を使用したBiosearchModel 9600ペプチド合成装置上で合成した。ペプチドを、分析し、そして適宜、さらに逆相HPLCクロマトグラフィーにより精製した。ペプチド246（配列番号７）を含むペプチドの幾つかの同定を、完全アミノ酸配列分析により確認した。ペプチド溶液を、希NaOHの添加により中和し、そして-2 0℃において溶液中に保存した。固定化ペプチドへのフィブロネクチンの直接的結合を、最初に園ペプチドを、所定濃度において25℃において３時間塩化ポリビニルマイクロタイター・プレート上に吸収させることにより行った。未結合ペプチドを、洗浄により除去し、そしてウェルを、tris-BSA（50mM tris-HCl，pH7-8，110mM NaCl，1% BSA）中で30 分間インキュベートした。ウェルを洗浄し、そして25℃において２時間30mlの0. 5μg/m¹²⁵I-フィブロネクチンと共にインキュベートした。ウェルをDulbecco's ホスフェート・バッファー生理食塩水により５回洗浄し、そして結合した放射能をカウントした。表１中に列記したペプチドを、先に記載したように合成し、そしてマイクロタイター・ウェルに吸収させた。トロンボスポンジンのＩ型反復又はカルボキシ末端ドメインからテストされた大きなペプチドの中で、ペプチド246（配列番号７）だけが、標識されたフィブロネクチンに結合した。ペプチドGlyGlyTrpSerHisT rp（配列番号１）が最も強い結合活性を示した。このペプチド配列は、ヒトThbs I遺伝子の第二Ｉ型反復内に位置する。トロンボスポンジンの第一及び第三のＩ型反復内の対応位置から誘導された合成ペプチド317（配列番号15）及び318（配列番号20）は、不活性であった。結果を表１及び図１中に示す。図１は、ペプチド300（△）（GlyGlyTrpSerHis Trp）（配列番号1）；246（○）（LysArgPheLysGlnAspGlyGlyTrpSerHisTrpSerPr oTrpSerSer）（配列番号7）；263（▲）（LysArgPheLy sGlnAspGlyGlyTrpSerHisTrpSerPro）（配列番号５）；及び264（■）（GlyGlyTr pSerHisTrpSerPro（配列番号4）へのI-フィブロネクチンの結合を示している。実施例２本実施例は、合成ペプチドによるトロンボスポンジン・ペプチド300（GlyGlyT rpSerHisTrp）へのフィブロネクチンの阻害の特異性について説明する。マイクロタイター・プレート・ウェルを、実施例１におけるように50μg/mlのペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）によりコートした。結合ペプチドへの¹²⁵I-フィブロネクチン（0.5μg/ml）の結合を、それらのペプチドの増加量の存在中で測定した：パネルA中：ペプチドは、GlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）（●）;GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）（▲）;GlyGlyTyrSerHisTrp（配列番号10）（■）；及びGlyGlyTrpSerHisTyr（配列番号11）（▼）であり；パネル B中:GlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）（●）;GlyGlyTrpThrHisTrp（配列番号1 2）（▲）;GlyGlyTrpAlaHisTrp（配列番号13）（■）；GlyTrpSerHisTrp（配列番号14）（+）；AlaAlaTrpSerHisTrp（配列番号21）（▼）;及びAspGlyTrpSerHi sTrp（配列番号225）（□）である。結果を表２中に示す。固定化されたペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号1）へのフィブロネクチンの結合は、可溶性ペプチド300により27μmにおける50%阻害をもって阻害された。保存的な単一アミノ酸置換、GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号9）;GlyGlyTyrS erHisTrp（配列番号10）及びGlyGlyTrpSerHisTyr（配列番号11）を含む３つのヘキサペプチドは、不活性であった。トロンボスポンジンの第一及び第三反復からの対応ヘキサペプチドも不活性であった。実施例３本実施例は、可溶性フィブロネチン、トロンボスポンジン及び合成ペプチドGl yGlyTrpSerHisTrpによるトロンボスポンジン・ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpへのフィブロネクチンの阻害について説明する。ヒト血小板トロンボスポンジンを、Roberts，et al．1985 J．Cell Biol．104 :131-139の方法に従って精製した。 50μg/mlのペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）によりコートされたマイクロタイター・プレート・ウェルへの¹²⁵I-フィブロネクチン（0.5μg/ml）の結合を、合成ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp、フィブロネクチン又はトロンボスポンジンの存在中で測定した。結果を図３中に示す。非標識フィブロネクチン及びトロンボスポンジンは、上記ペプチドGlyGlyTrpS erHisTrp（配列番号１）への¹²⁵I-フィブロネクチンの結合について競合したが、幾つかの対照タンパク質、すなわち、卵白アルブミン、トランスフェリン、フェチュイン、ヤギIgG及びネズミ・ラミニンは、競合しなかった（IC₅₀〉200μg/ ml）。実施例４本実施例は、本発明に係るペプチド及び全トロンボスポンジンが、フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインに結合することを説明する。マイクロタイター・プレートを、実施例１中に記載したように50μg/mlの合成ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）によりコートした。この結合ペプチドへの¹²⁵I-フィブロネクチン（0.5μg/ml）の結合を、Telios Pharmaceuticals ，Inc．San Diego，CAから得たフィブロネクチンのタンパク質分解断片の存在中で測定した。このタンパク質分解断片は、無傷のフィブロネクチン；30kDaゼラチン-結合性ドメイン；33kDa組換え体細胞結合性ドメイン；28kDa組換え体細胞結合性ドメイン及びトランスフェリンを含んでいた。結果を図４中に示す。テストしたタンパク質分解断片の中で、ゼラチン-結合性ドメインは、固定化ペプチドへの¹²⁵I-フィブロネクチン結合の最も強い阻害剤であった。細胞結合性ドメインを含む33kDa断片は阻害性であった。しかしながら、その33kDa断片の N-末端5kDa以外の全てを含む28kDa断片は不活性であり、そしてその28kDa断片と同じアミノ末端をもつ40kDa断片は、約10倍活性が低かった。33kDa組換え体断片の配列は、フィブロネクチンの120kDa断片内に含まれており、そしてその120kDa 断片は、ほんの弱い阻害剤であり、33kDaにより表された活性は、おそらく隠れた部位（cryptic site）による。この33kDa断片の活性は、ゼラチン結合性断片の活性よりも低かった。実施例５本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpによるゼラチンへのフィブロネクチン結合の阻害の特異性について説明する。マイクロタイター・プレートのウェルを、Dulbecco'sPBS中の２μg/mlゼラチンにより25℃において３時間インキュベートした。このウェルを空にし、そして 1% BSAを含むDulbecco's PBSと共に30分間インキュベートした。このウェルを、空にし、そしてペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）（●）;GlyGlyTrpSe rLysTrp（配列番号９）（▲）;GlyGlyTyrSerHisTrp（配列番号10）（■）；又は GlyGlyTrpSerHisTyr（配列番号11）（▼）の存在中、25℃において２時間0.5μg /mlの¹²⁵I-フィブロネクチンと共にインキュベートした。ウェルを、PBSにより４回洗浄し、そのプレートから切断し、そしてその結合放射能をカウントした。結果を図５中に示す。ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）による阻害は、特異的であり、その活性配列からの単一アミノ酸置換をもつその関連ペプチドGlyGlyTrpSerLysTrp （配列番号９）;GlyGlyTyrSerHisTrp（配列番号10）及びGlyGlyTrpSerHisTyr（配列番号11）は不活性であった。実施例６実施例５中に記載したようなリガンド結合性検定を実施した。但し、マイクロタイター・プレートをゼラチンの代わりに固定化された生来のＩ型コラーゲンによりコートした。ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）は、IC₅₀=40μmをもってＩ型コラーゲンンへのフィブロネクチン結合を阻害し、ペプチドTrpSerHisTrpSerPro（配列番号２）;GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）;GlyGlyTyrSerHisTrp（配列番号 10）;GlyGlyTrpSerHisTyr（配列番号11）;AlaAlaTrpSerHisTrp（配列番号21）;A spGlyTrpSerHisTrp（配列番号22）;及びGlyGlyTrpThrHisTrp（配列番号24）は不活性であった。実施例７本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）による変性コラーゲンへのフィブロネクチン-依存性細胞接着の阻害について説明する。 Dulbecco's PBS中のゼラチン（１μg/ml）を、24ウェル・プレート内のプラスチック・ディスク上にコートし、そして37℃において２時間インキュベートした。懸濁液を除去した後、このディスクを室温において30分間1% BSA-tris pH7.8 により処理した。このディスクを、PBSにより２回洗浄し、そして0.4mlの0.1％B SAを含むRPMI 1640培地及び１μg/mlのフィブロネクチン、及び2、20又は200μg の阻害性ペプチドを、それらのウェルに添加した。0.1% BSAを含む0.1mlのRPMI 培地中の10⁵細胞の懸濁液をウェルに添加し、そして１時間5％CO₂と共に37℃においてインキュベートした。ディスクを洗浄して非接着細胞を除去し、そして染色した。接着細胞を顕微鏡によりカウントした。結果を図６及び７中に示す。図６のパネルAにおいて、細胞系A2058のヒト・メラノーマ細胞を上記ウェルに添加し、そして図７のパネルAにおいて、MDA 435s胸癌腫細胞を固定化ゼラチンに添加した。使用した濃度において、細胞は、添加フィブロネクチンの非存在中ゼラチンに弱く接着した。フィブロネクチンの存在中刺激された接着が、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）により投与量-依存性のやり方で阻害された。その阻害は特異的であり、ここで、フィブロネクチン結合性活性を欠いた相同ペプチド、GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）及びTrpSerHisTrpSerPro（配列番号２）は不活性であった。固定化フィブロネクチンへのA2058細胞（図6B）又はMDA 435s細胞（図7B）の直接的接着は、ペプチドGlyGlyTrpSerHlsTrp（配列番号１）又は上記対照ペプチドにより阻害されなかったが、フィブロネクチンへの上記胸癌腫細胞の接着は、ペプチドGlyArgGlyAspSer（配列番号25）により阻害された。従って、その胸癌腫細胞上のインテグリン・レセプタとフィブロネクチンとの相互作用は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）により阻害されなかった。実施例８本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）による生来のＩ型コラーゲンへの胸癌腫細胞のフィブロネクチン-仲介接着の阻害について説明している。ディスクを実施例7におけるように処理した。但し、Dulbecco's PBS中のＩ型コラーゲンの１μg/mlをそれらのディスク上にコートした。固定化Ｉ型コラーゲンへの胸癌腫細胞（細胞系MDA 435s）の細胞接着を、フィブロネクチン単独の存在中並びにペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）;GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）;TrpSerHisTrpSerPro（配列番号２）又はGlyArgGlyAspSer（配列番号25）の存在中で測定した。結果を図８中に示す。生来のＩ型コラーゲンへの胸癌腫細胞のフィブロネクチン-仲介接着は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）及びGlyArgGlyAspSer（配列番号25）により阻害されたが、GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）又はTrpSerHisTrpSerPro （配列番号２）によっては阻害されなかった。Ｉ型コラーゲンへの直接的接着は、ゼラチンよりも強かった。ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）の効果は、フィブロネクチン-仲介接着について特異的であったっが、このペプチドは、Ｉ型コラーゲンへの細胞の直接的接着を阻害しなかった。実施例９本実施例は、ペプチドGlyGlyTrpSerHisTrpによりゼラチナーゼの阻害について説明する。ウシ角膜内皮細胞からのならし培地中のゼラチナーゼ活性による¹²⁵I-ゼラチンの分解を、放射標識付けされた基質によりコートされ且つp-ヒドロキシ水銀ベンゾエートを使用して活性化されたならし培地と共に60又は90分間インキュベートされたマイクロタイター・プレートからの放射能の放出により測定した。所定濃度のペプチドGlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）の存在中の活性を、ペプチドの非存在中で測定された対照活性として表し、そして水銀活性の非存在中で測定した背景放出について補正した。阻害を、内皮細胞ならし培地のゼラチン酵素図（zymogram）によっても測定した：a、対照；b、50μg/ml GlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）；c、500μg/ml GlyGlyTrpSerHisTrp（配列番号１）；d、50μg/ml GlyGlyTrpSerLysTrp（配列番号９）；e、500μg/ml GIy GlyTrpSerLysTrp;及びf、500μg/mlのペプチドLysArgPheLysGlnAspGlyGlyTrpSer HisTrpSerProTrpSerSer（配列番号７）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者サイプス，ジョンエム. アメリカ合衆国，メリーランド 20818, キャビンジョン，セブンティエイスストリート 6510 (72)発明者ゴー，ネン−ファアメリカ合衆国，メリーランド 20878, カイザースバーグ，プレイリーランディングテラス 10617 (72)発明者ネグレ，エリックアメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベセスダ，エウィングドライブ 8710

Claims

【特許請求の範囲】１．フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーを有するペプチドであって、少なくとも５のアミノ酸を含んで成り、そして配列HisTrp及び少なくとも１の他のトリプトファン残基を含むようなペプチド。２．ペプチドが配列XaaHisTrp｛ここで、Xaaがセリン、トレオニン及びアラニンから成るアミノ酸の群から選ばれる。｝を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。３．ペプチドが5〜30アミノ酸残基を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。４．ペプチドが6〜20アミノ酸を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。５．アミノ-末端N-アセチル及びカルボキシル-末端アミドをさらに含んで成る、請求項１に記載のペプチド。６．フィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーを有するペプチドであって、30までのアミノ酸をもち、そして以下の配列（A）： Xa-Xb-His-Trp-Xc ｛ここで、XaがH又は１〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン、トリプトファン、又はトレオニンであり、そしてXcがOH、NH₂又は１〜27 アミノ酸のアミノ酸配列であり、そしてXa及びXbの中の少なくとも１が配列（A ）内にTrpから３アミノ酸残基内に位置するトリプトファンを含む。｝を含んで成るようなペプチド。７．Xaがアミノ酸残基394-420を含む連続的に生じたトロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた1〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン又はトレオニンであり、そしてXcがアミノ酸残基424-450を含む連続的に生じたヒト・トロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた１〜27アミノ酸のアミノ酸配列である、請求項６に記載のペプチド。８．ペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から成る群から選ばれた配列をもつ、請求項1に記載のペプチド。９．ペプチドがGlyGlyTrpXaaHisTrp｛ここで、Xaaがセリン、トレオニン及びアラニンから成るアミノ酸の群から選ばれる。｝を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。１０．Xaaがアラニンである、請求項４に記載のペプチド。１１．Xaaがセリンである、請求項４に記載のペプチド。１２．フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン-結合性タンパク質に結合するための医薬組成物であって、少なくとも１の請求項１に記載のペプチドの有効量及び医薬として許容される賦形剤又は担体を含んで成る医薬組成物。１３．有効量のペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から成る群から選ばれた配列をもつペプチドである、請求項１２に記載の医薬組成物。１４．ペプチドがフィブロネクチンのゼラチン-結合性ドメインについての特異的な結合アフィニティーを有するペプチドであって、そのペプチドが30までのアミノ酸をもち、そして以下の配列（A）： Xa-Xb-His-Trp-Xc ｛ここで、XaがH又は1〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン、トリプトファン、又はトレオニンであり、そしてXcがOH、NH₂又は１〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、そして Xa及びXbの中の少なくとも１が配列（A）内にTrpから３アミノ酸残基内に位置するトリプトファンを含む。｝を含んで成るような、請求項１２に記載の医薬組成物。１５．Xaがアミノ酸残基394-420を含む連続的に生じたトロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた１〜27アミノ酸のアミノ酸配列であり、Xbがセリン、アラニン又はトレオニンであり、そしてXcがアミノ酸残基424-450を含む連続的に生じたヒト・トロンボスポンジン・アミノ酸配列から得られた１〜27アミノ酸のアミノ酸配列である、請求項１４に記載の医薬組成物。１６．フィブロネクチン又は他の関連コラーゲン-結合性タンパク質に結合するための医薬組成物であって、少なくとも１の請求項４に記載のペプチドの有効量及び医薬として許容される賦形剤又は担体を含んで成る医薬組成物。１７．ペプチドが配列番号１に記載の配列をもつペプチドである、請求項１３に記載の医薬組成物。１８．治療の必要な患者においてフィブロネクチン又は他の関連コラーゲン- 結合性タンパク質に結合するための方法であって、請求項１２に記載の医薬組成物の有効量をそのような患者に投与することを含んで成る方法。１９．フィブロネクチン、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-9又は他の関連コラーゲン-結合性タンパク質に結合するための請求項１８に記載の方法であって、そのペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から成る群から選ばれた配列をもつペプチドであるような方法。２０．治療の必要な患者においてコラゲナーゼ及びフィブロネクチンに相同な他のプロテアーゼの酵素活性を阻害する方法であって、医薬として許容される賦形剤又は担体内に含まれる少なくとも１のペプチドの有効量をそのような患者に投与することを含んで成り、そのペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８から成る群から選ばれた配列をもつペプチドであるような方法。