JPH08509983A - 抗金属キレート抗体の分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗金属キレート抗体を含有する調製物をカルボン酸誘導体化固体支持体にアプライし、そして非特異的タンパク質を溶出するには十分であるが抗金属キレート抗体を溶出するには十分でない塩濃度を含有する溶出緩衝液で先ず溶出し、その後抗金属キレート抗体を溶出するように溶出溶液の塩濃度を高めることによって、抗体を含む非特異的タンパク質から抗金属キレート抗体を分離する方法を提供する。１つの実施態様では、カルボン酸誘導体化固体支持体はカルボキシメチル樹脂である。適当な塩にはリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び硫酸ナトリウムか含まれる。この方法を使用して、モノクローナル又はポリクローナル抗金属キレート抗体を非特異的タンパク質から分離すること並びに二抗原特異抗金属キレート抗体をモノクローナル抗金属キレート抗体及び他の非特異的タンパク質から分離することができる。この方法はまた抗原反応性領域を有する抗金属キレート抗体フラグメントを非特異的タンパク質から分離するのにも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 抗金属キレート抗体の分離 発明の背景 本発明は抗体の分離方法に関するものであり、そして更に詳細には抗金属キレ ート抗体を他の抗体やタンパク質から分離する方法に関するものである。 過去25年間に免疫学分野の革命が行われてきた。1970年代には、抗体、即ち免 疫系を使用して異種として認識される物質を認識し、結合しそして究極的には排 除するタンパク質の単一種を多量に産生する方法が開発された。広範囲の潜在的 な抗原に特異的に結合するために、個体が有する約10⁵から10⁸個の各リンパ球系 は種々の異種物質又は抗原に対して特異性を有する種々の抗体を産生する。単一 の抗体産生リンパ球を癌細胞のような固定化された細胞と融合させることによっ て単一のリンパ球クローンを作ることが現在可能であり、その際各細胞は同一の モノクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ の開発は広範囲の一連の疾病の診断と治療の両方の可能性に対して非常に大きな 影響を有している。 抗体は、「Ｙ」の形状に配列されたＨ及びＬペプチド鎖の２つの同一対を含ん でいる。各腕は、イオン的相互作用、水素結合及びファンデルワールス力を含む 種々の非共有結合的相互作用によって抗原に結合する部位を有しており、これら の相互作用が抗体とその同族抗原間に親和性を生じさせる。この抗原−抗体結合 部位は、抗体の所謂可変領域に相当する抗原反応性領域内に包含されている。天 然の抗体では、両抗原反応性結合領域は同一である。２つの異なる可変領域を示 す「二抗原特異抗体」が産生されている。これらの二抗原特異抗体は化学的にか 又は抗体タンパク質をコードする２つの異なる遺伝子組を同時に発現する操作さ れた細胞によって産生することができる。それ故、これらの遺伝子産生物は、同 一の抗原結合部位を示す２つを含有する抗体遺伝子産生物（「一抗原特異抗体」 ）と異なる抗原結合部位を示すものの種々の組合せを示す種々の抗体種になる。 二抗原特異抗体は１より多い抗原との同時結合を可能にする点で非常に大きな 有用性を有している。この使用例としては、腫瘍細胞の表面に発現される抗原に 特異的な１つの腕と画像化又は治療部分に特異的な１つの腕を有する二抗原特異 抗体を効果的に使用して、このような部分を腫瘍部位に対して標的化することが できる。このような治療及び診断目的で使用される部分には金属キレート中の金 属がある。金属キレートに結合親和性を有する抗体は「抗金属キレート抗体」と 呼称される。 抗体技術に関する最近の発展によって、タンパク質や他の夾雑物から抗体を精 製する方法及び特定の抗体種を他の抗体から単離する方法の需要が生じている。 慣用的には、抗体を分離するために２つの方法：イオン交換クロマトグラフィー 及びアフィニティークロマトグラフィーが使用されてきた。イオン交換クロマト グラフィーは、荷電官能基が共有結合している固体支持体を使用する。これらの 荷電基と種々のタンパク質表面の利用可能な電荷とのイオン性相互作用がタンパ ク質の多くのタイプ又はファミリーを分離する手段を提供する。表面が負に荷電 しているタンパク質は正荷電官能基を有する陰イオン交換体に結合し易く、一方 表面が主として正電荷をさらしているタンパク質は陽イオン交換体に結合し易い 。これらのタンパク質の結合はｐＨ、塩組成及び濃度によって影響を受け、そし てこれらのパラメータを使用して抗体を１つのファミリーとして他のタイプのタ ンパク質から単離することができる。イオン交換クロマトグラフィーは或る種の 適用では完全に有用であることが証明されているが、物理的特性は類似している が抗原結合のような機能特性が異なる抗体は通常区別されないという重大な限界 を有している。 更に特異的な精製は、単離すべき抗体の同族抗原又はハプテンが結合している 樹脂を含有するアフィニティーカラムを使用して達成することができる。ハプテ ンは、担体に結合したとき抗原性である小さい分子である。抗体調製物は、カラ ムに結合しそしてカラムに保持されている抗原に特異的な抗体と共にカラムを通 過させる。抗原−抗体結合が強いため、抗体を溶出するためには同族物含有溶液 が必要である。例えば、米国特許第5,112,951号明細書に開示されているように 、抗金属キレート抗体は、ハプテンの不存在下で、非特異的抗体と比較したとき 、スルホプロピルカラムで保持時間の延長を示す。更に、ネズミ抗体はそれらの キメラ誘導体よりはるかにひくいｐＩを有しているという事実にも拘わらす、保 持 時間はネズミ抗体とそれらのキメラ誘導体で類似している。しかし乍ら、ハプテ ン類似体、１mＭのＣｏ/ＥＤＴＡの存在下での抗金属キレート抗体の保持時間は 、非特異的抗体では僅かな変化にすぎないのに比べて劇的に低下した。抗金属キ レート抗体のこのより長い保持時間と金属キレートハプテンの存在下での保持時 間の低下は、これらの抗体とオキソ酸樹脂の結合が抗原反応性結合領域での相互 作用であることを反映していることを示している。 同様な物理的特性を有する抗体を分離する潜在能力にも拘わらす、アフィニテ ィー精製は或る重大な欠点を有している。例えば、アフィニティー精製は抗体を 溶出する抗原又は類似ハプテンからの抗体の分離が困難であるか又は不可能であ ることがある。加えて、同族体及び同族樹脂は入手不可能であるか又は高価であ る。更に一層重要なことは、極端なｐＨ又はカオトロピック剤の存在下のような 苛酷な溶出条件によって抗体が変性する可能性があることである。 かくして、非特異的抗体又はタンパク質から抗金属キレート抗体を特異的に単 離するために安価で且つ効果的でありそしてその過程でこれらの変性を生じさせ ない方法の需要が存在する。好ましくは、このような方法は抗金属キレート抗体 並びにモノクローナル抗体及びそれらの二抗原特異誘導体に富むポリクローナル フラクションの単離に有効でなければならない。本発明はこれらの需要を充足す るものでありそして関連する利点も提供する。 発明の概要 本発明は、抗金属キレート抗体を含有する調製物をカルボン酸誘導体化固体支 持体にアプライし、そして非特異的タンパク質を溶出するには十分であるが抗金 属キレート抗体を溶出するには十分でない塩濃度を有するｐＨ７．５以下の溶出 緩衝液で先ず溶出し、その後抗金属キレート抗体を溶出するように溶出溶液の塩 濃度を高めることによって、抗体を含む非特異的タンパク質から抗金属キレート 抗体を分離する方法を提供する。１つの実施態様では、カルボン酸誘導体化固体 支持体はカルボキシメチル樹脂である。適当な塩にはリン酸ナトリウム、塩化ナ トリウム、硫酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムが含まれる。或いは、抗金属キレ ート抗体は、抗金属キレート抗体に対する親和性が同族ハプテンより低い第２の 非同族カルボン酸を含有する溶液を用いて選択的に溶出することかできる。 この方法を使用して、モノクローナル又はポリクローナル抗金属キレート抗体 を非特異的タンパク質から分離すること並びに二抗原特異抗金属キレート抗体を モノクローナル抗金属キレート抗体及び他の非特異的タンパク質から、溶出した 抗体を沈澱させることなく分離することができる。この方法はまた抗原反応性領 域を有する抗金属キレート抗体フラグメントを非特異的タンパク質から分離する のにも有用である。 図面の簡単な説明 図１は、金属キレート、インジウム−ベンジルＥＤＴＡに対して産生させた抗 体と一連の非同族カルボン酸との反応性を示す図である。 図２は時間に対する280nmでの紫外線吸光度の図であり、実施例Ｉに記載した スルホプロピル誘導体化カラムで溶出剤塩としてリン酸ナトリウムを使用してク ロマトグラフにかけた二抗原特異抗金属キレート抗体（ＢｘＢＦＡ）の溶出スキ ャンを示している。 図３は時間に対する280nmでの紫外線吸光度の図であり、実施例IIに記載した カルボキシメチル誘導体化カラムで溶出剤塩としてリン酸ナトリウムを使用して クロマトグラフにかけた二抗原特異抗金属キレート抗体（ＢｘＢＦＡ）の溶出ス キャンを示している。 図４は時間に対する280nmでの紫外線吸光度の図であり、実施例IIIに記載した カルボキシメチル誘導体化カラムで溶出剤塩としてリン酸ナトリウムを使用して クロマトグラフにかけた二抗原特異抗金属キレート抗体（ＥＣＡ 001）の溶出ス キャンを示している。 図５は時間に対する280nmでの紫外線吸光度の図であり、実施例IVに記載した イミノジ酢酸誘導体化カラムで溶出剤塩としてリン酸ナトリウムを使用してクロ マトグラフにかけた二抗原特異抗金属キレート抗体（ＢｘＢＦＡ）の溶出スキャ ンを示している。 図６ａ及び６ｂは時間に対する280nmでの紫外線吸光度の図であり、実施例Ｖ に記載したイミノジ酢酸誘導体化カラムで溶出剤としてグルタミン酸及び／又は グ リシンを使用してクロマトグラフにかけた二抗原特異抗金属キレート抗体（Ｂｘ ＢＦＡ）の溶出スキャンを示している。 図７は時間に対する280nmでの紫外線吸光度の図であり、実施例VIに記載した イミノジ酢酸誘導体化カラムで溶出剤塩として硫酸ナトリウムを使用してクロマ トグラフにかけた二抗原特異抗金属キレート抗体（ＥＣＡ 001）の溶出スキャン を示している。 図８は時間に対する280nmでの紫外線吸光度の図であり、実施例VIIに記載した グルタミン酸誘導体化カラムで溶出剤塩としてリン酸ナトリウムを使用してクロ マトグラフにかけた二抗原特異抗金属キレート抗体（ＢｘＢＦＡ）の溶出スキャ ンを示している。 発明の詳細な説明 本発明は、ハプテンキレートが、他の非特異的抗体を含み得る、非特異的タン パク質由来のカルボン酸または酸誘導体である、抗金属キレートを分離する有効 な方法を提供する。本方法は、同族ハプテンキレートとの、少なくとも、若干の 構造類似性を有するが、抗原反応領域への親和性が減退している、非同族抗原の カルボン酸部分に結合する抗金属キレート抗体の、他の非特異的抗体及びタンパ ク質からそれらを区別できる予想外の能力を利用する。抗原及びハプテン、ある いは、誘導体や断片のようなそれらの類似体は、アフィニティーカラムの固相で 使用されているが、本方法は、抗原結合部位を介する抗金属キレート抗体と非同 族ハプテン又は類似体との結合を基礎としている。さらに、塩濃度上昇が抗金属 キレート抗体を溶出するのに十分であるというのが、本発明の長所である。本発 明の他の長所は、上昇した塩濃度のpHを6.5以上にすることができることである 。あるいは、抗金属キレート抗体を、同族ハプテンよりも抗金属キレート抗体へ の親和性が低いモノ、ジ、トリカルボン酸（例、In-ベンジル-EDTA）で選択的に 溶出できる。さらに、従来の親和性精製法に共通する過酷な、あるいは、変性を 起こす溶出条件は必要でない。 本発明は、結合が抗原反応領域との、すなわち、抗原結合部位又はその近くで のものであることを表す免疫特異性を反映する形で、負に荷電した多酸素共鳴構 造（multi-oxygen resonance structure）に結合するという抗金属キレート抗体 の 予想外の能力を前提にしている。特に、カルボン酸及びその誘導体のようなオキ ソ酸ハプテンキレートに対して産生された抗金属キレート抗体は、抗体の抗原反 応領域との結合に協力する状態にある１つ又は２つのカルボン酸官能性を持つ非 同族ハプテンカルボン酸に対する引力を有する。例えば、非インジウム金属を持 つEDTAを含む非同族ハプテンや、図１で示すように、酢酸、イミドジ酢酸、ベン ジルEDTAなどの同族体よりも、金属ベンジル−EDTAに対して産生される抗体の結 合部位への親和性の方が低い非同族カルボン酸、並びに、グリシンあるいはクエ ン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸のような他の酸である。 このような非同族カルボン酸は、固体支持体に付着（結合）させ、カルボン酸 誘導固体支持体を形成できる。クロマトグラフィー法で固相としてこのような非 同族カルホン酸固体支持体を使用すれば、モノクローナル抗金属キレート抗体を 非特異的タンパク質から分離でき、同様に、ポリクローナル抗金属キレート抗体 に富むフラクションを抗血清から得ることができる。 本発明は、非特異的タンパク質からモノクローナル及びポリクローナル抗金属 キレート抗体を区別する他に、ポリドーマの培養液中に共に認められるような、 一抗原特異抗金属キレート抗体からの二抗原特異抗金属キレートの分離を可能に する。この培養液中の各種抗体は、塩濃度を増加させるグラジェントで溶出する と、別々の保持時間を示す。活性二抗原特異抗金属キレート抗体は、活性一抗原 特異抗金属キレート抗体よりも低い塩濃度で、非同族カルボン酸誘導体化固相支 持体から溶出する。この分離は、単一の抗金属キレート結合部位を持つ二抗原特 異抗体（一価）と、２つの抗原結合部位を持つ一抗原特異抗金属キレート抗体（ 二価）の間の結合力の差を反映するものである。従って、二抗原特異抗金属キレ ート抗体は、U.S特許No.5,112,951に開示されるように、他の望ましくない種か ら有効に分離できる。 ここで使用する、「抗金属キレート抗体」という用語は、少なくとも１つの金 属キレート又はハプテンキレートがベンジル−EDTAのようなカルボン酸のキレー ト類似体に対する高い親和性を示す可変領域を有する、キメラ（Chimeric）、CD Rグラフト（CDR-grafted）、ヒト化（humanized）抗体のような技術上周知の抗 体と抗体構成物を指す。一般に、抗金属キレート抗体の親和性は、約10⁶L/M以上 、 好ましくは10⁷L/M以上、最も好ましくは10⁸L/M以上である。しかし、もちろん、 特殊な抗金属キレート抗体は、異なる金属キレートに対して異なる親和性を示す ことになる。ハプテンがカルボン酸か酸誘導体である金属キレートハプテンに対 してこのような親和性を示さない抗体は、「非特異的抗体」と呼ぶ。非特異的抗 体は、非抗体タンパク質と合わせて、「非特異的タンパク質」と称する。抗金属 キレート抗体の説明については、U.S特許No.4,722,892とReardanら、Nature、31 6:265-268（1985）を参照されたい。金属キレートには、ここで「同族酸（cogna te acid）」キレート剤と称するEDTA、DTPA、DOTAを含むが、これらに限定しな いポリカルボキシレートキレート剤と錯体化した放射性同位元素を含めて、（II ）又は（III）酸化状態の金属イオンがある。このような金属の一覧については 、Reardan（上出）を参照されたい。キレート剤の考察については、U.S.特許No. 4,678,667を参照されたい。 本発明の方法は、非特異的抗体とその断片を含む非特異的タンパク質からの抗 原反応領域を含有する抗金属キレート抗体断片の分離にも適する。ここで使用す る、抗金属キレート抗体という用語は、抗原反応領域を有する断片（フラグメン ント）を含む（Fab、F（ab’）₂、Fab’などのFab断片）。 本発明の方法は、抗金属キレート抗体の精製に常用されるアフィニティークロ マトグラフィーに優るいくつかの長所を持つ。指摘したように、本法は、非特異 的抗体から抗金属キレート抗体を分離できるだけでなく、価数によって、カルボ ン酸誘導体化固相支持体に対して異なる結合力を持つ抗体の区別もできる。さら に、カルボン酸誘導体化固相支持体、緩衝液、塩が金属キレート樹脂や金属キレ ートハプテンよりも安価で、容易に入手できるので、費用的にも有効である。ま た、カラムを容易に消毒、発熱物質除去でき、蓄積タンパク質を除去し、0.2N水 酸化ナトリウム処理などによって再生できる。 抗金属キレートモノクローナル抗体は、組織培養上清に共通して認められる他 のタンパク質の場合よりも、このような非同族カルボン酸誘導体化固相支持体に はるかに多く結合し、予想外のことだが、pIが高めの非特異的モノクローナル抗 体よりもはるかに強く結合する。個々のタンパク質あるいは抗体のpIすなわち「 等電点」は、基本的にアミノ酸組成によって決定し、そのタンパク質の正味の 荷電がゼロの場合のpHと定義する。タンパク質は、その等電点以上では、正味の 負の荷電を持ち、等電点以下では、正の荷電を持つ。どの一定pHでも、pIが高め のタンパク質は、より正に荷電し、あるいは、逆に、pIが低めのタンパク質より も負に荷電しにくいと思われる。特に、抗体のように、構造と物理的特徴が類似 したタンパク質の間では、高めのpIは、カルボン酸誘導体化固相支持体上で、負 に荷電した官能基との、より強い相互作用が予想できる。しかも、同一の定常領 域を持つように遺伝子工学で処理した抗体の間でさえ、抗金属キレートカルボン 酸は、高めのpIを持つ非金属キレート特異性抗体よりも、非同族カルボン酸誘導 体化固相支持体上で長く保持される。その上、高めのpHでは、同じ抗体は、正荷 電が低く、カルボン酸誘導固体支持体上での負荷電官能基による保持がそれほど 確実でなくなる。これにもかかわらず、pH7.5以下で、非同族カルボン酸支持体 を使って、金属キレート抗体の分離を実施できることが発見されている。 非同族誘導固体支持体上での抗金属キレート抗体のこの挙動が免疫特異性結合 を表すという指摘として、U.S.特許No.5,112,951は、同一の抗原反応結合領域配 列を持つが、異なる定常領域及びpIを持つ抗金属キレート抗体が、それらの由来 するキメラ抗体や先天的マウス抗体の場合のように、非同族オキソ酸誘導固体支 持体上で同じ長い保持時間を示す、と開示している。これらの予想外の観察は、 この場合、pIが金属キレート特異性を持つ抗体の一次挙動の説明になることを指 摘するものである。非常に決定的なこととして、液相での金属キレートハプテン の存在は、非特異的抗体の保持時間に匹敵すべく、その保持時間を短縮すること によって、非同族誘導体化固相への抗金属キレート抗体の予想外に強い結合を効 果的に抑える。これらの競合する液相金属キレートハプテンのサイズが小さいこ とを考慮すると、抗金属キレート抗体のこの予想外の結合挙動の原因となる相互 作用部位は、これら抗金属キレート抗体の抗原結合部位に近いか、同一であるに 違いない。 金属キレートハプテンの存在下での予想外に強い非同族オキソ酸結合反応とそ の除去は、陽イオン交換クロマトグラフィーの正常なメカニズムと異なるメカニ ズムによって、抗金属キレート抗体が非同族カルボン酸誘導固体支持体に結合し 、この新しい相互作用メカニズムがこれらの抗体の免疫特異性に関連することを 表 している。さらに、この予想外の挙動は、抗金属抗体に由来する二抗原特異抗体 にまで及ぶ。このような二抗原特異抗体は、単一の金属キレート結合部位しか持 たず、また、それらが由来する、２つの金属キレートハプテン結合部位を持つ一 抗原特異抗金属キレート抗体よりも、非同族カルボン酸誘導カラム上で、計測で きるほどにはあまり保持されないことの説明になるのが、この一価ということで ある。 抗金属キレート抗体と非同族カルボン酸誘導固体支持体の相互作用は、免疫学 的に特異な結合に特徴的な挙動を示し、抗原特異性結合部位での、あるいは、そ の近くでの相互作用を反映する。しかし、それらの溶出に塩濃度の増加のみが必 要であるという事実は、これらの抗体が非同族カルボン酸誘導体化固相支持体に 対して持つ親和性が、それらの金属キレートに対する親和性に比較して低いこと を指摘している。固体支持体上の非同族カルボン酸基は、一部の金属キレートハ プテンの三次元空間の立体配置か荷電密度パターンが似ており、それによって、 たとえ金属キレート自体に対する親和性よりも低くとも、マトリックスへの抗体 の親和性の原因になり得る、と考えられる。非同族カルボン酸誘導固体支持体は 、金属キレートハプテンのように負の荷電の酸素原子を持たないので、このよう な立体配置の類似性は、もっともらしい。この特徴は、他の負に荷電した多酸素 共鳴構造も、本発明の方法で使用するのに適した誘導体であることを表している 。この相互作用の基礎がなんであっても、非同族カルボン酸誘導カラム上での抗 金属キレート抗体の挙動は、抗金属キレート抗体の抗原反応性を反映する相互作 用として最も的確に説明することができる。図１に示すように、非同族酸の構造 は、金属キレート、ベンジルEDTAの中の酸の構造への類似性が増加するので、金 属キレート、インジウム−ベンジルEDTAに対して生じた抗体の一連の非同族カル ボン酸との反応性が増加する。 各種の候補となる非同族酸に対する対象となる抗体の相対的親和性を、固体支 持体カラムからの溶出と技術上周知の方法を使って経験的に測定できる点が注目 される。これらの方法を、本明細書の実施例でさらに詳細に示す。当業者は、候 補となる非同族酸が、候補となる化学構造の同族ハプテンのそれとの類似度を比 較する簡単な検査によっても選択できることを認めるであろう。一般原則として 、 最高の同族ハプテンへの構造類似度を持つ非同族酸は、同族金属キレートのそれ により近い抗金属キレート抗体に対する親和性と持つようになることが予想され る。 各種の抗金属キレート抗体は、周知又は利用可能である。実施例は、CHA255と CHB235で、これらは、インジウムEDTA錯体に対する特別な親和性を有するマウス 由来のモノクローナル抗体である。U.S.特許No.4,722,892を参照されたい。本明 細書で言及する抗金属キレート抗体と非特異的抗体をその特徴と共に表Ｉに挙げ る。 モノクローナル、ポリクローナルの両抗金属キレート抗体は、当業者に周知の 方法によって作製できる。例えば、抗原は、溶液中の担体にキレート剤を結合さ せることによって調製できる。次に、生じた溶液をクエン酸インジウムなどの金 属塩と混合し、透析する。あるいは、透析の代わりにゲル濾過を使用できる。付 着キレート量は、吸光度から、あるいは、放射能滴定によって測定できる。抗金 属キレート抗体を生じるハイブリドーマ細胞は、技術上周知の方法によって調製 できる。例えば、Antibodies，a Laboratory Manual,（Harlow & Lane，eds.）C old Spring Harbor，New York（1988）を参照されたい。 CHA255とCHB235の調製で、例えば、インジウム-EDTA抗原を調製した。Keyhole limpetヘモシアニン（9.3mg）は、水溶液265μL中、pH 6.Oで、（L）-SCN-C₆H_{4 -} CH₂ -EDTA（イソシアネ-トベンジル-EDTA；ITCBE）と、36℃で８時間反応させ た。生じた溶液を0.1 Mクエン酸インジウム90μLと混合し、１mM EDTA、0.15 M NaClに対して透析した。310 nmのチオウレア基の吸光度から、タンパク質１mg当 たり約0.1 mgの付着キレートがあると決定された。 上述の抗原で免疫、増殖させたBALB/cマウスの脾臓細胞を、Gerhard，Monoclo nal Antibodies，（Kennettら，eds.）Plenum Press New York（1980）の技術を 使って、P3.653骨髄腫細胞系の変異体と融合させた。生じたハイブリドーマは、 Wangら、J．Immunol.Meth.,18:157（1977）に従い、固相第二抗体ラジオイムノ アッセイを使って、そのIn（III）アミノベンジル-EDTA結合能についてスクリー ニングした。未標識抗原による結合阻害で測定したように、高力価で、比較的高 い親和性の抗体を示すそれらのハイブリドーマを選択し、腹水生成のため、BALB /cマウスに腹腔内注入した。マウス抗体の場合、Parhamら,J.Immunol.Meth.,53: 133（1982）が述べたように、DEAE-セルロース上でのイオン交換クロマトグラフ ィーによって、マウスの腹水からモノクローナル抗金属キレート抗体を精製した 。 キレートに対する抗体の結合定数は、Eisen，Meth.Med.Res．10:106（1964） の方法によって測定した。簡単に説明すると、抗体と金属キレートを、pH 7の0. 05M 2-ハイドロエチル-ピペラジン-エタンスルフォネート（HEPES）、0.1 M NaC l、0.1%ウシ血清アルブミン中、37℃で24時間、ほぼ平衡に達するまで透析した 。透析バッグ内の抗体結合部位の濃度は、10^-7Mで、遊離のIn（III）-（L）-ア ミノベン ジルEDTA錯体の濃度は、同一範囲内であった。CHA255とCHB235は、それぞれ、In （III）EDTA錯体に対して、10⁹L/Mと10⁸L/M程度の親和性（結合定数）を持つ。 例えば、マウス由来の可変領域とヒト由来の定常領域を発現するキメラ抗金属 金属キレート抗体を生成できる。例えば、マウス由来のCDR可変領域とヒト由来 のフレームワーク領域及び定常領域を発現するCDRグラフト抗金属キレート抗体 を生成できる。このようなキメラ又はCDRグラフト抗体を調製するために、可変 領域と定常領域のDNA配列をゲノムDNAから入手できる。ゲノムDNAは、Basic Met hods in Molecular Biology,（L.G.Davis，M.D．Dibner and J.F.Battey，eds） ，Elsevier，New York(1986)；Feder,J.，etal.,Am.J.Hum.Genetics，37:635-64 9(1985)；Steffer，D．and Weinberg，R.A.,Cell 15:61003-1010(1978)；Beidl er，et al.，J.Immunol.，141:4053-4060（1988）に記述されるような様々な従 来の技術によって、調製、クローン化できる。例えば、所望の可変軽鎖及び重鎖 領域をコードするDNA配列は、望みの抗金属キレート抗体を発現するマウスハイ ブリドーマの細胞DNAから入手できるが、定常領域をコードするDNA配列は、ヒト リンパ球、望ましくは、ヒト末梢血リンパ球に由来するものがよい。細胞DNAは 、標準法によって単離でき、ゲノムDNAは、制限エンドヌクレアーゼによって制 限断片に切断でき、生じた断片は、クローン化して適切な組換えDNAクローニン グベクターとし、望みのDNA配列の有無について、放射能標識又は酵素的標識し たプローブでスクリーンニングできる。望みの配列を含有するDNA構成体をクロ ーニングベクターと発現ベクターに取り込む方法は、現在、技術上周知であり、 Eukaryotic Viral Vectors，（Y．Gluzman，ed.）Cold Spring Harbor Laborato ries publications，Cold Spring Harbor，New York(1982)；Eukaryotic Transc ription，（Y．Gluzman，ed.）Cold Spring Harbor，NeW York(1985);Sequence Specificity in Transcription & Translation，（R．Calendar and L.Gold，ed s）Allan R．Liss，Inc.，New York(1985)；Maximizing Gene Expression，（W ．Reznikoff and L.Gold，eds）Butterworths，New York(1986)；Mammalian Cel l Technology，（W．G．Thilly，ed.）Butterworths，New York(1986)；J.Sambr ook andM.J．Gething，Focus，（Bethesda Research Laboratories/Life Techno logies，Inc.）10#3，pp.41-481（1988）などの多数の文献に記述されている。 適切な宿主細胞、好ましくは真核細胞を、電気穿孔法、プロトプラストフュー ジョン、リン酸カルシウム沈降法を含めて、数種の技術上周知の標準トランスフ ェクション法のいずれかによって形質転換し、発現ベクターに取り込むことがで きる。このような技術は、Toneguzzo，F.,et al.，Mol．and Cell Biol.，6:703 -706(1986)；Chu，G.，et al.，Nucleic Acid Res.，15:1311 1325(1987)；Rice ，D.，et al.，Proc．Natl．Acad．Scl．USA，79：7862-7865(1979)；Oi，V.,et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80：825-829（1983）によって、全般的に 述べられている。好ましくは、キメラ構成体から成る組換え発現ベクターを連続 的に宿主細胞にトランスフェクトする。例えば、キメラ軽鎖DNA構成体を、初め に、宿主細胞にトランスフェクトする。次に、キメラ軽鎖ポリペプチドを発現す る形質転換宿主細胞を、例えば、Engvall,E.とPerlmann，P.，Immunochemistry ，8:871-874（1971）で述べるように、技術上周知の標準法によって選択する。 その後、キメラ重鎖DNA構成体から成る発現ベクターを選択した宿主細胞にトラ ンスフェクトする。別法としては、キメラ軽鎖、重鎖の両発現ベクターを一斉に 宿主細胞に導入するか、両キメラ遺伝子構成体を、細胞へのトランスフェクショ ンのために単一発現ベクター上で合わせることができる。トランスフェクション 及び選択後、望みの金属キレートと反対に向かうキメラ抗体の検出のため、標準 アッセイを実施する。 本発明の方法は、一抗原特異抗金属キレート抗体からの二抗原特異抗金属キレ ート抗体の分離における特別な有用性を見いだすものである。金属キレートに対 するある特異性と異なる抗原に対する他の特異性を示す二抗原特異抗体を入手で きる。例えば、U.S.特許No.4,722,892、U.S.特許No.4,475,893、Martinis，et a l.，Protides of the Biological Fluids，（H．Peters，ed.）pp.311-316，Per gamon Press，Oxford（1983）を参照されたい。例えば、二抗原特異抗体を発現 できるポリドーマは、ある特異性の抗体を分泌する細胞を別の特異性抗体を分泌 する細胞と融合させることによって実施できる。次に、２つの抗体の重鎖と軽鎖 を組み合わせて、２つの活性一抗原特異二価抗体（親細胞のそれに相当）、ある 親の軽鎖と重鎖から成るある抗原結合部位と、他の親の軽鎖と重鎖から成る他の 抗原結合部位を有する活性二抗原特異抗体、各種の他の不活性種を含めて、多様 な 抗体種を形成する。「活性」という用語は、各抗原結合部位が同じ親からの軽鎖 と重鎖から成り、それに親の特異性を付与する構成体を意味する。「不活性」は 、一方又は両方の抗原結合部位が、ある親からの重鎖と他の親からの軽鎖から成 り、いずれの親の結合特異性も持たない構成体を意味する。これらのポリドーマ からの培養液は、両活性一抗原特異抗体、並びに、活性二元抗体をふくめて、様 々な抗体種を含有する。 ポリクローナル抗金属キレート抗体は、技術上当業者が周知の方法によって入 手できる。例えば、Ghose，et al.，Methods in Enzymology 93:326-327（1983 ）を参照されたい。このような抗血清は、複数の両抗金属キレート抗体と非特異 的抗体を含有するので、本発明の方法は、非特異的抗体及びタンパク質からの抗 金属キレート抗体の分離が可能で、抗金属キレート抗体に富むフラクションの同 定を可能にする。このような抗血清は、非同族カルボン酸誘導固体支持体の保持 時間が上清に認められる他のタンパク質の保持時間と重複するおそれのある金属 キレートに低い親和性しか持たない抗金属キレート抗体を含有する場合がある。 そのため、本発明は、生じる調製液が、適宜、純粋でなくなることがあるものの 、非特異的抗体から10⁷L/M又は丁度10⁶L/Mの親和性を有する抗体を分離するのに も使用できるが、10⁸L/M以上の金属キレートに対する抗体を分離するのに特に適 している。本法は、高濃度抗金属キレート抗体を有するフラクションを調製する のに、特に、よく適している。 本発明の分離法に従って、細胞培養上清などの抗金属キレート抗体を含有する 溶液を、50mMリン酸ナトリウムのような緩衝液、pH7.5以下、好ましくは5.6〜6. 8、最も好ましくは6.8で透析し、出発溶液、通常は同一緩衝液か、抗体を掛ける （アプライする）ものと同じ伝導度を持つ溶液、で平衡化しておいた非同族カル ボン酸誘導樹脂カラムに掛ける。樹脂は、カルボキシイオン交換樹脂が好ましい 。市販カルボキシメチル（CM）樹脂の例には、TSK CM 5/PW（TosoHaas，Philade lphia，Pennsylvania）と（Bio-Rad Laboratories，Richmond，California）とP harmacia CM Sepharose Fast Flow（Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway，New Jersey）がある。市販イミノジ酢酸（IDA）樹脂の例には、Chelate Column（Por os，Cambridge，Massachusetts and TosoHaas）がある。他の非同族カルボン酸 誘 導固体支持体が使用できる。適切な支持体材料には、他のものは当業者に周知に なるが、ポリスチレンとポリエステル、ガラスとガラスマトリックス、デキスト ランとセルロース、ポリマー被覆支持体のようなポリマー樹脂がある。非同族カ ルボン酸は、当業者に周知の手段によって固体支持体に結合できる。これらのカ ルボン酸は、カルボン酸基が有効である限り、様々な長さの脂肪族、芳香族、あ るいは、分岐アルキルを介して樹脂に付着できる。 非特異的抗体や他の非特異的タンパク質からのモノクローナル抗金属キレート 抗体を分離するのに適しているような本発明の１つの実施態様において、結合し た材料を、塩濃度を増加させる直線グラジェントで、技術上周知の方法によって 、溶出液を使ったカラムから溶出する。この目的で、リン酸ナトリウム、塩化ナ トリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない各 種緩衝塩を使用できる。300mMまでのリン酸ナトリウム、pH7.5以下の直線グラジ ェントを使用するのが好ましい。これに代わるものとしては、リン酸ナトリウム 緩衝液、pH7.5以下を、硫酸ナトリウムグラジェントと共に使用できる。収集し た溶出フラクションは、例えばUV吸光度のような技術上周知の方法でタンパク質 についてアッセイできる。抗金属キレート抗体は、非特異的抗体よりも遅い保持 時間でカラムから溶出し、それによって、分離が可能になる。 別の実施態様では、ポリドーマの培養で認められ得る他の抗体やタンパク質か ら活性二抗原特異抗金属キレート抗体を分離するのに適している。培養液を、上 述の通り、非同族カルボン酸誘導体化固相支持体に掛け、溶出液をタンパク質濃 度についてアッセイすると、様々なピークが認められる。二抗原特異抗体は、２ つの親型の間で正常に溶出することになる。活性二抗原特異の相当するピークの 同定は、例えば、単一成分中に両活性が存在することを必要とする修飾ELISAに よって決定できる。次に、他の抗体種からの活性二抗原特異抗金属キレート抗体 の分離を可能にするため、溶出条件を選択できる。 他の実施態様では、本発明は、ポリクローナル抗血清から抗金属キレート抗体 に富む溶出フラクションを得る方法を提供する。上述の通り、抗血清を非同族カ ルボン酸誘導体化固相支持体に掛けると、タンパク質濃度は、ガウス（Gausian ）分布に近づく。例えば、定量ELISA測定によって決定する場合の抗金属活性は 、あ とから溶出するフラクションのほうが増加する。従って、抗血清を非同族カルボ ン酸誘導体化固相支持体に掛け、後から溶出する材料を選択することによって、 金属キレート抗体に富む材料が得られることになる。 本発明は、固体支持体の同定、緩衝液の組成、グラジェントの性質、特殊抗体 の親和性などを含めて、特定条件下での以下の実施例により説明するが、希望す る抗体を分離するために使用すべき特別な溶出剤の条件は、経験的に決定できる ことが、当業者に明らかになろう。例えば、本明細書の教示を生かして、非同族 カルボン酸誘導固体支持体上で保持しないが、抗金属キレート抗体を保持する溶 出剤の条件を、経験的に見いだすことができる。２つの型の抗体を区別するため に選択した塩濃度を有するこの溶出剤によって、抗金属キレート抗体を非同族カ ルボン酸誘導固体支持体から取り出すことができる。正確な溶出剤の条件は、誘 導体化した支持体の型、溶出剤の組成、分離する抗金属キレート抗体と非金属キ レート抗体の両方の物理的特性に依存する。次に、適正な溶出条件の決定をバッ チ式精製に応用し、そこで、非特異的タンパク質の結合を防ぐために出発溶液を 選択し、希望の抗金属キレート抗体を溶出するために溶出緩衝液を選択する。 以下の実施例は、本発明を説明するためのもので、制限するものではない。 実施例Ｉ スルフォプロピルカラムでの抗金属キレート抗体のHPLCクロマトグラフィー 10ミクロンのTSK SP 5PW樹脂ビーズを充填したスルフォプロピル（SP）カラム （75ｘ7.5mm）をBioRadから購入し、製造会社のマニュアルに従って調製し、各 溶出用の希望のpHの50 mMリン酸ナトリウム中で平衡化した。8.6のpIとIn-ベン ジルEDTA金属キレート及び腫瘍CEAへの特異性を持つ抗金属キレート抗体、BxBFA 、即ち、マウス/ヒトキメラモノクローナル二重特異性抗体を、平衡緩衝液で１ ：３に希釈した。100 ugの抗体をカラムに掛け、マトリックスに結合させた。各 試験で、希望するpHとリン酸塩濃度を得るために、一塩基及び二塩基リン酸溶液 を水と混合する３回、ある場合には４回のポンプ送液で、抗体を溶出した。100 分間に渡る50mMから300mMまでリン酸ナトリウムの塩を増加させる一連の直線グ ラジェントを、pH8.0、7.3、6.7、6.2、又は、5.5、流速１ml/分で溶出さ せた。Waters 490E（Milford，Massachusetts）可変波長UV検出器を使って、280 nmでの吸光度によって、抗体の存在を決定した 図２から分かるように、カラム上の抗体の保持時間は、pHが低下するにつれ、 増加した。これは、スルフォプロピルカラム上で、これらの低めのpHで抗体が保 持する漸増する正の荷電と、負の荷電に対するそれらの吸引によって起こる。pH 5.5でのBxBFAの保持時間は、約50分であった。 実施例II カルボキシメチルカラム上での抗金属キレート抗体の分離 10ミクロンTSK CM 5/PW樹脂ビーズを充填したカルボキシメチル（CM）カラム （75ｘ7.5mm）をBioRad Laboratoriesから購入し、製造会社のマニュアルに従っ て調製し、平衡化した。抗体は、実施例Ｉの通りに、カラムに掛けた。また、実 施例Ｉの通りに、pH8.0、7.3、6.7、6.2、5.5で、一連の溶出を実施した。カル ボキシメチルカラムからの抗体の溶出時間を図３に示す。スルフォプロピルカラ ムに比較して、BxBFAは、pH5.5では、カルボキシメチルカラムから溶出しなかっ た。pH5.5の代わりに、pH6.2で、BxBFAは、カルボキシメチルカラムから溶出で き、保持時間は約61分あり、同一のグラジェント条件下のpH5.5では、スルフォ プロピルカラムに見られるものよりも長い保持時間である。抗体は、pHが高いほ ど、正の荷電が減るという事実にもかかわらず、スルフォプロピルカラムと比較 したカルボキシメチルカラムによる強めの保持が起こる。このイオン吸引の減少 は、対立荷電の吸引以外の力が、カルボキシメチルカラム上でのさらに長い保持 時間の原因になることを意味する。一般に、カルボキシメチルカラム上での保持 時間の延長は、pHが高いほど、即ち、pH６以上か出発細胞培養材料の生理的pHに 近づくほど、精製を行えることを意味する。in vitro細胞培養法で産生した抗体 の場合、出発材料のpHのpH約5.5以下への調整は、そこで抗体を含むタンパク質 の沈殿を引き起こすことがある。 実施例III 抗金属へのハプテンの作用 10ミクロンのTSK CM 5/PW樹脂ビーズを充填したカルボキシ（CM）カラム（75 ｘ7.5mm）をBio-Rad Laboratoriesから購入し、製造会社のマニュアルに従って 調製した。カラムを平衡化し、実施例Ｉの通りに、精製したECA 001試料、pI6.5 とIn-ベンジルEDTA金属キレートと腫瘍CEAに対する特異性を持つマウスポリドー マ産生二重特異性抗体を調製し、カラムに掛けた。溶出は、溶液のpHが9.6、8.3 、7.4、6.8、6.2、5.5である点を除いて、実施例Ｉの通りに進めた。溶出時間は 、図４に示す通りである。ECAについての保持時間は、約５分で、pH 6.2では、 上記の実施例２のBxBFAの場合よりも少なかった。ECA 001抗体は、原則として、 BxBFA抗体のそれに類似したカルボクシメチルカラムに対する吸引示すが、この 抗体は、それぞれのpIの比較で分かるように、BXBFAに比べて負の荷電が強いの で、負に荷電したカルボキシメチルカラムによって、ある程度反発される。この ２つの抗体は、大きく異なるpIを持つが、In-ベンジルEDTA金属キレートに対す る特異性が共通している点が、カラム上の保持の類似の説明になる。上記の実施 例２の通り、pH5.5でのリン酸塩の溶出では、カラムからECA 001抗体の取得を行 えない。 実施例IV 10ミクロンの樹脂ビーズを充填したイミノジ酢酸（IDA）カラム（75ｘ7.5mm） をTosoHausからキレートカラム（Chelate Column）として購入し、製造会社のマ ニュアルに従って調製した。カラムは、金属を負荷させずに平衡化し、実施例Ｉ の通りに抗金属キレート抗体BxBFAを調製し、カラムに掛けた。pH値が9.0、8.0 、7.3、6.7、6.2、5.5であり、図５に示す通りに、経時的にpHをモニターした点 を除いて、実施例Ｉの通りに一連の溶出を実施した。pH9.4を持つ500mMリン酸ナ トリウムの緩衝液でさえ、カラムから抗体を溶出できなかった。単純なリン酸塩 溶液で金属キレートを溶出するには、イミノジ酢酸の構造がベンジル-EDTAの構 造に類似し過ぎると、推定される。 実施例Ｖ 10ミクロン樹脂ビーズを充填したイミノジ酢酸（IDA）カラム（75ｘ7.5mm）を キレートカラム（Chelate Column）としてTosoHausから購入し、製造会社のマニ ュアルに従って調製した。カラムは金属を負荷せずに平衡化し、実施例Ｉの通り に、金属キレート抗体BxBFAを調製し、カラムに掛けた。溶出は、グルタミン酸 の０から240mMまでの直線グラジェントを、pH値8.2、7.2、6.7、6.2、5.6で使用 した点を除いて、実施例Ｉの手順に従って実施した。pH値8.1、7.3、6.7、6.2、 5.6でのグリシン溶出を使って、同一の手順に従った。溶出時間は、図6a及び6b に示す通りであった。pHは、最終濃度60mMに調整したリン酸ナトリウム緩衝液の ラジェント中、終始、維持した。グルタミン酸とグリシンの構造は、カラムから 抗体を遊離するのに、同族金属/ベンジル-EDTAの構造と十分に類似していたが、 リン酸塩溶液はそう成り得なかった、と考えられる。 実施例VI 抗体がECA 001の精製試料であった点を除いて、実施例Ｖの通りにイミノジ酢 酸（IDA）カラムを調製、平衡化し、カラムに掛けた。溶出は、実施例Ｉの手順 の通りだが、カラムを湧出するための硫酸ナトリウムの直線グラジェントを使っ て実施した。やはり、溶出絵溶液のpHは、pH値9.6、8.1、7.4、6.8、6.2、ある いは、5.2の60mMリン酸塩を使って維持した。溶出時間は、図７に示す通りであ った。この実施例は、硫酸塩がグルタミン酸と似た方法で、非同族ハプテンとし て作用することを立証している。 実施例VII グルタミン酸（GLU）カラムを10ミクロンの樹脂ビーズで、製造会社のマニュ アルに従い、Tresyl 5PWカラム（TosoHaus）を使って調製した。カラムは、抗体 がBxBFAであった点を除いて、実施例Ｖの通りに、平衡化し、負荷した。溶出は 、実施例Ｉに従ったが、pH値8.1、7.4、6.9、6.4、5.7でカラムを溶出するため に、リン酸ナトリウムの50mMから300mMまでの直線グラジェントを使って実施し た。溶出時間は、図８に示す通りであった。 本発明を、好ましい実施態様に関して記述してきたが、本発明の精神から逸脱 せずに変更を加えられることは、当業者に明らかである。従って、本発明は、以 下の請求項によってのみ制限される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約６から約９までのｐＩを有する抗金属キレート抗体に富む溶出液フラク ションを、前記抗金属キレート抗体及び非特異的タンパク質を含有する調製物か ら得る方法であって、 ａ．出発溶液中の前記調製物を、前記出発溶液中で平衡化させた非同族 モノカルボン酸誘導体化固体支持体にアプライし、 ｂ．前記非特異的タンパク質を前記支持体から除去し、 ｃ．（１）前記抗金属キレート抗体を前記支持体から溶出するのに十分 な濃度に高めた第１の非カルボン酸塩（但し、分離すべき調製物を含有する溶液 及び前記溶出溶液のｐＨは約6.2から約6.8までである）、又は（２）前記抗金属 キレート抗体に対して親和性を有する非同族ハプテンを含有する溶出溶液のいず れかを含有する溶出溶液を添加し、 ｄ．段階ｃで溶出されたフラクションを集める、 段階を含む前記方法。 ２．前記酸誘導体がカルボキシメチルである請求項１に記載の方法。 ３．前記固体支持体がポリマー被覆支持体、ポリスチレン、ポリエステル、ガ ラス、デキストラン及びセルロースからなる群から選択される請求項１に記載の 方法。 ４．前記抗金属キレート抗体が抗金属キレートモノクローナル抗体である請求 項１に記載の方法。 ５．前記溶出溶液が前記第１の非カルボン酸塩を含有しそして前記除去段階が 、前記支持体から非特異的タンパク質を溶出するのに十分な濃度の第２の非カル ボン酸塩を含有する溶液をアプライすることをさらにに含む請求項１に記載の方 法。 ６．前記溶出溶液が前記第１の非カルボン酸塩を含有しそして該塩がリン酸ナ トリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び硫酸ナトリウムからなる群から 選択される請求項５に記載の方法。 ７．前記第１及び前記第２のカルボン酸塩が同じ化学式を有している請求項５ に記載の方法。 ８．前記溶出溶液が前記第１の非カルボン酸塩を含有しそして前記アプライ段 階が、前記抗金属キレート抗体の結合を妨げることなく前記非特異的タンパク質 の１部の結合を妨げるのに十分な塩濃度を有する前記出発溶液中で実施される請 求項５に記載の方法。 ９．前記抗金属キレート抗体が抗原反応性領域を有するフラグメントである請 求項１に記載の方法。 １０．前記抗金属キレート抗体が１より多いカルボキシ基とキレート結合する 金属キレート剤に対して産生させたものである請求項１に記載の方法。 １１．請求項１の方法によって調製された抗金属キレート抗体に富む溶出液フ ラクション。 １２．約６から約９までのｐＩを有する抗金属キレート抗体を調製物中の非特 異的タンパク質から効果的に分離する請求項１に記載の方法。 １３．請求項１２に記載の方法によって分離された抗金属キレート抗体。 １４．約６から約９までのｐＩを有する二抗原特異抗金属キレート抗体を該二 抗原特異抗金属キレート抗体、一抗原特異抗金属キレート抗体及び非特異的タン パク質を含有する調製物から分離する方法であって、前記抗金属キレート抗体は １より多いカルボキシ基とキレート結合する金属キレート剤に対して産生させた ものであり、 ａ．出発溶液中の前記調製物を、前記出発溶液中で平衡化させたモノカ ルボン酸誘導体化固体支持体にアプライし、 ｂ．前記二抗原特異抗金属キレート抗体及び前記一抗原特異抗金属キレ ート抗体を分離させることなく非特異的抗体を前記支持体から溶出するのに十分 な濃度の第１の非カルボン酸塩を含有する溶出溶液を添加し、 ｃ．前記二抗原特異抗金属キレート抗体を前記支持体から溶出するには 十分であるが前記一抗原特異抗金属キレート抗体を前記支持体から溶出するには 十分でない濃度に高めた第２の非カルボン酸塩を含有する更なる溶出溶液を添加 し（但し、カラム、分離すべき調製物を含有する溶液及び前記溶出溶液のｐＨは 約6.2から約6.8までである）、 ｄ．段階ｃで溶出された前記二抗原特異抗金属キレート抗体を含有する フラクションを集める、 段階を含む前記方法。 １５．前記カルボン酸誘導体がカルボキシメチルである請求項１４に記載の方 法。 １６．前記固体支持体がポリマー被覆支持体、ポリスチレン、ポリエステル、 ガラス、デキストラン及びセルロースからなる群から選択される請求項１４に記 載の方法。 １７．前記塩がリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び硫酸 ナトリウムからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。 １８．前記抗金属キレート抗体が抗原反応性領域を有するフラグメントである 請求項１４に記載の方法。 １９．前記アプライ段階が、前記二抗原特異抗金属キレート抗体の結合を妨げ ることなく前記非特異的抗体の１部の結合を妨げるのに十分な塩濃度を有する前 記出発溶液中で実施される請求項１４に記載の方法。 ２０．前記第１及び前記第２の非カルボン酸塩が同じ化学式を有している請求 項１４に記載の方法。 ２１．請求項１４に記載の方法によって分離された二抗原特異抗金属キレート 抗体。 ２２．約６から約９までのｐＩを有する抗金属キレート抗体を非特異的タンパ ク質から分離する方法であって、該抗金属キレート抗体は１より多いカルボキシ 基とキレート結合する金属キレート剤に対して産生させたものであり、 ａ．出発溶液中の前記調製物を、前記出発溶液中で平衡化させた非同族 モノカルボン酸誘導体化固体支持体にアプライし、 ｂ．前記抗金属キレート抗体を放出させることなく前記非特異的タンパ ク質を前記支持体から溶出するのに十分な濃度の第１の非カルボン酸塩を含有す る溶出溶液を添加し、 ｃ．前記抗金属キレート抗体を前記固体支持体から溶出するのに十分な 濃度に高めた第２の非カルボン酸塩を含有する更なる溶出溶液を添加し（但し、 カラム、分離すべき調製物を含有する溶液及び前記溶出溶液のｐ Ｈは約6.2から約6.8までである）、 ｄ．段階ｃで溶出された抗金属キレート抗体を含有するフラクションを 集める、 段階を含む前記方法。 ２３．前記カルボン酸誘導体がカルボキシメチルである請求項２２に記載の方 法。 ２４．前記固体支持体がポリマー被覆支持体、ポリスチレン、ポリエステル、 ガラス、デキストラン及びセルロースからなる群から選択される請求項２２に記 載の方法。 ２５．前記塩が、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び硫 酸ナトリウムからなる群から選択される請求項２２に記載の方法。 ２６．前記抗金属キレート抗体が抗原反応性領域を有するフラグメントである 請求項２２に記載の方法。 ２７．前記アプライ段階が、前記抗金属キレート抗体の結合を妨げることなく 前記非特異的タンパク質の１部の結合を妨げるのに十分な塩濃度を有する前記出 発溶液中で実施される請求項２２に記載の方法。 ２８．請求項２２に記載の方法によって分離された抗金属キレート抗体。