PT690720E - Utilizacoes terapeuticas de produtos de proteina bactericida indutora de permeabilidade - Google Patents

Description

1

Descrição “Utilizações terapêuticas de produtos de proteína bactericida indutora de permeabilidade”

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito às aplicações terapêuticas de produtos de proteína bactericida indutora de permeabilidade (BIP) para o tratamento de doenças não directamente associadas com infecções bacterianas gram-negaíivas, incluindo a neutralização das propriedades anticoagulantes da heparina, a inibição da angiogénese e da proliferação de células tumorais e endoteliais e o tratamento de estados patológicos inflamatórios crónicos, tais como a artrite.

A heparina é um conjunto heterogéneo de mucopolissacáridos de cadeia linear, designados por glicosaminoglicanos, que possuem propriedades anticoagulantes. Embora possa haver outros presentes, os principais açúcares que ocorrem na heparina são: (1) 2-sulfato do ácido a-L-idurónico, (2) 6-sulfato de 2-desoxi-2-sulfamino-a-D-glicose, (3) ácido β-D-glucorónico, (4) 2-acetamido-2-desoxi-a-D-glicose e (5) ácido α-L-idurónico. Estes açúcares encontram-se presentes em quantidades por ordem decrescente, normalmente segundo a ordem (2) > (1)> > (4) > (3) > (5), e estão unidos por pontes ghcosídicas, formando polímeros de diversos tamanhos. A heparina é lòrtemente acídica devido ao seu conteúdo em grupos ácido carboxílico e sulfato ligados de forma covalente. A heparina encontra-se dentro dos grânulos dos mastócitos e é libertada por desgranulação. Há uma forma de heparina associada a essas células que é designada por sulfato de heparano. A expressão ‘sulfato de heparano’ utiliza-se em sentido lato para descrever diversos proteoglicanos sulfatados (PGSH, em inglês HSPG) que se encontram com uma distribuição quase universal nas membranas da superfície das células dos mamíferos e na matriz extracelular. Os PGSH contêm uma percentagem variável de sequências heparinóides pentaméricas que actuam de uma forma semelhante à da heparina solúvel. Os PGSH servem de repositório da antitrombina ΙΠ (ΑΊΊΠ) e dos factores de crescimento de ligação da heparina, tais como os factores 1-5 de crescimento dos fíbroblastos (FCF), IL-8, FEG-MG (em inglês GM-CSF) e IL-3. Folkman et al., Inflammation: Basic Principies and Clinicai Correlates, 2a ed. Capítulo 40, págs. 821-839 (1992). Com efeito, as células geneticamente deficientes em PGSH necessitam de heparina exógena para o seu desenvolvimento. A heparina é vulgarmente administrada em doses até 400 unidades/kg durante procedimentos cirúrgicos, tais como as derivações cardiopulmonares, a cateterização cardíaca e em procedimentos de hemodiálise, com a finalidade de se evitar a coagulação do sangue durante tais procedimentos. O efeito anticoagulante da heparina no sangue é um resultado da interacção da heparina com a ΑΤΠΙ. O complexo heparina/ΑΤΠΙ é um inibidor poderoso de muitos dos factores de coagulação que intervêm na cascata de coagulação. Foi já demonstrada uma inibição específica para os factores DCa, Xa, Xla, Xnia activados e para a trombina. O complexo heparina/ /ATTH possui a afinidade mais elevada para o factor Xa e para a trombina que são comuns nos circuitos de coagulação quer intrínsecos quer extrínsecos envolvidos nos dois últimos passos da cascata de coagulação donde resulta a conversão do fibrinogénio em fibrina.

Quando a heparina é administrada pelos seus efeitos anticoagulantes durante intervenções cirúrgicas, constitui um aspecto importante da terapia pós-cirúrgica que os efeitos da heparina sejam imediatamente neutralizados para que possa ser restabelecida a função nonnal de coagulação. Presentemente utiliza-se protamina para neutralizar a heparina. As protaminas são proteínas simples de baixo peso molecular que são vulgarmente isoladas a partir do esperma de salmão São ricas em resíduos aminoácidos arginina e são fortemente alcalinas. Administradas por si sós, as protaminas (normalmente sob a forma de sulfato de protamina) têm efeitos anticoagulantes. Quando administradas na presença de heparina, forma-se um complexo estável e desaparece a actividade anticoagulaiile dos dois fánnacos. A utilidade clínica das protaminas está limitada pelos seus efeitos hipotensivos e de tipo anafilático significativos. Há outros compostos já estudados que possuem uma actividade neutralizadora da heparina, entre os quais se refere o factar 4 plaquetário (F4P, em inglês PF4) e a proteína básica principal, ver a patente de invenção norte-americana n° 5 086 164. A proteína básica principal possui uma actividade neutralizadora da heparina, mas também é fortemente tóxica.

Angiogénese A angiogénese esta estreitamente relacionada com a proliferação das células endoteliais e constitui o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos capilares. Assim sendo, constitui um processo importante no desenvolvimento e no crescimento dos mamíferos e também nos processos de menstruação. A libertação de factores de crescimento angiogénicos, tais como os factores 1-5 de crescimento dos fibroblastos, induz a proliferação de células endoteliais através de um mecanismo de ligação ao receptor dependente da heparina. Ver Yayon et ai, Cell, 64:841-848 (1991). Estes factores de crescimento de ligação da heparina podem ser libertados devido a traumas vasculares (cicatrização de ferimentos), estímulos imunitários (doenças autoimunitárias), mediadores inflamatórios (prostaglandinas) e a partir de células tumorais. A angiogénese também está associada a diversos estados patológicos em que se considera desejável inibir o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. Como exemplo, a angiogénese é crítica para o crescimento, proliferação e metastase de diversos tumores. Há outros estados patológicos associados à angiogénese, entre os quais se refere a retinopatia diabética, fihroplasia retrolental, glaucoma neovascular, psoríase, angiofibromas, inflamações imunitárias e não imunitárias, incluindo a artrite reumatóide, proliferação capilar com placas ateroscleróticas, hemangiomas, endometriose e sarcoma de Kaposi.

Folkman et al., supra, afirmam que as lesões psoriáticas na pele são dominadas pela proliferação epitelial, pela neovascularização e por um infiltrado de células inflamatórias. No entanto, não está esclarecido se a angiogénese é um passo na patogénese da psoríase ou se é um fenómeno secundário. Há várias substâncias sobre as quais se sabe que funcionam como inibidores da angiogénese e sobre as quais se sabe que inibem a angiogénese tumoral, prevenindo o início da artrite e inibindo a artrite já existente em modelos de artrite induzida pelo colagénio, Peacock et al., J. Exp. Med, 175, 1135-1138 (1992). Como exemplo, sabe-se que a protamina inibe a angiogénese de tumores e o subsequente crescimento dos tumores. De acordo com Taylor et al, Nature, 297:307-312 (1982), a actividade antiangiogénica da protamina é atribuída à sua capacidade para se ligar à heparina. Também se sabe que o F4P possui actividade antiangiogénica. Para o presente pedido tem interesse a patente de invenção norte-americana n° 5 112 946 que descreve o F4P modificado e os seus análogos que têm actividade antiangiogénica mas que não têm capacidade para se ligarem à heparina. Demonstrou-se que o F4P possui pelo menos duas propriedades funcionais. A ligação à heparina foi estudada mais exaustivamente; no entanto, o F4P foi descrito originalmente como possuidor de propriedades inibitórias da colagenase. Os inibidores da colagenase foram os primeiros inibidores da angiogénese a ser descobertos. Ver Folkman, 1973, supra. As mutações na região do F4P de ligação à heparina não foram analisadas nos seus efeitos sobre a actividade inibitória da colagenase. É interessante saber que a trombospondina também é um inibidor da angiogénese e que se liga à heparina com um motivo serina/triptofano em vez de um motivo aminoácido básico. Posto isto, não há nenhuma ligação evidente da heparina à sequência de consenso singular ou para a inibição da angiogénese. O pedido de patente de invenção PCT publicado com o n° WO 92/01003 descreve a utilização de derivados de glicosaminoglicano (heparina) e a sua utilização como inibidores da invasividade tumoral. Aí são descritos derivados de heparina sobre os quais se afirma que são praticamente isentos de actividade anticoagulante e que impedem a formação de metástases tumorais num hospedeiro.

Inflamação crónica A inflamação crónica está acompanhada normalmente por angiogénese. A artrite é uma síndroma crónica caracterizada pela inflamação das articulações periféricas em associação com o espessamento sinovial e o influxo de factores imunitários e células tais como os leucócitos polimorfonucleares (PMN). Na artrite reumatóide a inflamação é de natureza imunitária, ao passo que na artrite reactiva a inflamação está associada à infecção do tecido sinovial com bactérias pirogénicas ou com outros agentes infecciosos. Folkman eí ai, 1973, supra, também observaram que há muitos tipos de artrite que evoluem de uma fase dominada por um infiltrado inflamatório na articulação até uma fase posterior em que um parmus neovascular invade a articulação e começa a destruir a cartilagem. Embora não haja certezas quanto ao facto de a angiogénese na artrite ser um componente causador da doença, e não um epifenómeno, há provas de que a angiogénese é necessária para a manutenção da sinovite na artrite reumatóide.

Embora os fáimacos anti-inflamatórios não esteroidais (FAINE, em inglês NSAID), os corticóides e outras terapias tenham proporcionado bons resultados no tratamento da artrite, continua a ser necessário nesta especialidade que haja terapias mais eficazes para a artrite e para outras doenças inflamatórias.

Sabe-se agora que a inflamação e a angiogénese são separáveis mas que não são processos mutuamente exclusivos. Foram já descobertas proteínas angiogénicas específicas que estimulam a angiogénese sem inflamação, ao passo que os esteróides angiostáticos podem inibir a angio-génese sem diminuição da inflamação aguda. Ver Folkman, 1973, supra. É interessante saber que a endotoxina foi identificada como sendo o mais poderoso estimulador exógeno da angiogénese, devido ao facto de estimular as citoquinas dos macróíàgos e os factores de crescimento.

Proteína bactericida indutora da permeabilidade A proteína bactericida indutora da permeabilidade é uma proteína isolada a partir dos grânulos dos PMN dos mamíferos, que são células do sangue essenciais na defesa contra os microrganismos invasores. A proteína BIP humana foi isolada a partir de neutrófilos poli-

morfonucleares por extraeção ácida combinadamente com a cromatografia de permuta iónica [Elsbach, J. Biol. Chem., 254:11000 (1979)] ou com a cromatografia de afinidade com E. coli [Weiss, et al, Blood, 69:652 (1987)], sendo aqui designada por BIP natural, a qual possui uma poderosa actividade bactericida contra um espectro largo de bactérias gram-negativas. O peso molecular da proteína BDP humana é de aproximadamente 55 000 daltons (55 kD). A sequência de aminoácidos da proteína BIP humana completa e também a sequência de ADN que codifica a proteína estão explicitadas na figura 1 da obra de Gray et al., ‘J. Biol. Chem. 264:9505 (1989).

Comprovou-se que o efeito bactericida da proteína BIP é altamente específico para as espécies sensíveis gram-negativas, não sendo tóxica para outros microrganismos nem para as células eucarióticas. O mecanismo exacto pelo qual a proteína BIP aniquila as bactérias é ainda desconhecido, mas sabe-se que a proteína BIP tem de atacar em primeiro lugar a superfície das bactérias sensíveis gram-negativas. Esta ligação inicial da proteína BIP às bacténas implica interaeções electrostáticas entre a proteína BIP básica e os locais negativamente carregados dos lipopolissacáiidos (LPS). Os LPS receberam a designação de “endotoxina” devido à potente resposta inflamatória que estimulam. Os LPS induzem a libertação de mediadores pelas células inflamatórias hospedeiras, o que em última instância pode ter como consequência um choque endotóxico irreversível. A proteína BIP liga-se ao lípido A que é o componente mais tóxico e mais biologicamente activo dos LPS.

Em bactérias sensíveis, presume-se que a ligação da proteína BIP destrua a estrutura dos LPS, levando a activação de enzimas bacterianas que degradam os fosfolípidos e os peptido-gbcanos, alterando a permeabilidade da membrana exterior das células e iniciando fenómenos que em última instância conduzem à morte celular. Elsbach e Weiss, Inflammation: Basic principies and Clinicai Correlates, eds. Gallin et al., Capítulo 30, Review Press, Ltd. (1992). Presume-se que a proteína BIP actue em duas fases. A primeira é uma fase subletal caracterizada por uma paragem imediata do crescimento, permeabilização da membrana exterior e activação selectiva das enzimas bacterianas que hidrolisam os fosfolípidos e os peptidoglicanos. Nesta fase, as bactérias podem ser resgatadas por aplicação sobre meios enriquecidos com albumina do soro. A segunda fase, definida pela inibição do crescimento, que não pode ser revertida pela albumina do soro, ocorre ao fim de uma exposição prolongada das bactérias à proteína BIP e caracteriza-se por profundas mudanças fisiológicas e estruturais, incluindo a penetração da membrana citoplásmica. A proteína BIP também é capaz de neutralizar as propriedades endotóxicas dos LPS aos quais se liga Devido às suas propriedades bactericidas gram-negaávas e à sua capacidade para neutralizar os LPS, a proteína BIP também pode ser utilizada para o tratamento de mamíferos que padeçam de doenças provocadas por bactérias gram-negativas, tais como bacterimia ou sépsis. Há um fragmento proteolítico, correspondente à parcela do terminal N da holoproteína BIP humana, que possui a actividade antibacteriana e de ligação do lípido A, existente na holoproteína humana de 55 kDa obtida naturalmente. Ao contrário da parcela do terminal N, a região do terminal C da proteína BIP humana isolada manifesta apenas uma actividade antibacteriana ligeiramente detectável. Ver a obra de Ooi etal., J. Exp. Med, 174:649 (1991). Há um fragmento do terminal N da proteína BIP, constituído aproximadamente pelos primeiros 199 aminoácidos da holoproteína BIP humana, designado por “ΒΙΡτ^” (em inglês “rBPIs”) que foi produzido por meios recombinantes como proteína de 23 kDa. Gazzano-Santoro et al., Infect. Immun. 60:4754-4761 (1992). São importantes para o presente pedido as revelações que constam do pedido de patente de invenção internacional PCT/US91/05768, publicado com o n° WO 92/03535, respeitantes a composições que compreendem uma proteína BIP e um composto aniónico, onde se diz que tais composições (1) não têm nenhuma actividade bacteriana e (2) revelam actividade neutralizadora da endotoxina. Os compostos aniónicos são preferencialmente seleccionados entre proteínas, tal como a albumina do soro, mas também podem ser um proteoglicano, tal como a heparina. Além disso, Weiss et al., em ‘J. Clirt. Invest.\ 55:33-42 (1975) afirmam que o sulfato de heparina e os LPS se ligam para bloquear a expressão da actividade da proteína BIP, que faz aumentar a permeabilidade. No entanto, em nenhuma dessas obras há referências à neutralização da heparina por combinação com a proteína BIP. O documento WO-A-90/09183 (INVITRON CORPORATION) divulga uma proteína bacterícida indutora da permeabilidade (BIP) capaz de inibir a estimulação de células mediada pelos lipopolissacáridos (LPS); o documento WOA-92/09621 (NEW YORK UNTVERSITY) descreve fragmentos da proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) que possuem actividade neutralizadora dos lipopolissacáiidos (LPS).

Continua a ser necessário, nesta especialidade, que haja novos produtos e métodos utilizáveis na neutralização da heparina, na inibição de tumores e da angiogénese, no combate à proliferação das células endoteliais e no tratamento de inflamações crónicas.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção descreve um produto de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade (BIP), utilizável como medicamento de ligação à heparina, e descreve também a utilização do produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a produção de um medicamento de ligação à heparina.

Dito de forma concreta, de acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a produção de um medicamento de ligação à heparina para que se ligue à heparina terapeuticamente administrada a um paciente.

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a produção de um medicamento de ligação à heparina, para neutralizar o efeito anticoagulante da heparina e proporciona também um método para neutralizar a actividade anticoagulante da heparina, o qual consiste em administrar uma quantidade eficaz de produto de proteína BIP in vitro a uma amostra de um fluído que contenha heparina.

De acordo com outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona a utilização de um produto de proteína BIP para a produção de um medicamento de ligação à heparina para inibir a proliferação de células endoteliais, mas que não se limite à proliferação de células endoteliais associadas à angiogénese. A invenção descreve métodos para inibir a angiogénese associada a diversos estados clínicos. Dito de modo concreto, a invenção prcvc a utilização de um produto de proteína BIP para a produção de um medicamento de ligação à heparma para o tratamento do cancro, mediante a inibição da angiogénese associada à proliferação de tumores malignos, e para o tratamento de lesões do sarcoma de Kaposi e não só. Os cancros sensíveis ao tratamento por administração de produtos de proteína BIP são os melanomas, sarcomas e os carcinomas da mama, cólon, pulmão e próstata, mas sem que isso constitua qualquer limitação. Outras situações patológicas em que os produtos de proteína BIP podem ser administrados para inibir a angiogénese são a retinopatia ocular, a fibroplasia retrolental, a psoiíase, os angiofibromas, a endometriose, os hemangiomas e não só. A invenção também descreve métodos de contracepção que consistem em administrar uma quantidade eficaz de um produto de proteína BIP de modo a impedir a implantação de um ovo fertilizado. A invenção também proporciona a utilização de um produto de proteína BIP para a produção de um medicamento de ligação à heparma para o tratamento de estados patológicos inflamatórios crónicos, tais como artrite, psoríase, doença inflamatória dos intestinos, doença de Crohn, colite ulcerativa, lúpus eritematoso, uveíte autoimunitária, doença de Lyme e asma.

Assim, a invenção proporciona a utilização de um produto de proteína BIP para a produção de um medicamento de ligação à heparma e medicamentos de ligação à heparina para a neutralização das propriedades anticoagulantes da heparina, para a inibição da proliferação de células tumorais e endoteliais, para a inibição da angiogénese e para o tratamento de estados patológicos inflamatórios crónicos.

Tais medicamentos podem ser preparados para administração oral, para injecção ou para aplicação por via parentética e contêm preferencialmente veículos e adjuvantes convencionais, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, conforme é do conhecimento dos especialistas na matéria. Os medicamentos assumem preferencialmente a forma de doses unitárias contidas em formas de dosagem no estado sólido, semi-sólido e líquido, tais como comprimidos, pílulas, pós, soluções ou suspensões líquidas e soluções injectáveis e administráveis por infusão.

As doses eficazes estão compreendidas entre cerca de 100 pg/kg e cerca de 10 mg/kg de peso corporal.

Conforme aqui utilizada, a expressão “produto de proteína BIP” abrange a proteína bactericida indutora da permeabilidade produzida naturalmente e por via recombinante; os fragmentos polipeptídicos naturais, sintéticos, rccombinantes e biologicamente activos da proteína bactericida indutora da permeabilidade; e os polipeptidos ou análogos biologicamente activos, incluindo as proteínas de fusão híbridas, quer da proteína bactericida indutora da permeabilidade quer dos seus fragmentos biologicamente activos.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DAS FIGURAS A figura 1 mostra um gráfico de um ensaio de ligação daheparina efectuado com a BlPr^ e com a BIPr; a figura 2 mostra um gráfico que ilustra o efeito da heparina sobre a ligação da BlPr^ ao lípido A da estirpe J5 de E. coli, comparativamente com diversas amostras de LPS e ácido teicóico; a figura 3 mostra um gráfico que ilustra o efeito da BlPr^ sobre a inibição da trombina por acçlo de ATIII/hep arina; a figura 4 mostra um gráfico que ilustra o efeito da 13111¾ sobre a inibição do factor Xa por acção de ATliL/heparina; a figura 5 mostra um gráfico que ilustra o efeito da BlPr^ sobre a inibição do aumento do tempo da trombina no plasma humano, mediado pela heparina; a figura 6 mostra um gráfico que ilustra o efeito da BIP123 sobre o tempo parcial da tromboplastina; a figura 7 mostra um gráfico que ilustra o efeito da BlPr^ e da proteína de controlo da taumatina nas avaliações artríticas num modelo de artrite induzida pelo colagénio, com artrite ligeira; a figura 8 mostra um gráfico que ilustra o efeito da 13113¾ e da protamina sobre as avaliações artríticas no modelo de artrite induzida pelo colagénio, com artrite grave; a figura 9 mostra um gráfico que ilustra 0 efeito da 6113¾ sobre a incidência da artrite no modelo de artrite induzida por Yersinia; a figura 10 mostra um gráfico que ilustra o efeito da BlPr^ sobre a inibição da estimulação de tipo LPS no ensaio de LAL, com Borrelia burgdorferi; a figura 11 mostra um gráfico que ilustra a sobrevivência de murganhos tratados com BIP ou com uma solução tampão no modelo de metástases de melanoma do murganho; a figura 12 mostra um gráfico que ilustra o efeito da BlPr^ sobre a proliferação das células endoteliais capilares de tipo Π nos murinos; a figura 13 ilustra a ligação da BIP às células epiteliais; a figura 14 mostra um gráfico de um ensaio de ligação da heparina no caso dos péptidos sintéticos de BEP; a figura 15 mostra um gráfico de um ensaio de ligação do lisado de amebócitos de Limulus (LAL) no caso dos péptidos sintéticos de BIP; a figura 16 mostra um gráfico de um ensaio bactericida de difusão radial no caso dos péptidos sintéticos de BTP; a figura 17 mostra um gráfico que ilustra um efeito dos péptidos sintéticos de BIP num ensaio de ligação da heparina; as figuras 18a e 18b mostram um gráfico que ilustra o efeito dos péptidos sintéticos de BIP sobre a inibição da trombina por acção de ΑΊΤΠ/heparina; as figuras 19a e 19b mostram um gráfico que ilustra o efeito dos péptidos sintéticos de BIP num ensaio de ligação de LAL; as figuras 20a, 20b, 20c e 20d mostram gráficos que ilustram o efeito de péptidos sintéticos de BIP em ensaios bactericidas de difusão radial; as figuras 20e e 20f mostram gráficos que ilustram o efeito dos péptidos sintéticos de BIP em ensaios de caldo de cultura de E. coli; as figuras 21a e 21b mostram os resultados da absorvência na CLER no caso dos fragmentos proteolíticos de BIPtib; a figura 22 mostra um gráfico de resultados de um ensaio de inibição de LAL no caso dos fragmentos proteolíticos da BlPr^; e a figura 23 mostra os domínios funcionais da BIPrzs.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA A presente invenção diz respeito à administração de produtos de proteína bactericida indutora de permeabilidade (BIP) para o tratamento de diversos casos terapêuticos não directamente associados com uma infecção bacteriana.

Embora os produtos de proteína BIP aqui descritos sejam úteis como citotoxinas poderosas contra as bactérias gram-negativas e para neutralizar os efeitos adversos dos lipopolissacáridos associados às paredes celulares de bactérias gram-negativas, foi descortinado um conjunto vasto de efeitos terapêuticos para os produtos de proteína B1P não directamente associados com infecções bacterianas gram-negativas. Dito de forma concreta, a invenção diz respeito a métodos para tratar casos não directamente associados com infecções gram-negativas, incluindo a neutralização da actividade anticoagulante da heparina, a inibição da proliferação de células tumorais e endoteliais, incluindo a proliferação de células associadas à angiogénese, e o tratamento de estados patológicos inflamatórios crónicos, tais como a artrite.

Os produtos de proteína BIP que contêm fragmentos biologicamente activos da holoproteína BIP que se pretende administrar podem ser gerados e/ou isolados por todos os meios conhecidos na especialidade. O pedido de patente de invenção norte-americana co--pendente e de que somos co-proprietários, com o n° de série 07/885 501, e a sua continuação parcial correspondente ao pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/072 063, depositado a 19 de Maio de 1993 e publicado com o n° WO 93/23540 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 93913992.9), descrevem métodos novos para purificar produtos de proteína BIP recombinante, expressos em células hospedeiras de mamíferos transformados geneticamente e nelas segregados quando estas são criadas em cultura, e descrevem a forma de produzir grandes quantidades de produtos de BIP recombinante, adequados para incorporação em preparações farmacêuticas estáveis e homogéneas.

Os fragmentos de BIP biologicamente activos compreendem as moléculas biologicamente activas que contêm a mesma sequência de aminoácidos de uma holoproteína BIP, com a excepção de a essas moléculas lhes faltarem os aminoácidos do terminal amino, os aminoácidos internos e/ou os aminoácidos do terminal carboxi da holoproteína. A título de exemplos não limitativos, tais fragmentos compreendem os aqui descritos e o fragmento natural de 25 kDa já antenormente mencionado e ainda um fragmento do terminal amino com 199 resíduos aminoácidos, de 23 kDa e recombinante, pertencente à holoproteína BIP humana designada por ΒΙΡΓ23 (em inglês τΒΡ1Ώ). Ver Gazzano-Santoro et al., Irfect. Imntrn. <50:4754-4761 (1992). Nessa publicação utilizou-se um vector de expressão como fonte de ADN codificador de um produto de expressão recombinante (BlPr^) que possui a sequência de sinal de 31 resíduos e os primeiros 199 aminoácidos do terminal N da BIP humana peifeitamente desenvolvida (madura), conforme é explicitado nas SEQ ID NOs: 1 e 2 retiradas da obra de Gray et al., supra, com a excepção de o resíduo valina na posição 151 ser especificado por GTG em vez de GTC e o resíduo 185 ser o ácido glutâmico (especificado por GAG) em vez de lisina (especificada por AAG). Também foi produzida a holoproteína recombinante aqui designada por BIPr ou BIPrso que possui a sequência explicitada nas SEQ ID NOs: 1 e 2 retiradas da obra de Gray et al., supra, com as excepções assinaladas para a BlPr^. Há outros exemplos não limitativos de fragmentos biologicamente activos da BIP que compreendem os fragmentos, v.g., da holoproteína BIP ou da BlPr^ gerada quando se submete as proteínas a clivagem química com agentes tais como o brometo de cianogénio (CNBr) ou por digestão enzimática com agentes tais como a endoproteinase Asp-N. Os fragmentos da proteína BIP também podem ser fornecidos sob a forma de péptidos sintéticos lineares ou cíclicos que compreendem réplicas desde cerca de 5 até cerca de 50 aminoácidos contínuos no interior da holoproteína BIP e especialmente dentro da metade do terminal amino da proteína. Tais péptidos podem ser fornecidos numa forma monomérica, na fornia de dímeros ou multímeros (em que o péptido replica uma região da BIP que possui resíduos cisterna) e sob a forma de dímeros ou multímeros “lineares” em que há uma sequência de BIP presente repetitivamente no péptido, com ou sem separação por meio de aminoácidos “separadores” que permitem uma apresentação conformacional escolhida.

Os análogos biologicamente activos da BIP compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as proteínas de fusão híbridas recombinantes que contêm a holoproteina BIP ou os seus fragmentos biologicamente activos e pelo menos uma parcela de um outro polipeptido, pelo menos. Tais proteínas foram descritas por Theofan et al. no pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários, com o n° de série 07/885 911 e numa sua continuação parcial correspondente ao pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/064 693, depositado a 19 de Maio de 1993 e publicado com o n° WO 93/23434 (PCT/US93/04754), e incluem as proteínas de fusão híbridas que possuam, na extremidade do terminal amino, uma proteína BIP ou um seu fragmento biologicamente activo e que possuam na extremidade do terminal carboxi pelo menos um domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou uma sua variante alélica.

Os análogos biologicamente activos da proteína BIP também compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os produtos de proteína BIP em que um ou vários resíduos aminoácidos foram substituídos por um aminoácido diferente ou por aminoácidos atípicos. Por exemplo, o pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários, com o n° de série 08/013 801 (Theofan et d., “Stable Bactericidal/ /Permeability-Increasing Protein Products and Pharmaceutical Compositions Containing the Same”), depositado a 2 de Fevereiro de 1993 e publicado com o n° WO 94/18323 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 94908704.3), descreve análogos polipeptídicos de BIP e de fragmentos de BIP em que um resíduo cisterna na posição 132 ou na posição 135 é substituído por um aminoácido diferente. Um produto proteínico preferido, designado por BIPr^Acis (em inglês rBP^Acis), compreende os primeiros 199 resíduos aminoácidos da holoproteina BIP mas em que o resíduo cisteína na posição 132 é substituído por um resíduo alanina. A administração de um produto de proteína BIP realiza-se preferencialmente sob a forma de uma composição farmacêutica que incorpore um produto de proteína BIP e um diluente, adjuvante ou veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A composição de produto de proteína BIP pode ser administrada simultaneamente ou não com antibióticos, agentes tensio-activos ou outros agentes quimioterapêulicos conhecidos. Uma composição farmacêutica preferida que contém produtos de proteína BIP incorpora a proteína BIP segundo uma concentração de 1 mg/mL em soluto salino tamponado com citrato (citrato 0,02 M, NaCl 0,15 M a pH 5,0) contendo 0,1% em peso de poloxâmero 188 (Pluronic F-68, BASF Wyandotte, Parsippany, NJ) e 0,002% em peso de polissorbato 80 (Tween 80, ICI Américas Inc., Wilmington, DE). Tais combinações preferidas estão descritas no pedido de patente de invenção norte-americana co--pendente e de que somos co-proprietários, com o n° de série 08/012 360 (McGregor et al., “bnproved Pharmaceutical Composition”), depositado a 2 de Fevereiro de 1993 e publicado com o n° WO 94/17819 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 94907963.6).

As doses eficazes de proteína BIP e de produtos de proteína BIP, para a neutralização parcial ou total da actividade anticoagulante da heparina e de outros efeitos aqui descritos, podem ser determinadas facilmente pelos especialistas na matéria tomando em consideração parâmetros convencionais, incluindo a massa corporal do paciente, a quantidade de heparina administrada a esse paciente e o tempo decorrido desde a administração da heparina. Há outros aspectos e vantagens da presente invenção que serão compreendidos tomando em consideração os exemplos ilustrativos a seguir descritos. O exemplo 1 aborda sistemas de ensaio para a quantificação da ligação da heparina pelos produtos de proteína BIP; o exemplo 2 descreve a capacidade relativa da heparina para bloquear a ligação dos LPS bacterianos aos produtos de proteína BIP; os exemplos 3 e 4 apresentam resultados de testes sobre a capacidade dos produtos de proteína BIP para inibirem respectivamente a inactivação da trombina ou do factor Xa por acção dos complexos antitrombina ΙΠ/heparina; e o exemplo 5 descreve o efeito dos produtos de proteína BIP sobre o aumento do tempo da trombina, mediado pela heparina. O exemplo 6 descreve o efeito de produtos de proteína BIP sobre o aumento do tempo parcial da tromboplastína, mediado pela heparina. Os exemplos 7-9 dizem respeito à administração de produtos de proteínas BIP em sistemas modelares de animais com artrite induzida pelo colagénio e por via bacteriana, exemplificando o tratamento de estados patológicos inflamatórios crónicos. Os exemplos 10 e 11 ilustram os testes efectuados com produtos de proteínas BIP para investigar os efeitos angiostáticos num sistema modelar de metástases de melanoma maligno no murganho. O exemplo 12 estuda os efeitos dos produtos de proteína BIP sobre a proliferação das células endoteliais e os possíveis mecanismos de ligação envolvidos. O exemplo 13 diz respeito à preparação de péptidos BIP sintéticos. Os exemplos 14-16 ilustram a ligação à heparina, a ligação aos LPS e as actividades bactericidas observadas com os péptidos BIP sintéticos do exemplo 13. O exemplo 17 descreve a preparação de outros péptidos BIP sintéticos. Os exemplos 18 a 21 abordam as propriedades dos péptidos do exemplo 17. O exemplo 22 descreve a preparação de péptidos do fragmento proteolítico BIP. O exemplo 23 descreve os efeitos bactericidas dos fragmentos proteolíticos BIP. O exemplo 24 descreve as propriedades de ligação à heparina existentes nos fragmentos proteolíticos BIP. O exemplo 25 descreve o efeito dos fragmentos proteolíticos BIP num ensaio com LAL.

Exemplo 1 LIGAÇÃO DA HEPARINA PELOS PRODUTOS DE PROTEÍNAS BIP Foram realizados ensaios de ligação da heparina utilizando moléculas BIP recombinantes e naturais ligadas à membrana e heparina marcada radioactivamente. Dito de forma abreviada, juntou-se BlPr^ e holoproteína designada por BIPr ou BIPrso às cavidades de uma placa de microtitiilação de 96 cavidades onde havia uma membrana ‘lmobilon-P’ (Millipore, Bedford, ΜΛ) disposta no fundo das cavidades. Juntou-se a cada cavidade 5 pg de proteína. Efectuou-se a secagem das cavidades que a seguir foram bloqueadas com albumina do soro de bovino a 1% (ASB) em soluto salino tamponado com fosfato a pH 7,4 (tampão de bloqueio). Foram preparadas diluições de ^-heparina (DuPont, NEN, Wiuhnmgton, DE) no tampão de bloqueio que foram incubadas nas cavidades que continham a proteína BIP, durante 1 hora a 4°C. Aspirou-se a heparina imo ligada e efectuou-se a lavagem das cavidades três vezes com tampão de bloqueio, secou-se e removeu-se para efeitos de quantificação num contador de cintilação em meio líquido. Os resultados de um ensaio típico estão apresentados de forma gráfica na figura 1. Apesar da ASB no tampão de bloqueio ter realmente uma capacidade e uma afinidade diminutas para se ligar à heparina, isso foi considerado fisiologicamente irrelevante e subtraiu-se sempre o valor espontâneo ao sinal do composto testado. A ligação da heparina marcada radioactivamente foi totalmente inibida por um excesso 100 vezes superior de heparina não marcada (dados não representados).

Em experiências semelhantes efectuou-se a comparação da ligação da heparina por acção das moléculas BIPrZ}, BIPr50 e da holoproteína natural (BIP) com os resultados obtidos com a proteína de contraprova taumatina (esta possui uma carga e dimensões semelhantes às da molécula BlPr^) ou com uma contraprova de tampão de lavagem (ASB a 1%). Nestes ensaios observou-se uma menor ligação da heparina por acção das holoproteínas BIP naturais e recombinantes. A menor intensidade de ligação por acção das moléculas BIPr e BIPn pode ser eventualmente o resultado da contaminação das preparações de proteína com hidratos de carbono.

Além disso, foram determinadas as constantes de ligação utilizando como ligando 3H--heparina, pelo método de minimização de funções não lineares com recurso à aplicação informática ‘Grafit’(Erithicus Soffward Ltd., Staines, UK) para as moléculas BlPr^, BI Pr*), sulfato de protamina (Sigma Chemical Co.) e taumatina, estando os resultados agrupados no quadro 1 seguinte. QUADRO 1

Constantes de ligação utilizando 3H-heparina como ligando PROTEÍNA Ka CAPACIDADE COLUNA DE HEPARINA ELUIÇÃO COM NaCl ΒΙΡΓ23 79 nM 2,63 pg 0,84 M Bilhão 173 nM 1,30 pg 0,81 M Protamina 8,1 nM 2,66 pg 1,33 M Taumatina Sem ligação 0,15 M Exemplo 2 COMPETIÇÃO DA HEPARINA PELA LIGAÇÃO AO PRODUTO DE PROTEÍNA BIP Avaliou-se a capacidade da hepaiina, do lipido A solúvel, dos LPS e dos ácidos teicóicos para competirem com o lipido A da estirpe J5 de E. coli imobilizada pela ligação à proteína BIPtzj solúvel. Dito de forma concreta, foram utilizadas cavidades de microtitulação ‘Imulon 2’ (Dynatech, Chintilly, VA) recobertas com lipido A da estirpe J5 de E. coli numa concentração de 0,5 pg/mL em metanol (volume de 50 p.T,). As cavidades foram depois bloqueadas durante 4 horas a 37°C com STP contendo 0,1% de ASB. As cavidades de contraprova foram tratadas com 50 pL de metanol absoluto e depois foram bloqueadas conforme se disse antes. As cavidades bloqueadas foram então aspiradas e lavadas duas vezes com STP/’Tween-20’ a 0,05%. Introduziu-se nas cavidades concentrações variáveis de inibidores putativos, num volume de 25 μΐ. de STP, seguindo-se a aplicação de proteínaBIPra radioiodada a 200 000 cpm em 25 pL de STP contendo 0,1% de ‘Tween 20’. As soluções testadas continham ‘Ra LPS’ de Salmonella minnesota R60 a 200 pg/mL; LPS regulares de E. coli 0113 (RIBI Immunochem., Hamilton, MT, #R318) a 200 pg/mL; ácido lipoteicóico proveniente de Strepíococcus faecalis (Sigma, St. Louis, MO, #L4015) a 400 pg/mL; ácido lipoteicóico proveniente de Staphylococcus aureus (Sigma #L-2525) a 400 pg/mL; e heparina sódica injectável de qualidade USP (Lypho--Med, Rosemont, IL, #9155-01) a 400 pg/mL. Esperou-se que a ligação tivesse lugar de um dia para o outro a 4°C com agitação suave, após o que as cavidades foram aspiradas e lavadas três vezes com STP/’Tween-20’ a 0,05% e a seguir efectuou-se uma contagem. Os resultados estão ilustrados na figura 2 que mostra a afinidade elevada da proteína BIPtb para a heparina e que também mostra que a heparina bloqueia a ligação da proteína BIP ao lípido A.

Exemplo 3

NEUTRALIZAÇÃO DA HEPARINA PELOS PRODUTOS DE PROTEÍNA BIP: EFEITO DA PROTEÍNA BIP SOBRE AINACTIVAÇÃO DA TROMBINA PELOS COMPLEXOS

DE ATm/HEPARINA

Recorreu-se a um ensaio cromogénico para se determinar o efeito da proteína BlPr^ sobre a inactivação da trombina pelos complexos de ΑΤΠΙ/heparina. Dito de fornia concreta, utilizou-se um estojo dc ensaio anti-trombina de marca ‘ Chromostrate™ ’ (Organon Teknika Corp., Durham, NC) para se examinar a inibição da trombina purificada, por acção dos complexos previamente formados de ΑΤΙΠ/heparina no plasma. »*** O ensaio foi praticado em placas de microtitulação de 96 cavidades, em triplicado, com um volume final de 200 pL por cavidade. A ordem de adição dos componentes de ensaio foi a seguinte: 1) 50 pL de amostra (proteína BlPr^ ou taumatina, enquanto proteína de contraprova) com concentrações finais de 100, 50, 25, 10 e 1 pg/cavidade, em STP; 2) 50 pL de plasma a 1:100 em tampão; 3) 50 pL de trombina à razão de 1 nKat/mL, em tampão; e 4) 50 pL de substrato cromogénico na concentração de 1 pmol/mL, em H£). Deixou-se a reacção decorrer durante 10 minutos a 37°C e interrompeu-se por adição de 50 pL de ácido cítrico 0,1 M, tendo a reacção de cor sido quantificada num leitor de microplacas. Os resultados dos ensaios, ilustrados na figura 3, indicam que a proteína BIPra consegue neutralizar eficientemente os complexos de ATIIl/heparina no plasma humano hepaiinizado, de uma forma dependente da dose. À medida que aumentou a concentração plásmica, aumentou também a actividade da trombina. Isto é devido a uma diminuição da quantidade de complexos inibitórios de ΑΊΊΠ/ /heparina no plasma acrescentado. Com a proteína de contraprova, a taumatina, não foi observado nenhum efeito neutralizador semelhante e verificou-se que era essencialmente equivalente ao tampão de contraprova para todas as concentrações de proteínas.

Exemplo 4

NEUTRALIZAÇÃO DA HEPARINA PELOS PRODUTOS DE PROTEÍNA BIP: EFEITO DA PROTEÍNA BIP SOBRE AINACTTVAÇÀO DO FACTOR Xa PELOS COMPLEXOS

DE ATIII/HEPARINA

Recorreu-se a um ensaio cromogénico para se determinar o efeito da proteína BlPr^ sobre a neutralização do factor Xa pelos complexos de ΑΊΊΠ/heparina. Dito de forma concreta, o ensaio foi efectuado utilizando um estojo de ensaio anti-lactor Xa com heparina ‘Chromostrate’ (Organon Teknika Corp.) e foi praticado com concentrações fixas de factor Xa e de ΑΊΊΠ. Fez-se variar a concentração da heparina de modo a obter-se uma curva padrão para a heparina com as concentrações de 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,063, 0,031, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002 e 0 unidades/mL, em STP. O protocolo de ensaio pennitiu medir a actividade funcional do factor Xa pela libertação de um composto croinogcnico a partir de um substrato sintético. Os complexos de ATm/heparina neutralizam a actividade do factor Xa, pelo que a quantidade de cromogénio libertado era inversamente proporcional à quantidade de actividade de heparina anti-factor Xa na amostra de ensaio. O ensaio teve lugar em placas de microtituiação de 96 cavidades, em triplicado, com um volume final de 200 pL por cavidade. Os componentes de ensaio foram acrescentados às cavidades de microtituiação do modo seguinte: 1) amostras de 50 pL (proteína BIPr23 ou taumatina, enquanto proteína de contraprova) com concentrações finais de 100, 50, 25, 10 e 1 pg/cavidade, em STP; 2) 50 pL de factor Xa a 0,14 nKal/mL, em H2O; 3) 25 pL de ΑΤΙΠ a 0,5 U/mL, em H20; 4) 24 pL de heparina a 0,25 U/mL, em tampão; 5) 50 pL de substrato (3 pmol/mL). Deixou-se a reacção decorrer durante 10 minutos a 37°C e interrompeu-se com 50 pL de ácido cítrico 0,1 M, tendo então a reacção de cor sido quantificada num leitor de microplacas. Os resultados da experiência, ilustrados na figura 4, indicam que a proteína BIPr2^ consegue neutralizar eficientemente a heparina na inibição do factor Xa pelos complexos de ATm/heparina. À medida que aumentou a concentração da heparina, a quantidade necessária de BIPr23 para a neutralização da heparina também aumentou Com a proteína de contraprova, a taumatina, não foi observado nenhum efeito neutralizador semelhante e verificou-se que era essencialmente equivalente ao tampão de contraprova para todas as concentrações de proteína.

Exemplo 5

NEUTRALIZAÇÃO DA HEPARTNA PELOS PRODUTOS DE PROTEÍNA BIP: EFEITO DA PROTEÍNA BIP SOBRE 0 PROLONGAMENTO DO TEMPO DA TROMBINA

MEDIADO PELA HEPARINA

Examinou-se o efeito dos produtos de proteína BEP sobre o prolongamento do tempo da trombina mediado pela heparina, isto é, o tempo necessário para a coagulação de uma mistura de trombina e plasma. O tempo da trombina é aumentado pela presença de inibidores endógenos ou exógenos da formação da trombina, tais como a heparina administrada terapeuticamente. Os agentes que neutralizam os efeitos anticoagulantes da heparina reduzem o tempo da trombina medido no teste. Efectuou-se a incubação de plasma humano citrado (200 j iT.) durante 1 minuto a 37°C, quer com 15 pL de diluente (NaCl 0,15 M, Tris 0,1 M a pH 7,4), quer com 15 pL de diluente contendo também heparina na concentração de 25 pg/mL (187 unidades/mg). Foram acrescentadas diversas concentrações de proteína BlPr^ (desde 0,0 até 56 pg/mL) num volume de 15 pL, seguindo-se imediatamente a adição de 100 pL de reagente de trombina (Sigma Chemical Co., N° 845-4). Mediu-se o tempo de coagulação (tempo da trombina) utilizando um fibrómetro ‘BBL’ (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD). Os resultados ilustrados na figura 5 permitem concluir que a proteína BlPr^ inibe o prolongamento do tempo da trombina mediado pela heparina. Na ausência de heparina, a proteína BDPr^ não teve nenhum efeito no ensaio, mesmo para concentrações da ordem de 56 pg/mL.

Exemplo 6 NEUTRALIZAÇÃO DA HEPARINA PELOS PRODUTOS DA PROTEÍNA BIP: EFEITO DA PROTEÍNA BIP SOBRE O TEMPO PARCIAL DA TROMBOPLASTINA Determinou-se o efeito da proteína ΒΙΡΓ23, ou do sulfato de protamina, sobre o tempo parcial da tromboplastina (TPT, em inglês PTT) em ratos heparinizados. O TPT é prolongado pela presença de inibidores endógenos ou exógenos da formação da trombina, tais como a heparina administrada terapeuticamente. Os agentes que neutralizam os efeitos anticoagulantes da heparina reduzem o TPT tal como medido no teste. Foram utilizados ratos da estirpe Sprague--Dawley, alojados segundo as regras ‘NIH’, aos quais se administrou heparina à razão de 100 unidades/kg por injecção intravenosa sob a forma de bolus, através da veia caudal de cada animal, seguindo-se a administração de proteína BlPr^ à razão de 5 mg/kg, ou sulfato de protamina ou tampão à razão de 5 mg/kg. Depois determinou-se o TPT a partir de amostras de sangue colhidas a partir da aorta abdominal dos animais previamente anestesiados. Determinou-se também o TPT dos animais não tratados. Os resultados ilustrados na figura 5 permitem concluir que tanto a proteína ΒΙΡγ^ como a protamina tiveram um efeito intermédio sobre o TPT dos animais tratados. Os dados destes animais confirmam os efeitos dos produtos de proteína BIP neutralizadores da heparina, conforme descrito nos exemplos 2-5.

Os resultados conjuntos dos exemplos 1 a 6 permitem concluir que a proteína BlPr^ se liga à heparina no ensaio de ligação directa e que neutraliza eficientemente a inibição das proteases de coagulação por acção da heparina. Com base nestas características, antevê-se que os produtos de proteína BIP venham a ser úteis na neutralização clínica dos efeitos anticoagulantes da heparina em doses geralmente correspondentes à dose prática recomendada para o sulfato de protamina, mas não se prevê que possua os efeitos graves hipotensivos e de tipo anafiláticos dessa substância.

Exemplo 7

EFEITOS TERAPÊUTICOS DOS PRODUTOS DE PROTEÍNA BIP NA DOENÇA INFLAMATÓRIA CRÓMCA: MODELO DE ARTRITE INDUZIDA COM COLAGÉNIO

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito à descoberta da utilidade da proteína BIP para tratar e evitar os efeitos de estados patológicos inflamatórios crónicos, tais como a artrite, incluindo a artrite reumatóide e a activa, a psoríase, a doença inflamatória dos intestinos, a doença de Crohn, a colite ulcerativa, o lúpus eritematoso, a uveíte de natureza autoimunitária, a doença de Lyme e a asma. São apresentados métodos exemplificativos para o tratamento de pacientes que padeçam de artrite, os quais consistem em administrar uma quantidade eficaz de um produto de proteína BIP com a finalidade de se evitar ou tratar a artrite. O produto de proteína BIP pode ser administrado por via tópica ou por injecção, por exemplo, intrarticular, intravenosa, intramuscular ou subcutânea, ou por outros métodos parentéticos e não parentéricos. O efeito da administração dos produtos de proteína BIP foi estudado num modelo de artrite induzida pelo colagénio. Dito de forma concreta, induziu-se artrite em murganhos por imunização intradermal com colagénio de tipo Π de bovino, com aplicação na base da cauda, em conformidade com o método de Stuart et al., J. Clin. Invest., 69:673-683 (1982). De um modo geral, os murganhos começaram a desenvolver sintomas artríticos ao 21° dia após a imunização com o colagénio. As classificações artríticas dos murganhos tratados foram efectuadas de uma forma cega ao longo de um período de 120 dias, no caso dos murganhos tratados em cada um dos dias 21 a 25 com doses quer de proteína BIPr23, proteína de contraprova taumatma ou tampão, doses essas que foram injectadas por via intravenosa na veia caudal.

Dito de fornia concreta, administrou-se colagénio de tipo Π de bovino (Southern Bio-technology Associates, Inc., Birmingham, AL), por injecção intradermal (0,1 mg/murganho), na base da cauda no dia 0 a grupos de 10 murganhos machos (murganho/DBA/lJ), pesando cada um deles aproximadamente 20-25 g. Dissolveu-se a proteína BlPr^ em NaCl 0,5 M e acetato de sódio 20 mM a pH 6,0 e diluiu-se com tampão de STP (1 mg/mL) para administração à razão de 0,125 mg/murganho. Como contraprovas utilizou-se a proteína taumatina em STP (0,121 mg/murganho) ou apenas o tampão de STP (0,1 mL).

Os resultados apresentados na figura 7 demonstram que a proteína BIPr23 tem um efeito estatisticamente significativo na redução da avaliação artrítica dos murganhos tratados, comparativamente com os animais que receberam como contraprova tampão de STP e proteína taumatina.

Exemplo 8

EFEITOS TERAPÊUTICOS DOS PRODUTOS DE PROTEÍNA BIP EM COMPARAÇÃO COM O SULFATO DE PROTAMINA NO CASO DA DOENÇA INFLAMATÓRIA

CRÓNICA: MODELO DE ARTRITE INDUZIDA PELO COLAGÉNIO

Utilizou-se o modelo de artrite induzida pelo colagénio, descrito no exemplo 7, para se avaliar os resultados de um produto de proteína BIP por comparação com o sulfato de protamina, utilizando como contraprovas quer a proteína taumatina quer o tampão. Dito de forma concreta, dissolveu-se a proteína BlPr^ em NaCl 0,5 M e acetato de sódio 20 mM a pH 6,0 e diluiu-se com tampão de STP (1 mg/mL) e admmistrou-se à razão de 0,125 mg/murganho. Os outros materiais testados foram administrados nas doses seguintes: sulfato de protamina (Sigma Chemical Co) (0,13 mg/murganho), taumatina (0,121 mg/murganho) e tampão de STP

(0,1 mL). Cada um de quatro grupos de 10 animais recebeu as substâncias de teste ou de contraprova por injecção intravenosa através da veia caudal em cada um dos dias desde o 28° até ao 32°. A figura 8 mostra os resultados das avaliações artríticas para os diversos protocolos de tratamento e de contraprova, com variações feitas nos dias 28°-80°. Os asteriscos (*) na figura 8 representam uma diferença estatisticamente significativa entre a proteína BlPra c o tampão, para um valor p < 0,01, ao passo que os sinais (+) representam uma diferença estatisticamente significativa entre a proteína BlPr^ e o tampão para um valor p < 0,05. Estes resultados demonstram que a proteína BlPr^ reduziu de forma significativa a classificação artrítica dos murganhos tratados no sistema modelar.

Exemnlo 9 MODELOS DE ARTRITE REACTIVA INDUZIDA GRAM-NEGATTVA O efeito da administração de produtos de proteína BIP para tratar a artrite reactiva foi estudado num modelo de artrite reactiva induzida por Yersima enterocolitica, em conformidade com o método de Yong et al., Microbial Pathogenesis, 4:305-310 (1988). Dito de forma concreta, efectuou-se a administração de produtos de proteína BIP a murganhos macho da estirpe DBA/2J aos quais se havia injectado previamente por via intravenosa, através da veia caudal, Yersima enterocolitica cWA 0:8 T2 (isto é, faltava-lhe o plasmídeo da virulência, de acordo com Yong et al., supra) segundo um regime de dosagem igual a 4 x 108 bactérias, valor este calculado para induzir nos murganhos artrite não séptica. Cada um de três grupos de 15 murganhos recebeu as substâncias de teste ou de contraprova por injecção intravenosa através da veia caudal. Administrou-se aos murganhos quer a proteína ΒΓΡτ^, segundo um regime de dosagem de cerca de 5,0 mg/kg, dissolvida num tampão constituído por citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, 0,1% de poloxâmero 188,0,002% de polissorbato 80 a pH 5,0, quer a proteína taumatina, segundo um regime de dosagem de cerca de 5,0 mg/kg, dissolvida no tampão constituído por citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, 0,1% de poloxâmero 188 e 0,002% de polissorbato 80 a pH 5,0, quer tampão por si só. Os resultados traduzidos na figura 9 mostram que o produto de proteína BIP reduziu dc forma significativa a incidência de artrite reactiva comparativamente com o tampão ou com a proteína de contraprova taumatina. O microrganismo Borrelia burgdorferi é o agente patogénico responsável pela doença de Lyme e pela artrite que lhe está associada e possui um complexo de tipo UPS nas suas paredes celulares que é diferente do complexo de E. coli, mas estruturalmente afim. Determinou-se o efeito da administração dos produtos de proteína BIP sobre a inibição de LPS de Borrelia burgdorferi num ensaio de inibição de lisado de amebócitos Limulus (LAL). Dito de forma concreta, realizou-se um ensaio de LAL, de acordo com o método do exemplo 15, medindo o efeito da proteína BlPr^ sobre os LPS de Borrelia burgdorferi administrados à razão de 2,5 pg/mL e sobre os LPS de E. coli 013 administrados à razão de 2 ng/mL. Os resultados traduzidos na figura 10 mostram que a proteína BlPr^ neutraliza os efeitos quer dos LPS de Borrelia burgdorferi quer dos LPS de E. coli 013 no ensaio de LAL.

Exemplo 10

EFEITO DA PROTEÍNA BIP NO MODELO DE MELANOMA MALIGNO DO

MURGANHO

De acordo com este exemplo, testou-se um produto de proteína BIP, protamina e as duas substâncias de contraprova, proteína taumatina e tampão, para se avaliar a sua eficácia num modelo de metástases de melanoma maligno do murganho. Dito de forma concreta, inoculou-se quatro grupos de 9 murganhos C57BL/6J com 105 células de melanoma maligno R16.F10 por injecção intravenosa na veia caudal no dia 0. Administrou-se por via intravenosa quer a proteína ΒΙΡγώ (0,13 mg/murganho) quer o sulfato de protamina (0,13 mg/murganho), quer a taumatina (0,13 mg/murganho), quer o tampão de STP (0,1 mL/mugranho) na veia caudal dos murganhos nos dias 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15, 17 e 19. Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical ao 20° dia para observação dos tecidos pulmonares. Efectuou-se a perfusão dos lobos de cada pulmão que foram insuflados por injecção de 3 mL de água no pulmão através da traqueia Depois efectuou-se a contagem dos nódulos dos tumores superficiais com o auxílio de um microscópio de dissecação e analisou-se o número de tumores encontrados em cada grupo para procurar diferenças estatisticamente significativas. Embora os dados não tivessem sido estatisticamente significativos, os animais tratados com a proteína BIPra revelaram a mais baixa carga tumoral, seguindo-se os animais tratados com a protamina, com a contraprova de proteína taumatina e com a contraprova de tampão. A falta de significação estatística (o número de tumores não reflectiu adequadamente o tamanho dos tumores) indica que seria necessária uma metodologia experimental mais específica para se determinar a carga tumoral.

Exemplo 11

EFEITO DA PROTEÍNA BIP NUM MODELO DE MELANOMA MALIGNO DO

MURGANHO

Testou-se novamente um produto de proteína BIP, a protamina e as duas substâncias de contraprova, proteína taumatina e tampão, para se investigar a sua eficácia num modelo de metástases do melanoma maligno do murganho, de acordo com o exemplo 10. Dito de forma concreta, inoculou-se seis grupos de murganhos da estirpe C57BL/6J com 105 células do melanoma maligno B16.F10 por injecção intravenosa na veia caudal no dia 0. Qualquer das substâncias RlPr^ (0,125 mg/murganho), sulfato de protamina (0,125 mg/murganho), taumatina (0,125 mg/murganho) ou tampão de STP, de acordo com o explicitado no quadro 2 subsequente, foi administrada por via intravenosa na veia caudal dos murganhos nos dias 1,2, 5, 7, 9, 12, 14, 16 e 19. Todos os animais dos grupos A-D foram sacrificados por deslocamento cervical no 20° dia para observação dos tecidos pulmonares. Efectuou-se a remoção dos pulmões que foram colocados numa proveta com água fria. Os lobos de cada pulmão foram depois sujeitos a uma operação de perfusão e insuflados por injecção de 3 mL de água no pulmão através da traqueia. Depois efectuou-se a análise dos nódulos dos tumores superficiais para se pesquisar o seu conteúdo em melanina.

Grupo OUADR02 Contraprova/Substância testada N° de animais A Tampão 10 B Protamina 10 C Taumatina 10 D ΒΙΡΓ23 10 E Tampão 5 F BIPr2! 5

Os grupos E e F, constituídos por animais tratados respectivamente com a substância tampão ou com a proteína BlPr^, não foram sacrificados, mas foram observados uma vez por dia para se determinar a mortalidade. A figura 11 agrupa os dados de sobrevivência para os dois grupos de animais. Embora a totalidade dos 10 animais tenham morrido por volta do 43° dia, os murganhos tratados com a proteína BlPr^ sobreviveram, de um modo geral, significativamente mais do que os murganhos não tratados, significando isso que a proteína BIP teve um efeito antiangiogénico e que reduziu as metástases dos tumores do melanoma.

Pelo exposto, de acordo com um outro aspecto da invenção, os produtos de proteína BIP podem ser utilizados para inibir o sarcoma de Kaposi num sistema modelar, tal como o de Miles et ai, ‘VII International Conference on AIDS’, Florença, Itália, Documento 41(8), 1991.

Exemplo 12

EFEITO DA PROTEÍNA BIP SOBRE A PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS

ENDOTELIAIS

Fez-se passar células endoteliais (CE) dos capilares cerebrais dos murrnos, conforme descrito por Bauer em Microvascular Research 37:148-161 (1989), por Meio 199 contendo sais de Earle, L-glutamina e bicarbonato de sódio na concentração de 2,2 g/L (Gibco, Grand Island, NY, #400-100EB) mais 10% de soro fetal de vitelo inactivado termicamente (Irvine Scientific, Irvine, CA) e 1% de penicilina/esneptomicina (Gibco, #600-5140AG). Efectuou-se a colheita das células confluentes por tripsinização com tripsina-EDTA (Gibco #610-5300PG) durante 3 minutos. Interrompeu-se a tripsinização juntando ao balão 10 mL de meio de passagem. Os ensaios de proliferação foram realizados com CE recém-colhidas em placas de microtitulação convencionais de 96 cavidades de fundo redondo. Em cada cavidade de ensaio manteve-se um volume final de 200 pL/cavidade. Acrescentou-se a cada cavidade um total de 4 x 104 CE com concentrações variáveis de proteína BlPr^j, proteína de contraprova tanmatina e tampão de contraprova. Decorridas 48 horas de cultura numa incubadora em atmosfera com 5% de CO2, juntou-se a cada cavidade 1 pCi de [metil-3H]-timidina em 10 pL de Meio 199. Após um período de estimulação de 24 horas, efectuou-se a colheita das CE por hipsinização sobre filtros de raicrofibras de vidro e quantificou-se a [3H]-timidina incorporada, utilizando para tal um contador de radiação β cm fase sólida, proporcional ao gás. A inibição da proliferação das CE, dependente da concentração, por acção da proteína BIPrzs, está ilustrada na figura 12. Não foi observado efeito nenhum quando se acrescentou às cavidades concentrações semelhantes de taumatina ou volumes iguais de tampão. A primeira inibição de proliferação é observada para uma concentração da proteína BlPr^ igual a 12,4 pg/rnL e parece que o efeito é máximo à concentração de 50 pg/mL. Sabe-se que o crescimento das CE depende do F-2CF (em inglês FGF-2) (FbCF, cm inglês bFGF) no soro do vitelo e que o F-2CF necessita do heparano da superfície celular para a activação dos receptorcs (Yayon et cd., Cell 64:841-848,1991). Sem se pretender estabelecer qualquer tipo de dependência de uma teoria da invenção, admite-se que a proteína BlPr^ ligada ao heparano da superfície celular nas CE interfere com a activação das células por acção do F-2CF.

Foram efectuados estudos de ligação directa da proteína BlPr^ sobre as CE colhendo as células que passaram 10 vezes, retiradas de um balão confluente e recolocando as células tripsinizadas em suspensão em 12,5 mL de meio de cultura. Acrescentou-se 0,5 mL da suspensão a cada cavidade de uma placa convencional de cultura de tecidos de 24 cavidades e efectuou-se a incubação de um dia para o outro. Lavou-se a placa com albumina de soro de bovino a 0,1% em soluto salino tamponado com fosfato contendo cálcio e magnésio (Gibco). Após a lavagem acrescentou-se a cada cavidade 0,5 mL de ASB/STP. Experiências preliminares indicaram que a proteína BlPr^ marcada com 125I, na concentração de 50 ng/mL, acrescentada às cavidades, produziu uma resposta específica aproximadamente igual a 30 000 c.p.m. ao fim de um período de incubação de 3 horas a 4°C com lavagem três vezes em STP e lise com NaOH 1M, por contagem da radiação γ do lisado.

Poder-se-ia ter desencadeado a competição pela ligação específica da proteína ΒΙΡτ^ “quente”, marcada com 1251, na concentração de 50 ng/mL, às CE por adição de heparina na concentração de 20 pg/mL (Sigma, Grau 1). Observou-se uma competição idêntica com a proteína BIPr23 não marcada (“fria”), acrescentada à cultura de ligação. A combinação de proteína ΒΙΡΓ23 não marcada e heparina (acrescentada simultaneamente ou previamente misturada antes da adição) não foi capaz de reduzir a ligação para valores abaixo da competição apenas com heparina (figura 13). Estes dados indicam que a proteína BTPr^ se liga às células endoteliais através de uma molécula semelhante à heparina e que parece que esta ligação interfere com a proliferação das células endoteliais (CE), em presença de factor de crescimento de ligação à heparina (F2-CF).

Exemnlo 13 PREPARAÇÃO DOS PÉPTIDOS SINTÉTICOS PENTADECAMÉRICOS (15-MÉRICOS)

DA PROTEÍNA BIP

Para se avaliar as propriedades biológicas de produtos do fragmento peptídico da proteína BIP, efectuou-se a preparação de péptidos sintéticos de aminoácidos pentadecaméricos (15--méricos), com base no fragmento do terminal amino de 23 kDa da proteína BIP e avaliou-se a sua actividade de ligação à heparina, a sua actividade num ensaio de inibição de lisado de amebócitos de Limulus (LAL) e a sua actividade bactericida. Dito de forma concreta, efectuou-se a preparação de 47 péptidos sintéticos, cada um deles constituído por 15 aminoácidos e sobrepondo-se aos péptidos adjacentes em 11 aminoácidos, sendo essa preparação feita em duplicado, com base na sequência da proteína Bllfra descrita supra.

Os péptidos foram sintetizados simultaneamente, em conformidade com os métodos de Maeji et al., Imrmnol. Methods, 134:23-33 (1990) e Gammon et ai, J. Exp. Med, 773:609-617 (1991), utilizando a tecnologia em fase sólida da empresa ‘Cambridge Research Biochemicals Ltd.’, sob licença da empresa ‘Coselco Mimotopes Pfy I M\ Dito de forma abreviada, dividiu-se a sequência da proteína 1311¾¾ (1-199) em 47 pépddos pentadecaméricos diferentes, progredindo ao longo da sequência linear da BlPr^ e iniciando um péptido subsequente em cada 15 aminoácidos. Esta tecnologia da síntese de péptidos permite a síntese simultânea, em pequena escala, de vários péptidos sobre pinos separados num modelo em placa de 96 cavidades. Assim sendo, foram utilizados 94 pinos individuais para esta síntese e os pinos restantes (B, B) foram submetidos aos mesmos passos dos outros pinos, mas sem a adição de FMOC-aminoácidos activados. Na clivagem final dos péptidos pentadecaméricos, para fora do suporte de pinos em tese sólida, utilizou-se um tampão alcalino aquoso (carbonato de sódio, pH 8,3). A ligação única ao pino experimenta uma ciclização quantitativa da dicetopiperazinã nessas condições, dai resultando um péptido clivado com um radical ciclo(lisilprolilo) no terminal carboxilo de cada péptido. Os terminais amino não foram adiados, pelo que o grupo amino livre pode ter contribuído potencialmente para as reacções aniónicas de ligação. De cada cavidade recuperou-se em média cerca de 15 pg de cada péptido pentadecamérico.

Exemplo 14

LIGAÇÃO DA HEPARINA PELOS PÉPTIDOS SINTÉTICOS PENTADECAMÉRICOS

DA PROTEÍNA BIP

Submeteu-se os péptidos sintéticos do produto de proteína BIP, descritos supra, a um ensaio de ligação da heparina, em conformidade com os métodos descritos no exemplo 1. Os resultados, tal como se ilustra na figura 14, indicam a existência de 3 domínios funcionais independentes com actividade de ligação à heparina; o primeiro deles prolonga-se sensivelmente entre os aminoácidos 21 e 55; o segundo prolonga-se sensivelmente entre os aminoácidos 65 e 107; e o terceiro prolonga-se sensivelmente entre os aminoácidos 137 e 171.0 material dos pinos virgens de contraprova não teve nenhuns efeitos de ligação à heparina.

Exemplo 15

EFEITO DOS PÉPTIDOS SINTÉTICOS PENTADECAMÉRICOS DA PROTEÍNA BIP

NUM ENSAIO COM LAL

Submeteu-se os péptidos sintéticos do produto de proteína BIP a um ensaio de inibição do lisado de amebócitos de Limulus (LAL) para se determinar as propriedades de ligação aos LPS. Dito de forma concreta, misturou-se os péptidos sintéticos da proteína BIP, em tubos de Eppendorf, com uma concentração fixa de LPS de E. coli 0113 (4 ng/mL, concentração final) e fez-se a incubação a 37°C durante 3 horas com agitação ocasional. Testou-se também as contraprovas adicionadas na concentração de 0,05 pg/mL. A seguir à incubação, acrescentou-se a cada tubo 350 pL de D-STP (em inglês (D-PBS) para se obter uma concentração de LPS igual a 200 pg/mL para o ensaio de LAL. Transferiu-se cada amostra para tiras de ‘hmnulon ΙΓ (Dynaetch, Chantilly, VA) em volumes de 50 pL por cavidade.

Juntou-se a cada cavidade 50 pL de Lisado de Amebócitos de Limulus (estojo de LAL cromogénico quantitativo, Whitaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD) e manteve-se as cavidades a incubar à temperatura ambiente durante 25 minutos. Depois juntou-se então o substrato cromogénico à razão de 100 pL por cavidade e misturou-se bem. Após uma incubação durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente, interrompeu-se a reacção por adição de 100 pL de ácido acético a 25%. Mediu-se então a densidade óptica a 405 nm num leitor multiplacas (Vmax, Molecular Dynamics, Menlo Park, CA), estando os resultados apresentados na figura 15 em termos de percentagem da inibição dos LPS. Os dados da figura 15 indicam SÍl\ que há pelo menos três domínios principais com inibição significativa do LAL; o primeiro constituído pelos aminoáridos 17 a 55; o segundo é constituído sensivelmente pelos aminoácidos 73 a 99 e o terceiro é constituído sensivelmente pelos aminoácidos 137 a 163. Há outros péptidos individuais que também inibem o LAL. Pelo contrário, o material dos pinos virgens de contraprova nao manifestou nenhum efeito neutralizador dos LPS, tal como medido pelo ensaio de LAL.

Exemplo 16

EFEITOS BACTERICIDAS DOS PÉPTIDOS SINTÉTICOS PENTADECAMÉRICOS DA

PROTEÍNA B1P

Testou-se os péptidos sintéticos do produto de proteína BIP para se pesquisar os seus efeitos bactericidas contra a bactéria irregular mutante da estirpe J5 de E. coli num ensaio de difusão radial. Dito de forma concreta, preparou-se uma cultura de estirpe J5 de E. coli de um dia para o outro e diluiu-se a 1:50 em caldo de soja tripsínica recente e manteve-se a incubar durante 3 horas a 37°C até ser atingida a fase logarítmica As bactérias foram então reunidas por centrifugação a 3000 rp.m. durante 5 minutos num aparelho ‘Sorvall RT6000B’ Acrescentou-se 5 mL de tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,4) e eentrifugou-se novamente a preparação. Decantou-se o sobrenadante e acrescentou-se 5 mL de tampão recente, preparou--se nova suspensão com as bactérias e determinou-se a sua concentração medindo a absorvência a 590 nm. A absorvência de 1,25 x 109 UFC/mL de suspensão era igual a 1,00. Diluiu-se as bactérias para 4 x 106 UFC/mL em 10 mL de gelose fundida da subcamada (aproximadamente 45°C) e inverteu-se a posição repetidas vezes para efectuar a mistura dentro de tubos de poli-propileno de 15 mL utilizados para este fim.

Verteu-se a totalidade do conteúdo de cada tubo dentro de um prato de Petri quadrado, perfeitamente nivelado, e distribuiu-se uniformemente sacudindo o prato de lado a lado. A gelose endureceu em menos de 30 segundos e ficou com uma espessura uniforme de cerca de 1 mm. Depois perfurou-se um conjunto de cavidades através da gelose endurecida, utilizando para tal um punção estéril de 3 mm acoplado a uiu aspirador. O punção foi esterilizado com álcool puro (100%) e deixou-se secar ao ar.

Com uma pipeta introduziu-se cuidadosamente em cada cavidade 10 pL dos péptidos sintéticos BIP. Como contraprovas, acrescentou-se tampão a pH 8,3 a uma cavidade independente (como contraprovas positivas acrescentou-se também proteína BIPr2( nas concentrações de 5 pginL e 1 pg/mL). Além disso, testou-se como contraprovas os produtos dos pinos virgens B e B. Deixou-se a placa a incubar a 37°C durante 3 horas e depois juntou-se 10 mL de gelose fundida da sobrecamada (à temperatura aproximada de 45°C) ao prato de Petri nivelado, deixou-se endurecer e manteve-se a incubar de um dia para o outro a 37°C. Observou-se uma zona límpida contrastando com a zona ocupada pelas bactérias nas cavidades que possuíam actividade bactericida. Para se ver melhor esta zona, verteu-se sobre a gelose uma solução diluída de corante de Coomassie (azul brilhante de Coomassie a 0,002%, metanol a 27%, formaldeído a 15% (solução-mãe a 37%) e depois deixou-se contrastar durante 24 horas. As zonas bacterianas foram medidas com um micrómetro ‘Mitutoyo’.

Os resultados da experiência estão ilustrados na figura 16 em que o único péptido sintético BIP com actividade bactericida foi um fragmento correspondente rios aminoácidos 85-99. As contraprovas positivas de proteína BlPra também tiveram efeitos bactericidas, mas as contraprovas dos pinos virgens e do tampão não tiveram.

Exemplo 17

PREPARAÇÃO DE FRAGMENTOS DE PÉPTIDOS BIP

Com base nos resultados dos testes de péptidos sobrepostos nos exemplos 13 a 16, preparou-se fragmentos de péptidos de produto de proteína BIP por síntese de péptidos em fase sólida, em conformidade com os métodos de Memfield, J. Am. Chem. Suc. 85.2149 (1963) e Memfield et d., And. Chem. 38:1905-1914 (1966), utilizando para tal um siníetizador de modelo 432 da ‘Applied Biosystems bic.’. Foram preparados 9 péptidos do produto de proteína BIP, designados por BIP-2 até BIP-10, a que correspondem as sequências de aminoácidos de parcelas de resíduos aminoácidos 1-199 da proteína BIPr23, conforme consta do quadro 3 subsequente. No caso dos péptidos BIP-7, BIP-9 e BIP-10, estes representavam repetições de sequência, parciais ou mesmo múltiplas. Dito de forma concreta, o péptido BIP-7 compreende um icosâmero (20-mero) constituído pelos resíduos aminoácidos 90-99 repetidos duas vezes numa única cadeia linear. O péptido BIP-10 compreende um tricontâmero (30-mero) constituído pelos resíduos aminoácidos 90-99 repetidos três vezes numa única cadeia linear. O péptido BIP-9 compreende um hexadecâmero (16-mero) constituído pelos resíduos aminoácidos 94-99 seguidos pelos resíduos 90-99 numa única cadeia linear. QUADRO 3

Péptidos do produto de proteína BIP

Polipeptido n° Região dos aminoácidos Resíduos aminoácidos PM (daltons) BIP-2 85-99 15 1828,16 BIP-3 73-99 27 3072,77 BIP-4 25-46 22 2696,51 BIP-5 142-163 22 2621,52 BIP-6 112-127 16 1569,82 QUADRO 3 (cont.)

Péptidos do produto de proteína BIP

Polipeptido n° Região dos aminoácidos Resíduos aminoácidos PM (daltons) BIP-7 90-99, 90-99 20 2644,66 BIP-8 90-99 10 1316,8 BIP-9 94-99, 90-99 16 2131,34 BIP-10 90-99, 90-99,90-99 30 3958,45

Exemplo 18 LIGAÇÃO DA HEPARINA PELOS PÉPTIDOS DO PRODUTO DE PROTEÍNA BIP Neste exemplo submeteu-se os péptidos BIP-2, BIP-3, BIP-4, BIP-6, BIP-7 e BIP-8, conjuntamente com BIP-cis, do produto de proteína BIP, a um ensaio de ligação da heparina em conformidade com os métodos descritos no exemplo 1. Os resultados, conforme ilustrado na figura 17, indicam que os péptidos BIP-7 e BIP-8 possuem uma capacidade de ligação à heparina extremamente elevada, ao passo que os péptidos BIP-2 e BIP-3 possuem uma capacidade de ligação à heparina mais moderada e os péptidos BDM e BIP-6 possuem fraca ou nenhuma capacidade de ligação à heparina.

Exemplo 19

NEUTRALIZAÇÃO DA HEPARINA PELOS PÉPTIDOS DOS PRODUTOS DE

PROTEÍNA BIP

Neste exemplo submeteu-se os péptidos dos produtos de proteína BIP, designados por BIP-2, BIP-3, BIP-4, Bff-5, BIP-6, BIP-7 e BIP-8, conjuntamente com a proteína BlPr^, a um ensaio para se determinar os seus efeitos sobre a inactivação da trombina por acção dos complexos de ΑΤΜ/heparina, em conformidade com o método do exemplo 3. Para se determinar os seus efeitos, foram administradas concentrações variáveis dos produtos de proteína BIP, variando entre 1,0 pg/mL e 100 pg/mL. Os péptidos de proteínas BIP, designados por BIP-7, BIP-3 e BIP-5, revelaram os efeitos mais significativos de neutralização da heparina, conforme ilustrado nas figuras 18a e 18b, as quais traduzem as concentrações das amostras apresentadas respectivamente em termos de concentrações em peso ou molares.

Exemplo 20 EFEITO DOS PÉPTIDOS DOS PRODUTOS DE PROTEÍNA BIP NUM ENSAIO COM LAL Neste exemplo submeteu-se os péptidos dos produtos de proteína BIP, designados por BIP-2, BIP-3, BIP-4, BIP-6, BIP-7 e BIP-8, conjuntamente com a proteína BlPr^, a um ensaio com LAL, em conformidade com o método do exemplo 15, para se determinar as suas propriedades de ligação e de inibição dos LPS. Os resultados demonstram que os péptidos BIP-7 e BIP-3 possuem propriedades significativas de inibição dos LPS, demonstram que os péptidos BIP-2 e BIP-8 possuem propriedades moderadas de inibição dos LPS e que os péptidos BIP-4 e BIP-6 não têm actividade significativa de inibição dos LPS, conforme traduzido nas figuras 19a e 19b que correspondem às concentrações das amostras calculadas respectivamente como concentrações em peso ou molares.

Exemplo 21 ENSAIO BACTERICIDA COM OS PÉPTIDOS DOS PRODUTOS DE PROTEÍNA BIP Neste exemplo testou-se os péptidos dos produtos de proteína BIP, designados por BIP-2, BIP-3, BIP-4, BIP-5, BIP-6, BIP-7, BIP-8, BIP-9 e BIP-10, conjuntamente com a proteína ΒΠ*Γ23, para se pesquisar os seus efeitos bactcricidas contra a estirpe mutante J5 de E. coli (irregular) e contra a estirpe 011:B4 de E. coli (lisa) num ensaio de difusão radial, em conformidade com os métodos do exemplo 16. Os resultados traduzidos nas figuras 20a-20d comprovam que cada um dos péptidos BIP-2, BIP-3, BIP-5, BIP-7, BIP-8, BIP-9 e BIP-10, revela possuir um maior ou menor grau de actividade bactericida, ao passo que os péptidos BIP-4 e BIP-6 não manifestaram nenhuma actividade bactericida. Qualquer dos péptidos bactericidas revelou uma tendência para ser mais eficaz contra a estirpe irregular do que contra a estirpe lisa de E. coli.

De acordo com outro aspecto deste exemplo, foram efectuados ensaios bacterianos em caldo de cultura para se determinar a actividade bactericida de determinados péptidos BIP. Dito de forma concreta, seleccionou-se quer a estirpe J5 (irregular) da bactéria E. coli quer a estirpe 0111:B4 (lisa) da bactéria E. coli a partir de colónias singulares criadas em placas de gelose e que foram utilizadas para inocular placas de cultura a que se acrescentou diluições sequenciais, à razão de 1:10, dos péptidos dos produtos de proteína BIP. As placas ficaram a incubar de um dia para o outro e foram lidas com um leitor de placas, segundo o protocolo de EISLE, para se determinar as unidades formadoras de colónias sobreviventes. Os resultados desta experiência estão traduzidos nas figuras 20e (E. coli J5) e 20f (E. coli 0111:B4) que mostram que os péptidos dos produtos de proteína BIP, designados por BIP-3, BIP-7, BIP-9 e BIP-10 possuem uma actividade antibacteriana significativa.

Os resultados destes ensaios bactericidas, conjuntamente com os ensaios com LAL e de ligação à heparina, indicam que há pequenos péptidos BIP sintéticos que possuem um ou vários efeitos bactericidas» de ligação à heparina e neutralizadores dos LPS, e que há pelo menos três domínios funcionais separados distintos no interior do fragmento do terminal amino de 23 kDa. Um domínio está situado entre os resíduos aminoácidos 17 e 45. Um segundo domínio, o 43"" ./7 mais activo deles, caracterizado pelo facto de demonstrar acitividade na totalidade dos três ensaios, está situado entre os aminoácidos 71 e 99. Um péptido específico de resíduos 86-99 demonstrou possuir actívidade na totalidade dos três ensaios. Há um terceiro domínio constituído pelos resíduos 142-169.

Exemplo 22

PREPARAÇÃO DOS PÉPTIDOS DO FRAGMENTO PROTEOLÍTICO BIP

Neste exemplo, foram aplicados processos de clivagem química e de digestão enzimática à proteína BlPr^, produzida em conformidade com os procedimentos de Gazzano-Santoro et al., supra, para se criar fiagmentos proteolíticos da proteína recombinante, com diversos tamanhos. A proteína BlPr^ foi reduzida e alquilada antes da proteólise, por meio de brometo de cianogénio (CNBr) ou de endoproteinase Asp-N. Trocou-se um sal por outro na proteína por precipitação em acetona fria (1:1, v/v) à temperatura de 4°C de um dia para o outro e reuniu-se por centrifugação (5000 x g) durante 10 minutos. A massa obtida de proteína ΒΙΡγώ foi lavada duas vezes com acetona fria e depois secou-se sob uma corrente de azoto. A seguir reconstituiu-se a proteína BlPr^ à concentração de 1 mg/mL em ureia 8 Μ/Tris 0,1M a pH 8,1 e reduziu-se por adição de ditiotreitol 3,4 mM (Calbiochem, San Diego, CA) durante 90 minutos a 37°C. Efectuou-se a alquilação por adição de iodoacetamida (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) até uma concentração final de 5,3 milimnlar, durante 30 minutos, ao abrigo da luz e à temperatura ambiente. Fez-se precipitar com acetona a proteína reduzida e alquilada, centrifugou-se e lavou-se conforme descrito antes e dissolveu-se novamente a massa obtida para digestão com CNBr ou com Asp-N.

Antes da adição de CNBr, a massa que havia sido lavada foi dissolvida em ácido tri-fluoroacético a 70% (ATF) (de qualidade para a sequenciação de proteínas. Sigma) até uma concentração final de proteínas igual a 5 mg/mL. Dissolveu-se brometo de cianogénio (Baker Analyzed Reagent, VWR Scientifíc, San FRancisco, CA) em ATF a 70% e juntou-se-lhe esta solução para se obter uma razão final entre CNBr e proteína igual a 2:1 (p/p). Isto representa aproximadamente um excesso molar 75 vezes superior de CNBr relativamente aos resíduos metionina na proteína. Limpou-se a mistura de reacção com azoto e deixou-se a operação prosseguir durante 24 horas ao abrigo da luz e à temperatura ambiente. Interrompeu-se a reacção por adição de 9 volumes de água destilada e a seguir congelou-se (-70°) e liofilizou-se. A proteína BlPr^, reduzida e alquilada, foi solubilizada, segundo uma concentração de 5,0 mg/mL, em ureia 8 M/Tris 0,1 M a pH 8,1. Adicionou-se um volume igual de Tris 0,1 M a pH 8,1 de modo a que as condições finais correspondessem a uma concentração da proteína igual a 2,5 mg/mL em ureia 5 M/Tris 0,1 M a pH 8,1. Acrescentou-se a endoproteinase Asp-N obtida a partir de Pseudomonas fragi (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), segundo uma proporção entre enzima: substrato igual a 1:1000 (p/p) e deixou-se a digestão prosseguir durante 6 horas a 37°C. Interrompeu-se a reacção por adição de ATF até tuna concentração final de 0,1% e depois efectuou-se o fiaccionamento das amostres por CLER de fase inversa.

As misturas de fragmentos obtidas com CNBr e Asp-N foram purificadas numa coluna de tipo ‘Zorbax Proetin Plus C3’ (4,6 x 250 mm, tamanho dos poros igual a 300 Á, MACMOD Analytical Inc., Chadsford, PA). Trabalhou-se com um gradiente variável entre acetonitrilo a 5% em ATF a 0,1% até acetonitrilo a 80% em ATF a 0,1% durante 2 horas, com um caudal de 1,0 mL/minuto. A eluição dos fragmentos foi monitorizada a 220 nm, utilizando para tal uma CLER de tipo ‘Beckman System Gold’. O compartimento de aquecimento da coluna foi mantido a 35°C e as fracções foram recolhidas manualmente, congeladas para -70°C c secas num concentrador de modelo ‘Speed Vac’. Os fragmentos foram então solu-bilizados em acetato de sódio 20 mM a pH 4,0/NaCl 0,5 M antes de serem utilizados.

Efectuou-se uma espectrometria de massa por ionização por electropulverízação num espectrómetro de massa de modelo ‘VG Bio-Q’, tendo este trabalho sido realizado pelo Dr. Francis Bitsch e pelo Sr. John Kim no laboratório do Dr. Cecric Shackleton na instituição “Children’s Hospital-Oakland Research Institute’. As massas moleculares foram obtidas por transformação matemática dos resultados.

Embora a sequência de ADN da proteína ΒΙΡτ^ codifique os resíduos aminoácidos 1-199 da proteína perfeitamente desenvolvida (madura), há uma porção significativa da proteína produzida que é truncada em Leu-193 e Vai-195, conforme determinado por espectrometria de massa por ionização por electropulverização (EM-EEP). Estes truncamentos no terminal C foram verificados isolando os péptidos tripsínicos do terminal C que foram sequenciados e analisados por EM-IEP. Há seis resíduos metionina, nas posições 56,70,100,111,170 e 196, e a clivagem química por acção do brometo de danogénio produziu seis fragmentos peptídicos principais, conforme previsto. Os resultados das experiências de clivagem com CNBr estão resumidos no quadro 4. Os fragmentos foram isolados por CLER de fase inversa (em C3) (figura 21a) e as suas sequências do terminal N foram determinadas pelo método de degradação de Edman. Os dois fiagmentos maiores (Cl e C5) não foram resolvidos pela coluna de CLER em C3 e foram infrutíferas as outras tentativas feitas para os resolver por cromatografia de permuta iónica, presumivelmente devido ao facto de serem semelhantes em comprimento e em ponto isoeléctrico. As identidades dos fragmentos Cl e C5 na mistura foram determinadas por EM-IEP. A massa prevista para Cl é de 6269 (quadro 4), tomando em consideração a perda de 30 u.a.m como resultado da conversão da metionina do terminal C em homosserina durante a reacção de clivagem com CNBr. A massa observada de 6251,51 + 0,34 é consistente com a perda de uma molécula de água (18 u.a.m.) no intermediário lactona da homosserina, que pode ser favorecido em relação à formação da homosserina deivdo à hidrofobicidade dos aminoácidos do terminal C do fragmento Cl. A massa prevista do fragmento C5 é de 6487 e a massa observada é de 6385,84 ± 0,39 (quadro 1). No caso do fragmento C5, os aminoácidos do terminal C são hidrofílicos, pelo que a hidrólise do intermediário lactona da homosserina é provavelmente favorecida. A partir dos resultados da sequenciação do terminal N e dos resultados do espectro de massa, o componente C5 representa aproximadamente 10%-25% do material na mistura C1/C5.

Foi efectuada uma clivagem proteolítica com a endoproteinase Asp-N para se obter outros fragmentos para as regiões contidas na mistura C1/C5 obtida com CNBr. Há seis resíduos de ácido aspártico na sequência da proteína BIPr23 nas posições 15,36,39,57,105 e 116. Os seis fragmentos principais obtidos com Asp-N e isolados por CLER em C3 (figura 21B) foram sequenciados e as suas massas foram determinadas por EM-IEP (quadro 4). Recorreu-se a uma digestão de curta duração para uma razão entre a enzimaisubstrato igual a 1:1000 (p/p) para se eliminar as clivagens potenciais não específicas, partícularmente no ácido glutâmico. É evidente que esta digestão não prosseguiu até ficar completa, na medida em que foi isolado um fragmento (1-38) em que os resíduos Asp (aminoácidos 15 e 35) não foram clivados. Os espectros de massa dos fragmentos obtidos com Asp-N foram consistentes com as massas previstas para cada um dos fragmentos individualizados. Ao contrário da clivagem com CNBr, em que o fragmento do terminal C foi exiguamente reduzido, o fragmento obtido com Asp-N a partir do aminoácido 116 até ao terminal C foi bem resolvido a partir de todos os outros fragmentos obtidos com Asp-N. QUADRO4 RESUMO DA ANÁLISE DOS FRAGMENTOS DA CU VAGEM DA PROTEÍNA BIPiv,

Fragmentos obtidos por clivagem com CNBr

MASSA MÁXIMO (PICO) SEQUÊNCIA D.I. medida prevista I 101-110 C4 (101-111) Não determinada 1169 Π 57-67 C2 (57-70) Não determinada 1651 m 71-99 C3 (71-100) Não determinada 3404 IV 171-194 C6 (171-196) Não determinada 2929 V 1-25, 112-124 Cl (1-56) 6251,51 ±0,34 6299 C5 (112-170) 6485,84 ±0,39 6403 Fragmentos proteolíticos obtidos com Aso-N MASSA MÁXIMO (PICO) SEQUÊNCIA D.I. medida prevista A 1-14 AI (1-14) 1465,5 1464 I 39-56 A3 (39-56) 2145,2 2145 Π 15-38 A2 (15-38) 2723,6 2724 m 57-76 A4 (57-104) 5442,5 5442 IV 1-38 AI A2 (1-38) 4171,4 4172 VI 116-134 A6a (116-193) 8800,3 8800 vn 116-128 A6b (116-195) 8997,1 8996

Exemplo 23 EFEITOS BACTERICDDAS DOS FRAGMENTOS PROTEOLÍTICOS BIP Efectuou-se uma pesquisa dos fragmentos proteolíticos BIP, obtidos em conformidade com o exemplo 22, para se pesquisar os seus efeitos bactericidas sobre a bactéria da estirpe J5 mutante irregular de E. coli num ensaio de difusão radial, essencialmente em conformidade com os procedimentos do exemplo 16. Não foi demonstrada a existência de nenhuma actividade bactericida para os fragmentos de proteína RTPr23 gerados por digestão com CNBr ou com Asp-N, quando testados até ao valor de 25 pmol/cavidade. Nesta experiência, a actividade bactericida mensurável detectada foi muito pequena, da ordem de 0,75 pmol de proteína BlPr^ por cavidade. A proteína BIPr23 reduzida e alquilada (até 100 pmol/cavidade) também não revelou ser bactericida, ao passo que a proteína BlPr^ alquilada conservou a actividade bactericida equivalente à da proteína ΒΙΡτ^.

Exemplo 24

LIGAÇÃO DA HEPARINA PELOS FRAGMENTOS PROTEOLÍTICOS BIP

Nesta experiência foram utilizados fragmentos proteolíticos de proteína BlPr^ e BIP, produzidos em conformidade com o exemplo 22, em ensaios de ligação da heparina, essencialmente em conformidade com os procedimentos do exemplo 1.

Avaliou-se a ligação à heparina, por parte dos fragmentos obtidos com CNBr, utilizando 100 pmol de cada fragmento por cavidade com uma concentração saturante de 3H--heparina (20 pg/mL). Os resultados obtidos estão ilustrados no quadro 5 (médias obtidas com cavidades em duplicado ± a variação entre os dois valores) e indicam que os fragmentos obtidos com CNBr, que contêm os aminoácidos 71-100 (C3) e 1-56 e 112-170 (Cl,5), se ligam à heparina com uma intensidade idêntica O fragmento dos aminoácidos 171-193, obtido com CNBr, tambcm se liga mais à heparina do que uma proteína de contraprova a taumatina ou uma proteína ou um fragmento de carga e peso molecular idênticos se liga à proteína ΒΙΡτ^.

Também se demonstrou que os fragmentos obtidos com a Asp-N possuem múltiplas regiões de ligação à heparina na proteína ΒΙΡγ^. Conforme se observa no quadro 5, o fragmento de aminoácidos 57-104, obtido com Asp-N, ligou-se à quantidade mais elevada de heparina, sendo seguido pelos fragmentos de aminoácidos 1-38 e 116-193. Estes dados, em combinação com os dados respeitantes ao fragmento obtido com CNBr, indicam que há pelo menos três regiões independentes de ligação à heparina na proteína BlPr^ estando a capacidade mais elevada situada entre os resíduos 71-100. 0UADR05 Lieacão à heoarina oor parte dos fragmentos de nroteína BIPrn Fragmentos Região Ligação de 3H-heparina (c.p.m.) Dieestão com CNBr Cl, C5 1-56, 112-170 82 918 ±4 462 C2 57-70 6 262 ± 182 C3 71-100 81 655 ±3 163 C4 101-111 4 686 ±4 C6 171-196 26 204 ± 844

Dieestão com Asd-N AI 1-38 17 002 ±479 A2 15-38 3 042 ± 162 A3 39-56 8 664 ± 128 A4 57-104 33 159 ± 1 095 A6a 116-193 13 419 ±309 ΒΙΡΓ23 1-193 51 222 ± 1 808 Taumatina 7 432 ± 83 Tampão de lavagem 6 366 ± 46

Exemplo 25 EFEITO DOS FRAGMENTOS PROTEOLÍTICOS BIP NUM ENSAIO COM LAL Foram utilizados fragmentos proteolíticos BIP, produzidos em conformidade com o exemplo 22, num ensaio de inibição do LAL, essencialmente conforme descrito no exemplo 15, estando os resultados obtidos ilustrados na figura 22 em que: o triângulo a cheio representa a proteína BlPr^; o circulo em branco representa o fragmento A3 obtido com Asp-N; o circulo a cheio representa o fragmento A2 obtido com Asp-N; o quadrado em branco representa o fragmento A3 obtido com Asp-N; o quadrado a cheio representa o fragmento A1A2 obtido com Asp-N; o triângulo em branco representa o fragmento A6b obtido com Asp-N; o triângulo pequeno em branco representa o fragmento C3 obtido com CNBr; e o quadrado pequeno a cheio representa o fragmento C1/C5 obtido com CNBr.

As fraeções obtidas por digestão com CNBr, que contêm os fragmentos de aminoácidos 1-56 e 112-170, inibiram a reacção do LAL induzida com os LPS, segundo um valor CI5o aproximadamente igual a 100 nM. O valor CI50 é aproximadamente 10 vezes superior ao valor CI50 observado com a proteína BlPr^ (9 nM) no mesmo ensaio. Os outros fragmentos obtidos por digestão com CNBr foram não inibitórios.

Foi observado um resultado ligeiramente diferente com os fragmentos gerados na digestão com Asp-N, em que se concluiu que os fragmentos eram inibitórios num ensaio com LAL. O fragmento correspondente aos aminoácidos 116-193 revelou uma actividade inibitória de LAL semelhante à da proteína BlPr^ intacta, com inibição completa da reacção de LAL induzida pelos LPS, para uma concentração 15 nM. Os fragmentos correspondentes aos aminoácidos 57-104 e 1-38 também foram inibitórios num ensaio de LAL, mas foram necessárias quantidades 10 vezes superires. Estes resultados, em combinação com os resultados da digestão com CNBr, indicam que há pelo menos três regiões da molécula 131¾ que têm capacidade para neutralizar a activação da reacção de TAL com os LPS, presumindo-se que a região mais potente esteja no interior do fragmento dos aminoácidos 116-193.

Em estudos congéneres sobre os fragmentos proteolíticos do exemplo 22, envolvendo protocolos de EISLE, utilizando um anticoipo anti-BIPra policlonal dc coelho, capaz de bloquear as propriedades bactericidas da molécula BIPr23 e de inibição do LAL, e utilizando também dois anticorpos monoclonais diferentes anti-BIPr23 de murganho, não bloqueantes, concluiu-se que o anticorpo policlonal era imunorreactivo com os fragmentos de aminoácidos 116-193 e 57-104 obtidos por digestão com Asp-N e também com os fragmentos de aminoácidos 1-56 e 112-170 obtidos por digestão com CNBr, ao passo que os anticorpos monoclonais dos murinos reagiram apenas com um fragmento obtido com Asp-N, representando os resíduos 1--14 da molécula BlPr^.

Acima de tudo, os resultados indicam que a proteína Bnfra contém três domínios funcionais que contribuem para a actividade biológica total da molécula. Presume-se que o primeiro domínio apareça na sequência de aminoácidos 17-45 e que seja destruído pela clivagem com Asp-N no resíduo 36. Este domínio é moderadamente activo tanto no ensaio de inibição da actividade de LAL induzida pelos LPS como no ensaio de ligação à heparina. Presume-se que o segundo domínio activo seja a região dos aminoácidos 56-99 e que a sua inibição da actividade de LAL induzida pelos LPS é diminuída por clivagem com CNBr no resíduo 70. Este domínio também revela a mais elevada capacidade de ligação à heparina e contém o péptido bactericida de resíduos 85-99. O terceiro domínio activo, entre os aminoácidos 142--169, é activo para inibir a estimulação dos LAL induzida pelos LPS e revela a mais baixa capacidade de ligação à heparina observada nas três regiões. Há outras proteínas bactericidas, por exemplo, as cecropinas e as magaininas, que são caracterizadas por uma região contínua, anfipátíca em hélice a, região essa que é necessária para que haja actividade. Foi observado um elevado grau de afinidade entre o motivo hidrofóbico catiónico das moléculas bactericidas de ligação aos LPS e as sequências de consenso das proteínas de ligação à heparina. Há uma correlação excelente entre os péptidos ΒΙΡτ^ sintéticos que se ligam à heparina e aqueles que inibem a reacção dos LAL induzida pelos LPS (r = 0,75, p = 0,0001, n = 47) (figuras 14 a 16). Estes dados sugerem que os LPS e a heparina podem apresentar, às proteínas com que interactuam, distribuições de carga semelhantes. Em consequência, outras proteínas, que se ligam avidamente aos LPS, também podem ligar-se fortemente à heparina. Há inúmeras modificações e variantes na prática da invenção que se presume que possam ocorrer aos especialistas na matéria, tendo em consideração as suas variantes presentemente preferidas. Em consequência, as únicas limitações a observar no âmbito da presente invenção são as que constam das reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: XOMA CORPORATION (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Utilizações terapêuticas de produtos de proteína bactericida indutora de permeabilidade” (ui) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Marshall, 0’Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) RUA: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) CIDADE: Chicago (D) ESTADO: Illinois (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 60606-6402 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Sharp, Jeffrey S. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 31 879 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: 31580

(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 312/474-6300 (B) TELEFAX: 312/474-0448 (C) TELEX: 25-3856 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1813 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 31.1491 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: mat_péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 124.1491 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: CAGGCCTTGA GGTTTTGGCA GCTCTGGAGG ATO AGA CM5 AAC AIG GOC AGG GGC 54

Met Aig Ghi Asn Met Ala Aig Gfi -31 -30 -25 OCT TOC AAC GGG COG AGA TOG GIG TOC CIG AIG GIG CIC GIC GOC ATA 102 Pro Cis Asn Ala Pro Aig Τφ Vai Ser Leu Met Vai Leu Vai Ala De -20 -15 -10 GGC AGC GOC GIG ACA GGG GOC GIC AAC OCT GGC GIC GIG GIC AGG ATO 150 G£ Thr Ala Vai Ur Ala Ala Vai Asn Pro GB Vai Vai Vai Aig De -5 1 5 TOC CAG AAG GGC CIG GAC TAC GOC AGC CAG CAG GGG ACG GOC GCT CIG 198 Sa- Gin Lis Gfi Lai Asp Tr Ala Sa- Gin Gin Gfi Thr Ala Ala Leu 10 15 20 25 CAG AAG GAG CIG AAG AGG ATO AAG An OCT GAC TAC TCA GAC AGC ITT 216 Gin Lis Glu Leu Lis Aig De Lis ile Pro Asp Tir Sa- Asp Ser Phe 30 35 40

\ AAG AIC AAG CAT CIT GGG AAG GGG CAT TAT AGC TIC TAC AGC AIG GAC 294 Lis Se Lis His Leu Qi Lis Qi His Tír Ser Phe Γη- Sff Met Asp 45 50 55 AIC CGT GAA TIC CAG CIT COC AGT ICC CAG ATA AGC AIG GIG GGC AAT 342 De Arg Gu Phe Qn Leu Pro Ser S<r Qn Se Sff Met Vd Pro Asn 60 65 70 GIG GGC crr AAG TFC ICC AIC AGC AAC GOC AAT AIC AAG AIC AGC GGG 390 Vd Gfi Leu Tis Phe Ser Se Ser Asn Ala Asn Se Lis Be Ser Qi 75 80 85 AAA TOG AAG GCA CAA AAG AGA TIC ΤΓΑ AAA AIG AGC GGC AAT TTT GAC 438 Jjs lip Lis Ala Qn lis Arg Phe Leu Lis Met Sff Qi Asn Phe Asp· 90 95 100 105 CIG AGC ATA GAA GGC AIG ICC ATT TOG GCT GAT CIG AAG CIG GGC AGT 486 • Leu Sff Se Qu Qi Met Ser Se Ser Ala Asp Leu Lis Leu Qi Sff 110 115 120 AAC COC ADG TCA GGC AAG COC ACC AIC ACC TOC TOC AGC TOC AGC AGC 534 Asn Pro Thr Ser Qi Lis Pro Thr Se Thr Os Ser Ser Os Ser Ser 125 130 135 CAC AIC AAC AGT GIC CAC GIG CAC AIC TCA AAG AGC AAA GIC GGG TOG 582 His Se Asn Ser Vd His Vd His Se Ser Lis Sff Lis Vd Qi Tip 140 145 150 CIG AIC CAA CIC TTC CAC AAA AAA ATT GAG TCT GGG CIT GGA AAC AAG 630 Leu Be Qn Leu Phe His lis Tis Se Qu Ser Ala Leu Arg Asn Lis 155 160 165 AIG AAC AGC CAG GIC TOC GAG AAA GIG ACC AAT TCT GTA TOC TOC AAG 678 Met Asn Ser Qn Vd Cis Ou Lis Vd Thr Asn Ser Vd Ser Ser Lis 170 175 180 185 • CIG CAA GCT TAT TTC CAG ACT CIG OCA GTA AIG ACC AAA ATA GAT TCT 726 Leu Gn Pro Tir Phe Qn Thr Leu Pio Vd Met Thr Lis Se Asp Sff 190 195 200 GIG GCT GGA AIC AAC TAT GGT CIG GIG GCA CCT OCA GCA ACC ADG GCT 774 Vd Ala Qi Se Asn Tir Qi Leu Vd Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala 205 210 215 GAG ACC CIG GAT GTA CAG AIG AAG GGG GAG ΊΤΓ TAC AGf GAG AAC CAC 822 Gu ΊΠτ Leu Asp Vd Qn Met Lis Qi Qu Phe Tir Sff Gki Asn His 220 225 230 CAC ΑΑΓ OCA CCT COC TTT GCT GCA OCA GIG AIG GAG TTT COC GCT GOC 870 Hs Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Vd Met Qu Phe Pio Ala AJa 235 240 245 CAT GAC OGC AIG GTA TAC CIG GGC CIC TCA GAC TAC TIC TIC AAC ACA 918 His Asp Aig Met Vd Tr Leu Qi Leu Ser Asp Tff Phe Phe Asn Thr 250 255 260 265 s" Í7 /VÍ 56 - GOC GGG CIT GEA TAC CAA GAG GCT GGG GIC TIG AAG AIG AOC CIT AGA 966 Ala d Leu Vai Ur Gb Gb Ala GE Vai Leu Lis Met Thr Leu Aig 270 275 280 GAT GAC AIG ATT OCA AAG GAG TOC AAA τη GGA CIG ACA ACC AAG TIC 1014 Asp Asp Met Be Pro Lis Gbi Sa Lis Phe Aig Leu Thr Thr Lis He 285 290 295 ΤΓΓ GGA AOC TIC CIA OCT GAG GIG GOC AAG AAG τη GOC AAC AIG AAG 1062 Phe ca Thr Phe Leu Pro Gb Vai Ala Lis Lis Phe Pro Asn Met Lis 300 305 310 AEA CAG AIC CAT GIC TCA GOC TOC AGC GOG OCA CAC CIG TOT GIG CAG 1110 Be Gin lie His Vai Ser Ala Ser Thr Pro Pro His Leu Ser Vai Gb 315 320 325 OCC ACC GOC CIT ACC TIC TAC OCT GOC GIG GAT GIC CAG GOC ΤΓΓ GOC 1158 Pro Ur GE Leu Thr Phe Tir Pro Ala Vai Asp Vai Gb Ala Phe Ala 330 335 340 345 GIC CTC GOC AAC ICC ICC CIG Gd TGC CTC TTC CIG ATT GGC ATO CAC 1206 Vai Leu Pro Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu He Leu Be Oi Met His 350 355 360 ACA ACT GGT ICC AIG GAG GIC AGC GOC GAG TOC AAC AGG CIT GTT GGA 1254 Thr Thr GE Ser Met Ou Vai Ser Ala Ou Ser Asn Aig Leu Vai d 365 370 375 GAG CTC AAG CTC GAT AGG CIG CTC CIG GAA CIG AAG CAC TCA AAT ATT 1302 Ou Leu Lis Leu Asp Arg Leu Leu Leu Gb Leu Lis His Ser Asn Be 380 385 390 GOC GOC TIC CGG GIT GAA TIG CIG CAG GAT AIC AIG AAC TAC ATT GEA 1350 GB Pro Phe Pro Vai Gb Leu Leu Gn Asp Be Met Asn Tir Be Vai 395 400 405 GOC ATT CIT GIG CIG GOC AGG GIT AAC GAG AAA CTA CAG AAA GOC TIC 1398 Pio He Leu Vai Leu Pro Aig Vai Asn Gb Lis Leu Gb Lis d Phe 410 415 420 425 OCT CTC G0G AOG OOG GOC AGA GIC CAG CTC TAC AAC GEA GIG CIT CAG 1446 Pro Leu Pro Thr Pro Ala Aig Vai Gh Leu Tr Asn Vai Vai Leu Gb 430 435 440 OCT CAC CAG AAC TIC CIG CIG TIC GGT OCA GAC GIT GIC TAT AAA 1491 Pro His Gin Asn He Leu Leu He GE Ala Asp Vai Vai Tr Lis 445 450 455 TGAAGGCACC AGGGGTGCCG GGGGCTGTCA GCCGCACCTG TTCCTGATGG GCTGTGGGGC 1551 ACCGGCTGCC TTTCCCCAGG GAATCCTCTC CAGATCTTAA CCAAGAGCCC CTTGCAAACT 1611 TCTTCGACTC AGATTCAGAA ATGATCTAAA CACGAGGAAA CATTATTCAT TGGAAAAGTG 1671 CATGGTGTGT ATTTTAGGGA TTATGAGCTT CTTTCAAGGG CTAAGGCTGC AGAGATATTT 1731 CCTCCAGGAA TCGTGTTTCA ATTGTAACCA AGAAATTTCC ATTTGTGCTT CATGAAAAAA 1791 AACTTCTGGT TTTTTTCATG TG 1813

57 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 487 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Aig Ou Asn Met Ala Atg Gfi Pro Os Asn Ala Pro Arg Trp Vai -31 -30 -25 -20 Ser Leu Met Vai Leu Vai Ala Be Gfi Thr Ala Vial Thr Ala Ala Vai -15 -10 -5 1 Asn Pro Gfi Vai Vai Vai Arg Be Sa On Lis Gfi Leu Asp Tír Ala 5 10 15 Ser Gin Qn Oi Thr Ala Ala Leu Gin Tis Glu Leu Lis Arg Be Lis 20 25 30 Ue Pro Asp Tír Ser Asp Ser Phe Lis Be Lis Hs Leu Gfi Lis Gfi 35 40 45 Hs Tír Ser Phe Tír Ser Met Asp Be Arg Glu Phe Gin Leu Pro Sa 50 55 60 65 Ser GSn Be Ser Met Vai Pro Asn Vai Gfi Leu Lis Phe Sa Be Sa 70 75 80 Asn Ala Asn Be Lis Be Sa Gfi Lis Tip Lis Ala On Lis Aig Phe 85 90 95 Leu Lis Met Ser ca Asn Phe Asp Leu Sa Be Gki Gfi Met Sa Be 100 105 110 Ser Ala Asp Leu Tis Leu ca Sa Asn Pro Thr Sa Gfi Lis Pro Thr 115 120 125 De Thr Os Ser Ser Os Sa Sa Hs Be Asn Sa Vai Hs Vai Hs 130 135 140 145 Be Ser Lis Ser Lis Vai Gfi Trp Leu Be Gin Leu He Hs Lis Tis 150 155 160 Be <3u Ser Ala Leu Aig Asn Lis Met Asn Sa Gin Vai Cis Glu Lis 165 170 175 Vai Thr Asn Ser Vai Ser Sa- Lis Leu Gb Pro Tír Phe Gin Thr Leu 180 185 190 58

Pro Vd 195 Met Thr Vai 210 Ala Pro Pro GE GEj Phe Ttr Pro Vd Met Glu 245 Leu Ser Asp 260 Tir GE Vd 275 Leu Lis Lis 290 Phe Aig Leu Ala Lis Lis Phe Thr Pro Pro Mis 325 Ala Vd Asp 340 Vd Ser Leu 355 Phe Leu Ala 370 GEi Ser Asn Leu GEi Leu Lis Gin Asp De Met 405 Asn Gtu Lis 420 Leu Gin Leu 435 lír Asn GE 450 Ala Asp Vd

Lisboa, lis De Asp 200 Ser Ala Thr 215 Thr Ala Ser 230 Glu Asn Hs Phe Pro Ala Ala Phe Phe Asn Thr 265 Met Thr Leu 280 Aig Thr Thr 295 Tis Phe Pro 310 Asn Met Us Leu Ser Vd Gin Gfn Ala Phe Ala 345 De GE Met 360 Hs Aig Leu 375 Vd GE Hs 390 Sa· Asn De Asn Tir De Vd G3n Tis Gi lhe 425 Vd Vd Leu 440 Gin Vd Tw 455 Lis

Vd Ala GE De 205 Glu Thr Leu 220 Asp Hs Asn 235 Pro Pro Hs 250 Asp Aig Met Ala GE Leu Vd Asp Asp Met De 285 Ηκ GE Thr 300 Phe De Gin 315 De Hs Pro 330 Thr GE Leu Vd Leu Pro Asn Thr Thr GE Ser 365 Glu Leu Lis 380 Leu GE Pro 395 Phe Pro Pro 410 De Leu Vd Pro Leu Pro Thr Pro Hs Gin Asn 445

Asn Tir GE Leu Vd Qn Met Lis 225 Pro Phe Ala 240 Pro Vd Tir 255 Leu GE Tir 270 Gin Glu Ala Pro Lis Glu Ser Leu Pro Glu Vd 305 Vd Ser Ala 320 Ser Thr Phe 335 Tir Pro Ser 350 Ser Leu Ala Met Glu Vd Ser Asp Aig Leu Leu 385 Vd Glu Leu 400 Leu Leu Pro 415 Aig Vd Pro 430 Ala Aig Vd lhe Leu Leu Phe 14 de Setembro de 2001

O Agafst® Oficial da Propriedade industriai

JOSE DE SAMPAIO A.O.P.Í. Kua do Snlítri?, 195, r/c-Drt. 1169-063 LISBOA

Claims (13)

1. y'óf Reivindicações 1. Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para se ligar à heparina terapeu-ticamente administrada a um paciente.

   Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para neutralizar o efeito anti-coagulante da heparina.
2. 3. Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para inibir a angiogénese.

   Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para inibir a angiogénese associada à retinopatia ocular.
3. 5. Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para inibir a proliferação das células endoteliais. Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para tratar a endometnose mediante a inibição da proliferação das células endoteliais. 6.
4. 7. Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para inibir a proliferação de células de tumores malignos.
5. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o tumor maligno é o sarcoma de Kaposi.
6. 9. Utilização de um produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento de ligação à heparina para tratar uma doença inflamatória crónica.
7. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a doença inflamatória crónica é a artrite.
8. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a doença inflamatória artrítica é a artrite reumatóide.
9. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a doença inflamatória artrítica é a artrite reactíva
10. 13. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o produto proteínico é um fragmento biologicamente activo da proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP). 3
11. 14. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, em que o produto proteínico é um análogo biologicamente activo da proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP).
12. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o análogo da proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) é um fragmento de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) em que um resíduo cisterna na posição 132 é substituído por um aminoácido diferente.
13. 16. Método realizado in vitro para neutralizar o efeito anticoagulante da heparina numa amostra de um fluído, o qual consiste em fazer contactar a referida amostra com uma quantidade eficaz de produto de proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) de ligação à heparina. Lisboa, 14 de Setembro de 2001

    JOSÉ DE SAMPAIO Λ.Ο.Ρ.Ϊ. Rua do Salitro, 195, r/e-Ort, 1269-063 LISBOA