HUT73396A - Separation of anti-metal chelate antibodies - Google Patents
Separation of anti-metal chelate antibodies Download PDFInfo
- Publication number
- HUT73396A HUT73396A HU9503232A HU9503232A HUT73396A HU T73396 A HUT73396 A HU T73396A HU 9503232 A HU9503232 A HU 9503232A HU 9503232 A HU9503232 A HU 9503232A HU T73396 A HUT73396 A HU T73396A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibodies
- chelate
- antibody
- carboxylic acid
- antifungal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás antifémkelát antitestek elválasztására nem-specifikus fehérjéktől - beleértve az aniesteket is - oly módon, hogy az antifémkelát antitesteket tartalmazó készítményt felvisszük egy szilárd, karbonsavval módosított hordozóra, majd eluálunk, először olyan pufferrel, melynek sókoncentrációja elég magas ahhoz, hogy eluálja a nem-specifikus fehérjéket, de még nem elég magas ahhoz, hogy eluálja az antifémkelát antitesteket, majd az eluáló oldat sókoncentrációját addig emeljük, hogy eluálódjanak az antifémkelát antitestek, miközben az eluáló puffer pH-ja 7,5 vagy kevesebb. A találmány egyik kivitelezési módja szerint a szilárd, karbonsavval módosított hordozó egy karboxi-metil-gyanta. Megfelelő só a nátrium-foszfát, nátrium-klorid, nátrium-szulfát és nátrium-acetát. Egy másik változat szerint az antifémkelát antitestek szelektíven eluálhatók egy második, nem-felismerő (kognát) karbonsavat tartalmazó oldattal, melynek kisebb az affinitása az antifémkelát antitesthez, mint a felismerő hapténé.
A módszer alkalmas monoklonális vagy poliklonális antifémkelát antitestek nem-specifikus fehérjéktől való elválasztására és bifunkciós antifémkelát antitestek monoklonális antifémkelát antitestektől, valamint egyéb nem-specifikus fehérjéktől való elválasztására, miközben nem csapódnak ki az eluált antitestek. A módszer fel ··· ii használható antigén-reaktív területet hordozó antifémkelát antitest fragmensek nem-specifikus fehérjéktől való elválasztására is.
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁN 7 ·:· ·
ANTIFÉMKELÁT ANTITESTEK ELVÁLASZTÁSA
A találmány tárgya eljárás antitestek elválasztására, külö nösen antifémkelát antitestek egyéb antitestektől és fehérjéktől való elválasztására.
Az elmúlt 25 évben forradalom ment végbe az immunológia területén. Az 1970-es években módszereket fejlesztettek ki, melyek lehetővé tették egyedi antitestek mennyiségi előállítását. Az antitestek fehérjék, melyeket az immunrendszer arra használ, hogy felismerje, megkösse és esetenként eltávolítsa azokat az anyagokat, melyeket idegennek ítél. Annak érdekében, hogy specifikusan tudjon kötődni egyhez a lehetséges antigének óriási tömegéből, az egyén minden egyes 105-10e -as lymphocyta vonala különböző antitestet termel, mely specifikus az idegen anyaggal vagy antigénnel szemben. Egyetlen antitestet termelő lymphocytát örökéletü sejttel, így rákos sejttel fuzionálva, ma már előállítható egyetlen lymphocyta klón, melyben minden egyes sejt ugyanazt a monoklonális antitestet termeli.
Az ilyen monoklonális antitestet termelő hybridomák kifejlesztése óriási lehetőséget nyitott meg mind a diagnosztika, mind a legkülönbözőbb betegségek gyógyítása számára.
Az antitestek nehéz és könnyű peptidláncból képezett, ,Y alakban elrendezett, két azonos párból állnak. Az „Y” mindegyik ága tartalmaz egy helyet, mely nem-kovalens kötéssel így ionos-, hidrogén- vagy van dér Waals kötéssel - köti meg az antigént, ez az antigén és az őt felismerő antitest közötti af
82813-5957 TF/SM finitás alapja. Ez az antigénkötőhely az antigén-reaktív régión belül helyezkedik el, mely megfelel az antitest úgynevezett variábilis régiójának. Natív antitestben mindkét antigén-reaktív régió azonos. Előállítottak „bifunkciós antitestet’ is, melyben két különböző, variábilis régió található. Ezeket a bifunkciós antitesteket kémiai úton vagy manipulált sejtekkel lehet előállítani, melyek egyidejűleg expresszálnak antitestfehérjéket kódoló két különböző gén-szettet. Ezek a géntermékek ezután változó antitestfajtákká kapcsolódnak össze, melyek antitestgéntermékek különböző kombinációi, közéjük tartozik kettő, melynek azonos antigénkötőhelye van „(monofunkciós antitest”) és egy, melynek különbözőek az antigénkötőhelyei.
A bifunkciós antitestek igen hasznosak, mivel egyidejűleg teszik lehetővé a több, mint egy antigénhez való kötődést. így például egy bifunkciós antitest, melynek egyik ága specifikus arra az antigénre, mely a daganat felületén expresszálódik, a másik ága pedig specifikus a leképezésre vagy a terápiás szerre, hatékonyan használható arra, hogy egy ilyen szert a daganat helyére irányítson. Az ilyen terápiás és diagnosztikai célokra használható molekularészek közé tartoznak a fémkelátokban található fémek. Az antitesteket, melyeknek kötési affinitása van a fémkelátokhoz, „antifémkelát antitesteknek” nevezzük.
Az antitest technológia legújabb eredményei megteremtették azt az igényt, hogy módszereket fejlesszenek ki az antitestek fehérjéktől és egyéb szennyezőanyagoktól való megtisztítására, valamint speciális antitestfajták egyéb antitestektől való elválasztására.
Hagyományosan két módszert használnak antitestek elválasztására: ioncserélö-kromatográfiát és affinitáskromatográfiát. loncserélő-kromatográfiában szilárd hordozót alkalmaznak, melyhez kovalensen kötődnek a töltéssel rendelkező funkciós csoportok. Ezek a töltéssel rendelkező csoportok ionos kötést létesítenek a különböző fehérjék felületén található töltésekkel, s így megteremtik a lehetőségét a fehérjék különböző típusainak vagy családjának elválasztásához. Az a fehérje, melynek felülete negatív töltésű, nagy valószínűséggel hozzákötödik a pozitív funkciós csoporttal rendelkező anioncserélőhöz, míg a főként pozitív töltésű felületet tartalmazó fehérje valószínűleg a kationcserélőhöz kötődik. Ezen fehérjék kötődése függ a pH-tól, valamint a só összetételétől és koncentrációjától, így ezek a paraméterek jól hasznosíthatók antitest családok más típusú fehérjéktől való elválasztására. Míg azonban az ioncserélő kromatográfia hasznosnak bizonyult bizonyos esetekben, vannak jelentős korlátái is. így antitestek, melyek fizikai jellemzői hasonlóak, de egyedi funkciós jellegük, így antigénkötődésük van, általában nem választhatók el egymástól.
Specifikusabb tisztítás érhető el affinitás-kromatográfiával, ahol a gyantaoszlophoz kötődik az izolálandó antitestet felismerő antigén vagy haptén. A haptén egy kis molekula, mely hordozóhoz kötve antigén hatású. Az antitest készítményt átengedve az oszlopon, az megköti és visszatartja az antigénre specifikus antitestet. Az antigén-antitest kötés erőssége miatt csak a felismerő molekulát tartalmazó oldat képes az antitestet eluálni. így - az egyesült államokbeli 5 112 951 számú szabadalmi le' 4 .............
írás szerint haptén távollétében - az antifémkelát antitestek hosszabb retenciós idővel rendelkeznek szulfo-propil-oszlopon, mint a nem-specifikus antitestek. Sőt, a retenciós idők hasonlóak voltak egér-antitestek és kiméra származékaik esetében, annak ellenére, hogy az egér-antitestek pl értéke sokkal alacsonyabb volt, mint a kiméráké. Ugyanakkor a haptén analóg 1 mM Co/EDTA - jelenlétében az antifémkelát antitestek retenciós ideje drámai módon lecsökkent, a nem-specifikus antitesteknél megfigyelt csekély változásokhoz képest. Az antifémkelát antitestek hosszú retenciós ideje és ennek megszűnése fémkelát haptén jelenlétében arra mutat, hogy ezen antitestek oxosav-gyantához való kötődésekor a kölcsönhatás az antigén-reaktív kötőhely területén megy végbe.
Az affinitás-kromatográfia azonban igen előnytelen is lehet, annak ellenére, hogy segítségével hasonló fizikai tulajdonságú antitestek jól elválaszthatók egymástól. így esetenként nehéz vagy lehetetlen elválasztani az antitesteket az antigéntől vagy analóg hapténtöl, amellyel eluálhatók. Továbbá a felismerő vegyület, vagy a felismerő gyanta nem mindig áll rendelkezésre vagy költséges. És, ami még fontosabb, az antitest denaturálódhat az eluálás szélsőséges körülményei között, így szélsőséges pH-η, vagy kaotrop szerek jelenlétében.
Tehát igény merült fel olyan olcsó és hatékony módszerre, mellyel specifikusan izolálni lehet az antifémkelát antitesteket a nem-specifikus antitestek vagy fehérjék mellől anélkül, hogy ezalatt denaturálódás következne be. Célszerűen az ilyen módszer alkalmas antifémkelát antitestekben feldúsított poliklón frakciók, valamint monoklonális antitestek és bifunkciós szár i
mazékaik izolálására. A találmány kielégíti ezeket az igényeket és további előnyöket is biztosit.
A találmány tárgya eljárás antifémkelát antitestek elválasztására nem-specifikus fehérjéktől - beleértve az antitesteket is -, azzal jellemezve, hogy az antifémkelát antitesteket tartalmazó készítményt felvisszük egy karbonsavval módosított szilárd hordozóra, majd eluálunk, először olyan pufferrel, melynek sókoncentrációja elég magas ahhoz, hogy eluálja a nem-specifikus fehérjéket, de még nem elég magas ahhoz, hogy eluálja az antifémkelát antitesteket, majd az eluáló oldat sókoncentrációját addig emeljük, hogy eluálódjanak az antifémkelát antitestek, miközben az eluáló puffer pH-ja 7,5 vagy ez alatt van. A találmány szerinti eljárás egyik kivitelezési módja szerint a karbonsavval módosított szilárd hordozó egy karboxi-metil gyanta. Megfelelő só a nátrium-foszfát, nátrium-klorid, nátrium-szulfát és nátrium-acetát. Egy másik változat szerint az antifémkelát antitestek szelektíven eluálhatók egy második, nem-felismerő (kognát) karbonsavat tartalmazó oldattal, melynek kisebb az affinitása az antifémkelát antitesthez, mint a felismerő hapténé.
A módszer alkalmas monoklonális vagy poliklonális antifémkelát antitestek nem-specifikus fehérjéktől való elválasztására és bifunkciós antifémkelát antitestek monoklonális antifémkelát antitestektől, valamint egyéb nem-specifikus fehérjéktől való elválasztására, anélkül, hogy közben kicsapódnának az eluált antitestek. A módszer felhasználható antigén-reaktív régiót hordozó antifémkelát antitest fragmensek nem-specifikus fehérjéktől való elválasztására is.
Ábrák rövid ismertetése
1. ábra. Az indium-benzil-EDTA fémkeláttal szemben képezett antitest reakcióképessége egy sorozat nem-felismerő (kognát) karbonsav esetén.
2. ábra. Ultraibolya abszorbancia 280 nm-nál az idő függvényében. Bifunkciós antifémkelát antitest (BxBFA) kromatográfiás profilja módosított szulfopropil oszlopon, nátrium-foszfát eluáló só alkalmazásakor (1. példa).
3. ábra. Ultraibolya abszorbancia 280 nm-nál az idő függvényében. Bifunkciós antifémkelát antitest (BxBFA) kromatográfiás profilja módosított karboxi-metil oszlopon, nátrium-foszfát eluáló só alkalmazásakor (2. példa).
4. ábra. Ultraibolya abszorbancia 280 nm-nál az idő függvényében. Bifunkciós antifémkelát antitest (ECA 001) kromatográfiás profilja módosított karboxi-metil oszlopon, nátrium-foszfát eluáló só alkalmazásakor (3. példa).
5. ábra. Ultraibolya abszorbancia 280 nm-nál az idő függvényében. Bifunkciós antifémkelát antitest (BxBFA) kromatográfiás profilja módosított imino-diecetsav oszlopon, nátriumfoszfát eluáló só alkalmazásakor (4. példa).
6a. és 6b. ábra. Ultraibolya abszorbancia 280 nm-nál az idő függvényében. Bifunkciós antifémkelát antitest (BxBFA) kromatográfiás profilja módosított imino-diecetsav oszlopon, glutaminsav és/vagy glicin mint eluálószer alkalmazásakor (5. példa).
7. ábra. Ultraibolya abszorbancia 280 nm-nál az idő függvényében. Bifunkciós antifémkelát antitest (ECA 001) kromatográfiás profilja módosított imino-diecetsav oszlopon, nátriumszulfát eluáló só alkalmazásakor (6. példa).
8. ábra. Ultraibolya abszorbancia 280 nm-nál az idő függvényében. Bifunkciós antifémkelát antitest (BxBFA) kromatográfiás profilja glutaminsavval módosított oszlopon, nátriumfoszfát eluáló só alkalmazásakor (7. példa).
A találmány tárgya hatékony eljárás antifémkelát antitestek elválasztására, azzal jellemezve, hogy a hapténkelát valamely nem-specifikus fehérjéből származó karbonsav vagy karbonsav származék - ide tartoznak egyéb nem-specifikus antitestek is. Az eljárás kiaknázza az antifémkelát antitestek azon meglepő képességét, hogy kötődni tudnak egy nem-felismerő (kognát) antigénhez, valamely karbonsav részhez, melynek van ugyan némi szerkezeti hasonlósága a felismerő hapténkelátokhoz, de kicsi az affinitása antigén-reaktív régióikhoz és így differenciálni tudja őket a nem-specifikus antitestektől és fehérjéktől. Míg az antigének és haptének vagy analógjaik - így származékaik és fragmenseik - affinitás oszlopok szilárd fázisaként használatosak, a találmány szerinti eljárás alapja az antifémkelát antitestek és a nem-felismerő (kognát) haptén vagy analógja között az antigénkötődés helyén létrejövő kötés. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy magasabb sókoncentráció elegendő az antifémkelát antitestek eluálásához. A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy a nagyobb sótartalmú oldat pH-ja 6,5 vagy magasabb is lehet. Egy további változat szerint az antifémkelát antitestek szelektíven eluálhatók olyan mono-, divagy trikarbonsavakkal, melyek affinitása kisebb az (I antifémkelát antitestekhez, mint a felismerő hapténeké (így indium-benzil-EDTA). Ezen túlmenően, nincs szükség szélsőséges denaturáló eluáló körülményekre, melyek jellemzőek a hagyományos affinitási tisztítási rendszerekre.
A találmány az antifémkelát antitestek azon meglepő képességére épül fel, hogy kötődni képesek negatív töltésű, több oxigént tartalmazó rezonancia szerkezetekhez, mégpedig oly módon, hogy az visszatükrözi immunológiai specificitásukat és megmutatja, hogy a kötődés antigén-reaktív területükön vagy az antigénkötőhely közelében megy végbe. Különösen az oxosav-haptén-kelátok ellen képezett antifémkelát antitestek, így a karbonsavak és származékaik vonzódnak a nem-felismerő (kognát) haptén-karbonsavakhoz, olyanokhoz, melyekben egy vagy két karbonsav funkció elhelyezkedése olyan, hogy hozzá tud járulni az antitest kötődéséhez az antigén reaktív helyen. Ilyenek a nem-felismerő (kognát) haptének - a nem indium fémet tartalmazó EDTA is - és a nem-felismerő (kognát) karbonsavak, melyeknek kisebb az affinitása azon antitest kötőhelyéhez, melyet fém-benzil-EDTA ellen termeltek, mint a felismerő vegyületé, beleértve az ecetsavat, imino-diecetsavat, benzil-EDTA-t (1. ábra), glicint vagy más savakat, így a citromsavat, aszparaginsavat és glutaminsavat.
Az ilyen nem-felismerő (kognát) karbonsav hozzákapcsolható a szilárd hordozóhoz, mikor is karbonsavval módosított szilárd hordozó képződik. Ha a kromatográfiánál ilyen nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozót használunk szilárd fázisként, a monoklonális antifémkelát antitestek elválaszthatók a fehérjéktől és - hasonló módon - az antiszérumból poliklonális antifémkelát antitestekben dúsított frakciók nyerhetők.
A találmány szerinti eljárás nemcsak a monoklonális és poliklonális antifémkelát antitesteket tudja a nem-specifikus fehérjéktől megkülönböztetni, hanem lehetővé teszi a bifunkciós antifémkelát antitestek elválasztását a monofunkcionális antifémkelát antitestektől, amelyek együttesen találhatók egy polidoma fermentlevében. A fermentlében található különböző antitest fajtáknak meghatározott retenciós idejük van, ha növekvő sókoncentrációjú oldattal gradiens eluálást végzünk. Az aktív bifunkciós antifémkelát antitestek kisebb sókoncentrációnál eluálódnak a nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozóról, mint az aktív, monofunkciós antifémkelát antitestek. Ez az elválasztás jól visszatükrözi az egyetlen antifémkelát kötőhelyet („egyértékü”) tartalmazó bifunkciós antitest és a két antigén kötőhelyet („kétértékű”) tartalmazó monofunkciós antifémkelát antitest között fennálló affinitásbeli különbséget. így az 5 112 951 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint a bifunkciós antifémkelát antitestek hatékonyan elválaszthatók a másik, nem kívánt fajtától.
A találmányban az „antifémkelát antitest” fogalom a szakmában jól ismert antitestekre és antitest szerkezetekre vonatkozik, így kiméra, CDR-illesztett és humanizált antitestekre, melyekben olyan variálható régió van, melynek nagy az affinitása legalább egy fémkeláthoz vagy fémkelát analóghoz, melyben a haptén kelát egy karbonsav, mint a benzil-EDTA. Általában az antifémkelát antitest affinitása nagyobb, mint 106 L/M, előnyö < ............
sen nagyobb, mint 107 L/M, még előnyösebben nagyobb, mint 108 L/M. Azonban természetesen egy meghatározott antifémkelát antitestnek különböző affinitása lehet a különböző fémkelátok iránt. Azokat az antitesteket, melyeknek nincs affinitása az olyan fémkelát hapténekhez, ahol a haptén egy karbonsav vagy karbonsav származék, „nem-specifikus antitest-nek nevezzük. Együttesen a nem-specifikus antitesteket és a nemantitest fehérjéket .nem-specifikus fehérjékének nevezzük. Az antifémkelát antitesteket a 4 722 892 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és Reardan et al., Natúré, 316. 265-268 (1985)-ben megjelent közleményében írták le. Fémkelát alatt értendő minden (II) és (III) oxidációs fokozatban levő fémion beleértve a radioaktív izotópokat - melyet polikarboxilát kelátképző zár komplexbe. Ide tartozik - nem korlátozó jelleggel - az EDTA, DPTA és DOTA, melyet jelen találmányi leírásban „felismerő sav” kelátképzőként neveztünk el. Az ilyen fémek jegyzéke a fenti Reardan et al. közleményben található. A kelátképzöszerek a 4 678 667 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kerültek megvitatásra.
A találmány szerinti eljárás alkalmas még antigén-reaktív régiót tartalmazó antifémkelát antitest fragmensek nemspecifikus fehérjétől való elválasztására, beleértve a nemspecifikus antitesteket és fragmenseiket is. Az antifémkelát antitest fogalomba a találmányi leírásban beleértendők annak olyan fragmensei, melyek antigén-reaktív régióval rendelkeznek (Fab fragmensek: Fab, F(ab’)2 és Fab’).
A találmány szerinti eljárásnak számos előnye van az antifémkelát antitestek tisztítására használt hagyományos af • · ' 11 ............
finitás-kromatográfiai módszerekkel szemben. Mint említettük, az eljárás nemcsak azt teszi lehetővé, hogy elválasszuk az antifémkelát antitesteket a nem-specifikus antitestektől, de azt is, hogy vegyértékük alapján differenciálni lehessen a karbonsavval módosított szilárd fázisú hordozó iránt különböző affinitást mutató antitesteket. Ezenkívül a módszer gazdaságosabb, mivel a módosított szilárd fázisú hordozók, pufferek és sók kevésbé költségesek és jobban hozzáférhetőek, mint a fémkelát gyanták és fémkelát haptének. Sőt, az oszlop könnyen sterilizálható, pirogén-mentesíthető, megtisztítható a felhalmozott fehérjétől és regenerálható, pl. 0,2 N nátrium-hidroxiddal végzett kezeléssel.
A monoklonális antifémkelát antitestek sokkal szorosabban kötődnek az ilyen nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozóhoz, mint az egyéb, szövettenyészetek felülúszójában általában található fehérjék, és váratlan módon még szorosabban kötődnek, mint a nem-specifikus, magasabb pl-vel rendelkező monoklonális antitestek. Egy egyedi fehérje vagy antitest pl-je, vagy „izoelektromos pont’’-ja, elsősorban az aminosav összetétel függvénye és úgy definiálható, mint az a pH, ahol a fehérjemolekula töltése nulla. E fölött az izoelektromos pont fölött a fehérje töltése negatív, ez alatt pedig pozitív. Bármely pH-η a magasabb pl-vel rendelkező fehérje pozitívabb töltésű, ill. fordítva, kevésbé negatív töltésű, mint az alacsonyabb pl-vel rendelkező fehérje. Különösen a hasonló szerkezetű és fizikai tulajdonságú fehérjék esetén, amilyenek az antitestek is, a magasabb pl várhatóan erősebb kölcsönhatást jelent a karbonsavval módosított szilárd hordozó negatív töltést funkci12 ós csoportjaival, mivel általában ionos erők felelősek a fehérjék és a negatív töltésű funkciós csoportok egymásra hatásáért. De még olyan antitestek esetén is, melyeket úgy manipuláltak genetikailag, hogy azonos konstans területeik legyenek, az antifémkelát antitestek retenciós ideje hosszabb a nemfelismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozón, mint a magasabb pl-vel rendelkező nem-fémkelát specifikus antitesté. Hasonló meggondolás alapján magasabb pH-η ugyanannak az antitestnek kevésbé pozitív a töltése, így a negatív töltésű funkciós csoportok kevésbé biztonságosan tudják a karbonsavval módosított szilárd hordozón megtartani. Ennek ellenére felfedeztük, hogy nem-felismerő (kognát) karbonsav hordozók segítségével elvégezhetők a fémkelát antitest elválasztások pH 7,0-en és kisebb pH-η is.
Annak jeleként, hogy az antifémkelát antitestek nem-felismerő (kognát) csoporttal módosított szilárd hordozója immunológiailag specifikus kötést tud létrehozni, az 5 112 951 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti, hogy antifémkelát antitestek, melyek ugyanazon antigén-reaktív régió szekvencia hordozói, de különbözők az állandó régióik és pl értékük - ilyenek a kiméra antitestek és a natív egér-antitestek, melyekből származnak -, ugyanolyan megnyújtott retenciós idővel rendelkeznek a nem-felismerő (kognát) oxo-savval módosított szilárd hordozón. Ezek a váratlan megfigyelések azt jelzik, hogy ebben az esetben nem lehet a pl értékével megmagyarázni a fémkelát specificitással rendelkező antitestek elsődleges magatartását. Sőt, a fémkelát haptén jelenléte a folyékony fázisban hatékonyan felfüggeszti az antifémkelát antitestek nem várt
.............
erős kötődését a nem-felismerő (kognát) csoporttal módosított szilárd fázison, úgy, hogy annyira lecsökkenti retenciós idejüket, hogy az a nem-specifikus antitestek tartományába esik. Figyelembe véve a folyékony fázis versenybe szálló fémkelát hapténjeinek kis méretét, a kölcsönhatás helye, mely felelős az antifémkelát antitestek váratlan kötődéséért vagy azonos az antifémkelát antitest antigénkötődési helyével vagy a közelében van.
A nem-felismerő (kognát) oxosav váratlan erős kötési reakciója és ennek megszűnése fémkelát haptének jelenlétében azt jelzi, hogy az antifémkelát antitestek olyan mechanizmus szerint kötődnek a nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozóhoz, mely különbözik a kationcserélő kromatográfia normál mechanizmusától és a kölcsönhatás ezen új mechanizmusa az antitestek immunológiai specificitásával van összefüggésben. Sőt, ez a váratlan magatartás kiterjed az antifémkelát antitestekből származó bifunkciós antitestekre is. Az ilyen bifunkciós antitesteknek egyetlen fémkelát kötőhelyük van és ez az egyértékűség a felelős azért, hogy mérhetően kevésbé tartja vissza a nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított oszlop, mint a monofunkciós antifémkelát antitestet, amelyből származik s amelynek két fémkelát hapténkötöhelye van.
Az antifémkelát antitestek és a nem-rokon karbonsavval módosított szilárd hordozó kölcsönhatása a specifikus immunológiai kötődés jellegzetességeit hordozza magában. Azt jelzi, hogy a kölcsönhatás az antigén-specifikus kötőhelyen vagy annak közelében megy végbe. Azonban az a tény, hogy növekvő ·
sókoncentráció is elegendő eluálásukhoz azt jelzi, hogy fémkelátokhoz való affinitásukkal összehasonlítva ezen antitestek affinitása a nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozóhoz viszonylag gyenge. Feltételezik, hogy a szilárd hordozón levő nem-felismerő (kognát) karbonsavcsoportok utánozzák a fémkelát haptén egy részének háromdimenziós térbeli konfigurációját vagy töltéssűrúség eloszlását. Ezzel magyarázható az antitest affinitása a mátrixhoz, mely azonban kisebb, mint magához a fémkeláthoz való affinitás. Az ilyen konformációs hasonlóság elképzelhető, mivel a nem-rokon karbonsavval módosított szilárd hordozó olyan negatív töltésű oxigénatomokat tartalmaz, mint a fémkelát haptén. Ez a jellegzetesség arra mutat, hogy más negatív töltésű, sok oxigént tartalmazó rezonancia-szerkezetek is alkalmasak lehetnek a találmány szerinti eljárásban történő felhasználásra. Bármi legyen is a kölcsönhatás alapja, az antifémkelát antitestek magatartása a nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított oszlopon legjobban úgy értelmezhető, mint egy kölcsönhatás, mely tükrözi az antifémkelát antitestek antigénnel szembeni reakcióképességét. Az 1. ábra mutatja, hogy egy fémkeláttal, indiumbenzil-EDTA-val szemben képezett antitest reakcióképessége egy sor nem-rokon karbonsavval szemben hogyan növekszik a fémkelátban - a benzil-EDTA-ban - levő savhoz való hasonlóság növekedésével.
Meg kell jegyezni, hogy a szóban forgó antitest viszonylagos affinitása különböző nem-felismerő (kognát) savjelőlthöz empirikusan is meghatározható, ha szilárd oszlopokról történő eluálást alkalmazunk a szakmában ismert módszerek szerint.
Ezeket a módszereket a példákban mutatjuk be. A szakmában jártas szakember tudja, hogy egy nem-felismerő (kognát) savat úgy is kiválaszthatunk, hogy összehasonlítjuk a vizsgált molekula (savjelölt) szerkezetének hasonlóságát a felismerőhaptén szerkezetével. Általános szabály, hogy annak a nemfelismerő (kognát) savnak, melynek a legnagyobb a szerkezeti hasonlósága a felismerő hapténhez, lesz affinitása ahhoz az antifémkelát antitesthez, mely közelebb áll a felismerő fémkeláthoz.
Számos antifémkelát antitest ismert és beszerezhető. Ilyen a CHA255 és CHB235, melyek egér eredetű monoklonális antitestek és különleges affinitásuk van az indium-EDTA komplexhez. Lásd a 4 722 892 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírást. Az itt felsorolt antifémkelát antitesteket és tulajdonságaikat az 1. táblázatban foglaltuk össze.
il
1. táblázat
| Antitest | Pl | Specificitás | Jellemzés |
| CHA255 | 7,5 | 111ln fémkelát | egér, monoklonális, monofunkciós |
| CHB235 | 6,6- 72 | 111 In fémkelát | egér, monoklonális, monofunkciós |
| XCHA351 | 8,5 | 111 In fémkelát | kiméra, monoklonális, monofunkciós |
| XCEM449.08 | 8,8 | tumor CEA | kiméra, monoklonális, monofunkciós |
| CYA339 | “V fémkelát | egér, monoklonális, monofunkciós | |
| CEVMSC | 7,0- 7,2 | tumor CEA | egér, monoklonális, monofunkciós |
| ECHO037 | 111ln fémkelát/tumor CEA | egér, polidoma- termelt. bifunkciós | |
| BxBFA | 8,6 | 111ln fémkelát/tumor CEA | kiméra, monoklonális, bifunkciós |
| pCYA | Y-fémkelát | egér poliklonális, monofunkciós | |
| ECA 001 | 6,6 | 111ln fémkelát/tumor | egér, polidoma- termelt, bifunkciós |
CEA il *· 4 4 ·» • 9 ·· · · ««· •· ♦
Mind a monoklonális, mind a poliklonális antitestek elkészíthetők a szakmában ismert módszerekkel. így az antigén előállítható úgy, hogy konjugációba visszük a kelátképzőszert az oldatban levő hordozóval, a kapott oldatot összekeverjük a fémsóval, így pl. az indium-citráttal és dializáljuk. Dializálás helyett gélszürést is alkalmazhatunk. A megkötött kelét mennyisége meghatározható az abszorbanciából vagy radioaktív titrálással. Az antifémkelát antitestet termelő hibridoma sejtek a szakmában ismert módszerrel készíthetők (Antibodies, a Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor, New York, 1988).
így a CHA255 és CHB235 készítésénél indium-EDTA antigént állítottunk elő. Kacsakagyló hemocianint (9,3 mg) 265 pl vizes oldatban, pH 6,0-on, 36 C°-on, 8 óra hosszat reagáltattunk (L)-SCN-C6H4-CH2-EDTA-val (izotiocianát-benzil-EDTA, ITCBE). A kapott oldatot 90 pl 0,1 M indium-citráttal elegyítettük, majd dializáltuk 1 mM EDTA, 0,15 M NaCI-val szemben. A tiokarbamidcsoport 310 nm-nél mért abszorbanciájából megállapítottuk, hogy közelítőleg 0,1 mg kelét kötődik egy mg fehérjéhez.
A fenti antigénnel többszörösen immunizált BALB/c egérlép sejteket - Gerhard, (Monoclonal Antibodies, Kennett, et al., eds, Plenum Press, New York, 1980) módszere szerint - fuzionáltuk egy P3.653 myeloma sejtvonal variánssal. A nyert hiridomákat szilárd fázisú második antitest radioimmunmeghatározással szkrineltük Wang et al. szerint (J, Immunoi.
• 9 í
Meth, , 18, 157, 1977) arra, hogy mennyire képesek In(lll)amino-benzil-EDTA-t megkötni. Azokat a hibridomákat, melyek nek magas volt a titere és viszonylag nagy affinitású antitestjeik voltak - a jelzetlen antigénhez való kötődés gátlásának meghatározása szerint - kiválasztottuk és ascites termelés céljából intraperitoneálisan beoltottuk BALB/c egerekbe. Egérantitestek esetében a monoklonális antifémkelát antitesteket az egér-ascitesböl ioncserélő-kromatográfiával tisztítottuk DEAE-cellulózon Parham et al. módszere szerint (J. Immunoi, Meth..
53, 133, 1982).
Az antitestek keláthoz való kötési állandóját Eisen módszerével (Meth. Med. Rés. 10, 106, 1964) határoztuk meg. Röviden, az antitestet és a fémkelátokat 24 óra hosszat dializáltuk az egyensúly közelében 37 C°-on, 0,05 M 2-hidroxi-etil-piperazin-etánszulfonát (HEPES), 0,1 M NaCI, 0,1 % NaN3 és 0,1 % marhaszérum albuminban pH 7-en. A dialízis zsákon belül az antitest kötőhelyek koncentrációja 10'7 M volt és a szabad In(lll)-(L)-amino-benzil-EDTA komplex koncentrációja ugyanebben a tartományban volt. A CHA255 és CHB235 affinitása (kötési állandója) az ln(lll)-EDTA komplexhez 109 L/M és 108 L/M nagyságrendben volt.
Antifémkelát antitest kimérákat is előállíthatunk, melyek expresszálnak pl. egy variálható, egéreredetú régiót és egy állandó, emberi eredetű régiót. CDR-illesztésü antifémkelát antitestek is képezhetők, melyek expresszálnak pl. egér eredetű CDR-eket és emberi eredetű szerkezetet és állandó régiót. Az ilyen kiméra és a CDR-illesztésű antitestek előállításához a variálható és állandó régiók DNS szekvenciáit genom DNS-ből * · lehet nyerni. A genom DNS előállítását és klónozását számos hagyományos módszer segítségével végezhetjük, melyek a következő irodalomban találhatók: Basic Methods in Molecular
Bioloov (L. G. Davis, M. D. Dibner and J. F. Battey, eds., Elsevier, New York, 1986), Feder, J. et al., Am. J. Hűm. Genetics 37. 635-649, 1985, Steffer D. and Weinberg R. A. Cell 15, 1003-1010, 1978, valamint Beidler et al., J. Immunoi,, 141. 4053-4060, 1988. így azt a DNS szekvenciát, mely a kívánt variálható könnyű, és nehézláncú régiót kódolja, olyan egér hibridoma sejt-DNS-ből nyerhetjük, mely expresszálja a kívánt antifémkelát antitestet, Míg a DNS szekvenciát, mely az állandó régiót kódolja, humán lymphocytákból, előnyösen humán perifériás vér-lymphocytákból nyerhetjük. A sejt-DNS szabvány eljárásokkal izolálható. A genom-DNS-t restrikciós endonukleázokkal restrikciós fragmensekre hasítjuk fel és a nyert fragmenseket megfelelő rekombináns DNS-klónozó vektorokba klónozzuk, majd izotóppal ill. enzimmel jelzett mintákkal vizsgáltunk a kívánt DNS-szekvenciákra. Ma már jól ismertek a módszerek, mellyel a kívánt szekvenciát tartalmazó DNSszerkezetek beépíthetők a klónozó vektorokba; és expressziós vektorokba, ilyen irodalmak: Eukaryotic Viral Vectors (Y. Gluyman, ed.), Cold Spring Harbor Laboratories publications, Cold Spring Harbor, New York, 1982, Eukaryotic Transcription (Z. Gluzman, ed.), Cold Spring Harbor, New York, 1985, Sequence Specificity in Transcription and Translation (R. Calendar and L. Gold, eds.), Allan R. Liss, Inc., New York, 1985, Maximizinq Gene Expression (W. Reznikoff and L. Gold, eds.) Butterworths, New York, 1986, Mammalian Cell //'
Technology (W. G. Thilly, ed.), Butterworths, New York, 1986, J. Sambrook and M. J. Gething, Focus, Bethesda Research Laboratories/Life Technologies, Inc. 10 3, 41-48, 1988.
Megfelelő gazdasejtek - előnyösen eukariota sejtek - átalakíthatok akármelyik szakmában ismert szabvány transzekciós eljárással, így elektroporációs technikával, protoplaszt fúzióval és kalcium-foszfát kicsapásos módszerrel, úgy, hogy beépüljenek az expressziós vektorok. Ilyen módszereket közölnek általában Toneguzzo, F. et al., Mól, and Cell Bioi., 6, 703-706, 1986, Chu, G. et al., Nucleic Acid Rés., 15, 1300-1325, 1987, Rice, D. et al., Proc, Natl, Acad. Sci. USA, 79, 7862-7865, 1979 és Oi, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80. 825-829, 1983. Előnyösen a kiméra szerkezetet tartalmazó rekombináns expressziós vektorokat szekvenciálisán építik be a gazda sejtekbe. így először a kiméra könnyű láncú DNS szerkezeteit tartalmazó expressziós vektorokat építik be a gazdasejtbe. Ezután a szakmában ismert eljárásokkal (Engvall, E., Immunochemistry, 8, 871-874, 1971) kiválasztják azokat az átalakított gazdasejteket, melyek a kiméra könnyű láncú polipeptideit expresszálják. Az expressziós vektorokat, amelyek a nehéz láncú DNS szerkezeteket tartalmazzák, ezután építik be a kiválasztott gazdasejtekbe. Egy másik módszer szerint a kiméra mindkét, könnyű és nehézláncú expressziós vektorát egyidejűleg építik be a gazdasejtbe vagy mindkét kiméra génszerkezetet egyetlen expressziós vektorrá kombinálják a sejtekbe való beépítésre. A beépítés és kiválasztás után szabvány analíziseket végeznek olyan kiméra antitestek kimutatására, melyek a kívánt fémkelátok ellen irányulnak.
ί
............
A találmány szerinti eljárás különösen jól alkalmazható bifunkciós antifémkelát antitestek monofunkciós antifémkelát antitestektől való elválasztására. így olyan bifunkciós antitestek nyerhetők, melyek egyik specificitása fémkelátok, a másik különböző antigének ellen irányul. Lásd pl. 4 722 892 sz. és 4 475 893 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat és Martinis et al. Protides of the Biolooical Fluids, H. Peters, ed., 311-316, Pergamon Press, Oxford, 1983. így, ha az egyfajta specificitással rendelkező antitestet kiválasztó sejtet fuzionálják egy másfajta specificitással rendelkező antitestet kiválasztó sejttel, bifunkciós antitesteket expresszáló polidomák képezhetők. A két antitest nehéz és könnyű láncai ekkor összeépülnek és különböző antitest változatokat képeznek, köztük két aktív monofunkciós, kétértékű antitestet (ezek megfelelnek a szülősejteknek), egy aktív bifunkciós antitestet, melynek egyik antigénkötőhelye tartalmazza az egyik szülő könnyű és nehéz láncait, a másik kötőhely pedig a másik szülő könnyű ás nehéz láncait, valamint számos további inaktív fajtát. Az „aktív fogalom alatt értjük azokat a szerkezeteket, melyekben minden egyes antigénkötőhely ugyanattól a szülőtől származó könnyű és nehéz láncból áll, így ezek a szülői specificitás hordozói. Az „inaktív” fogalom azokra a szerkezetekre vonatkozik, melyek nem hordozói egyetlen szülő specificitásának sem, mert egy vagy mindkét antigénkötöhelyük tartalmaz egy nehéz láncot az egyik szülőtől és egy könnyű láncot a másik szülőtől. Ezen polidomák fermentleve különböző antitestfajtákat tartalmaz, így mind az aktív monofunkciós, mind az aktív bifunkciós antiteste ket.
ll
A poliklón antifémkelát antitestek a szakmában ismert eljárásokkal állíthatók elő, lásd pl. Ghose et al., Methods in Enzymoloqv 93. 326-327, 1983. Mivel az ilyen antiszérum számos antifémkelát antitestet és nem-specifikus antitestet is tartalmaz, a találmány szerinti eljárás különösen hasznos, mivel lehetővé teszi az antifémkelát antitestek elválasztását nemspecifikus antitestektől és fehérjéktől, valamint lehetővé teszi az antifémkelát antitestekben dúsított frakciók azonosítását. Az ilyen antiszérum tartalmazhat olyan antifémkelát antitesteket, melyek kis affinitást mutatnak fémkelátokhoz, amelyek retenciós ideje a nem-rokon karbonsavval módosított szilárd hordozón fedésbe kerülhet a felülúszóban található egyéb fehérjék retenciós idejével. A találmány ezért különösen alkalmas az olyan antitestek elválasztására, melyek affinitása a fémkelátokhoz nagyobb, mint 108 L/M, de használható még olyan antitestek nem-specifikus antitestektől való elválasztására is, melyek affinitása 107L/M, sőt olyan alacsony, mint 106 L/M, bár ilyenkor a kapott készítmények már kevésbé tiszták. A módszer különösen alkalmas nagy antifémkelát antitest koncentrációjú frakciók előállítására.
A találmány szerinti eljárás kivitelezési módja szerint az antifémkelát antitesteket tartalmazó oldatot, így a sejttenyészet felülúszóját dializáljuk puffer oldattal szemben - ilyen az 50 mM nátrium-foszfát oldat - pH 7,5-ön vagy alatta, előnyösen pH 5,6 és 6,8 között, még előnyösebben pH 6,8-on és felvisszük egy nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított gyantaoszlopra, melyet előzőleg egyensúlyba hoztunk a kiindulási oldattal, rendszerint ugyanazzal a puffer oldattal vagy olyannal, melynek vezetőképessége azonos az oldatéval, amiben felvittük az antitestet. A gyanta előnyösen karboxi-metil-ioncserélő gyanta. Ilyen kereskedelemben beszerezhető karboxi-metil (CM) gyanta lehet TSK CM 5/PW (TosoHaas, Philadelphia, Pennsylvania) és (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) és Pharmacia CM Sepharose Fást Flow (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, Jersey). Kereskedelemben beszerezhető imino-diecetsav (IDA) lehet Chelate Column (Poros, Cambridge, Massachusetts and TosoHaas). Használhatók azonban egyéb karbonsavval módosított nem-felismerő (kognát) szilárd hordozók is. Megfelelő hordozóanyag a polimer gyanta, ilyen lehet a polisztirol és poliészter, üveg és üvegmatrix, dextrán és cellulóz, valamint a polimerrel bevont hordozók, de a szakmában jártas szakemberek további készítményeket is ismernek. A nemfelismerő (kognát) karbonsavak a szakemberek számára ismert módon vihetők fel a szilárd hordozóra. Ezeket a karbonsavakat alifás, aromás vagy különböző hosszúságú elágazó alkilcsoporton keresztül kapcsolhatjuk a gyantához, csak annak van jelentősége, hogy a karboxicsoport hozzáférhető legyen.
A találmány szerinti eljárás egyik kivitelezési módja szerint, melyben monoklonális antifémkelát antitesteket kell elválasztani nem-specifikus antitestektől és más, nem-specifikus fehérjéktől, a megkötött anyagot az oszlopról növekvő sókoncentrációjú oldattal, lineáris gradiens eluálással mossuk le, a szakemberek számára ismert módon. Erre a célra különböző puffersók alkalmazhatók, íg például - nem korlátozó jelleggel - a nátrium-foszfát, nátrium-klorid, nátrium-acetát és nátriumszulfát. Előnyösen lineáris gradienst alkalmazunk 300 mM nát24 rium-foszfátig, pH 7,5-ön vagy ennél kisebb pH-η. Egy másik változat szerint nátrium-foszfát puffért alkalmazunk, pH 7,5-ön vagy ennél kisebb pH-η, nátrium-szulfát gradienssel kiegészítve. Az összegyűjtött eluátum-frakciókban ismert módon, így ultraibolya abszorbancia méréssel, meghatározzuk a fehérjetartalmat. Az antifémkelát antitestek hosszabb retenciós idővel eluálódnak az oszlopról, mint a nem-specifikus antitestek, így lehetővé válik elválasztásuk.
A találmány szerinti eljárás további kivitelezési módja szerint, ahol aktív, bifunkciós antifémkelát antitesteket kell elválasztani egyéb antitestektől és fehérjéktől, melyek egy polidoma tenyészetben találhatók, a fermentlevet felvisszük egy fentiekben leírt, nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított, szilárdfázisú hordozóra és megmérjük az eluátumok fehérjekoncentrációját. Ekkor különböző csúcsok jelennek meg. Normál körülmények között a bifunkciós antitest a két szülői típus között eluálódik. Módosított ELISA teszttel - melynek feltétele, hogy mindkét aktivitás egyetlen részben legyen jelen - határozzuk meg azt a csúcsot, mely megfelel az aktív bifunkciós antitestnek. Ezután az eluálás feltételeit már úgy lehet megválasztani, hogy a bifunkciós antifémkelát antitestek jól elváljanak a többi antitest típustól.
A találmány szerinti eljárás további kivitelezési módja szerint poliklonális antiszérumból állítunk elő antifémkelát antitestekben dúsított eluátum-frakciókat. Ha az antiszérumot átfuttatjuk a fentiekben leírt, nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított, szilárdfázisú hordozón, a fehérjekoncentráció egy Gauss-görbe alakját veszi fel. A kvantitatív ELISA méréssel meg25 ..............
határozott antifémkelát aktivitás növekszik a későbbi frakciókban. így, ha az antiszérumot átengedjük egy nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd fázisú hordozón és kiválasztjuk a későbbi eluátumokat, antifémkelát antitestekben dúsított anyagot nyerünk.
Bár a találmány szerinti eljárást a következő példákban meghatározott körülmények között ismertetjük - ebbe beletartozik a szilárd hordozó típusa, a puffer és a gradiens összetétele, az adott antitestek affinitása - a szakember számára világos, hogy a kívánt antitest elválasztására alkalmazandó tényleges eluálási viszonyok empirikusan is meghatározhatók. így a találmány szellemében eljárva empirikusan is találhatók olyan eluálási körülmények, melynél a nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozók nem tartják vissza a nem-specifikus antitesteket, ugyanakkor azonban visszamaradnak az antifémkelát antitestek. Az antifémkelát antitestek a nem-felismerő (kognát) karbonsavval módosított szilárd hordozóról ugyanezzel az eluenssel távolíthatók el. Az eluens sókoncentrációját úgy kell megválasztani, hogy az különbséget tudjon tenni a két antitesttípus között. Az eluálás tényleges körülményeit a módosított hordozó típusa, az eluens összetétele valamint az elválasztandó antifémkelát antitestek és nemfémkelát antitestek fizikai tulajdonságai határozzák meg. Megfelelő eluálási körülmények kifejlesztése után azok alkalmazhatók a szakaszos üzemű tisztításnál, ahol a kiindulási oldatot úgy választjuk meg, hogy megakadályozzuk a nem-specifikus fehérjék kötődését és az eluáló puffért úgy, hogy az eluálja a kívánt antifémkelát antitesteket.
<1
Az eljárást nem korlátozó jelleggel a következő példákkal szemléltetjük.
1. példa
Antifémkelát antitestek nagynyomású kromatográfiája (HPLC) szulfo-propil oszlopon.
A szulfo-propil (SP) oszlopot (75 x 7,5 mm), melynek töltete 10 mikronos TSK SP 5PW gyantagyöngy, a Bio-Rad Laboratories-tól szereztük be, a gyártócég utasításai alapján készítettük elő és minden egyes kromatográfia alkalmával a kívánt pH-n 50 mM nátrium-foszfát pufferrel hoztuk egyensúlyba. Az antifémkelát antitestet, BxBFA-t, egy egér/humán kiméra monoklonális, bispecifikus antitestet, melynek pl értéke 8,6 és specifikus In-benzil-EDTA fémkelátra, valamint tumor CEA-ra, 1:3 arányban hígítottunk az egyensúly kialakításához használt pufferrel. 100 pg antitestet vittünk fel az oszlopra és hagytuk, hogy hozzákötödjön a mátrixhoz. A tervezett pH és foszfát koncentráció biztosítására minden kísérletben az antitest eluálásánál három - esetenként négy - szivattyút használtunk az egy- és kétbázisú foszfát oldatok összekeveréséhez. Egy sor lineárisan növekvő sókoncentráció-gradienst futtattunk melyben 100 perc alatti 50 mM-ról 300 mM-ra emeltük a nátrium-foszfát koncentrációt, 8,0, 7,3, 6,7, 6,2 vagy 5,5 pH-érték és 1 ml/perces áramlási sebesség mellett. Az antitestet 280 nm-nél mért abszorbancia meghatározásával mutattuk ki, Waters 490E (Milford, Massachusetts) változtatható hullámhosszú ultraibolya detektor alkalmazásával.
ií
A 2. ábrán látható, hogy a pH csökkenésével nő az antitest retenciós ideje az oszlopon. Ennek oka, hogy az antitest egyre pozitívabb töltése, amit ilyen alacsony pH értéken felvesz, növekvő vonzást mutat a szulfo-propil oszlop negatív töltéséhez. pH 5,5-en a BxBFA retenciós ideje közelítőleg 50 perc pH 5,5ön.
2. példa
Antifémkelát antitestek elválasztása karboxi-metil oszlopon
A 10 mikronos TSK CM 5/PW gyantagyönggyel töltött karboxi-metil (CM) oszlopot (75 x 7,5 mm) a Bio-Rad Laboratories-tól szereztük be, és a gyártó cég utasításai alapján készítettük elő, egyensúlyba hoztuk, majd elkészítettük az antitestet, amit az 1. példában leírtak szerint felvittük az oszlopra. Az 1. példában leírtakhoz hasonlóan egy sorozat eluálást végeztünk pH 8.0, 7,3, 6,7, 6,2 és 5,5 pH-értéken. A 3. ábrán ábrázoltuk a karboxi-metil oszlopon mért eluálási időket. A szulfo-propil oszloppal összehasonlítva a BxBFA sosem eluálódott a karboxi-metil oszlopról pH 5,5-ön. A BxBFA pH 5,5 helyett pH 6,2-őn eluálódott a karboxi-metil oszlopról, közelítőleg 61 perces retenciós idővel, ami hosszabb, mint amit a szulfo-propil oszlopon tapasztaltunk pH 5,5-őn, azonos gradiens sókoncentráció mellett. Összehasonlítva a szulfo-propil oszloppal, a BxBFA erősebb retenciója a karboxi-metil oszlopon annak ellenére áll fenn, hogy magasabb pH-η az antitest pozitív töltése lecsökken. Az ionos vonzás csökkenése azt jelenti, hogy az ellentétes töltés vonzásán kívül más erők is felelősek a
28« karboxi-metil oszlopon tapasztalt hosszabb retenciós időért. Általában a karboxi-metil oszlopon megfigyelt hosszabb retenciós idők egyúttal azt is jelentik, hogy a tisztítást magasabb pH-η is végre lehet hajtani, pH 6 felett, vagy még közelebb a kiindulási sejttenyészet fiziológiai pH-jához. T. i. in vitro sejttenyésztési eljárásokkal előállított antitestek esetén, ha a kiindulási anyag pH-ját 5,5-re vagy az alá állítjuk, kicsapódhat a fehérje az antitesttel együtt.
3. példa
Haptén hatása az antifémre
A 10 mikronos TSK CM 5/PW gyantagyönggyel töltött karboxi-metil (CM) oszlopot (75 x 7,5 mm) a Bio-Rad Laboratories-tól szereztük be és a gyártó cég utasításai alapján készítettük elő. Az oszlopot egyensúlyba hoztuk, elkészítettünk egy tisztított ECA 001 mintát, majd az 1. példában leírtak szerint felvittük az oszlopra. Az ECA 001 egy egér polidoma által termelt bispecifikus antitest, pl értéke 6,5 és specifikus Inbenzil-EDTA fémkelátra és tumor CEA-ra. Az eluálást az 1. példa szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy az oldatok pHja 9,4 8,3, 7,4, 6,8, 6,2 és 5,5 volt. Az eluálási időket a 4. ábra mutatja be. Az ECA 001 retenciós ideje pH 6,2-őn 5 perccel rövidebb volt, mint a BxBFA-é a 2. példában. Az ECA 001 antitest vonzódása a karboxi-metil oszlophoz elvileg hasonlít a BxBFA-hoz, mivel azonban ennek az antitestnek a BxBFA-nál több negatív töltése van - ami akkor is látható, ha összehasonlítjuk megfelelő pl értékeiket - bizonyos fokig taszítja a negatív töltésű karboxi-metil oszlop. Bár a két antitestnek igen különböző a pl értéke, közös specificitásuk az In-benzil-EDTA li fémkeláttal szemben oda hat, hogy hasonló a retenciójuk az oszlopon, A fenti 2. példához hasonlóan pH 5,5-ön a foszfát oldatos eluálás nem tudta az ECA 001 antitestet lehozni az oszlopról.
4. példa
A 10 mikronos gyantagyönggyel töltött imino-diecetsav (IDA) oszlopot (75 x 7,5 mm) Chelate Column néven a TosoHaus cégtől szereztük be és a gyártó cég utasításai alapján készítettük elő. Az oszlopot fémterhelés nélkül hoztuk egyensúlyba, az antifémkelát antitestet, BxBFA-t, az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő és vittük fel az oszlopra. Egy sorozat foszfát pufferes eluálást végeztünk az 1. példában leírtak szerint azzal a különbséggel, hogy a pH 9,0, 8,0, 7,3, 6,7, 6,2 és 5,5 volt és időbeli lefutása az 5. ábra szerint alakult. Az antitestet nem lehetett az oszlopról eluálni pH 9.4 mellett még 500 mM-os nátrium-foszfáttal sem. Valószínű, hogy az imino-diecetsav szerkezete túlságosan hasonlít a benzilEDTA-hoz, a felismerő savkelátorhoz, hogy a fémkelátot egy egyszerű foszfátsó oldattal lehessen eluálni.
5. példa
A 10 mikronos gyantagyönggyel töltött imino-diecetsav (IDA) oszlopot (75 x 7,5 mm) Chelate Column néven a TosoHaus cégtől szereztük be és a gyártó cég utasításai alapján készítettük elő. Az oszlopot fémterhelés nélkül hoztuk egyensúlyba, az antifémkelát antitestet, BxBFA-t, az 1. példában leírtak szerint állítottuk elő és vittük fel az oszlopra. Az eluálást az 1. példában leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy lineáris gradiens koncentrációjú glutaminsav il oldatot használtunk O-tól 240 mM-ig, pH 8,2, 7,2, 6,7, 6,2 és 5,6-on. Hasonló eluálást végeztünk glicin oldattal is pH 8,1, 7,3, 6,7 és 5,6-on. Az eluálási időket a 6a. és 6b. ábrákon mutatjuk be. A gradiens mentén a pH-t nátrium-foszfát pufferekkel stabilizáltuk, melyek végső koncentrációja 60 mM volt. Feltételeztük, hogy a glutaminsav és a glicin szerkezete eléggé hasonlít a felismerő fém/benzil-EDTA szerkezetéhez, hogy le tudja szorítani az antitestet az oszlopról, míg a foszfát oldat nem képes erre.
6. példa
Az imino-diecetsav (IDA) oszlopot az 5. példában leírtak szerint készítettük el, hoztuk egyensúlyba és vittük fel rá a mintát, azzal a különbséggel, hogy az antitest tisztított ECA 001 volt. Az eluálást az 1. példában leírtak szerint végeztük, azzal a különbséggel, hogy az oszlop eluálásához lineáris nátrium-szulfát koncentráció-gradienst alkalmaztunk. Az eluáló oldat pH-ját ismét 60 mM foszfáttal tartottuk fenn, 9,4, 8,1, 7,4, 6,8, 6,2 és 5,2 értéken. Az eluálási időket a 7. ábra mutatja be. A példa igazolja, hogy a szulfát - a glutaminsavhoz hasonlóan - nem- felismerő hapténként működik.
7. példa
A glutaminsav (GLU) oszlopot 10 mikronos gyantagyöngyökből, a gyártócég utasításai szerint, Tresyl 5/PW oszlop (TosoHaus) felhasználásával készítettük el. Az oszlopot az 5. példában leírtak szerint hoztuk egyensúlyba és vittük fel rá a mintát, azzal a különbséggel, hogy az antitest BxBFA volt. Az eluálást az 1. példában leírtak szerint végeztük, azzal a kü31 lönbséggel, hogy lineáris nátrium-foszfát gradienst (50-300 mM) használtunk az eluáláshoz, pH 8,1, 7,4, 6,9, 6,4 és 5,7 mellett. Az eluálási időket a 8. ábra mutatja be.
Noha a találmány a jelen előnyös kivitelezési módozatokban került bemutatásra, a szakember számára kézenfekvő, hogy módosítások eszközölhetők anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől. így a találmányt csak a következő igénypontok korlátozzák.
Claims (12)
1) növekvő koncentrációjú nem-karbonsav sóoldat, melynek koncentrációja elég magas ahhoz, hogy a hordozóról eluálni tudja a fenti antifémkelát antitesteket, és ahol az oszlop, a szétválasztandó készítményt tartalmazó oldat és az eluáló oldat pH-ja közelítőleg 6,2 és 6,8 között van, vagy
1. Eljárás antifémkelát antitestekben dúsított eluátum frakciók előállítására, melyek pl értéke 6 és 9 között van, olyan készítményekből, melyek fenti antifémkelát antitesteket és nemspecifikus fehérjéket tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy
a) a fenti készítményt egy kiindulási oldatban felvisszük egy nem-felismerő (kognát) monokarbonsavval módosított szilárd hordozóra, melyet ugyanezzel a kiindulási oldattal hoztunk egyensúlyba,
b) eltávolítjuk a hordozóról a fenti nem-specifikus fehérjét,
c) hozzáadagoljuk az eluáló oldatot, mely vagy
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy savszármazékként karboxi-metil származékot alkalmazunk.
2) egy nem-felismerö (kognát) haptént tartalmazó oldat, melynek affinitása van az antifémkelát antitestekhez, és
d) összegyűjtjük a c) lépésben eluált frakciókat.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd hordozóként polimerrel bevont hordozót, polisztirolt, poliésztert, üveget, dextránt és cellulózt alkalmazunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fenti antifémkelát antitestek antifémkelátként monoklonális antitesteket alkalmazunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eluáló oldatot alkalmazunk, amely először nemkarbonsav sót tartalmaz, majd a b) lépésben egy további, második nem-karbonsav sót, olyan koncentrációban, mely lehetővé teszi a nem-specifikus fehérje eluálását a hordozóról.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eluáló oldatot alkalmazunk, amely először nemkarbonsav sót tartalmaz, mely lehet nátrium-foszfát, nátrium-klorid, nátrium-acetát vagy nátrium-szulfát.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első és a második nem-karbonsav sóként megegyező kémiai képletű sókat alkalmazunk.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eluáló oldatot alkalmazunk, amely az első nem-karbonsav sót tartalmazza és a mintafelvitel is ebben az oldatban történik, melynek sókoncentrációja elég magas ahhoz, hogy megakadályozza a nem-specifikus fehérjék kötődését, de nem akadályozza meg az antifémkelát antitestek megkötését.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antifémkelát antitestként egy olyan fragmenst alkalmazunk, mely hordozója az antigén-reaktív régiónak.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antifémkelát antitesteket alkalmazunk, melyeket olyan fémkelátot képző szerek ellen termelték, melyek egynél több karboxilcsoporttal képesek kelátot képezni.
t
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárással hatékonyan elválaszthatók egy készítményben levő 6-9 pl-értékú antifémkelát antitestek a nem-specifikus fehérjéktől.
12. Eljárás 6-9 pl-értékkel rendelkező bifunkciós antifémkelát antitestek elválasztására, bifunkciós antifémkelát antitestet, monofunkciós antifémkelát antitestet és nem-specifikus fehérjét tartalmazó készítményből, melyben az antifémkelát antitestet olyan fémkelátot képző szerekkel szemben termelték, melyek egynél több karboxilcsoporttal képesek kelátot képezni, azzal jellemezve, hogy
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6076693A | 1993-05-11 | 1993-05-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9503232D0 HU9503232D0 (en) | 1996-01-29 |
| HUT73396A true HUT73396A (en) | 1996-07-29 |
Family
ID=22031612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9503232A HUT73396A (en) | 1993-05-11 | 1994-05-03 | Separation of anti-metal chelate antibodies |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0698037A1 (hu) |
| JP (1) | JPH08509983A (hu) |
| KR (1) | KR960702474A (hu) |
| AU (1) | AU6824494A (hu) |
| CA (1) | CA2162671A1 (hu) |
| HU (1) | HUT73396A (hu) |
| WO (1) | WO1994026772A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA943142B (hu) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2584727B1 (fr) * | 1985-07-11 | 1988-06-17 | Roussel Uclaf | Procede d'extraction de proteines du lait, produits, application du procede, et compositions pharmaceutiques |
| ATE107276T1 (de) * | 1988-02-03 | 1994-07-15 | Hybritech Inc | Modifizierte haptene, nützlich als bildformendes agens und als arzneimittel. |
| US5112951A (en) * | 1989-07-28 | 1992-05-12 | Hybritech Incorporated | Separation of anti-metal chelate antibodies |
-
1994
- 1994-05-03 KR KR1019950705067A patent/KR960702474A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-05-03 WO PCT/US1994/004878 patent/WO1994026772A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-05-03 EP EP94916647A patent/EP0698037A1/en not_active Withdrawn
- 1994-05-03 JP JP6525517A patent/JPH08509983A/ja active Pending
- 1994-05-03 AU AU68244/94A patent/AU6824494A/en not_active Abandoned
- 1994-05-03 CA CA002162671A patent/CA2162671A1/en not_active Abandoned
- 1994-05-03 HU HU9503232A patent/HUT73396A/hu unknown
- 1994-05-06 ZA ZA943142A patent/ZA943142B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6824494A (en) | 1994-12-12 |
| WO1994026772A1 (en) | 1994-11-24 |
| JPH08509983A (ja) | 1996-10-22 |
| HU9503232D0 (en) | 1996-01-29 |
| EP0698037A1 (en) | 1996-02-28 |
| ZA943142B (en) | 1995-01-09 |
| KR960702474A (ko) | 1996-04-27 |
| CA2162671A1 (en) | 1994-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4122050B2 (ja) | ヒト癌腫抗原（ｈｃａ）、ｈｃａ抗体、ｈｃａ免疫アッセイ法、画像化の方法及び治療 | |
| AU594651B2 (en) | Immunoassays for protein analytes, particularly HB A1c, involving sample denaturation | |
| AU600439B2 (en) | Ras oncogene peptides and antibodies | |
| Hannestad et al. | Polyclonal human antibodies to IgG (rheumatoid factors) which cross‐react with cell nuclei | |
| EP2105447A1 (en) | Avian-derived antibody capable of binding specifically to human hmgb1, immunological determination method for human hmgb1, and immunological determination reagent for human hmgb1 | |
| WO2012059495A1 (en) | Optimized method for antibody capturing by mixed mode chromatography | |
| WO2003000176A2 (en) | Conjugates of reduced antibodies and biomolecules | |
| JP2567564B2 (ja) | ヒト非小細胞肺癌に関する抗原 | |
| JPH04505857A (ja) | Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル抗体 | |
| JPH05244987A (ja) | 抗硫酸化チロシン抗体，その製造方法及び抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ | |
| Muller et al. | Specificity of antibodies raised against triacetylated histone H4 | |
| CN116041502A (zh) | 一种识别Tau蛋白pT181磷酸化的单克隆抗体及其应用 | |
| Furie et al. | Antibodies to the unfolded form of a helix-rich region in staphylococcal nuclease | |
| CA1338324C (en) | Monoclonal antibody for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type iii) and procollagen (type iii) in body fluids | |
| JP5055598B2 (ja) | ヒトｈｍｇ−１に特異的に結合する抗体を用いるヒトｈｍｇ−１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬 | |
| EP0415557B1 (en) | Separation of anti-metal chelate antibodies | |
| HUT73396A (en) | Separation of anti-metal chelate antibodies | |
| Hammond et al. | Characterization of a monoclonal antibody to human sex hormone binding globulin | |
| IE881290L (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological¹determination of intact procollagen peptide (Type III) and¹procollagen (Type III) in body fluids | |
| Muller et al. | [12] Use of antihistone antibodies with nucleosomes | |
| JP3888695B2 (ja) | ヒトｌｅｃｔ２に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット | |
| EP1889060A2 (en) | Monoclonal antibody reagents | |
| US4943524A (en) | Enzyme immunoassay for cancer procoagulant | |
| JP2018138520A (ja) | 抗ミッドカインモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫学的測定キット | |
| JPH09297137A (ja) | 変性又は修飾リポタンパク質（ａ）に結合する抗体及びこの抗体を用いる測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee |