JPH08508891A - 細胞の長期増殖及び発生用培地 - Google Patents
細胞の長期増殖及び発生用培地Info
- Publication number
- JPH08508891A JPH08508891A JP7502993A JP50299395A JPH08508891A JP H08508891 A JPH08508891 A JP H08508891A JP 7502993 A JP7502993 A JP 7502993A JP 50299395 A JP50299395 A JP 50299395A JP H08508891 A JPH08508891 A JP H08508891A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- medium
- serum
- culture
- medium according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000007774 longterm Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000012010 growth Effects 0.000 title claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 211
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 123
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 36
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 14
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 14
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims abstract description 9
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 8
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims abstract description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 24
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 18
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 17
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 12
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 10
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 claims description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims description 3
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 claims description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 claims description 3
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002912 lymphogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims description 3
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims 1
- YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 2'-deoxyguanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101000766307 Gallus gallus Ovotransferrin Proteins 0.000 claims 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 48
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 38
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 abstract description 31
- 230000011712 cell development Effects 0.000 abstract description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 abstract description 6
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 47
- 239000000306 component Substances 0.000 description 39
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 32
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 30
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 28
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 22
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 16
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 13
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 12
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 7
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 6
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 3
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101001027130 Mus musculus Fibronectin Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 150000001887 cortisones Chemical class 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAXYLHVUYZTRNE-GZASURKISA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one;4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JAXYLHVUYZTRNE-GZASURKISA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 241001400238 Dictyostelium medium Species 0.000 description 1
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101000980898 Homo sapiens Cell division cycle-associated protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100028198 Macrophage colony-stimulating factor 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- VZQXUWKZDSEQRR-UHFFFAOYSA-N Nucleosid Natural products C12=NC(SC)=NC(NCC=C(C)C)=C2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O VZQXUWKZDSEQRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 101000879673 Streptomyces coelicolor Subtilisin inhibitor-like protein 3 Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000947 anti-immunosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N cortisol 21-acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N 0.000 description 1
- 125000000017 cortisol group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000044493 human CDCA4 Human genes 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004283 incisor Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 101150035614 mbl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical group 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- JKVUQLWTIZFTMF-UHFFFAOYSA-M potassium;2-oxopropanoate Chemical compound [K+].CC(=O)C([O-])=O JKVUQLWTIZFTMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/36—Lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/58—Adhesion molecules, e.g. ICAM, VCAM, CD18 (ligand), CD11 (ligand), CD49 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1394—Bone marrow stromal cells; whole marrow
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
標準培地(例えばIscove改良ダルベッコ培地)、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質及び脂肪酸源、コレステロール、還元剤、ピルビン酸塩、グルココルチコイド(培養すべき細胞が造血細胞の場合)、DNA及びRNA合成用ヌクレオシド、基質細胞や種々の組織又は器官の細胞の増殖及び発生を剌激する成長因子(例えば表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子及びインシュリン)、並びに細胞外マトリックス細胞(例えばコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニン)を細胞の増殖や発生に効果的な量含んでいる、細胞(特に造血細胞及び骨髄基質細胞)の短期及び長期の増殖や発生のための無血清又は低血清培地。
Description
【発明の詳細な説明】
細胞の長期増殖及び発生用培地発明の背景
I.発明の分野
本発明は、細胞の増殖及び発生(development)を支援するための無血清(ser
um-free)または低血清(serum-depleted)培地に係わる。特に本発明は、造血
細胞及びそれらの成長を支援する基質細胞(stromal cells)の長期増殖用培地
に係わる。更に本発明は、かかる培地を使用して種々の組織及び器官由来の哺乳
動物細胞を培養する方法に係わる。本発明の培地及び方法によって細胞の増殖及
び発生を最高数カ月間にわたって維持し得る。
II.発明の背景及び従来の技術
本発明の1つの態様は、血清の不在下または実質的に低減された状態で細胞、
特に哺乳動物細胞を培養するための培地であって、化学的に十分に確定されてお
り、かかる細胞の発生及び増殖を長期間支援し得る培地である。
これまでに多くの種類の哺乳動物細胞が単離され、更なる研究または使用のた
めに細胞を培養して増殖させる試みがなされている。かかる培養に使用される培
地は一般には、
多くはウマ、ウシまたは仔ウシ血清によって与えられる細胞の増殖及び発生に必
要な栄養素、付着因子及び成長因子の供給源を含んでいる。しかしながら、生理
学的状態が与えられるわけではないので、細胞培養を支援すべく血清を使用する
ことには問題がある。実際、細胞が細胞培養に通常使用される部類の血清濃度に
直面するのは、血液が凝固する創傷の部位だけであろう。血清の使用は更に、コ
ストが高いことや、試料ごとに様々な未確定成分が血清中に存在することにより
やっかいなものとなる。かかる未確定成分が存在したりしなかったりすることで
細胞培養に一貫性がなくなり、培養プロセスの制御が不十分となる。例えば、特
定の血清試料により特性の成分が培地に導入され、細胞の成長が阻害され得る。
血清の存在に伴う問題に応えて、これまでに種々の無血清培地が作製されてお
り、例えば下記のものが参照される:
上記の多数の引用文献に記載されているように、増殖及び発生の刺激物質とし
て造血成長因子を使用し、造血前駆細胞を短期間(最高3〜4週間)無血清培養
する方法が既
に存在する。しかしながら、造血細胞の長期培養を研究するための理想的な無血
清培地の開発は特に難しいことが示されている。
本発明以前には、in vivoで起こるプロセスの幾つかを厳密に模倣すると見ら
れる血清補充骨髄培養系を主に使用し、哺乳動物の長期造血がin vitroで研究さ
れている。最初のこのような実験はDexter,T.M.ら,J.Cell.
Physiol.,91:335−344(1977)に記載されており、内皮
細胞、線維芽細胞、アジポサイト(adipocytes)及びマクロファージを含むネズ
ミ骨髄基質細胞の付着層の形成に係わる。この細胞層は、恐らくは物理的に付着
性のマトリックスと、造血細胞の増殖及び発生に必要な成長因子を含む正しい細
胞間シグナル発生とを与えることにより、造血細胞を支援するのに必要とされる
。
Dexter培養において行われる造血は、基質細胞層と密に接触して起こる
。多くの場合で幹細胞及び前駆細胞は、位相差顕微鏡下での特徴的な外観により
敷石状領域(cobblestone regions)と称される箇所を形成する基質細胞下で増
殖する。造血細胞が成熟すると、それらの多く
は基質細胞の表面最上部に移動する。更に、十分に分化した状態にまで成熟する
と造血細胞を周辺の培地中に放出し、造血細胞は週に2回フィーディングにより
取り出される。
上記培養系では造血が数カ月維持され、前駆細胞が一定して産生された。その
後まもなくヒト細胞に対しても同様の系が開発された(Gartner,S.及
びKaplan,H.S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
77:4756−4759(1980))。
Dexter法の1つの重要な欠点は、通常は骨髄、特にBリンパ球によって
産生される他の細胞種の犠牲のもとに、主にマクロファージと好中球とを発生し
得ることである。Bリンパ球の長期産生方法はWhitlock,C.A.及び
Witte,O.N.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79
:3608−3612(1982)によって発見された。この系は、ウマ血清を
ウシ胎仔血清で置き換え、ヒドロコーチゾンを2−メルカプトエタノールで置き
換えている点でDexterらの方法とは異なる。しかしながら、この系ではB
リンパ球以外の造血種の発生は除外される。これら2つの培養系において起こる
発生の相違の理由、及びこれらが骨髄造血のどんな面
をも模倣しない理由は判っていないが、恐らくは血清の使用が影響している。
細胞、特に哺乳動物造血細胞を培養するのに理想的な、化学的に制御された培
地を製造する試みが多数行われているにもかかわらず、このような培地には尚も
多数の欠点がある。例えば、従来の培地はかかる細胞を本当には長期培養できな
い。本発明によれば、「長期」とは、培地中での新しい前駆細胞の産生を含め、
増殖及び発生が約8週間以上継続することと定義される。本発明の培地は培養中
で最高3〜5カ月の継続的な成長及び発生を行い得る。このような長期間にわた
って哺乳動物造血細胞を培養できる無血清培地は従来はなかった。
以下、幾つかの別の関連従来技術を簡単に説明する。
Cormierら,Growth Factors.1991;4:157−
164は純化した(enriched)ネズミ造血幹細胞の無血清培養に係わり、ある種
の成長因子が増殖に及ぼす影響に注目している。しかしながら、この文献に記載
されている培地は、本発明と比較して異なる成分を異なる相対割合で含み、本発
明培地とは対照的に(本明細書に定義したような)長期成長を行うことはできな
かっ
た。
Dexter,T.M.ら,J.Cell.Physiol.91:335−
344(1977)は、古典的なDexter長期骨髄培養法を開示している。
本発明とは違ってこの方法は血清を含むことは注目すべきである。その結果、該
方法の使用は既に記載されているようにある種のマウス株に制限され、かかる株
でさえ、その成長は本発明ほど顕著ではない。
Dexter,T.M.ら,Long−Term Bone Marrow
Culture,New York:Alan R.Liss:57−96は長
期骨髄培養方法及び培地の総説である。この文献に記載の方法及び培地はいずれ
も本発明と同じ部類の成分を含まない。
Drouet,X.ら,Brit.J.of Haem.73:143−14
7(1989)は、無血清のヒト長期骨髄培地を開示している。しかしながら、
そこに記載されている培地は本発明と同程度の長期培養は行えず、成長はたった
3〜4週間維持されるだけである。更に、本発明の培地とは違い、Drouet
らによって検討されたものは基質細胞を含まない。
Whitlock,C.A.,& Witte,O.N.P.N.A.S.7
9:3608−3612(1982)は、ネズミ骨髄由来のBリンパ球及びそれ
らの前駆体の長期培養に係わる。これは有名なWitte−Whitlock培
養法である。しかしながら、ここでも、この論文に記載されている培地は、血清
を含み、Bリンパ球の成長しか支援できない点で本発明のものとは実質的に異な
る。
Teofili,L.ら,Ann.Hematol.65:22−25(19
92)は、予め形成した細胞外マトリックスを使用してヒト造血前駆細胞を成長
させるための無血清培養系を記載している。しかしながら、この方法では長期成
長は行われず、前駆細胞が妥当な数に維持されるのはたった3週間である。更に
この方法は、骨髄基質細胞の成長を支援すべく成長因子を使用することもないし
、細胞付着用の精製細胞外マトリックス材料を使用することもない。その結果、
広範囲の種々の組織及び器官に由来する細胞の成長は支援されない。
上記の従来技術にもかかわらず、細胞の長期培養用の化学的に規定された培地
の製造に対するニーズが残っている。理想的にはかかる培地は、簡単に製造でき
、化学的に規定
された成分を含み、安価に製造し得、細胞を最適に長期成長及び発生させ得るべ
きである。
従って本発明の目的は、特に造血系の細胞の増殖及び発生を長期間維持するた
めの無血清培地を提供することである。
本発明の別の目的は、化学的に規定された培地中で細胞を短期及び長期培養す
るための培地を提供することである。
本発明の別の目的は、骨髄移植及び/または遺伝子治療におけるかかる細胞中
への遺伝子の移入のために、初期前駆細胞の増殖及び/または発生を刺激する方
法を提供することである。
詳細を後述する本発明の上記及び他の目的は当業者には明らかであろう。
III.発明の要約
本発明によれば、細胞を長期増殖及び発生させるための培地であって、細胞の
成長及び発生に有効な量の、
(a)Iscove改良ダルベッコ培地(IMDM)、RPMI、DMEM、
Fischer培地、α培地、LeibovitのL−15、NCTC、F−1
0、MEM、及びMcCoy培地のような標準培地;
(b)血清アルブミン;
(c)トランスフェリン;
(d)脂質及び脂肪酸源;
(e)コレステロール;
(f)還元剤;
(g)ピルビン酸塩;
(h)DNA及びRNA合成用ヌクレオシド;
(i)基質細胞並びに/または(好ましくは哺乳動物の)種々の器官及び組織
由来の細胞の増殖及び発生を刺激する1種以上の成長因子、例えば上皮成長因子
、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子及びインシュリン;及び
(j)1種以上の細胞外マトリックス材料
を含む無血清または低血清の培地が提供される。
好中球の発生及び増殖が所望される培養(例えば長期骨髄培養)に使用される
無血清培地の任意成分は:
(k)グルココルチコイド、例えばヒドロコーチゾン、コーチゾール、デキサ
メタゾンまたは他の構造的に関連のある天然もしくは合成分子
である。
支援すべき細胞が造血細胞である場合に培地に別個に添加し得る無血清または
低血清培地の他の任意成分は:
(1)詳細は後述する造血細胞の支援網を与える基質細胞
である。
特に好中球の成長に適した本発明の実施態様においては、細胞培地は下記の成
分を記載の濃度で含む。
本発明の好ましい実施態様においては、種々の器官または組織に由来する細胞
の成長に使用される細胞培養培地は既に記載したようなものであるが、但し、ヒ
ドロコーチゾンまたは他の関連グルココルチコイドは含まない。
別の好ましい実施態様においては、ヒドロコーチゾンまたは他のグルココルチ
コイドは培地中に存在せず、且つ、マクロファージの発生及び増殖の刺激物質で
ある成長因子CSF−1による造血前駆細胞の刺激も行われない。これはいくつ
かの方法で達成され得る。CSF−1遺伝子(B6C3Fe−a/a−op/o
pマウス株)またはそのレセプターの遺伝子またはCSF−1レセプターシグナ
ル発生経路の一部が失活され、これによって機能性タンパク質を生成しないマウ
ス突然変異株を使用することが可能である。CSF−1活性の種々の阻害物質も
使用し得る。例えば、CSF−1またはそのレセプターに対する中和抗体を使用
して刺激を防ぐことができる。更に、アンチセンスオ
リゴマー(短い一本鎖核酸配列)を使用してCSF−1、そのレセプターまたは
シグナル伝達機構のある部分の発現を防ぐことができる。このような培養におけ
る組織内での造血系発生は好中球及びマクロファージに制限されるだけでなく、
リンパ球、肥満細胞、巨核球及び赤血球系細胞(erythroid cell)といった他の
細胞も含む。
特に好ましい実施態様においては、培養する細胞は哺乳動物に由来する。
別の特に好ましい実施態様においては、細胞は造血系またはリンパ生成系に由
来する。
IV.図面の簡単な説明
図1は、本発明の無血清培地(LTBMC−SFM)と従来の無血清培地の、
7日後の骨髄付着細胞(基質細胞及び造血細胞)の数の比較を示す。本発明の培
地では2週間後に極めて優れた造血があったが、試験した従来の培地ではいずれ
も造血は認められなかったことに留意されたい。
図2は、無血清培地成分のうち1つの成分の除外が長期骨髄培養の樹立に及ぼ
す影響を、7日後の付着細胞数で示す。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。
図3は、血清を補充した“Dexter”培地(DEX)
に無血清培地の成分を加えたときの影響を示しており、成長因子(+GFs)、
フィッシャー培地に代えてIscove培地(+IMDM)、細胞外マトリック
ス材料(ECM)、追加栄養素(NUTS)を加えた場合及び33℃ではなくて
37℃とした場合を含む。培養SFM+37℃+DEXは標準無血清培地条件下
で実施したが、ウマ血清は含まなかった。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。
図4は、培養7日後の血清補充培地及び無血清培地における付着細胞(骨髄基
質細胞及び造血細胞の併存)の相対数を示す。無血清培養におけるコラーゲン及
びフィブロネクチンといった細胞外マトリックス材料の重要性も示す。フィブロ
ネクチンは濃度2μg/cm2である。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。
図5は、本発明を使用して起こる長期造血を、11週間で産生された非付着性
造血細胞(主に成熟細胞)の総数±標準偏差で表わす。
図6は、本発明を使用して起こる長期造血を、10週間で産生された非付着性
造血前駆細胞(コロニー形成細胞)の数±標準偏差で表わす。
図7は、種々のマウス株を使用したときの無血清長期骨
髄培養から21日後の非付着性造血細胞の産生を示す。C3H、C57B1/6
、Balb/c及びDBA/2は近交系マウス株であり、CD−1は遠縁交配マ
ウス株であり、B6D2F1(BDF1)及びB6C3F1はハイブリッド(それ
ぞれ雌C57B1/6×雄DBA/2及び雌C57B1/6×雄C3H)である
。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。
図8は、ヒドロコーチゾン(HC)の存在下または不在下で正常(+/+)及
び突然変異(op/op)マウスの長期骨髄培養で産生された非付着性造血細胞
形態を示す表である。
V.発明の詳細
A.本発明培地と従来の培地の比較
従来の無血清培地が正常造血細胞を長期成長させられない必然的な理由は、そ
れらが、造血細胞及び基質細胞を含む広範囲の細胞種の成長を支援すべく正しい
成分の組合せを適正濃度範囲で含まないからである。この結果、多数の従来の無
血清培地は、維持するのがより難しいというよりはむしろ、細胞系、正常一次細
胞(即ち動物から直接得られた細胞)の成長を支援することに制限されている。
正常
細胞の成長を維持し得るかかる培地は1種または数種の細胞種に対してのみそれ
を行い、造血細胞及び基質細胞の長期培養を可能にする成長条件は与えられない
。これとは対照的に、本発明の培地は、一次(正常)細胞及び細胞系を含む広範
囲の種々の組織または器官に由来する種々の細胞の成長を支援する固有の能力を
有する。この能力により、造血細胞の成長を支援するのに不可欠な造血前駆細胞
及び骨髄基質細胞(アジポサイト、マクロファージ、内皮細胞及び線維芽細胞)
の長期増殖が可能になる。これは、従来の無血清培地にはない能力である。
従来の無血清培地の別の欠点は種特異的なことであり、これに対して本発明の
培地はマウス及びヒト両方の細胞の成長を支援することができ、他の種に由来す
る細胞の成長及び発生も支援すると期待される。
本発明は従来の無血清培地を著しく改良したものであり、標準的な血清を補充
した骨髄培養をも改良している。例えば現行の方法は長期造血を行い得るマウス
株に制限されているが、本発明にはこのような制限はなく、全ての試験株から造
血が行われる。更に、付着性、温度、栄養素及び成長因子などの培養条件を多方
面で改良したことから、本発
明に記載の条件下での骨髄基質及び造血細胞の成長速度は血清補充培地より著し
く大きい。このようにして、血清を補充した従来の長期骨髄培養では有意な数の
造血細胞を生成するのに4〜5週間が必要であったものが、約2週間に短縮され
得る。
血清を使用する造血前駆細胞の従来の長期培養方法に対する本発明培地の更に
別の利点は、造血細胞の増殖及び発生を操作し得る制御にある。その理由は、培
養系中の全ての成分及びそれらの濃度が既知であり、従って制御し得るからであ
る。これは、血清の含有物が一般には未知であり、同様に既知成分の濃度も不確
定である血清補充培地とは対照的である。
例えば培地の成分の1つの濃度を低下させることにより、培養条件を成長に対
して次善のものとし、産生される造血及び/または基質細胞の数を減らすことが
できる。
同様にして、好中性細胞の最適成長に必要な無血清培地の成分、ヒドロコーチ
ゾンを除外したり、培地中の基質細胞によって通常産生されるマクロファージ成
長の剌激物質、成長因子CSF−1を除外することにより、造血幹細胞の発生を
変化させ得る。このような培地の変化により好中球
やマクロファージの発生のみならず、リンパ球、肥満細胞及び恐らくは赤血球及
び巨核球の発生も起こり得る。この種の発生の変化はin vivoで骨髄中に起こる
ことをはるかによく表わしており、従来の造血細胞長期培養方法には見られない
ものである。
規定した培養系を使用すると既知の分子の細胞に及ぼす作用を厳密に決定し得
る。このような分析は、試験分子が未知濃度で既に存在し得る血清補充培地を使
用しては不可能である。
B.定義
一般に本発明に関して使用される「培地」とは、細胞の成長及び発生を支援す
べく使用される成長因子及び栄養素を含む溶液である。
「長期」とは、少なくとも約8週間から約12〜20週間、またはそれ以上に
わたり、培養されている細胞の成長及び発生並びに前駆細胞の産生が継続するこ
とを意味する。好ましくは「長期」とは8〜12週間を意味する。
本発明の培地によって支援(即ち成長並びに発生/分化)され得る「細胞」は
、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ウマ及びネズミといった哺乳動物細胞であるのが
好ましい。より
好ましいのはヒトまたはネズミ細胞である。当業者には明らかなように他の供給
源及び他の哺乳動物種由来の細胞も考えられる。
かかる細胞は、肺、肝、腎、胸腺、甲状腺、心臓、脳などの種々の「組織」か
ら誘導し得る。
本発明の培地中で培養し得る正常哺乳動物細胞の特定の例には線維芽細胞、内
皮細胞、アジポサイト、グリア細胞、ニューロン細胞、筋芽細胞、上皮細胞(こ
れは広範囲の種々の組織由来であり得る)、肝細胞、破骨細胞、心筋細胞がある
。本発明培地は更に上記細胞の不死化細胞を含む広範な細胞を支援し得る。他の
例としては骨髄基質細胞系、胚性幹細胞系(例えばD3、E3、SQ1.2S8
、MBL−1、632、及びCCEG2)、胚性癌細胞系(例えばPGC3)、
メラノーマ、乳房及び下垂体細胞系が挙げられる。
培養するのに好ましい本発明の細胞は、好ましくは脾、胎児肝、末梢血、臍帯
または骨髄から得られる造血細胞及びリンパ生成細胞である。
一般に、本発明の培地はこれまでに試験されている全ての型の細胞の成長をう
まく支援するし、多くの哺乳動物細
胞型の成長を支援することが期待される。
「基質細胞」なる用語は、in vivo及びin vitroで造血細胞の支援網を形成す
る骨髄の細胞を指して使用される。この点で基質細胞は、付着部位を与えること
において物理的に、そして細胞が成長に必要とするサイトカインを与えることに
おいて生物学的に造血細胞を支援する。培養に際しては基質細胞は付着層を形成
し、内皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞及びプレアジポサイト/アジポサイ
トを含む。従って支援すべき細胞が造血細胞である場合、基質細胞を培地の一部
として含まれたり、造血細胞が培地中に存在する間培地に加える(好ましくは1
回の培養で104〜107個の基質細胞)ことが好ましい。
「アミノ酸」なる用語はD及びL立体異性形態の全ての天然α−アミノ酸並び
にそれらの類縁体及び誘導体を指す。類縁体は、通常は同様の特性を有する別の
原子でアミノ酸中の原子が置換されているものと定義される。誘導体は、別の分
子または原子が付加されたアミノ酸と定義される。誘導体には例えばアミノ基の
アセチル化、カルボキシル基のアミノ化、または2つのシステイン分子の硫黄残
基の酸化によるシスチンの形成が含まれる。
アミノ酸は標準的な1文字または3文字の記号で示される。
本明細書において「無血清」とは、実質的に全ての血清が培地から除外されて
いること(例えば0〜0.49%)を意味する。これに次ぐ「低血清」なる用語
は、多くとも約5%(例えば0.5〜5%)の血清が培地に添加され得ることを
意味する。好ましくは培地の3%未満、特に好ましくは0.5%未満が血清由来
である。これに対して、従来の血清含有培地は典型的には>5〜40%の血清を
含んでいる。
「細胞培養有効量」とは、長期の細胞増殖及び発生を行い得る量を意味する。
かかる量は、所与の成分を可変濃度で細胞成長培地に添加し、細胞の増殖及び発
生の程度及び期間を熟練した細胞培養者が公知の方法で決定する実験により、所
与の成分に対して決定し得る。かかる量の好ましい範囲と例を本明細書に与える
。
C.培地
本発明の重要な点は、成分を適正量で組合せることで哺乳動物細胞、特に造血
細胞の短期及び長期の成長(即ち増殖)及び発生を支援し得ることを見い出した
ことである。
一般的に、本発明培地に含まれる3種の主要な物質がある。細胞外マトリックス材料
これらは例えば培地表面への細胞の付着に関与し、典型的には0.2〜100
μg/cm2の濃度で含まれる。
哺乳動物源(ウシまたはヒト、好ましくはネズミ)由来の好ましい細胞外マト
リックス材料の例としては、コラーゲン源(好ましくはコラーゲンI及びコラー
ゲンIV)、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンが挙げられる。特
に好ましいのは下記のものである:
・マウスコラーゲンIV:1μg/cm2以上、好ましくは約2〜100μg
/cm2、より好ましくは約5μg/cm2の濃度で使用し得る;
・マウスフィブロネクチン:0.2μg/cm2以上、好ましくは約0.5〜
100μg/cm2、より好ましくは約2μg/cm2の濃度で使用し得る。
しかしながら、マトリックスと関連分子の複合混合物であるMATRIGEL
のごとき純粋でない細胞外マトリックス源を使用することもできる。既存の付着
細胞によって分泌されたマトリックスを使用することもできる。細胞を
プラスチック培地表面で成長させ、細胞外マトリックスを分泌させ、かかる細胞
を回収し、第2の細胞系が付着し得る細胞外マトリックス層を与える。成長因子
これらは、本発明培地による支援が所望される種々の組織由来の基質細胞また
は他の細胞の増殖を剌激することに関与する。骨髄基質細胞の場合にはそれらは
培地中で造血細胞のための成長因子、例えばGM−CSF、G−CSF、SCF
、IL−1、CSF−1、IL−6、その他種々のものを産生する。無血清培地
を使用して精製造血細胞集団を培養する場合、基質細胞は除外されるであろうこ
とから、(関与する成長因子及び細胞に従って典型的には0.5ng/ml〜1
00μg/mlの濃度で)成長因子を添加する必要がある。
特定の型の細胞の成長及び発生を支援するのに必要な成長因子の選択は細胞系
によって変わり、細胞生物学及び培養分野の当業者には容易に決定されるであろ
う。本発明に特に有用であるが、成長のために所望または必要であれば別の特定
の成長因子を常に添加し得る、基質細胞及び組織細胞のための成長因子としては
下記のものが挙げられる。
・組換えヒト上皮成長因子(EGF):0.5ng/m1以上、好ましくは約
5〜200ng/ml、より好ましくは約15ng/mlの濃度で使用し得る;
・組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF):0.1ng/ml以上
、好ましくは約0.5〜40ng/ml、より好ましくは約2ng/mlの濃度
で使用し得る;
・組換えヒト血小板由来成長因子(PDGF)(好ましくはB−Bイソ形):
0.5ng/ml以上、好ましくは約2〜200ng/ml、より好ましくは約
10ng/mlの濃度で使用し得る;
・(ヒトまたは好ましくはウシ膵由来の)インシュリン:0.5μg/ml以
上、好ましくは約2〜100μg/ml、より好ましくは約10μg/mlの濃
度で使用し得る。
これらの成長因子を産生する細胞系由来のならし培地のごとき純粋でない成長
因子源を使用することもできるが、成分の明確な培地は得られない。更に、他の
種、例えばウシやマウス由来の成長因子を使用することもできる。栄養素
これらは、培養細胞の正常代謝機能に関与する分子であ
る。
本発明の培地に有用な栄養素及び代謝添加剤としては標準培地(後述);血清
アルブミン(好ましくはウシまたはヒト);トランスフェリン(好ましくはウシ
またはヒト);細胞の成長及び発生に有用な脂質及び脂肪酸源(このましくはダ
イズ脂質);コレステロール;還元剤(好ましくは2−メルカプトエタノールま
たはモノチオグリセロール);ピルビン酸塩(好ましくはピルビン酸ナトリウム
);グルココルチコイド(好ましくはコーチゾン誘導体、例えばヒドロコーチゾ
ン 21−ヘミスクシネート、特に好ましくはナトリウム塩);及び、ヌクレオ
シドが挙げられる。
本発明培地の栄養素の個々の成分の幾つかを以下に詳述する:
・本発明に従って使用され得る「標準培地」は、通常は下記の範疇から少なく
とも1種の成分を与える、細胞成長のための標準培地である:
(a)通常はグルコースのごとき炭水化物の形態のエネルギー源;
(b)実質的に全ての必須及び非必須アミノ酸、通常は20種のアミノ酸と、
システインの代わりにシスチンとか
らなる基本セットのもの;
(c)低濃度で必要とされるビタミン及び/または他の細胞成長支援有機化合
物;
(d)水素イオン濃度を安定化させ、従って酸及び塩基を適当に中和すること
により溶液のpHを安定化するよう作用する緩衝剤、例えばHEPES、Tri
sまたはMOPS(好ましくはHEPES);
(e)無機塩及び微量元素。微量元素は超低濃度、通常はマイクロモル量(例
えば1〜1000μM)で必要とされる無機化合物または天然元素であると定義
される。
本発明に有用な標準培地の特定の例はRPMI、DMEM、MEM、Leib
ovitzのL−15、Fischer培地、F−10、α培地、NCTC及び
McCoy培地であるが、好ましいのはIscove改良ダルベッコ培地(IM
DM);Iscove,N.N.& Melchers,F.J.Exp.Me
d.147,923(1978)である。
本発明によれば、標準培地に以下の範疇から特定の成分が補充される。
本発明の「血清アルブミン」はヒト、サル、ウシ、ヒツ
ジ、ウマ、ネズミといった任意の哺乳動物源から得ることができるが、好ましく
は血清アルブミン源はヒトまたはウシである。血清アルブミンは、1mg/ml
以上、好ましくは約3〜50mg/ml、より好ましくは約10mg/mlの濃
度で使用し得る。本発明培地は通常は無血清であるが、血清アルブミンのような
化学的に十分に規定され高度に精製(純度>95%)された任意の血清成分を含
んでもよい。
トランスフェリンは上述の培地の別のタンパク質成分であるが、これは哺乳動
物起源、特にヒトまたはウシ由来のものであるのが好ましい。この成分は25μ
g/ml以上、好ましくは約25〜1000μg/ml、より好ましくは約10
0〜300μg/mlで配合し得る。
「脂質及び脂肪酸源」は種々のかかる供給源の任意のものを意味する。例えば
、本発明培地に補充するのに脂質の粗抽出物を使用し得る。脂質抽出物は任意の
生物学的供給源から得ることができるが、1つの好ましい供給源は植物材料、特
にダイズである(ダイズ脂質抽出物はBoehringer−Mannheim
から購入し得る)。典型的には抽出物は約20%〜約95%の脂質を含み、その
大部
分はリン脂質であり、残りは脂肪酸と微量のステロールである。該抽出物は細胞
培地に約5μg/ml以上、好ましくは約5μg/ml〜約100μg/ml、
より好ましくは5μg/ml〜約50μg/mlの濃度で添加し得る。
細胞の原形質膜の流動性を調節し得る分子の添加は重要な成分である。本発明
は脂質コレステロールを約1μg/ml以上、好ましくは3〜30μg/ml、
より好ましくは約7.8μg/mlの濃度で使用する。
「還元剤」なる用語は、細胞培地と適合性のある任意の還元剤を意味する。好
ましい例としては2−メルカプトエタノールまたはモノチオグリセロールが挙げ
られる。一般に、還元剤は約10〜400μM、好ましくは30〜300μM、
特に好ましくは約100μMの濃度で存在する。
「ピルビン酸塩」は細胞培地と適合性のある任意のピルビン酸の塩を指すが、
好ましいのはピルビン酸ナトリウムまたはカリウムである。ピルビン酸自体を添
加し、その場である程度塩を形成をしてもよい。ピルビン酸塩は、潜在的なエネ
ルギー源として一般的な代謝過程に、またより複雑な分子の合成に必要とされる
。通常ピルビン酸塩は、>20μg/ml、好ましくは30〜500μg/ml
、特
に好ましくは約110μg/mlの濃度で存在する。
「ヌクレオシド」なる用語は、DNA及びRNA合成のための塩基を形成する
天然ヌクレオシドを指す。かかるヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシ
ン、シチジン、ウリジン、2’−デオキシアデノシン、2’−デオキシグアノシ
ン、2’−デオキシシチジン及びチミジンがある。リン酸化(モノ、ジまたはト
リ)類縁体を使用することもできる。ヌクレオシドは培地に約1〜100μg/
ml、好ましくは約5〜30μg/ml、特に好ましくは約10μg/mlの濃
度で添加し得る。
既にセクションBで詳述した成長因子、即ち上皮成長因子、線維芽細胞成長因
子、血小板由来成長因子及び/またはインシュリンは全てが標準培地に含まれる
のが好ましい。
本発明の全ての実施態様において必要とされない成分は天然または合成コルチ
コイド、例えばコーチゾン誘導体:プレドニゾン、デキサメタゾンまたは好まし
くはヒドロコーチゾンである。これらの分子は炭水化物、タンパク質及び脂肪の
代謝に関与し、抗炎症性及び免疫抑制性であり、ある種のサイトカイン及び/ま
たはそれらのレセプター、
例えばTNF−α,GM−CSF及びG−CSFのレベルを調節すると考えられ
る。ヒドロコーチゾンのごときコルチコイドは約0.05〜5μM、好ましくは
0.3〜1μM、特に好ましくは約0.5μMの濃度で使用し得る。
以下の表は、特に好ましい成分と、それらの各々の適正濃度、好ましい濃度及
び最も好ましい濃度とをまとめて示す一覧表である。量は、表中にも記載したが
、本明細書で定義した各タイプの等価の成分にも適用し得る。
本発明の範囲に含まれる1つの特定の細胞培地例を以下に示す。
D.培地調製及び培養方法
以下、本発明の培地を調製し、培養を実施する方法を例示する。本明細書に示
した等価の成分は本明細書に示した濃度範囲内で前述のものに置き換えることが
できる。細胞外マトリックス(ECM)
培養を開始する前の晩、6個のウェルプレート(Corning,表面積10
cm2/ウェル)を、グルタミン(292μg/ml)、ペニシリンG(100
単位/ml)及びストレプトマイシンスルフェート(100μg/ml)(これ
ら3種は全て、共に(Irvine Scientific)から100倍濃度
で市販されている)を含むIscove改良ダルベッコ培地(IMDM)溶液0
.73mlでコーティングする。次いで、溶解した細胞外マトリックス材料を、
前記溶液に添加することができる。幾つかのECM分子を試験した。コラーゲン
源が重要であり、マウスコラーゲンIV(5μg/cm2,Sigma,Cat.
#C0543)が好ましいことが分かった。次いで、別のECM分子(例えばフ
ィブロネクチン及びラミニン)を添加することができる。通常は、マウスフィブ
ロネクチン(2μg/cm2,Sigma,Cat.#F1141)を、コラー
ゲンIVと組み合わせて0.8mlの最終容量で使用する。
翌朝、ウェルをIMDMで1度洗浄し、無血清培地と細胞を添加する。栄養源/代謝性添加剤
幾つかの栄養源を培地に加える。栄養源は100倍の最終濃度で調製する。培
養物の最終濃度は以下に示す:
・ウシ血清アルブミン(10mg/ml,Sigma,cat.#A8412)
。
・ウシトランスフェリン(100μg/ml,Sigma,cat.#T−12
83)又はヒトトランスフェリン(300μg/ml,Boehringer−
Mannheim cat.#652 202)(それぞれマウス及びヒト培養
に対して)。
・大豆脂質(25μg/ml,Boehringer−Mannheim ca
t.#652 229)。
・コレステロール(7.8μg/ml,Sigma,cat.#C−3045)
。
・2−メルカプトエタノール(10-4M.Sigma,cat.#M−7522
)。
・ピルビン酸ナトリウム(110μg/ml(1mM),Sigma,cat.
#P3662)。
・21−ヘミ琥珀酸ヒドロコーチゾンのナトリウム塩(5×10-7M,Sigm
a,cat.#H−4881)。
・ヌクレオシド(それぞれ10μg/ml,Sigma,cat.#s:アデノ
シンA−4036,グアノシンG−6264,シチジンC−4654,ウリジン
U−3003,2’−デオキシアデノシンD−0651,2’−デオキシグアノ
シンD−0901,2’−デオキシシチジンD−0776,チミジンT−189
5)。成長因子(基質細胞用)
IMDM及び1%BSA中で100倍濃度の成長因子ストック溶液を調製し、
次いで培地中に希釈して、以下に示す必要濃度にする。
・表皮成長因子(EGF)(15ng/ml,Sigma,cat.#E412
7(マウス、顎下腺由来)、cat.#E1264(ヒト、組換え体))。
・組換えヒト線維芽細胞成長因子(FGF)(2ng/ml,Amgen In
c.又はGenzyme cat.#1208−00)。
・組換えヒト血小板由来成長因子(PDGF)(B−Bイソ形)(10ng/m
l,Amgen Inc.)。
・インシュリン(ウシ膵臓由来,10μg/ml,Sigma,cat.#I
4011)。無血清培地の調製
栄養源、成長因子等のストック溶液を新たに調製し、次いで、必要な相対濃度
(全ての添加剤については50μl/ウェル、BSAについては667μl/ウ
ェル)でプールし、(凍結融解を避けるため)必要時まで少量のアリコートで凍
結する。
無血清培地の実質的に全ての前記成分が、培養物中での基質細胞や造血細胞の
最適な成長のために重要であることに注目することが重要である。しかしながら
、全ての成分が絶対に必須というわけではない。最も重要な成分は、細胞外マト
リックス材料、IMDM(又は同様の標準培地)及び血清アルブミンである。他
の任意の成分を除去すると、緩慢であったり苛酷であったりしながら成長を低減
させることになるだろう。培養技術
まずCharles River Laboratoriesから入手した8
〜12週齢B6D2F1マウスの大腿骨骨髄(他のマウス株を使用してもよい)
をIMDM内にフラッシュして、長期骨髄培養物を得る。リンパ様長期骨髄培養
物が必要であれば、Jackson Labsか
ら入手した又はAmgenで繁殖させた2〜4週齢B6C3Fe−a/a−op
/opマウスを使用する。この場合、大腿骨及び脛骨を小片にカットし、次いで
これらを乳棒及び乳鉢を用いて摩砕して細胞を調製する。使用した任意のマウス
株の細胞を1500rpmで5分間遠心分離にかけて、3度洗浄する。次いで、
これらを10ml容量中に再度懸濁させる。この手順を2度繰り返し、最後に、
グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したIMDM中に5×1
06個/mlの濃度で細胞を再度懸濁させる。
胎児肝臓及び脾臓のような器官を小片にカットし、次いで組織ホモジナイザー
を用いて均質化して、他の組織や器官からの細胞を調製する。細胞を再度3度洗
浄し、胎児肝臓は106〜5×106個/ml、脾臓は107〜5×107個/ml
の濃度で再度懸濁させる。肝臓、肺臓、腎臓、脳及び心臓のような他の器官及び
組織も全く同様に調製する。但し、これらは、(IMDM及び20mg/mlの
ウシ血清アルブミンに溶解した)2mg/mlのコラゲナーゼ(Sigma)に
て37℃で1.5時間処理し、組織を消化してから均質化する。細胞は、5×1
06〜107個/m
lの濃度で使用する。
次いで、得られた1mlの細胞懸濁液を、1.22mlの凍結無血清培地と共
に、先に調製したウェルの各々に加える。上記のようにグルタミン、ペニシリン
及びストレプトマイシンを補充した調製したばかりのIMDM2.78mlを加
えて、容量を5ml/ウェルにする。これにより、各細胞ストック懸濁液につい
て説明したのと同じ最終細胞密度/ウェル(5ml容量)が得られる。即ち、ウ
ェルに5×106個/mlで1ml導入すると、最終密度は5×106個/ウェル
になる。
次いで、培養を、好ましくは暗所にて、5%CO2(一般には1〜20%、好
ましくは3〜10%、特に好ましくは4〜6%)に調整した空気インキュベータ
ーを用い、長期骨髄培養の場合は33℃で、3週間以内の骨髄培養及び組織又は
器官培養の場合は37℃で(一般には30〜45℃、好ましくは33〜40℃、
特に好ましくは33±1℃又は37±1℃で)インキュベートする。細胞を7日
間付着及び増殖させ、次いで培地の半分を除去し、これを2.5mlの無血清培
地に代えることにより、骨髄、胎児肝臓及び脾臓培養の場合で週2回、他の全て
の器官の場合で週
1回仕込む。
E.培地の使用
本発明では以下の使用が考えられる。
本発明の培地は、高密度(培地1mlに対して少なくとも100,000個の
細胞、しばしば培地1mlに対して600,000〜10,000,000個の
細胞)の細胞培養に特に有用である。更には、これらの培地で細胞を培養すると
通常、市販培地での細胞培養に比べて生成物の収率が高まる。
様々な哺乳動物細胞の培養では、完全培地を使用することができる。この培地
に、選択した細胞を接種する。この接種物の容量は、ある程度変動することは構
わないが、培地容量の約5分の1であることが好ましい。接種後、培養物を温度
に関して適切な環境で維持する。
本発明の培地を、半固体培地又は懸濁液中で単層として細胞を培養するために
使用することができる。細胞は、小規模培養として、即ち約2L以下の容量で増
殖させることができる。あるいは、回転式(spinner)フラスコで約16Lまで
又は動物細胞由来の生体化合物の商業生産用に設計された発酵器で約80L以上
のように、細胞を大容量で
培養することが好ましい。細胞を、高密度培養と考えられる少なくとも100,
000細胞/mlの濃度で小規模懸濁培養又は大規模懸濁液培養として増殖させ
ることが好ましい。細胞をバイオリアクター内で維持して、細胞によって生成さ
れる毒性分子を連続的に除去し、栄養源を絶えず供給することも可能である。
細胞自体又は細胞内部の生体化合物が、培養で所望される最終生成物であって
もよい。この場合、これらを培地から採取して、分離することができる。あるい
は、細胞によって培地内に分泌されるタンパク質又は他の有機化合物が培養で所
望される最終生成物であってもよい。この場合、培地を細胞から分離し、次いで
問題の化合物を培地から精製することができる。
本発明は更に、骨髄移植手法で潜在的に有用である。この可能性は、これらの
培地や技術が共に、基質細胞又は添加した外因性成長因子の存在下で、造血幹細
胞及び他の前駆体の生存、増殖(expansion)及び/又は発生を支援し得ること
により示唆される。本発明により生成された造血細胞を、ガンの化学療法又は放
射線治療後に白血球減少症にかかった患者の治療用移植片として使用することが
でき
る。これらは、先天性疾患、代謝性免疫疾患又は血液疾患で移植片として使用す
ることもできる。
本発明の他の考えられる使用は、体性細胞遺伝子治療のための幹細胞内への遺
伝子移入、特に免疫又は血液疾患(例えば重症合併型免疫不全(SCID)、ア
デノシンデアミナーゼ(ADA)欠乏症、及びAIDS)の治療のための造血幹
細胞内への遺伝子移入である。
本発明の別に考えられる使用は、生物学的役割が判明していない遺伝子の機能
を決定することである。本発明を用いて樹立した細胞培養物を、アンチセンスオ
リゴマーで処理することができる。これらは、通常約15〜30塩基長の短いD
NA鎖である。これらは、アンチセンスが鏡像である遺伝子の正常な転写、従っ
て発現を阻害する。アンチセンスDNAは、培養物に直接加えるか又はレトロウ
イルスベクターの形態で加えることができる。このようなアプローチにより、新
しい遺伝子の機能が潜在的に判明し得る。
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を例示するものであるが、本発明を
限定するものではない。全ての引用文献は参考として本明細書に組み入れるもの
とする。
VI.実施例 実施例1−市販の無血清培地又は本発明を用いた長期骨髄培養物の樹立
既に記載した方法で、(5×10-7Mヒドロコーチゾン及び37℃の温度を用
いて)無血清長期骨髄培養物を調製した。本発明により生じた初期成長、増殖及
び造血を、本発明で使用したのと同じ細胞外マトリックス(5μg/cm2コラ
ーゲンIV及び2μg/cm2フィブロネクチン)の存在下で様々な市販の無血清
培地を用いて得られた結果と比較した。使用した市販の無血清培地は、内皮SF
M(Gibco,cat.#320−7601PJ)、マクロファージSFM(
Gibco,cat.#320−2065PG)、AIM−V(Gibco,c
at.#320−2055AG)、UltraCULTURE(Whittak
er,cat.#12−725B)、NutriDOMA SR(Boehri
nger−Mannheim,cat.#1271091)、UltraDOM
A(Whittaker,cat.#12−723B)、Nutridoma
SP(Boehringer−Mannheim,cat.#100−104)
、UltraDOMA PF(Whittaker,cat.#12−727B
)、及
びPFHM−II(Gibco,cat,#320−2045AG)を含んでいた
。
血球計を用いて7日後に培養物中の付着細胞数をカウントして、培養物の樹立
効率を調べた。適切な増殖環境がなければ、付着、増殖して、約3×104個/
ウェルの任意の培養物を生成する少数の細胞が静的な非増殖性状態で維持される
か又はたちまち死滅する。
図1は、1週間の培養後の骨髄基質付着細胞及び造血付着細胞の数が、市販の
被試験無血清培地のいずれよりも本発明の培地で遥かに多かったことを示してい
る。存在する付着細胞の数は、本発明の培地を用いて得られた数の2〜22%で
あった。唯一の例外はPFHM−II培地であり、この培地では、本発明を用いて
得られた付着細胞の数のほぼ48%であった。
様々な種類の無血清培地で細胞の形態を調べると、本発明の培地で剌激した培
養物では、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞(又はアジポサイト)及びマクロフ
ァージを含む様々な種類の基質細胞が得られ、市販の無血清培地の方が細胞増殖
を限定することが観察された。全ての従来の培地は、マクロファージの生存及び
少数の線維芽細胞の増殖を
支援し得たが、内皮細胞があるとしても僅かであり(内皮細胞SFMを用いる場
合を除く)、脂肪細胞もなかった。従来の無血清培地は全て、本発明に比べて基
質細胞増殖の刺激が限定されていた。
付着基質細胞層の樹立効率の他に、3週間後にこれらの培養で生ずる造血の程
度も、培地中に放出された成熟造血細胞の数をカウントすることにより評価した
。肉眼で観察されるように、本発明では非付着細胞数が15.5±2.1×106
個/ウェル、他の無血清培地タイプではゼロであることに関連して、本発明の
培地のみが造血発生の兆候を示すことが判明した。実施例2−長期骨髄培養物の効率的な樹立には、全ての種類の血清培地成分が必 要である。
長期骨髄培養物の効率的な樹立に全ての種類の無血清培地成分(IMDM、成
長因子、細胞外マトリックス及び培地補充物)が必要であるかどうかを調べるた
めに、これらの全成分の存在下で、又はこれらの成分のうち1種を使用せずに、
培養を開始した。IMDMの代わりにはリン酸緩衝食塩水(PBS)を用い、他
の成分の代わりにはIMDMを用いた。成長因子には、表皮成長因子、線維芽細
胞成
長因子、血小板由来成長因子及びインシュリンが含まれた。使用した細胞外マト
リックス材料は、コラーゲンIV及びフィブロネクチンであった。培地補充物には
、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、大豆脂質、コレステロール、2−メ
ルカプトエタノール、ヌクレオシド及びヒドロコーチゾンが含まれた。5×10-7
Mヒドロコーチゾンの存在下、37℃で培養を実施した。
図2は、7日後の骨髄基質付着細胞及び造血付着細胞の数が、1種の成分を用
いない場合よりも、無血清培地の全成分の存在下で遥かに多いことを示している
。1種の成分の不在下では、完全培地の付着細胞数の2〜16%しか得られなか
った。
血清を補充した従来の“Dexter型”長期骨髄培養に改善を加えるのに、
どの種の無血清培地成分が最も重要であるかを調べるために、様々な種類の無血
清培養系をDexter培養に加えた。これらの成分には、細胞外マトリックス
、培地型(Dexter法はフィッシャー培地を使用し、本発明はIMDMを使
用する)、成長因子、栄養源(ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、コレス
テロール、2−メルカプトエタノール、ヌクレオシド及び大豆
脂質)並びに温度(Dexter法は33℃を使用し、本発明は37℃を使用す
る)が含まれる。7日後の付着細胞の数をカウントすることにより、これらの無
血清培地成分を1種以上添加することの効果を調べた。
前述のように8〜12週齢B6D2F1マウスの大腿骨からの骨髄細胞懸濁液
を調製して、Dexter培養物を樹立した。細胞を、最終濃度が20%(v/
v)の血清、10-6Mのヒドロコーチゾン及びフィッシャー培地と一緒に、Co
rning6ウェルプレートに添加して、最終容量を5ml、細胞密度を5×1
06個/mlとした。5%CO2含有空気を含む加湿インキュベーターで、これら
の培養物を33℃でインキュベートした。次いで、フィッシャー培地をIMDM
に代える場合のように、無血清培養系の様々な成分を添加するか又はこれを用い
てDexter培養の成分に代え、33℃ではなく37℃を使用した。ヒドロコ
ーチゾン濃度が5×10-7Mである標準無血清培養の場合を除き、いずれの場合
も、使用したヒドロコーチゾン濃度は10-6Mであった。無血清長期骨髄培養物
を前述の方法で樹立した。
図3は、基質細胞増殖量が、血清を補充したDexte
r培養よりも無血清培養条件下で遥かに多いことを示している。しかしながら、
細胞数のこのような大きな増加は、無血清培地成分の1種だけで説明することも
任意の対で説明することもできない。それどころか、最大数の細胞が得られる条
件を提供するには全ての成分が必要である。更には、標準無血清培養に血清を添
加すると、恐らくは血清が不確定の阻害性分子を含んでいるために、細胞数が減
少することが知見された。実施例3−無血清長期骨髄培養での細胞外マトリックス材料の重要性
無血清長期骨髄培養物の樹立における細胞外マトリックス(ECM)材料の重
要性を調べるために、種類や量の異なるECMを含む培養中の付着細胞数を7日
後に調べた。
培養を実施する前の晩、培養ウェル(Corning6ウェルプレート)を、
図4に示すような種類や濃度の異なるECM(最終容量は0.8ml)でコーテ
ィングした。マウスコラーゲンIV(Sigma)は0〜15μg/cm2の濃度
範囲で使用し、マウスフィブロネクチン(Sigma)は2μg/cm2で使用
した。血清を補充した培養にはECMコーティングは行わなかった。翌朝、EC
M溶
液を除去し、血清(20%ウマ血清、Gibco,10-6Mヒドロコーチゾン及
びフィッシャー培地、Gibco)並びに無血清培養(5×10-7Mヒドロコー
チゾン)を前述の方法で実施した。
図4は、ECMの不在下では、無血清培養中で7日後の付着細胞数は、ウマ血
清を補充した“Dexter”培養の約2倍にすぎず、ECMの存在下よりも遥
かに少ないことを示している。コラーゲンIVを添加すると、付着細胞数が4倍ま
で増加する。フィブロネクチン及びコラーゲンIVをウェルに添加すると、付着細
胞数は更にECMの不在下の6倍まで増加する。実施例4−無血清長期骨髄培養物での造血細胞の生成
無血清培地が長期造血骨髄培養物を維持し得るかどうかを評価するために、骨
髄培養を5×10-7Mのヒドロコーチゾンの存在下、37℃の温度にて、前述の
方法で実施した。培養物を週2回仕込み、仕込みから4日後に(a)非付着細胞
総数をカウントし、(b)非付着コロニー形成細胞数をカウントすることにより
、培養物での造血の程度を週毎に調べた。
血球計を用いて、培養物中の非付着細胞数をカウントし
た。当業者にはよく知られた標準的な半固体培地アッセイを用いて、コロニー形
成細胞の数を調べた。簡単に説明すると、細胞を5×104細胞/mlの濃度で
、20%(v/v)ウシ胎仔血清(Gibco)、10%(v/v)脱イオン化
ウシ血清アルブミン(Sigma)、0.8%メチルセルロース、成長因子マウ
スIL−3(0.75ng/ml,Piprotech)及びIMDMを含む半
固体培地中に懸濁させた。この混合物1mlを直径35mmのペトリ皿(Fal
con)に分配し、10%CO2、7%O2、83%N2を含む密封した加湿ボッ
クス内にて、37℃で14日間インキュベートした。
図5は、11週間の期間に無血清培養で生成した非付着細胞の数を示している
。この期間中、非付着細胞の生成は、導入した細胞集団(25×105個の細胞
)の約50%の平均値に維持されていた。培養開始から3週間後に、細胞生成の
ピークに達し、培養期間全般にわたって、細胞生成(cellularity)の頻繁な増
減が生じた。他の実験では、造血は14週間以上維持された。
図6は、9週間にわたって同一培養物(図5参照)で生成された非付着コロニ
ー形成細胞の数を示している。培養
開始から3週間後に生成のピークに達し、最初に培養物中に含まれるコロニー形
成細胞の数のほぼ170%であった。3週間後、コロニー形成細胞数は急速に低
下し、約5週間後には平均の2000個/ウェルに達した。
注目すべき重要な点は、コロニー形成細胞の多くが基質細胞に付着し、非付着
細胞のみを使用するこのアッセイでは検出されないために、このアッセイがこれ
らの培養物で生じる造血の量の指標をもたらし、コロニー形成細胞の絶対数を反
映しないことである。実施例5−種々のマウス株を用いた、無血清長期骨髄培養物での造血細胞の生成
まず、B6D2F1マウスの骨髄細胞を用いて本発明を実施した。造血が他の
マウス株からサポートされ得るかどうかを調べるために、通常研究者らが使用し
ている様々な株(Charles River Laboratoriesから
入手)を使用して、長期骨髄培養物を樹立した。大腿骨骨髄をIMDM内にフラ
ッシュし、細胞を3度洗浄し、次いでこれらをIMDM及び無血清成分(ヒドロ
コーチゾンを含む)に添加することにより、前述した方法で培養を実施した。次
いで、細胞懸濁液を、コラーゲン及びフィ
ブロネクチンで予めコーティングしたウェル内に置いて3週間インキュベートし
、培地の半分は2週間目から週2回代えた。この期間の後、最後の仕込みから4
日後に、生成した非付着細胞の数をカウントした。
図7は、被試験マウスが近交マウスであれ、非近交マウスであれ、ハイブリッ
ドマウスであれ、無血清培地が、全てのマウス株からの造血を支援したことを示
している。B6D2F1及びDBA/2が最大量の造血細胞生成を示し、細胞は
主に好中球及びマクロファージであった。肉眼では、ウェルにたくさんの非付着
細胞があることが観察された。C57B1/6株、Balb/c株及びB6C3
F1株は、これらの2種の株によって生成される造血細胞の約50%の数の細胞
を生成した。株CD−1及びC3Hは生成細胞数が最小であったが、これらの培
養物での細胞生成数は増加し、他の株の3週間後に対してむしろ4〜5週間後に
最大に達した。B6C3Fe−a/a−op/opのような他のマウス株からも
うまく造血が達成されたが、同様のことは全てのマウス株でも言える。実施例6−Bリンパ球を含む長期骨髄培養物
これまでの実施例で説明した無血清長期骨髄培養物での
造血発生は主に、血清を補充したDexter培養の場合と同様に、好中球及び
単球/マクロファージである。しかしながら、in vivo骨髄では、他の種
類の造血細胞(例えばBリンパ球、巨核球及び赤血球)が生成される。本発明者
らの長期骨髄培養物での前記細胞の発生に対して毒性及び/又は阻害性を示すヒ
ドロコーチゾンを除去すると、これらの細胞の生成の可能性が高まることが判明
した。これは、成長因子CSF−1(M−CSF)の不在下でも増加し得る。こ
の成長因子は通常これらの培養物中に高濃度で存在し、また恐らくは優先成長及
び発生刺激として作用するため、マクロファージ及び好中球の発生が他の種類の
発生よりも高くなる。点突然変異のためにホモ接合性状態ではCSF−1を生成
せず、従ってこのタンパク質に対するmRNAを産生しない突然変異マウス株B
6C3Fe−a/a−opを用いて、CSF−1を除去した。このようにCSF
−1が欠如すると、生後初期での切歯欠如、破骨細胞数の減少により生じる骨の
機能不良、マクロファージ数の大幅な減少及び不妊症のように動物に幾つかの影
響を及ぼす。
既に詳述した標準的な手順を用いて、培養物を樹立した。
B6C3F1マウスは、Jackson Laboratoriesから入手し
、大腿骨及び脛骨は生後2〜4週間目のものを使用した。乳棒及び乳鉢を用いて
骨を摩砕し、細胞を3度洗浄し、次いで得られた単一細胞懸濁液を、細胞外マト
リックス(コラーゲンIV及びフィブロネクチン)で予めコーティングしたウェル
中のIMDM及び無血清培地成分(ヒドロコーチゾンは非添加)に添加した。次
いで、培養物を3週間インキュベートし、2週目以降週2回成分を仕込み、その
後細胞の形態を調べた。
図8は、ヒドロコーチゾンで剌激したB6C3F1−a/a−+/+培養物で
は、生成した非付着細胞の大半が好中球であることを示している。これらの培養
物ではかなりの数のマクロファージも生成するが、大半はウェル表面に付着した
ままである。対照的に、ヒドロコーチゾンで刺激していない標準培養物では、生
成する非付着細胞総数は遥かに少なくなる。この生成細胞はすべてマクロファー
ジである。これらの相違で考えられる理由は、ヒドロコーチゾンが原始前駆細胞
の発生に直接作用するか、又は成長因子レセプター発現を刺激することにより細
胞及び/又は好中球の発生を刺激する成長因子(例えばG−CSF及びGM
−CSF)の生成に間接的に作用することである。しかしながら、ヒドロコーチ
ゾンの不在下では、主な発生剌激はCSF−1である。これは、マクロファージ
の発生を刺激し、比較的高濃度でこれらの培養物中に内生される因子である。従
って、細胞発生は単球及びマクロファージに有利となる。
ヒドロコーチゾンで剌激したB6C3F1−a/a−op/op培養物は、標
準+/+培養物(データは図示せず)で観察されるように同様に多数の好中球を
生成する。しかしながら、ヒドロコーチゾンがなければ、発生は異なる。最も顕
著な変化は、B220抗原及び表面免疫グロブリン(sIgM)を用いた免疫細
胞化学染色及び形態で分かるように、かなりの数(約17%)のBリンパ球が存
在することである。好中球は数的には尚主要タイプの生成細胞であり、細胞の8
0%を占める。少数(3%)のマスト細胞も観察される。
これらの培養物中にBリンパ球が存在するためには明らかに、ヒドロコーチゾ
ン及びCSF−1が存在してはならない。ヒドロコーチゾンはリンパ球に対して
有毒であり、CSF−1は恐らく、B細胞の発生よりもむしろマクロファ
ージの発生が剌激されるように主要な発生因子として作用する。CSF−1、従
ってマクロファージを除去すると明らかに、除去しなければ観察されることのな
い細胞が発生し得、またもはやCSF−1の主要な作用を克服する必要がないの
で、培養でより高い制御が可能となる。この一例を図8に示す。ここでは、幹細
胞因子(SCF)及びIL−7をOP/OP細胞に添加し、ヒドロコーチゾンは
添加しない。これらの培養物では、B細胞及びマスト細胞の相対数が増加し、I
L−7はB細胞の増殖を刺激し、SCFはマスト細胞の増殖を刺激する。実施例7−マウス又はヒト器官及び組織からの無血清培養物の樹立
様々な広範な器官(例えば脾臓、胎児肝臓、心臓、肺臓、腎臓、肝臓及び脳)
から無血清長期骨髄培養物を樹立することができる。まず、器官を小片にカット
して単一細胞懸濁液を調製する。ある種の器官(例えば脾臓、脳及び胎児(仔)
肝臓)は容易に崩壊するので、組織ホモジナイザー内に直接導入する。対照的に
、肺臓、肝臓、腎臓及び心臓は崩壊しにくいので、IMDM及び20mg/ml
のウシ血清アルブミン(Sigma)に溶解した2mg/mlの
コラゲナーゼ(Sigma)にて37℃で1.5時間処理し、組織を消化してか
ら均質化する。次いで、得られた細胞懸濁液を数分間沈降させて、組織破片を除
去し、廃棄することができる。次いで、細胞を遠心分離にかけ、これを10ml
の容量中に再度懸濁させて、この単一細胞懸濁液を3度洗浄する。この方法を2
度繰り返し、細胞を、使用に適した濃度で再度懸濁させる。
調製後、コラーゲンIV及びフィブロネクチンで予めコーティングした6ウェル
トレー(Falcon)中で、この細胞懸濁液1mlを1.22mlの調製した
ばかりの又は凍結濃縮した無血清培地(造血が必要な脾臓又は胎児(仔)肝臓の
培養を除いてはヒドロコーチゾンを含まず)及びIMDM(通常どおりグルタミ
ン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充)に添加した。これらの培養での
初期細胞密度は、使用する細胞の種類によって異なり、胎児(仔)肝臓培養物は
106〜5×106個/ウェルで、脾臓培養物は5×106〜5×107個/ウェル
で、他の器官は5×106〜5×107個/ウェルで樹立する。次いで、週1度培
地の半分を除去して新しい培地に代えて、細胞を5%CO2含有空気を含む加湿
インキュベーター内にて、37℃で
インキュベートする。
このようにして調製した培養物により、脾臓細胞及び胎仔肝臓細胞から造血が
生じ得る。更には、全ての種々の器官は、培養器官に由来する(アルカリ性及び
酸性ホスファターゼのような様々な酵素の存在に対する染色や形態によって決定
される)不均質細胞の集密層を生じる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CZ,DE,DK,ES,FI,G
B,HU,JP,KP,KR,KZ,LK,LV,MG
,MN,MW,NL,NO,NZ,PL,PT,RO,
RU,SD,SE,SK,UA,UZ,VN
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.(a)標準培地、 (b)血清アルブミン、 (c)トランスフェリン、 (d)脂質及び脂肪酸源、 (e)コレステロール、 (f)還元剤、 (g)ピルビン酸塩、 (h)DNA及びRNA合成用ヌクレオシド、 (i)基質細胞、組織細胞又は器官細胞の増殖及び発生を刺激する少なくとも1 種の成長因子、及び (j)少なくとも1種の細胞外マトリックス材料を細胞の培養に効果的な量含ん でおり、無血清又は低血清である細胞の長期増殖及び発生用培地。 2.前記成長因子が、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子 及びインシュリンからなる群の中から選択される請求項1に記載の培地。 3.前記成長因子の各々を含んでいる請求項2に記載の培地。 4.更にグルココルチコイドを含んでいる請求項1に記載 の培地。 5.前記グルココルチコイドがヒドロコーチゾンである請求項4に記載の培地。 6.更に基質細胞を含んでいる請求項1に記載の培地。 7.更にCSF−1活性阻害剤を含んでいる請求項1に記載の培地。 8.前記培地中で培養すべき前記細胞がCSF−1を生成し得ない請求項1に記 載の培地。 9.前記培地中で培養すべき前記細胞がB6C3Fe−a/a−op/opマウ ス株から得られる請求項8に記載の培地。 10.前記標準培地がIscove改良ダルベッコ培地である請求項1に記載の 培地。 11.前記血清アルブミン、トランスフェリン及び成長因子がヒト、マウス又は ウシ起源である請求項1に記載の培地。 12.前記ヌクレオシドが、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、2 ’−デオキシアデノシン、2’−デオキシグアノシン、2’−デオキシシチジン 又はチミジンの1種以上である請求項1に記載の培地。 13.前記細胞外分子が、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンからなる 群の中から選択される請求項1に記載の培地。 14.前記細胞外マトリックス材料の各々が含まれる請求項1に記載の培地。 15.前記細胞が造血性又はリンパ生成性である請求項1に記載の培地。 16.前記細胞が哺乳動物器官又は組織に由来する請求項1に記載の培地。 17.前記細胞が、正常細胞、非不死化細胞又は細胞系である請求項1に記載の 培地。 18.以下の成分: を指示した濃度で含んでいる請求項1に記載の培地。 19.請求項1に記載の培地で細胞を8〜20週間培養することを包含する細胞 の長期培養方法。 20.請求項1に記載の培地で細胞を2〜7週間培養することを包含する細胞の 短期培養方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US079,719 | 1993-06-18 | ||
US08/079,719 US5405772A (en) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | Medium for long-term proliferation and development of cells |
US08/079,719 | 1993-06-18 | ||
PCT/US1994/006893 WO1995000632A1 (en) | 1993-06-18 | 1994-06-17 | Medium for long-term proliferation and development of cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08508891A true JPH08508891A (ja) | 1996-09-24 |
JP2866742B2 JP2866742B2 (ja) | 1999-03-08 |
Family
ID=22152362
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7502993A Expired - Lifetime JP2866742B2 (ja) | 1993-06-18 | 1994-06-17 | 細胞の長期増殖及び発生用培地 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5405772A (ja) |
EP (1) | EP0703978B1 (ja) |
JP (1) | JP2866742B2 (ja) |
AT (1) | ATE183544T1 (ja) |
AU (1) | AU678836B2 (ja) |
CA (1) | CA2165335A1 (ja) |
DE (1) | DE69420138D1 (ja) |
DK (1) | DK0703978T3 (ja) |
ES (1) | ES2135589T3 (ja) |
GR (1) | GR3031218T3 (ja) |
WO (1) | WO1995000632A1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2005019450A1 (ja) * | 2003-08-22 | 2006-10-19 | タカラバイオ株式会社 | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
WO2012104936A1 (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | ヒト多能性幹細胞の培養方法 |
US8691579B2 (en) | 1999-10-01 | 2014-04-08 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods of isolating bipotent hepatic progenitor cells |
JP2016513472A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-16 | フェイト セラピューティクス,インコーポレーテッド | 幹細胞培養培地及び細胞生存を増強する方法 |
JP2016171811A (ja) * | 2010-02-22 | 2016-09-29 | ユニベルシテ ピエール エ マリー キュリー(パリ シズエム) | 造血系列の細胞を増殖及び分化させる細胞培養培地 |
Families Citing this family (90)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5612211A (en) * | 1990-06-08 | 1997-03-18 | New York University | Stimulation, production and culturing of hematopoietic progenitor cells by fibroblast growth factors |
US6231881B1 (en) | 1992-02-24 | 2001-05-15 | Anton-Lewis Usala | Medium and matrix for long-term proliferation of cells |
US6352707B1 (en) | 1992-02-24 | 2002-03-05 | Anton-Lewis Usala | Transplant encapsulation in a hydrogel matrix to obscure immune recognition |
US6037174A (en) * | 1993-08-23 | 2000-03-14 | Nexell Therapeutics, Inc. | Preparation of serum-free suspensions of human hematopoietic cells or precursor cells |
JPH07227278A (ja) * | 1994-02-18 | 1995-08-29 | Kyorin Pharmaceut Co Ltd | 成熟中枢神経細胞用の無血清培地 |
US7083979B1 (en) * | 1994-03-25 | 2006-08-01 | Indiana University Foundation | Methods for enhanced retroviral-mediated gene transfer |
DE4422667A1 (de) * | 1994-06-30 | 1996-01-04 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Züchtung hämatopoetischer Vorläuferzellen |
US5985554A (en) * | 1994-11-02 | 1999-11-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Method of probing the function of proteins or peptides encoded by partially sequenced cDNAs by inhibiting protein synthesis with antisense oligonucleotides |
US5719058A (en) * | 1995-04-10 | 1998-02-17 | Merck & Co., Inc. | Method for producing a highly enriched population of osteoclast cells |
AU6125396A (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Novartis Ag | Serum-free media for primitive hematopoietic cells and metho ds of use thereof |
ATE325533T1 (de) * | 1995-09-29 | 2006-06-15 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Verfahren zum verbesserten virusvermittelten dns- transfer unter verwendung von molekülen mit virus-und zellbindenden domänen |
EA199800272A1 (ru) * | 1995-10-04 | 1998-10-29 | Иммунекс Корпорейшн | Фактор, стимулирующий дендритные клетки |
EP0891419A4 (en) * | 1996-03-12 | 2000-03-01 | Life Technologies Inc | NUTRIENT ADDITIVE FOR HEMATOPOETIC CELL CULTURES |
US6043092A (en) * | 1996-03-18 | 2000-03-28 | University Of Pittsburgh | Cell culture media for mammalian cells |
JP3638614B2 (ja) * | 1996-07-25 | 2005-04-13 | ジェンザイム・コーポレーション | 軟骨細胞培地組成および培養方法 |
WO1998004680A1 (en) * | 1996-07-26 | 1998-02-05 | University Of Manitoba | Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells |
EP2221361A3 (en) * | 1996-08-30 | 2011-02-09 | Life Technologies Corporation | Method for producing a polypeptide in vitro in mammalian cells in a protein-free and serum-free culture medium |
TW517089B (en) * | 1996-09-03 | 2003-01-11 | Res Dev Foundation | Assessment of intracellular cysteine and glutathione concentrations |
US5945337A (en) | 1996-10-18 | 1999-08-31 | Quality Biological, Inc. | Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium |
AU5734998A (en) * | 1997-01-10 | 1998-08-03 | Life Technologies, Inc. | Embryonic stem cell serum replacement |
US5948426A (en) * | 1997-05-03 | 1999-09-07 | Jefferies; Steven R. | Method and article to induce hematopoietic expansion |
AU7984498A (en) * | 1997-06-25 | 1999-01-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Serum-free cell growth medium |
US5968829A (en) | 1997-09-05 | 1999-10-19 | Cytotherapeutics, Inc. | Human CNS neural stem cells |
US6800480B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-10-05 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture |
WO1999031222A1 (en) * | 1997-12-18 | 1999-06-24 | Willem Frederik Van Eelen | Industrial scale production of meat from in vitro cell cultures |
CA2324591A1 (en) * | 1998-04-09 | 1999-10-21 | Bresagen Limited | Cell differentiation/proliferation and maintenance factor and uses thereof |
WO1999056759A1 (en) * | 1998-05-07 | 1999-11-11 | University Of South Florida | Bone marrow cells as a source of neurons for brain and spinal cord repair |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7410798B2 (en) * | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US20020168766A1 (en) * | 2000-01-11 | 2002-11-14 | Gold Joseph D. | Genetically altered human pluripotent stem cells |
US6617159B1 (en) | 1998-11-09 | 2003-09-09 | Consorzio Per La Gestione Del Centro Di Biotechnologie Avanzate | Serum free medium for chondrocyte cells |
US7670628B2 (en) * | 1999-07-07 | 2010-03-02 | Angioblast Systems, Inc. | Mesenchymal precursor cell |
US20050158289A1 (en) * | 1999-07-07 | 2005-07-21 | Simmons Paul J. | Mesenchymal precursor cell and use thereof in the repair of bone defects and fractures in mammals |
US8062675B2 (en) * | 1999-07-07 | 2011-11-22 | Angioblast Systems, Inc. | Mesenchymal precursor cell |
AU2003901668A0 (en) | 2003-03-28 | 2003-05-01 | Medvet Science Pty. Ltd. | Non-haemopoietic precursor cells |
AUPQ147799A0 (en) * | 1999-07-07 | 1999-07-29 | Medvet Science Pty. Ltd. | Mesenchymal precursor cell |
JP2003505475A (ja) | 1999-07-23 | 2003-02-12 | ダイアクリン インク | 筋細胞、及び心臓修復におけるそれらの利用 |
US20030113301A1 (en) * | 1999-07-23 | 2003-06-19 | Albert Edge | Muscle cells and their use in cardiac repair |
US6811776B2 (en) * | 2000-12-27 | 2004-11-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Process for ex vivo formation of mammalian bone and uses thereof |
US7455983B2 (en) * | 2000-01-11 | 2008-11-25 | Geron Corporation | Medium for growing human embryonic stem cells |
JP2003521935A (ja) | 2000-02-11 | 2003-07-22 | フイラデルフイア・ヘルス・アンド・エデユケーシヨン・コーポレーシヨン | 骨髄細胞のニューロン細胞への分化およびそのための使用 |
US7005252B1 (en) * | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US7439064B2 (en) * | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
EP1366366B1 (en) * | 2000-05-10 | 2010-10-20 | Signe BioPharma Inc. | Compositions and methods for the diagnosis, treatment and prevention of steroid hormone responsive cancers |
US8119138B2 (en) * | 2000-05-10 | 2012-02-21 | Signe Biopharma Inc. | Anti-estrogen and immune modulator combinations for treating breast cancer |
US7863011B2 (en) * | 2000-05-10 | 2011-01-04 | Signe Biopharma, Inc. | Screening method for predicting susceptibility to breast cancer |
US20030072812A1 (en) * | 2001-05-10 | 2003-04-17 | Sirbasku David A | Breast cancer eradication program |
US7628980B2 (en) * | 2000-11-23 | 2009-12-08 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates |
US7445924B2 (en) * | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
AU2002231639B2 (en) | 2000-11-23 | 2007-01-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified vaccinia ankara virus variant |
US20050054102A1 (en) * | 2001-04-19 | 2005-03-10 | Anna Wobus | Method for differentiating stem cells into insulin-producing cells |
US7960508B2 (en) * | 2001-05-11 | 2011-06-14 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Peptide having cytotoxicity inhibitory activity and method of screening these peptide having cytotoxicity inhibitory activity |
US7169610B2 (en) * | 2002-01-25 | 2007-01-30 | Genzyme Corporation | Serum-free media for chondrocytes and methods of use thereof |
EP1499710B1 (en) * | 2002-03-29 | 2011-08-24 | Singapore Eye Research Institute | Method for growth of human conjunctival tissue equivalents for research, clinical ocular surface transplantation and tissue engineering |
EA011233B1 (ru) * | 2002-04-19 | 2009-02-27 | Бавариан Нордик А/С | Применение модифицированного вируса осповакцины анкара для вакцинации новорожденных |
JP2005534430A (ja) * | 2002-08-06 | 2005-11-17 | ジェンベック, インコーポレイテッド | 改良された注射システム |
NZ538575A (en) * | 2002-09-05 | 2007-03-30 | Bavarian Nordic As | Method for the amplification of a virus wherein primary avian cells are cultivated in a serum-free medium comprising growth factors and attachment factors |
EP1475434A1 (en) * | 2003-05-09 | 2004-11-10 | Oncoscience AG | Method for storing tumor cells |
US7608455B2 (en) * | 2003-08-20 | 2009-10-27 | Becton, Dickinson And Company | Modified reconstituted basement membrane composition for assay system |
AU2004299457B2 (en) | 2003-12-12 | 2011-03-24 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | A human cytotoxic T-lymphocyte epitope and its agonist epitope from the non-variable number of tandem repeat sequence of MUC-1 |
JP4651282B2 (ja) * | 2004-01-21 | 2011-03-16 | 田辺三菱製薬株式会社 | 造血幹細胞及び造血前駆細胞の増幅方法 |
US20070009497A1 (en) * | 2004-03-10 | 2007-01-11 | Steinman Ralph M | Dendritic cell expanded T suppressor cells and methods of use thereof |
US8252591B2 (en) | 2004-05-07 | 2012-08-28 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Hormone responsive tissue culture system and uses thereof |
US7481080B2 (en) * | 2004-07-01 | 2009-01-27 | General Electric Company | Clothes washer braking method and apparatus |
WO2006017370A2 (en) | 2004-07-13 | 2006-02-16 | Geron Corporation | Medium for growing human embryonic stem cells |
CA2581237C (en) * | 2004-09-24 | 2018-11-06 | Angioblast Systems, Inc. | Method of enhancing proliferation and/or survival of mesenchymal precursor cells (mpc) |
CA2591232C (en) * | 2004-12-28 | 2014-10-21 | The Rockefeller University | Glycolipids and analogues thereof as antigens for nk t cells |
US7923013B2 (en) * | 2004-12-28 | 2011-04-12 | The Rockefeller University | Glycolipids and analogues thereof as antigens for NKT cells |
WO2006073921A2 (en) * | 2004-12-30 | 2006-07-13 | The Rockefeller University | Compositions and methods for enhanced dendritic cell maturation and function |
US7837990B2 (en) * | 2005-03-28 | 2010-11-23 | The Rockefeller University | In vivo expanded NKT cells and methods of use thereof |
US20070059288A1 (en) * | 2005-03-31 | 2007-03-15 | Dinsmore Jonathan H | Treatment for heart disease |
AU2006244197A1 (en) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Mytogen, Inc. | Cellular cardiomyoplasty as supportive therapy in patients with heart disease |
CN107189980B (zh) | 2005-06-22 | 2021-07-09 | 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 | 人胚胎干细胞的悬浮培养物 |
US20070231901A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-10-04 | Shuichi Takayama | Microfluidic cell culture media |
US8921050B2 (en) | 2006-03-17 | 2014-12-30 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of diagnosing renal cell carcinoma |
US20070280922A1 (en) * | 2006-06-06 | 2007-12-06 | Zoltan Kiss Consulting | Combinations of human proteins to enhance viability of stem cells and progenitor cells |
US20080003676A1 (en) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
EP1900810A1 (fr) * | 2006-09-15 | 2008-03-19 | Celogos | Methode d'extraction et de selection de cellules |
WO2008137115A1 (en) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Multipotent stem cells and uses thereof |
EP2188367A4 (en) | 2007-08-10 | 2010-10-27 | Whitehead Biomedical Inst | HORMONE REACTIVE TISSUE CULTURE SYSTEM, AND USES THEREOF |
JP2009090160A (ja) * | 2007-10-03 | 2009-04-30 | Fujifilm Corp | 乳化物または分散物の製造方法、並びにこれを含む食品、皮膚外用剤及び医薬品 |
EP2083071A1 (en) * | 2008-01-25 | 2009-07-29 | Cell Med Research GMBH | Medium for propagating and expanding stem cells |
WO2009092789A1 (en) * | 2008-01-25 | 2009-07-30 | Cell Med Research Gmbh | Medium for propagating and expanding stem cells |
CA2736729A1 (en) | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Amyloid beta-peptides and methods of use thereof |
CA2828315A1 (en) | 2010-04-08 | 2011-10-13 | The University Court Of The University Of Edinburgh | Chondrogenic progenitor cells, protocol for derivation of cells and uses thereof |
EP2968406A4 (en) | 2013-03-14 | 2016-10-26 | Icahn School Med Mount Sinai | AUTOLOGOUS TUMOR LYSAT-FILLED DENDRITIC CELL VACCINE FOR THE TREATMENT OF LIVER CANCER |
AU2015236088A1 (en) * | 2014-03-25 | 2016-11-10 | Cook Biotech Incorporated | Extracellular matrix grafts loaded with exogenous factors |
KR101668743B1 (ko) * | 2014-08-08 | 2016-10-25 | (주)세포바이오 | 식물 유래 재조합 인간 혈청 알부민 및 식물성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 세포 보존용 조성물 |
CN104830772A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-08-12 | 深圳富利鑫健康产业发展有限公司 | 一种造血干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 |
CN114381428A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-22 | 广东善玺迦纳栗生物科技股份有限公司 | 作用于注射皮下或损伤组织部位的细胞培养基 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59232090A (ja) * | 1982-12-16 | 1984-12-26 | イミユネツクス・コ−ポレ−シヨン | 血清代替物を含む細胞培地 |
JPS60196186A (ja) * | 1984-03-17 | 1985-10-04 | Agency Of Ind Science & Technol | 低分子ゼラチンを含む付着依存性細胞用無血清培地組成物を用いる培養方法 |
JPH04271779A (ja) * | 1991-02-28 | 1992-09-28 | Kurabo Ind Ltd | 動物細胞培養用無血清培地 |
US5160490A (en) * | 1986-04-18 | 1992-11-03 | Marrow-Tech Incorporated | Three-dimensional cell and tissue culture apparatus |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4443546A (en) * | 1980-07-07 | 1984-04-17 | The Beth Israel Hospital Association | Process and composition for propagating mammalian cells |
JPS57194787A (en) * | 1981-05-28 | 1982-11-30 | Ajinomoto Co Inc | Culture medium for animal cell |
NZ206699A (en) * | 1982-12-30 | 1989-08-29 | Bio Response Inc | Process for the production of serum independent cell lines |
FR2543158B1 (fr) * | 1983-03-24 | 1985-11-15 | Inst Nat Sante Rech Med | Milieu de culture de cellules animales sans serum, sans hormones et sans facteurs de croissance et procedes de culture primaire et d'obtention de lignees cellulaires utilisant ce milieu |
US4940666A (en) * | 1983-07-15 | 1990-07-10 | University Patents, Inc. | Process and defined medium for growth of human epidermal keratinocyte cells |
US5132223A (en) * | 1983-11-10 | 1992-07-21 | Thomas Jefferson University | Process and medium for cloning and long-term serial cultivation of adult human endothelial cells |
US5030105A (en) * | 1985-06-06 | 1991-07-09 | Centro De Investigacion Y Estudios Avanzados Del Instituto Politecnico Nacional | Process for the long-term surviving culture of hepatocytes |
US4816401A (en) * | 1985-09-09 | 1989-03-28 | University Of Rochester | Serum free cell culture medium |
NO162160C (no) * | 1987-01-09 | 1989-11-15 | Medi Cult As | Serumfritt vekstmedium, samt anvendelse derav. |
DE3871206D1 (de) * | 1987-03-24 | 1992-06-25 | Grace W R & Co | Basisnaehrmedium fuer eine zellkultur. |
US5143842A (en) * | 1988-11-01 | 1992-09-01 | The University Of Colorado Foundation, Inc. | Media for normal human muscle satellite cells |
US5135866A (en) * | 1989-03-03 | 1992-08-04 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Very low protein nutrient medium for cell culture |
US5328844A (en) * | 1990-05-09 | 1994-07-12 | University Of Colorado Foundation, Inc. | Culture media for mammalian cells |
ATE164076T1 (de) * | 1990-06-08 | 1998-04-15 | Univ New York | Stimulierung der stroma- und vorläuferzellen im knochenmark |
US5122469A (en) * | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
WO1992018615A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-10-29 | Indiana University Foundation | System and process for supporting hematopoietic cells |
AU2882992A (en) * | 1991-11-06 | 1993-06-07 | Arthur A. Axelrad | Cell culture medium |
-
1993
- 1993-06-18 US US08/079,719 patent/US5405772A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-17 DE DE69420138T patent/DE69420138D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-17 AU AU71124/94A patent/AU678836B2/en not_active Ceased
- 1994-06-17 WO PCT/US1994/006893 patent/WO1995000632A1/en active IP Right Grant
- 1994-06-17 EP EP94920264A patent/EP0703978B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-17 AT AT94920264T patent/ATE183544T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-17 ES ES94920264T patent/ES2135589T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-17 CA CA002165335A patent/CA2165335A1/en not_active Abandoned
- 1994-06-17 DK DK94920264T patent/DK0703978T3/da active
- 1994-06-17 JP JP7502993A patent/JP2866742B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-16 GR GR990402309T patent/GR3031218T3/el unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59232090A (ja) * | 1982-12-16 | 1984-12-26 | イミユネツクス・コ−ポレ−シヨン | 血清代替物を含む細胞培地 |
JPS60196186A (ja) * | 1984-03-17 | 1985-10-04 | Agency Of Ind Science & Technol | 低分子ゼラチンを含む付着依存性細胞用無血清培地組成物を用いる培養方法 |
US5160490A (en) * | 1986-04-18 | 1992-11-03 | Marrow-Tech Incorporated | Three-dimensional cell and tissue culture apparatus |
JPH04271779A (ja) * | 1991-02-28 | 1992-09-28 | Kurabo Ind Ltd | 動物細胞培養用無血清培地 |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8691579B2 (en) | 1999-10-01 | 2014-04-08 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods of isolating bipotent hepatic progenitor cells |
US8709800B2 (en) | 1999-10-01 | 2014-04-29 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods of isolating bipotent hepatic progenitor cells |
US9625450B2 (en) | 1999-10-01 | 2017-04-18 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods of isolating bipotent hepatic progenitor cells |
JPWO2005019450A1 (ja) * | 2003-08-22 | 2006-10-19 | タカラバイオ株式会社 | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
JP2016171811A (ja) * | 2010-02-22 | 2016-09-29 | ユニベルシテ ピエール エ マリー キュリー(パリ シズエム) | 造血系列の細胞を増殖及び分化させる細胞培養培地 |
WO2012104936A1 (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | 独立行政法人医薬基盤研究所 | ヒト多能性幹細胞の培養方法 |
JP2016513472A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-16 | フェイト セラピューティクス,インコーポレーテッド | 幹細胞培養培地及び細胞生存を増強する方法 |
JP2020089373A (ja) * | 2013-03-15 | 2020-06-11 | フェイト セラピューティクス,インコーポレーテッド | 幹細胞培養培地及び細胞生存を増強する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0703978A1 (en) | 1996-04-03 |
US5405772A (en) | 1995-04-11 |
CA2165335A1 (en) | 1995-01-05 |
DE69420138D1 (de) | 1999-09-23 |
WO1995000632A1 (en) | 1995-01-05 |
AU7112494A (en) | 1995-01-17 |
ES2135589T3 (es) | 1999-11-01 |
GR3031218T3 (en) | 1999-12-31 |
ATE183544T1 (de) | 1999-09-15 |
EP0703978B1 (en) | 1999-08-18 |
JP2866742B2 (ja) | 1999-03-08 |
DK0703978T3 (da) | 2000-01-17 |
AU678836B2 (en) | 1997-06-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2866742B2 (ja) | 細胞の長期増殖及び発生用培地 | |
Fugman et al. | In vitro establishment and characterization of a human megakaryoblastic cell line | |
Rainey et al. | The NCI-H295 cell line: a pluripotent model for human adrenocortical studies | |
US7462487B2 (en) | Cell culture media | |
Zhang et al. | CRISPR/Cas9‐mediated sheep MSTN gene knockout and promote sSMSCs differentiation | |
US8486700B2 (en) | Multiple mesodermal lineage differentiation potentials for adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof | |
Broad et al. | Growth and adipose differentiation of sheep preadipocyte fibroblasts in serum‐free medium | |
JP2002517982A (ja) | 細胞の分化/増殖および維持因子ならびにそれらの使用 | |
Heath et al. | Methods for increasing monoclonal antibody production in suspension and entrapped cell cultures: biochemical and flow cytometric analysis as a function of medium serum content | |
CN1461341A (zh) | 肝祖先细胞克隆生长的方法 | |
CN100554409C (zh) | 使间充质干细胞分化成神经细胞的方法 | |
Hatzinger et al. | Rat kidney proximal tubule cells in defined medium: The roles of cholera toxin, extracellular calcium and serum in cell growth and expression of γ-glutamyltransferase | |
Mathis et al. | Biochemical characteristics of hyperplastic rat bile ductular epithelial cells cultured “on top” and “inside” different extracellular matrix substitutes | |
Bols et al. | Growth of fish cell lines in glutamine-free media | |
Brunette | Cholera toxin and dibutyrl cyclic-AMP stimulate the growth of epithelial cells derived from epithelial rests from porcine periodontal ligament | |
US20040229355A1 (en) | Culture medium for long-term culture of hepatocytes | |
EP0350887A2 (en) | Serum-free medium and process for cultivating mammalian cells | |
HAM | Selective media | |
Katsuno et al. | A preadipocyte cell line derived from murine bone marrow stroma: characterization of morphological, enzymatic, and functional nature of the cells | |
Malan-Shibley et al. | A serum-free medium for clonal growth and serial subculture of diploid rat liver epithelial cells | |
Germain et al. | Endoderm-secreted factor stimulates growth of embryonal carcinoma stem cells | |
Hanks | Insulin and hydrocortisone influences on cultured rat tongue epithelium | |
Takanashi et al. | Establishment and characterization of stromal cell lines that support differentiation of murine hematopoietic blast cells into osteoclast-like cells | |
SAMAREL | SERUIVI-FREE PRIMARY CULTURES OF NEONATAL RAT LGGLGGGGG GGGGGGGG SLLS LL S LLSLLL G LLLS GGG SLS LS LLS GGGLLG GGGLL GARY L. ENGELMANN “", ROSS G. GERRITYº | |
MATSUHISA et al. | Characterization of forced suspension culture of spontaneously transformed mouse fibroblasts (B-6) |