JPH08508891A

JPH08508891A - 細胞の長期増殖及び発生用培地

Info

Publication number: JPH08508891A
Application number: JP7502993A
Authority: JP
Inventors: ポンテイング，イアン・エル・オー
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1996-09-24
Anticipated expiration: 2014-03-08
Also published as: EP0703978B1; GR3031218T3; ATE183544T1; EP0703978A1; DK0703978T3; CA2165335A1; ES2135589T3; DE69420138D1; US5405772A; AU7112494A; JP2866742B2; AU678836B2; WO1995000632A1

Abstract

(57)【要約】標準培地（例えばＩｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地）、血清アルブミン、トランスフェリン、脂質及び脂肪酸源、コレステロール、還元剤、ピルビン酸塩、グルココルチコイド（培養すべき細胞が造血細胞の場合）、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用ヌクレオシド、基質細胞や種々の組織又は器官の細胞の増殖及び発生を剌激する成長因子（例えば表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子及びインシュリン）、並びに細胞外マトリックス細胞（例えばコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニン）を細胞の増殖や発生に効果的な量含んでいる、細胞（特に造血細胞及び骨髄基質細胞）の短期及び長期の増殖や発生のための無血清又は低血清培地。

Description

【発明の詳細な説明】細胞の長期増殖及び発生用培地発明の背景Ｉ．発明の分野本発明は、細胞の増殖及び発生（development）を支援するための無血清（ser um-free）または低血清（serum-depleted）培地に係わる。特に本発明は、造血細胞及びそれらの成長を支援する基質細胞（stromal cells）の長期増殖用培地に係わる。更に本発明は、かかる培地を使用して種々の組織及び器官由来の哺乳動物細胞を培養する方法に係わる。本発明の培地及び方法によって細胞の増殖及び発生を最高数カ月間にわたって維持し得る。 II．発明の背景及び従来の技術本発明の１つの態様は、血清の不在下または実質的に低減された状態で細胞、特に哺乳動物細胞を培養するための培地であって、化学的に十分に確定されており、かかる細胞の発生及び増殖を長期間支援し得る培地である。これまでに多くの種類の哺乳動物細胞が単離され、更なる研究または使用のために細胞を培養して増殖させる試みがなされている。かかる培養に使用される培地は一般には、多くはウマ、ウシまたは仔ウシ血清によって与えられる細胞の増殖及び発生に必要な栄養素、付着因子及び成長因子の供給源を含んでいる。しかしながら、生理学的状態が与えられるわけではないので、細胞培養を支援すべく血清を使用することには問題がある。実際、細胞が細胞培養に通常使用される部類の血清濃度に直面するのは、血液が凝固する創傷の部位だけであろう。血清の使用は更に、コストが高いことや、試料ごとに様々な未確定成分が血清中に存在することによりやっかいなものとなる。かかる未確定成分が存在したりしなかったりすることで細胞培養に一貫性がなくなり、培養プロセスの制御が不十分となる。例えば、特定の血清試料により特性の成分が培地に導入され、細胞の成長が阻害され得る。血清の存在に伴う問題に応えて、これまでに種々の無血清培地が作製されており、例えば下記のものが参照される：上記の多数の引用文献に記載されているように、増殖及び発生の刺激物質として造血成長因子を使用し、造血前駆細胞を短期間（最高３〜４週間）無血清培養する方法が既に存在する。しかしながら、造血細胞の長期培養を研究するための理想的な無血清培地の開発は特に難しいことが示されている。本発明以前には、in vivoで起こるプロセスの幾つかを厳密に模倣すると見られる血清補充骨髄培養系を主に使用し、哺乳動物の長期造血がin vitroで研究されている。最初のこのような実験はＤｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１：３３５−３４４（１９７７）に記載されており、内皮細胞、線維芽細胞、アジポサイト（adipocytes）及びマクロファージを含むネズミ骨髄基質細胞の付着層の形成に係わる。この細胞層は、恐らくは物理的に付着性のマトリックスと、造血細胞の増殖及び発生に必要な成長因子を含む正しい細胞間シグナル発生とを与えることにより、造血細胞を支援するのに必要とされる。Ｄｅｘｔｅｒ培養において行われる造血は、基質細胞層と密に接触して起こる。多くの場合で幹細胞及び前駆細胞は、位相差顕微鏡下での特徴的な外観により敷石状領域（cobblestone regions）と称される箇所を形成する基質細胞下で増殖する。造血細胞が成熟すると、それらの多くは基質細胞の表面最上部に移動する。更に、十分に分化した状態にまで成熟すると造血細胞を周辺の培地中に放出し、造血細胞は週に２回フィーディングにより取り出される。上記培養系では造血が数カ月維持され、前駆細胞が一定して産生された。その後まもなくヒト細胞に対しても同様の系が開発された（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｓ．及びＫａｐｌａｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４７５６−４７５９（１９８０））。Ｄｅｘｔｅｒ法の１つの重要な欠点は、通常は骨髄、特にＢリンパ球によって産生される他の細胞種の犠牲のもとに、主にマクロファージと好中球とを発生し得ることである。Ｂリンパ球の長期産生方法はＷｈｉｔｌｏｃｋ，Ｃ．Ａ．及びＷｉｔｔｅ，Ｏ．Ｎ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：３６０８−３６１２（１９８２）によって発見された。この系は、ウマ血清をウシ胎仔血清で置き換え、ヒドロコーチゾンを２−メルカプトエタノールで置き換えている点でＤｅｘｔｅｒらの方法とは異なる。しかしながら、この系ではＢリンパ球以外の造血種の発生は除外される。これら２つの培養系において起こる発生の相違の理由、及びこれらが骨髄造血のどんな面をも模倣しない理由は判っていないが、恐らくは血清の使用が影響している。細胞、特に哺乳動物造血細胞を培養するのに理想的な、化学的に制御された培地を製造する試みが多数行われているにもかかわらず、このような培地には尚も多数の欠点がある。例えば、従来の培地はかかる細胞を本当には長期培養できない。本発明によれば、「長期」とは、培地中での新しい前駆細胞の産生を含め、増殖及び発生が約８週間以上継続することと定義される。本発明の培地は培養中で最高３〜５カ月の継続的な成長及び発生を行い得る。このような長期間にわたって哺乳動物造血細胞を培養できる無血清培地は従来はなかった。以下、幾つかの別の関連従来技術を簡単に説明する。Ｃｏｒｍｉｅｒら，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ．１９９１；４：１５７− １６４は純化した（enriched）ネズミ造血幹細胞の無血清培養に係わり、ある種の成長因子が増殖に及ぼす影響に注目している。しかしながら、この文献に記載されている培地は、本発明と比較して異なる成分を異なる相対割合で含み、本発明培地とは対照的に（本明細書に定義したような）長期成長を行うことはできなかった。Ｄｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：３３５− ３４４（１９７７）は、古典的なＤｅｘｔｅｒ長期骨髄培養法を開示している。本発明とは違ってこの方法は血清を含むことは注目すべきである。その結果、該方法の使用は既に記載されているようにある種のマウス株に制限され、かかる株でさえ、その成長は本発明ほど顕著ではない。Ｄｅｘｔｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら，Ｌｏｎｇ−ＴｅｒｍＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＣｕｌｔｕｒｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ：５７−９６は長期骨髄培養方法及び培地の総説である。この文献に記載の方法及び培地はいずれも本発明と同じ部類の成分を含まない。Ｄｒｏｕｅｔ，Ｘ．ら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．ｏｆＨａｅｍ．７３：１４３−１４７（１９８９）は、無血清のヒト長期骨髄培地を開示している。しかしながら、そこに記載されている培地は本発明と同程度の長期培養は行えず、成長はたった３〜４週間維持されるだけである。更に、本発明の培地とは違い、Ｄｒｏｕｅｔらによって検討されたものは基質細胞を含まない。Ｗｈｉｔｌｏｃｋ，Ｃ．Ａ．，＆Ｗｉｔｔｅ，Ｏ．Ｎ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７９：３６０８−３６１２（１９８２）は、ネズミ骨髄由来のＢリンパ球及びそれらの前駆体の長期培養に係わる。これは有名なＷｉｔｔｅ−Ｗｈｉｔｌｏｃｋ培養法である。しかしながら、ここでも、この論文に記載されている培地は、血清を含み、Ｂリンパ球の成長しか支援できない点で本発明のものとは実質的に異なる。Ｔｅｏｆｉｌｉ，Ｌ．ら，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６５：２２−２５（１９９２）は、予め形成した細胞外マトリックスを使用してヒト造血前駆細胞を成長させるための無血清培養系を記載している。しかしながら、この方法では長期成長は行われず、前駆細胞が妥当な数に維持されるのはたった３週間である。更にこの方法は、骨髄基質細胞の成長を支援すべく成長因子を使用することもないし、細胞付着用の精製細胞外マトリックス材料を使用することもない。その結果、広範囲の種々の組織及び器官に由来する細胞の成長は支援されない。上記の従来技術にもかかわらず、細胞の長期培養用の化学的に規定された培地の製造に対するニーズが残っている。理想的にはかかる培地は、簡単に製造でき、化学的に規定された成分を含み、安価に製造し得、細胞を最適に長期成長及び発生させ得るべきである。従って本発明の目的は、特に造血系の細胞の増殖及び発生を長期間維持するための無血清培地を提供することである。本発明の別の目的は、化学的に規定された培地中で細胞を短期及び長期培養するための培地を提供することである。本発明の別の目的は、骨髄移植及び／または遺伝子治療におけるかかる細胞中への遺伝子の移入のために、初期前駆細胞の増殖及び／または発生を刺激する方法を提供することである。詳細を後述する本発明の上記及び他の目的は当業者には明らかであろう。 III．発明の要約本発明によれば、細胞を長期増殖及び発生させるための培地であって、細胞の成長及び発生に有効な量の、（ａ）Ｉｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、ＬｅｉｂｏｖｉｔのＬ−１５、ＮＣＴＣ、Ｆ−１０、ＭＥＭ、及びＭｃＣｏｙ培地のような標準培地；（ｂ）血清アルブミン；（ｃ）トランスフェリン；（ｄ）脂質及び脂肪酸源；（ｅ）コレステロール；（ｆ）還元剤；（ｇ）ピルビン酸塩；（ｈ）ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用ヌクレオシド；（ｉ）基質細胞並びに／または（好ましくは哺乳動物の）種々の器官及び組織由来の細胞の増殖及び発生を刺激する１種以上の成長因子、例えば上皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子及びインシュリン；及び（ｊ）１種以上の細胞外マトリックス材料を含む無血清または低血清の培地が提供される。好中球の発生及び増殖が所望される培養（例えば長期骨髄培養）に使用される無血清培地の任意成分は：（ｋ）グルココルチコイド、例えばヒドロコーチゾン、コーチゾール、デキサメタゾンまたは他の構造的に関連のある天然もしくは合成分子である。支援すべき細胞が造血細胞である場合に培地に別個に添加し得る無血清または低血清培地の他の任意成分は：（１）詳細は後述する造血細胞の支援網を与える基質細胞である。特に好中球の成長に適した本発明の実施態様においては、細胞培地は下記の成分を記載の濃度で含む。本発明の好ましい実施態様においては、種々の器官または組織に由来する細胞の成長に使用される細胞培養培地は既に記載したようなものであるが、但し、ヒドロコーチゾンまたは他の関連グルココルチコイドは含まない。別の好ましい実施態様においては、ヒドロコーチゾンまたは他のグルココルチコイドは培地中に存在せず、且つ、マクロファージの発生及び増殖の刺激物質である成長因子ＣＳＦ−１による造血前駆細胞の刺激も行われない。これはいくつかの方法で達成され得る。ＣＳＦ−１遺伝子（Ｂ６Ｃ３Ｆｅ−ａ／ａ−ｏｐ／ｏｐマウス株）またはそのレセプターの遺伝子またはＣＳＦ−１レセプターシグナル発生経路の一部が失活され、これによって機能性タンパク質を生成しないマウス突然変異株を使用することが可能である。ＣＳＦ−１活性の種々の阻害物質も使用し得る。例えば、ＣＳＦ−１またはそのレセプターに対する中和抗体を使用して刺激を防ぐことができる。更に、アンチセンスオリゴマー（短い一本鎖核酸配列）を使用してＣＳＦ−１、そのレセプターまたはシグナル伝達機構のある部分の発現を防ぐことができる。このような培養における組織内での造血系発生は好中球及びマクロファージに制限されるだけでなく、リンパ球、肥満細胞、巨核球及び赤血球系細胞（erythroid cell）といった他の細胞も含む。特に好ましい実施態様においては、培養する細胞は哺乳動物に由来する。別の特に好ましい実施態様においては、細胞は造血系またはリンパ生成系に由来する。 IV．図面の簡単な説明図１は、本発明の無血清培地（ＬＴＢＭＣ−ＳＦＭ）と従来の無血清培地の、７日後の骨髄付着細胞（基質細胞及び造血細胞）の数の比較を示す。本発明の培地では２週間後に極めて優れた造血があったが、試験した従来の培地ではいずれも造血は認められなかったことに留意されたい。図２は、無血清培地成分のうち１つの成分の除外が長期骨髄培養の樹立に及ぼす影響を、７日後の付着細胞数で示す。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。図３は、血清を補充した“Ｄｅｘｔｅｒ”培地（ＤＥＸ）に無血清培地の成分を加えたときの影響を示しており、成長因子（＋ＧＦｓ）、フィッシャー培地に代えてＩｓｃｏｖｅ培地（＋ＩＭＤＭ）、細胞外マトリックス材料（ＥＣＭ）、追加栄養素（ＮＵＴＳ）を加えた場合及び３３℃ではなくて３７℃とした場合を含む。培養ＳＦＭ＋３７℃＋ＤＥＸは標準無血清培地条件下で実施したが、ウマ血清は含まなかった。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。図４は、培養７日後の血清補充培地及び無血清培地における付着細胞（骨髄基質細胞及び造血細胞の併存）の相対数を示す。無血清培養におけるコラーゲン及びフィブロネクチンといった細胞外マトリックス材料の重要性も示す。フィブロネクチンは濃度２μｇ／ｃｍ²である。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。図５は、本発明を使用して起こる長期造血を、１１週間で産生された非付着性造血細胞（主に成熟細胞）の総数±標準偏差で表わす。図６は、本発明を使用して起こる長期造血を、１０週間で産生された非付着性造血前駆細胞（コロニー形成細胞）の数±標準偏差で表わす。図７は、種々のマウス株を使用したときの無血清長期骨髄培養から２１日後の非付着性造血細胞の産生を示す。Ｃ３Ｈ、Ｃ５７Ｂ１／６、Ｂａｌｂ／ｃ及びＤＢＡ／２は近交系マウス株であり、ＣＤ−１は遠縁交配マウス株であり、Ｂ６Ｄ２Ｆ１（ＢＤＦ₁）及びＢ６Ｃ３Ｆ₁はハイブリッド（それぞれ雌Ｃ５７Ｂ１／６×雄ＤＢＡ／２及び雌Ｃ５７Ｂ１／６×雄Ｃ３Ｈ）である。誤差を表わす棒線は標準偏差を示す。図８は、ヒドロコーチゾン（ＨＣ）の存在下または不在下で正常（＋／＋）及び突然変異（ｏｐ／ｏｐ）マウスの長期骨髄培養で産生された非付着性造血細胞形態を示す表である。Ｖ．発明の詳細Ａ．本発明培地と従来の培地の比較従来の無血清培地が正常造血細胞を長期成長させられない必然的な理由は、それらが、造血細胞及び基質細胞を含む広範囲の細胞種の成長を支援すべく正しい成分の組合せを適正濃度範囲で含まないからである。この結果、多数の従来の無血清培地は、維持するのがより難しいというよりはむしろ、細胞系、正常一次細胞（即ち動物から直接得られた細胞）の成長を支援することに制限されている。正常細胞の成長を維持し得るかかる培地は１種または数種の細胞種に対してのみそれを行い、造血細胞及び基質細胞の長期培養を可能にする成長条件は与えられない。これとは対照的に、本発明の培地は、一次（正常）細胞及び細胞系を含む広範囲の種々の組織または器官に由来する種々の細胞の成長を支援する固有の能力を有する。この能力により、造血細胞の成長を支援するのに不可欠な造血前駆細胞及び骨髄基質細胞（アジポサイト、マクロファージ、内皮細胞及び線維芽細胞）の長期増殖が可能になる。これは、従来の無血清培地にはない能力である。従来の無血清培地の別の欠点は種特異的なことであり、これに対して本発明の培地はマウス及びヒト両方の細胞の成長を支援することができ、他の種に由来する細胞の成長及び発生も支援すると期待される。本発明は従来の無血清培地を著しく改良したものであり、標準的な血清を補充した骨髄培養をも改良している。例えば現行の方法は長期造血を行い得るマウス株に制限されているが、本発明にはこのような制限はなく、全ての試験株から造血が行われる。更に、付着性、温度、栄養素及び成長因子などの培養条件を多方面で改良したことから、本発明に記載の条件下での骨髄基質及び造血細胞の成長速度は血清補充培地より著しく大きい。このようにして、血清を補充した従来の長期骨髄培養では有意な数の造血細胞を生成するのに４〜５週間が必要であったものが、約２週間に短縮され得る。血清を使用する造血前駆細胞の従来の長期培養方法に対する本発明培地の更に別の利点は、造血細胞の増殖及び発生を操作し得る制御にある。その理由は、培養系中の全ての成分及びそれらの濃度が既知であり、従って制御し得るからである。これは、血清の含有物が一般には未知であり、同様に既知成分の濃度も不確定である血清補充培地とは対照的である。例えば培地の成分の１つの濃度を低下させることにより、培養条件を成長に対して次善のものとし、産生される造血及び／または基質細胞の数を減らすことができる。同様にして、好中性細胞の最適成長に必要な無血清培地の成分、ヒドロコーチゾンを除外したり、培地中の基質細胞によって通常産生されるマクロファージ成長の剌激物質、成長因子ＣＳＦ−１を除外することにより、造血幹細胞の発生を変化させ得る。このような培地の変化により好中球やマクロファージの発生のみならず、リンパ球、肥満細胞及び恐らくは赤血球及び巨核球の発生も起こり得る。この種の発生の変化はin vivoで骨髄中に起こることをはるかによく表わしており、従来の造血細胞長期培養方法には見られないものである。規定した培養系を使用すると既知の分子の細胞に及ぼす作用を厳密に決定し得る。このような分析は、試験分子が未知濃度で既に存在し得る血清補充培地を使用しては不可能である。Ｂ．定義一般に本発明に関して使用される「培地」とは、細胞の成長及び発生を支援すべく使用される成長因子及び栄養素を含む溶液である。「長期」とは、少なくとも約８週間から約１２〜２０週間、またはそれ以上にわたり、培養されている細胞の成長及び発生並びに前駆細胞の産生が継続することを意味する。好ましくは「長期」とは８〜１２週間を意味する。本発明の培地によって支援（即ち成長並びに発生／分化）され得る「細胞」は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ウマ及びネズミといった哺乳動物細胞であるのが好ましい。より好ましいのはヒトまたはネズミ細胞である。当業者には明らかなように他の供給源及び他の哺乳動物種由来の細胞も考えられる。かかる細胞は、肺、肝、腎、胸腺、甲状腺、心臓、脳などの種々の「組織」から誘導し得る。本発明の培地中で培養し得る正常哺乳動物細胞の特定の例には線維芽細胞、内皮細胞、アジポサイト、グリア細胞、ニューロン細胞、筋芽細胞、上皮細胞（これは広範囲の種々の組織由来であり得る）、肝細胞、破骨細胞、心筋細胞がある。本発明培地は更に上記細胞の不死化細胞を含む広範な細胞を支援し得る。他の例としては骨髄基質細胞系、胚性幹細胞系（例えばＤ３、Ｅ３、ＳＱ１．２Ｓ８、ＭＢＬ−１、６３２、及びＣＣＥＧ２）、胚性癌細胞系（例えばＰＧＣ３）、メラノーマ、乳房及び下垂体細胞系が挙げられる。培養するのに好ましい本発明の細胞は、好ましくは脾、胎児肝、末梢血、臍帯または骨髄から得られる造血細胞及びリンパ生成細胞である。一般に、本発明の培地はこれまでに試験されている全ての型の細胞の成長をうまく支援するし、多くの哺乳動物細胞型の成長を支援することが期待される。「基質細胞」なる用語は、in vivo及びin vitroで造血細胞の支援網を形成する骨髄の細胞を指して使用される。この点で基質細胞は、付着部位を与えることにおいて物理的に、そして細胞が成長に必要とするサイトカインを与えることにおいて生物学的に造血細胞を支援する。培養に際しては基質細胞は付着層を形成し、内皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞及びプレアジポサイト／アジポサイトを含む。従って支援すべき細胞が造血細胞である場合、基質細胞を培地の一部として含まれたり、造血細胞が培地中に存在する間培地に加える（好ましくは１回の培養で１０⁴〜１０⁷個の基質細胞）ことが好ましい。「アミノ酸」なる用語はＤ及びＬ立体異性形態の全ての天然α−アミノ酸並びにそれらの類縁体及び誘導体を指す。類縁体は、通常は同様の特性を有する別の原子でアミノ酸中の原子が置換されているものと定義される。誘導体は、別の分子または原子が付加されたアミノ酸と定義される。誘導体には例えばアミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミノ化、または２つのシステイン分子の硫黄残基の酸化によるシスチンの形成が含まれる。アミノ酸は標準的な１文字または３文字の記号で示される。本明細書において「無血清」とは、実質的に全ての血清が培地から除外されていること（例えば０〜０．４９％）を意味する。これに次ぐ「低血清」なる用語は、多くとも約５％（例えば０．５〜５％）の血清が培地に添加され得ることを意味する。好ましくは培地の３％未満、特に好ましくは０．５％未満が血清由来である。これに対して、従来の血清含有培地は典型的には＞５〜４０％の血清を含んでいる。「細胞培養有効量」とは、長期の細胞増殖及び発生を行い得る量を意味する。かかる量は、所与の成分を可変濃度で細胞成長培地に添加し、細胞の増殖及び発生の程度及び期間を熟練した細胞培養者が公知の方法で決定する実験により、所与の成分に対して決定し得る。かかる量の好ましい範囲と例を本明細書に与える。Ｃ．培地本発明の重要な点は、成分を適正量で組合せることで哺乳動物細胞、特に造血細胞の短期及び長期の成長（即ち増殖）及び発生を支援し得ることを見い出したことである。一般的に、本発明培地に含まれる３種の主要な物質がある。細胞外マトリックス材料これらは例えば培地表面への細胞の付着に関与し、典型的には０．２〜１００ μｇ／ｃｍ²の濃度で含まれる。哺乳動物源（ウシまたはヒト、好ましくはネズミ）由来の好ましい細胞外マトリックス材料の例としては、コラーゲン源（好ましくはコラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンが挙げられる。特に好ましいのは下記のものである：・マウスコラーゲンＩＶ：１μｇ／ｃｍ²以上、好ましくは約２〜１００μｇ／ｃｍ²、より好ましくは約５μｇ／ｃｍ²の濃度で使用し得る；・マウスフィブロネクチン：０．２μｇ／ｃｍ²以上、好ましくは約０．５〜１００μｇ／ｃｍ²、より好ましくは約２μｇ／ｃｍ²の濃度で使用し得る。しかしながら、マトリックスと関連分子の複合混合物であるＭＡＴＲＩＧＥＬのごとき純粋でない細胞外マトリックス源を使用することもできる。既存の付着細胞によって分泌されたマトリックスを使用することもできる。細胞をプラスチック培地表面で成長させ、細胞外マトリックスを分泌させ、かかる細胞を回収し、第２の細胞系が付着し得る細胞外マトリックス層を与える。成長因子これらは、本発明培地による支援が所望される種々の組織由来の基質細胞または他の細胞の増殖を剌激することに関与する。骨髄基質細胞の場合にはそれらは培地中で造血細胞のための成長因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−１、ＣＳＦ−１、ＩＬ−６、その他種々のものを産生する。無血清培地を使用して精製造血細胞集団を培養する場合、基質細胞は除外されるであろうことから、（関与する成長因子及び細胞に従って典型的には０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で）成長因子を添加する必要がある。特定の型の細胞の成長及び発生を支援するのに必要な成長因子の選択は細胞系によって変わり、細胞生物学及び培養分野の当業者には容易に決定されるであろう。本発明に特に有用であるが、成長のために所望または必要であれば別の特定の成長因子を常に添加し得る、基質細胞及び組織細胞のための成長因子としては下記のものが挙げられる。・組換えヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）：０．５ｎｇ／ｍ１以上、好ましくは約５〜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で使用し得る；・組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）：０．１ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．５〜４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２ｎｇ／ｍｌの濃度で使用し得る；・組換えヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（好ましくはＢ−Ｂイソ形）：０．５ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２〜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用し得る；・（ヒトまたは好ましくはウシ膵由来の）インシュリン：０．５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し得る。これらの成長因子を産生する細胞系由来のならし培地のごとき純粋でない成長因子源を使用することもできるが、成分の明確な培地は得られない。更に、他の種、例えばウシやマウス由来の成長因子を使用することもできる。栄養素これらは、培養細胞の正常代謝機能に関与する分子である。本発明の培地に有用な栄養素及び代謝添加剤としては標準培地（後述）；血清アルブミン（好ましくはウシまたはヒト）；トランスフェリン（好ましくはウシまたはヒト）；細胞の成長及び発生に有用な脂質及び脂肪酸源（このましくはダイズ脂質）；コレステロール；還元剤（好ましくは２−メルカプトエタノールまたはモノチオグリセロール）；ピルビン酸塩（好ましくはピルビン酸ナトリウム）；グルココルチコイド（好ましくはコーチゾン誘導体、例えばヒドロコーチゾン２１−ヘミスクシネート、特に好ましくはナトリウム塩）；及び、ヌクレオシドが挙げられる。本発明培地の栄養素の個々の成分の幾つかを以下に詳述する：・本発明に従って使用され得る「標準培地」は、通常は下記の範疇から少なくとも１種の成分を与える、細胞成長のための標準培地である：（ａ）通常はグルコースのごとき炭水化物の形態のエネルギー源；（ｂ）実質的に全ての必須及び非必須アミノ酸、通常は２０種のアミノ酸と、システインの代わりにシスチンとからなる基本セットのもの；（ｃ）低濃度で必要とされるビタミン及び／または他の細胞成長支援有機化合物；（ｄ）水素イオン濃度を安定化させ、従って酸及び塩基を適当に中和することにより溶液のｐＨを安定化するよう作用する緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳ、ＴｒｉｓまたはＭＯＰＳ（好ましくはＨＥＰＥＳ）；（ｅ）無機塩及び微量元素。微量元素は超低濃度、通常はマイクロモル量（例えば１〜１０００μＭ）で必要とされる無機化合物または天然元素であると定義される。本発明に有用な標準培地の特定の例はＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、Ｆ−１０、α培地、ＮＣＴＣ及びＭｃＣｏｙ培地であるが、好ましいのはＩｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）；Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．Ｎ．＆Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７，９２３（１９７８）である。本発明によれば、標準培地に以下の範疇から特定の成分が補充される。本発明の「血清アルブミン」はヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネズミといった任意の哺乳動物源から得ることができるが、好ましくは血清アルブミン源はヒトまたはウシである。血清アルブミンは、１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは約３〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用し得る。本発明培地は通常は無血清であるが、血清アルブミンのような化学的に十分に規定され高度に精製（純度＞９５％）された任意の血清成分を含んでもよい。トランスフェリンは上述の培地の別のタンパク質成分であるが、これは哺乳動物起源、特にヒトまたはウシ由来のものであるのが好ましい。この成分は２５μ ｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２５〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００〜３００μｇ／ｍｌで配合し得る。「脂質及び脂肪酸源」は種々のかかる供給源の任意のものを意味する。例えば、本発明培地に補充するのに脂質の粗抽出物を使用し得る。脂質抽出物は任意の生物学的供給源から得ることができるが、１つの好ましい供給源は植物材料、特にダイズである（ダイズ脂質抽出物はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入し得る）。典型的には抽出物は約２０％〜約９５％の脂質を含み、その大部分はリン脂質であり、残りは脂肪酸と微量のステロールである。該抽出物は細胞培地に約５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し得る。細胞の原形質膜の流動性を調節し得る分子の添加は重要な成分である。本発明は脂質コレステロールを約１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは３〜３０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約７．８μｇ／ｍｌの濃度で使用する。「還元剤」なる用語は、細胞培地と適合性のある任意の還元剤を意味する。好ましい例としては２−メルカプトエタノールまたはモノチオグリセロールが挙げられる。一般に、還元剤は約１０〜４００μＭ、好ましくは３０〜３００μＭ、特に好ましくは約１００μＭの濃度で存在する。「ピルビン酸塩」は細胞培地と適合性のある任意のピルビン酸の塩を指すが、好ましいのはピルビン酸ナトリウムまたはカリウムである。ピルビン酸自体を添加し、その場である程度塩を形成をしてもよい。ピルビン酸塩は、潜在的なエネルギー源として一般的な代謝過程に、またより複雑な分子の合成に必要とされる。通常ピルビン酸塩は、＞２０μｇ／ｍｌ、好ましくは３０〜５００μｇ／ｍｌ、特に好ましくは約１１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。「ヌクレオシド」なる用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成のための塩基を形成する天然ヌクレオシドを指す。かかるヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジン及びチミジンがある。リン酸化（モノ、ジまたはトリ）類縁体を使用することもできる。ヌクレオシドは培地に約１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜３０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは約１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し得る。既にセクションＢで詳述した成長因子、即ち上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子及び／またはインシュリンは全てが標準培地に含まれるのが好ましい。本発明の全ての実施態様において必要とされない成分は天然または合成コルチコイド、例えばコーチゾン誘導体：プレドニゾン、デキサメタゾンまたは好ましくはヒドロコーチゾンである。これらの分子は炭水化物、タンパク質及び脂肪の代謝に関与し、抗炎症性及び免疫抑制性であり、ある種のサイトカイン及び／またはそれらのレセプター、例えばＴＮＦ−α，ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦのレベルを調節すると考えられる。ヒドロコーチゾンのごときコルチコイドは約０．０５〜５μＭ、好ましくは０．３〜１μＭ、特に好ましくは約０．５μＭの濃度で使用し得る。以下の表は、特に好ましい成分と、それらの各々の適正濃度、好ましい濃度及び最も好ましい濃度とをまとめて示す一覧表である。量は、表中にも記載したが、本明細書で定義した各タイプの等価の成分にも適用し得る。本発明の範囲に含まれる１つの特定の細胞培地例を以下に示す。Ｄ．培地調製及び培養方法以下、本発明の培地を調製し、培養を実施する方法を例示する。本明細書に示した等価の成分は本明細書に示した濃度範囲内で前述のものに置き換えることができる。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）培養を開始する前の晩、６個のウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，表面積１０ｃｍ²／ウェル）を、グルタミン（２９２μｇ／ｍｌ）、ペニシリンＧ（１００単位／ｍｌ）及びストレプトマイシンスルフェート（１００μｇ／ｍｌ）（これら３種は全て、共に（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から１００倍濃度で市販されている）を含むＩｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）溶液０．７３ｍｌでコーティングする。次いで、溶解した細胞外マトリックス材料を、前記溶液に添加することができる。幾つかのＥＣＭ分子を試験した。コラーゲン源が重要であり、マウスコラーゲンIV（５μｇ／ｃｍ²，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃Ｃ０５４３）が好ましいことが分かった。次いで、別のＥＣＭ分子（例えばフィブロネクチン及びラミニン）を添加することができる。通常は、マウスフィブロネクチン（２μｇ／ｃｍ²，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃Ｆ１１４１）を、コラーゲンIVと組み合わせて０．８ｍｌの最終容量で使用する。翌朝、ウェルをＩＭＤＭで１度洗浄し、無血清培地と細胞を添加する。栄養源／代謝性添加剤幾つかの栄養源を培地に加える。栄養源は１００倍の最終濃度で調製する。培養物の最終濃度は以下に示す：・ウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ａ８４１２）。・ウシトランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ｔ−１２８３）又はヒトトランスフェリン（３００μｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ− Ｍａｎｎｈｅｉｍｃａｔ．＃６５２２０２）（それぞれマウス及びヒト培養に対して）。・大豆脂質（２５μｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍｃａｔ．＃６５２２２９）。・コレステロール（７．８μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ｃ−３０４５）。・２−メルカプトエタノール（１０^-4Ｍ．Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ｍ−７５２２）。・ピルビン酸ナトリウム（１１０μｇ／ｍｌ（１ｍＭ），Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ｐ３６６２）。・２１−ヘミ琥珀酸ヒドロコーチゾンのナトリウム塩（５×１０^-7Ｍ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ｈ−４８８１）。・ヌクレオシド（それぞれ１０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃ｓ：アデノシンＡ−４０３６，グアノシンＧ−６２６４，シチジンＣ−４６５４，ウリジンＵ−３００３，２’−デオキシアデノシンＤ−０６５１，２’−デオキシグアノシンＤ−０９０１，２’−デオキシシチジンＤ−０７７６，チミジンＴ−１８９５）。成長因子（基質細胞用）ＩＭＤＭ及び１％ＢＳＡ中で１００倍濃度の成長因子ストック溶液を調製し、次いで培地中に希釈して、以下に示す必要濃度にする。・表皮成長因子（ＥＧＦ）（１５ｎｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ｅ４１２７（マウス、顎下腺由来）、ｃａｔ．＃Ｅ１２６４（ヒト、組換え体））。・組換えヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（２ｎｇ／ｍｌ，ＡｍｇｅｎＩｎｃ．又はＧｅｎｚｙｍｅｃａｔ．＃１２０８−００）。・組換えヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（Ｂ−Ｂイソ形）（１０ｎｇ／ｍｌ，ＡｍｇｅｎＩｎｃ．）。・インシュリン（ウシ膵臓由来，１０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ｉ４０１１）。無血清培地の調製栄養源、成長因子等のストック溶液を新たに調製し、次いで、必要な相対濃度（全ての添加剤については５０μｌ／ウェル、ＢＳＡについては６６７μｌ／ウェル）でプールし、（凍結融解を避けるため）必要時まで少量のアリコートで凍結する。無血清培地の実質的に全ての前記成分が、培養物中での基質細胞や造血細胞の最適な成長のために重要であることに注目することが重要である。しかしながら、全ての成分が絶対に必須というわけではない。最も重要な成分は、細胞外マトリックス材料、ＩＭＤＭ（又は同様の標準培地）及び血清アルブミンである。他の任意の成分を除去すると、緩慢であったり苛酷であったりしながら成長を低減させることになるだろう。培養技術まずＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した８〜１２週齢Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスの大腿骨骨髄（他のマウス株を使用してもよい）をＩＭＤＭ内にフラッシュして、長期骨髄培養物を得る。リンパ様長期骨髄培養物が必要であれば、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓから入手した又はＡｍｇｅｎで繁殖させた２〜４週齢Ｂ６Ｃ３Ｆｅ−ａ／ａ−ｏｐ／ｏｐマウスを使用する。この場合、大腿骨及び脛骨を小片にカットし、次いでこれらを乳棒及び乳鉢を用いて摩砕して細胞を調製する。使用した任意のマウス株の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけて、３度洗浄する。次いで、これらを１０ｍｌ容量中に再度懸濁させる。この手順を２度繰り返し、最後に、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ中に５×１０⁶個／ｍｌの濃度で細胞を再度懸濁させる。胎児肝臓及び脾臓のような器官を小片にカットし、次いで組織ホモジナイザーを用いて均質化して、他の組織や器官からの細胞を調製する。細胞を再度３度洗浄し、胎児肝臓は１０⁶〜５×１０⁶個／ｍｌ、脾臓は１０⁷〜５×１０⁷個／ｍｌの濃度で再度懸濁させる。肝臓、肺臓、腎臓、脳及び心臓のような他の器官及び組織も全く同様に調製する。但し、これらは、（ＩＭＤＭ及び２０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンに溶解した）２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）にて３７℃で１．５時間処理し、組織を消化してから均質化する。細胞は、５×１０⁶〜１０⁷個／ｍｌの濃度で使用する。次いで、得られた１ｍｌの細胞懸濁液を、１．２２ｍｌの凍結無血清培地と共に、先に調製したウェルの各々に加える。上記のようにグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充した調製したばかりのＩＭＤＭ２．７８ｍｌを加えて、容量を５ｍｌ／ウェルにする。これにより、各細胞ストック懸濁液について説明したのと同じ最終細胞密度／ウェル（５ｍｌ容量）が得られる。即ち、ウェルに５×１０⁶個／ｍｌで１ｍｌ導入すると、最終密度は５×１０⁶個／ウェルになる。次いで、培養を、好ましくは暗所にて、５％ＣＯ₂（一般には１〜２０％、好ましくは３〜１０％、特に好ましくは４〜６％）に調整した空気インキュベーターを用い、長期骨髄培養の場合は３３℃で、３週間以内の骨髄培養及び組織又は器官培養の場合は３７℃で（一般には３０〜４５℃、好ましくは３３〜４０℃、特に好ましくは３３±１℃又は３７±１℃で）インキュベートする。細胞を７日間付着及び増殖させ、次いで培地の半分を除去し、これを２．５ｍｌの無血清培地に代えることにより、骨髄、胎児肝臓及び脾臓培養の場合で週２回、他の全ての器官の場合で週１回仕込む。Ｅ．培地の使用本発明では以下の使用が考えられる。本発明の培地は、高密度（培地１ｍｌに対して少なくとも１００，０００個の細胞、しばしば培地１ｍｌに対して６００，０００〜１０，０００，０００個の細胞）の細胞培養に特に有用である。更には、これらの培地で細胞を培養すると通常、市販培地での細胞培養に比べて生成物の収率が高まる。様々な哺乳動物細胞の培養では、完全培地を使用することができる。この培地に、選択した細胞を接種する。この接種物の容量は、ある程度変動することは構わないが、培地容量の約５分の１であることが好ましい。接種後、培養物を温度に関して適切な環境で維持する。本発明の培地を、半固体培地又は懸濁液中で単層として細胞を培養するために使用することができる。細胞は、小規模培養として、即ち約２Ｌ以下の容量で増殖させることができる。あるいは、回転式（spinner）フラスコで約１６Ｌまで又は動物細胞由来の生体化合物の商業生産用に設計された発酵器で約８０Ｌ以上のように、細胞を大容量で培養することが好ましい。細胞を、高密度培養と考えられる少なくとも１００，０００細胞／ｍｌの濃度で小規模懸濁培養又は大規模懸濁液培養として増殖させることが好ましい。細胞をバイオリアクター内で維持して、細胞によって生成される毒性分子を連続的に除去し、栄養源を絶えず供給することも可能である。細胞自体又は細胞内部の生体化合物が、培養で所望される最終生成物であってもよい。この場合、これらを培地から採取して、分離することができる。あるいは、細胞によって培地内に分泌されるタンパク質又は他の有機化合物が培養で所望される最終生成物であってもよい。この場合、培地を細胞から分離し、次いで問題の化合物を培地から精製することができる。本発明は更に、骨髄移植手法で潜在的に有用である。この可能性は、これらの培地や技術が共に、基質細胞又は添加した外因性成長因子の存在下で、造血幹細胞及び他の前駆体の生存、増殖（expansion）及び／又は発生を支援し得ることにより示唆される。本発明により生成された造血細胞を、ガンの化学療法又は放射線治療後に白血球減少症にかかった患者の治療用移植片として使用することができる。これらは、先天性疾患、代謝性免疫疾患又は血液疾患で移植片として使用することもできる。本発明の他の考えられる使用は、体性細胞遺伝子治療のための幹細胞内への遺伝子移入、特に免疫又は血液疾患（例えば重症合併型免疫不全（ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠乏症、及びＡＩＤＳ）の治療のための造血幹細胞内への遺伝子移入である。本発明の別に考えられる使用は、生物学的役割が判明していない遺伝子の機能を決定することである。本発明を用いて樹立した細胞培養物を、アンチセンスオリゴマーで処理することができる。これらは、通常約１５〜３０塩基長の短いＤＮＡ鎖である。これらは、アンチセンスが鏡像である遺伝子の正常な転写、従って発現を阻害する。アンチセンスＤＮＡは、培養物に直接加えるか又はレトロウイルスベクターの形態で加えることができる。このようなアプローチにより、新しい遺伝子の機能が潜在的に判明し得る。以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を例示するものであるが、本発明を限定するものではない。全ての引用文献は参考として本明細書に組み入れるものとする。 VI．実施例実施例１−市販の無血清培地又は本発明を用いた長期骨髄培養物の樹立既に記載した方法で、（５×１０^-7Ｍヒドロコーチゾン及び３７℃の温度を用いて）無血清長期骨髄培養物を調製した。本発明により生じた初期成長、増殖及び造血を、本発明で使用したのと同じ細胞外マトリックス（５μｇ／ｃｍ²コラーゲンIV及び２μｇ／ｃｍ²フィブロネクチン）の存在下で様々な市販の無血清培地を用いて得られた結果と比較した。使用した市販の無血清培地は、内皮ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．＃３２０−７６０１ＰＪ）、マクロファージＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．＃３２０−２０６５ＰＧ）、ＡＩＭ−Ｖ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．＃３２０−２０５５ＡＧ）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，ｃａｔ．＃１２−７２５Ｂ）、ＮｕｔｒｉＤＯＭＡＳＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｃａｔ．＃１２７１０９１）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，ｃａｔ．＃１２−７２３Ｂ）、ＮｕｔｒｉｄｏｍａＳＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｃａｔ．＃１００−１０４）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡＰＦ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，ｃａｔ．＃１２−７２７Ｂ）、及びＰＦＨＭ−II（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ，＃３２０−２０４５ＡＧ）を含んでいた。血球計を用いて７日後に培養物中の付着細胞数をカウントして、培養物の樹立効率を調べた。適切な増殖環境がなければ、付着、増殖して、約３×１０⁴個／ウェルの任意の培養物を生成する少数の細胞が静的な非増殖性状態で維持されるか又はたちまち死滅する。図１は、１週間の培養後の骨髄基質付着細胞及び造血付着細胞の数が、市販の被試験無血清培地のいずれよりも本発明の培地で遥かに多かったことを示している。存在する付着細胞の数は、本発明の培地を用いて得られた数の２〜２２％であった。唯一の例外はＰＦＨＭ−II培地であり、この培地では、本発明を用いて得られた付着細胞の数のほぼ４８％であった。様々な種類の無血清培地で細胞の形態を調べると、本発明の培地で剌激した培養物では、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞（又はアジポサイト）及びマクロファージを含む様々な種類の基質細胞が得られ、市販の無血清培地の方が細胞増殖を限定することが観察された。全ての従来の培地は、マクロファージの生存及び少数の線維芽細胞の増殖を支援し得たが、内皮細胞があるとしても僅かであり（内皮細胞ＳＦＭを用いる場合を除く）、脂肪細胞もなかった。従来の無血清培地は全て、本発明に比べて基質細胞増殖の刺激が限定されていた。付着基質細胞層の樹立効率の他に、３週間後にこれらの培養で生ずる造血の程度も、培地中に放出された成熟造血細胞の数をカウントすることにより評価した。肉眼で観察されるように、本発明では非付着細胞数が１５．５±２．１×１０⁶ 個／ウェル、他の無血清培地タイプではゼロであることに関連して、本発明の培地のみが造血発生の兆候を示すことが判明した。実施例２−長期骨髄培養物の効率的な樹立には、全ての種類の血清培地成分が必要である。長期骨髄培養物の効率的な樹立に全ての種類の無血清培地成分（ＩＭＤＭ、成長因子、細胞外マトリックス及び培地補充物）が必要であるかどうかを調べるために、これらの全成分の存在下で、又はこれらの成分のうち１種を使用せずに、培養を開始した。ＩＭＤＭの代わりにはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用い、他の成分の代わりにはＩＭＤＭを用いた。成長因子には、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子及びインシュリンが含まれた。使用した細胞外マトリックス材料は、コラーゲンIV及びフィブロネクチンであった。培地補充物には、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、大豆脂質、コレステロール、２−メルカプトエタノール、ヌクレオシド及びヒドロコーチゾンが含まれた。５×１０^-7 Ｍヒドロコーチゾンの存在下、３７℃で培養を実施した。図２は、７日後の骨髄基質付着細胞及び造血付着細胞の数が、１種の成分を用いない場合よりも、無血清培地の全成分の存在下で遥かに多いことを示している。１種の成分の不在下では、完全培地の付着細胞数の２〜１６％しか得られなかった。血清を補充した従来の“Ｄｅｘｔｅｒ型”長期骨髄培養に改善を加えるのに、どの種の無血清培地成分が最も重要であるかを調べるために、様々な種類の無血清培養系をＤｅｘｔｅｒ培養に加えた。これらの成分には、細胞外マトリックス、培地型（Ｄｅｘｔｅｒ法はフィッシャー培地を使用し、本発明はＩＭＤＭを使用する）、成長因子、栄養源（ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、コレステロール、２−メルカプトエタノール、ヌクレオシド及び大豆脂質）並びに温度（Ｄｅｘｔｅｒ法は３３℃を使用し、本発明は３７℃を使用する）が含まれる。７日後の付着細胞の数をカウントすることにより、これらの無血清培地成分を１種以上添加することの効果を調べた。前述のように８〜１２週齢Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスの大腿骨からの骨髄細胞懸濁液を調製して、Ｄｅｘｔｅｒ培養物を樹立した。細胞を、最終濃度が２０％（ｖ／ｖ）の血清、１０^-6Ｍのヒドロコーチゾン及びフィッシャー培地と一緒に、Ｃｏｒｎｉｎｇ６ウェルプレートに添加して、最終容量を５ｍｌ、細胞密度を５×１０⁶個／ｍｌとした。５％ＣＯ₂含有空気を含む加湿インキュベーターで、これらの培養物を３３℃でインキュベートした。次いで、フィッシャー培地をＩＭＤＭに代える場合のように、無血清培養系の様々な成分を添加するか又はこれを用いてＤｅｘｔｅｒ培養の成分に代え、３３℃ではなく３７℃を使用した。ヒドロコーチゾン濃度が５×１０^-7Ｍである標準無血清培養の場合を除き、いずれの場合も、使用したヒドロコーチゾン濃度は１０^-6Ｍであった。無血清長期骨髄培養物を前述の方法で樹立した。図３は、基質細胞増殖量が、血清を補充したＤｅｘｔｅｒ培養よりも無血清培養条件下で遥かに多いことを示している。しかしながら、細胞数のこのような大きな増加は、無血清培地成分の１種だけで説明することも任意の対で説明することもできない。それどころか、最大数の細胞が得られる条件を提供するには全ての成分が必要である。更には、標準無血清培養に血清を添加すると、恐らくは血清が不確定の阻害性分子を含んでいるために、細胞数が減少することが知見された。実施例３−無血清長期骨髄培養での細胞外マトリックス材料の重要性無血清長期骨髄培養物の樹立における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料の重要性を調べるために、種類や量の異なるＥＣＭを含む培養中の付着細胞数を７日後に調べた。培養を実施する前の晩、培養ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ６ウェルプレート）を、図４に示すような種類や濃度の異なるＥＣＭ（最終容量は０．８ｍｌ）でコーティングした。マウスコラーゲンIV（Ｓｉｇｍａ）は０〜１５μｇ／ｃｍ²の濃度範囲で使用し、マウスフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）は２μｇ／ｃｍ²で使用した。血清を補充した培養にはＥＣＭコーティングは行わなかった。翌朝、ＥＣＭ溶液を除去し、血清（２０％ウマ血清、Ｇｉｂｃｏ，１０^-6Ｍヒドロコーチゾン及びフィッシャー培地、Ｇｉｂｃｏ）並びに無血清培養（５×１０^-7Ｍヒドロコーチゾン）を前述の方法で実施した。図４は、ＥＣＭの不在下では、無血清培養中で７日後の付着細胞数は、ウマ血清を補充した“Ｄｅｘｔｅｒ”培養の約２倍にすぎず、ＥＣＭの存在下よりも遥かに少ないことを示している。コラーゲンIVを添加すると、付着細胞数が４倍まで増加する。フィブロネクチン及びコラーゲンIVをウェルに添加すると、付着細胞数は更にＥＣＭの不在下の６倍まで増加する。実施例４−無血清長期骨髄培養物での造血細胞の生成無血清培地が長期造血骨髄培養物を維持し得るかどうかを評価するために、骨髄培養を５×１０^-7Ｍのヒドロコーチゾンの存在下、３７℃の温度にて、前述の方法で実施した。培養物を週２回仕込み、仕込みから４日後に（ａ）非付着細胞総数をカウントし、（ｂ）非付着コロニー形成細胞数をカウントすることにより、培養物での造血の程度を週毎に調べた。血球計を用いて、培養物中の非付着細胞数をカウントした。当業者にはよく知られた標準的な半固体培地アッセイを用いて、コロニー形成細胞の数を調べた。簡単に説明すると、細胞を５×１０⁴細胞／ｍｌの濃度で、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１０％（ｖ／ｖ）脱イオン化ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．８％メチルセルロース、成長因子マウスＩＬ−３（０．７５ｎｇ／ｍｌ，Ｐｉｐｒｏｔｅｃｈ）及びＩＭＤＭを含む半固体培地中に懸濁させた。この混合物１ｍｌを直径３５ｍｍのペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）に分配し、１０％ＣＯ₂、７％Ｏ₂、８３％Ｎ₂を含む密封した加湿ボックス内にて、３７℃で１４日間インキュベートした。図５は、１１週間の期間に無血清培養で生成した非付着細胞の数を示している。この期間中、非付着細胞の生成は、導入した細胞集団（２５×１０⁵個の細胞）の約５０％の平均値に維持されていた。培養開始から３週間後に、細胞生成のピークに達し、培養期間全般にわたって、細胞生成（cellularity）の頻繁な増減が生じた。他の実験では、造血は１４週間以上維持された。図６は、９週間にわたって同一培養物（図５参照）で生成された非付着コロニー形成細胞の数を示している。培養開始から３週間後に生成のピークに達し、最初に培養物中に含まれるコロニー形成細胞の数のほぼ１７０％であった。３週間後、コロニー形成細胞数は急速に低下し、約５週間後には平均の２０００個／ウェルに達した。注目すべき重要な点は、コロニー形成細胞の多くが基質細胞に付着し、非付着細胞のみを使用するこのアッセイでは検出されないために、このアッセイがこれらの培養物で生じる造血の量の指標をもたらし、コロニー形成細胞の絶対数を反映しないことである。実施例５−種々のマウス株を用いた、無血清長期骨髄培養物での造血細胞の生成まず、Ｂ６Ｄ２Ｆ₁マウスの骨髄細胞を用いて本発明を実施した。造血が他のマウス株からサポートされ得るかどうかを調べるために、通常研究者らが使用している様々な株（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）を使用して、長期骨髄培養物を樹立した。大腿骨骨髄をＩＭＤＭ内にフラッシュし、細胞を３度洗浄し、次いでこれらをＩＭＤＭ及び無血清成分（ヒドロコーチゾンを含む）に添加することにより、前述した方法で培養を実施した。次いで、細胞懸濁液を、コラーゲン及びフィブロネクチンで予めコーティングしたウェル内に置いて３週間インキュベートし、培地の半分は２週間目から週２回代えた。この期間の後、最後の仕込みから４日後に、生成した非付着細胞の数をカウントした。図７は、被試験マウスが近交マウスであれ、非近交マウスであれ、ハイブリッドマウスであれ、無血清培地が、全てのマウス株からの造血を支援したことを示している。Ｂ６Ｄ２Ｆ₁及びＤＢＡ／２が最大量の造血細胞生成を示し、細胞は主に好中球及びマクロファージであった。肉眼では、ウェルにたくさんの非付着細胞があることが観察された。Ｃ５７Ｂ１／６株、Ｂａｌｂ／ｃ株及びＢ６Ｃ３Ｆ₁株は、これらの２種の株によって生成される造血細胞の約５０％の数の細胞を生成した。株ＣＤ−１及びＣ３Ｈは生成細胞数が最小であったが、これらの培養物での細胞生成数は増加し、他の株の３週間後に対してむしろ４〜５週間後に最大に達した。Ｂ６Ｃ３Ｆｅ−ａ／ａ−ｏｐ／ｏｐのような他のマウス株からもうまく造血が達成されたが、同様のことは全てのマウス株でも言える。実施例６−Ｂリンパ球を含む長期骨髄培養物これまでの実施例で説明した無血清長期骨髄培養物での造血発生は主に、血清を補充したＤｅｘｔｅｒ培養の場合と同様に、好中球及び単球／マクロファージである。しかしながら、ｉｎｖｉｖｏ骨髄では、他の種類の造血細胞（例えばＢリンパ球、巨核球及び赤血球）が生成される。本発明者らの長期骨髄培養物での前記細胞の発生に対して毒性及び／又は阻害性を示すヒドロコーチゾンを除去すると、これらの細胞の生成の可能性が高まることが判明した。これは、成長因子ＣＳＦ−１（Ｍ−ＣＳＦ）の不在下でも増加し得る。この成長因子は通常これらの培養物中に高濃度で存在し、また恐らくは優先成長及び発生刺激として作用するため、マクロファージ及び好中球の発生が他の種類の発生よりも高くなる。点突然変異のためにホモ接合性状態ではＣＳＦ−１を生成せず、従ってこのタンパク質に対するｍＲＮＡを産生しない突然変異マウス株Ｂ６Ｃ３Ｆｅ−ａ／ａ−ｏｐを用いて、ＣＳＦ−１を除去した。このようにＣＳＦ −１が欠如すると、生後初期での切歯欠如、破骨細胞数の減少により生じる骨の機能不良、マクロファージ数の大幅な減少及び不妊症のように動物に幾つかの影響を及ぼす。既に詳述した標準的な手順を用いて、培養物を樹立した。Ｂ６Ｃ３Ｆ₁マウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、大腿骨及び脛骨は生後２〜４週間目のものを使用した。乳棒及び乳鉢を用いて骨を摩砕し、細胞を３度洗浄し、次いで得られた単一細胞懸濁液を、細胞外マトリックス（コラーゲンIV及びフィブロネクチン）で予めコーティングしたウェル中のＩＭＤＭ及び無血清培地成分（ヒドロコーチゾンは非添加）に添加した。次いで、培養物を３週間インキュベートし、２週目以降週２回成分を仕込み、その後細胞の形態を調べた。図８は、ヒドロコーチゾンで剌激したＢ６Ｃ３Ｆ₁−ａ／ａ−＋／＋培養物では、生成した非付着細胞の大半が好中球であることを示している。これらの培養物ではかなりの数のマクロファージも生成するが、大半はウェル表面に付着したままである。対照的に、ヒドロコーチゾンで刺激していない標準培養物では、生成する非付着細胞総数は遥かに少なくなる。この生成細胞はすべてマクロファージである。これらの相違で考えられる理由は、ヒドロコーチゾンが原始前駆細胞の発生に直接作用するか、又は成長因子レセプター発現を刺激することにより細胞及び／又は好中球の発生を刺激する成長因子（例えばＧ−ＣＳＦ及びＧＭ −ＣＳＦ）の生成に間接的に作用することである。しかしながら、ヒドロコーチゾンの不在下では、主な発生剌激はＣＳＦ−１である。これは、マクロファージの発生を刺激し、比較的高濃度でこれらの培養物中に内生される因子である。従って、細胞発生は単球及びマクロファージに有利となる。ヒドロコーチゾンで剌激したＢ６Ｃ３Ｆ₁−ａ／ａ−ｏｐ／ｏｐ培養物は、標準＋／＋培養物（データは図示せず）で観察されるように同様に多数の好中球を生成する。しかしながら、ヒドロコーチゾンがなければ、発生は異なる。最も顕著な変化は、Ｂ２２０抗原及び表面免疫グロブリン（ｓＩｇＭ）を用いた免疫細胞化学染色及び形態で分かるように、かなりの数（約１７％）のＢリンパ球が存在することである。好中球は数的には尚主要タイプの生成細胞であり、細胞の８０％を占める。少数（３％）のマスト細胞も観察される。これらの培養物中にＢリンパ球が存在するためには明らかに、ヒドロコーチゾン及びＣＳＦ−１が存在してはならない。ヒドロコーチゾンはリンパ球に対して有毒であり、ＣＳＦ−１は恐らく、Ｂ細胞の発生よりもむしろマクロファージの発生が剌激されるように主要な発生因子として作用する。ＣＳＦ−１、従ってマクロファージを除去すると明らかに、除去しなければ観察されることのない細胞が発生し得、またもはやＣＳＦ−１の主要な作用を克服する必要がないので、培養でより高い制御が可能となる。この一例を図８に示す。ここでは、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びＩＬ−７をＯＰ／ＯＰ細胞に添加し、ヒドロコーチゾンは添加しない。これらの培養物では、Ｂ細胞及びマスト細胞の相対数が増加し、ＩＬ−７はＢ細胞の増殖を刺激し、ＳＣＦはマスト細胞の増殖を刺激する。実施例７−マウス又はヒト器官及び組織からの無血清培養物の樹立様々な広範な器官（例えば脾臓、胎児肝臓、心臓、肺臓、腎臓、肝臓及び脳）から無血清長期骨髄培養物を樹立することができる。まず、器官を小片にカットして単一細胞懸濁液を調製する。ある種の器官（例えば脾臓、脳及び胎児（仔）肝臓）は容易に崩壊するので、組織ホモジナイザー内に直接導入する。対照的に、肺臓、肝臓、腎臓及び心臓は崩壊しにくいので、ＩＭＤＭ及び２０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）に溶解した２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）にて３７℃で１．５時間処理し、組織を消化してから均質化する。次いで、得られた細胞懸濁液を数分間沈降させて、組織破片を除去し、廃棄することができる。次いで、細胞を遠心分離にかけ、これを１０ｍｌの容量中に再度懸濁させて、この単一細胞懸濁液を３度洗浄する。この方法を２度繰り返し、細胞を、使用に適した濃度で再度懸濁させる。調製後、コラーゲンIV及びフィブロネクチンで予めコーティングした６ウェルトレー（Ｆａｌｃｏｎ）中で、この細胞懸濁液１ｍｌを１．２２ｍｌの調製したばかりの又は凍結濃縮した無血清培地（造血が必要な脾臓又は胎児（仔）肝臓の培養を除いてはヒドロコーチゾンを含まず）及びＩＭＤＭ（通常どおりグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充）に添加した。これらの培養での初期細胞密度は、使用する細胞の種類によって異なり、胎児（仔）肝臓培養物は１０⁶〜５×１０⁶個／ウェルで、脾臓培養物は５×１０⁶〜５×１０⁷個／ウェルで、他の器官は５×１０⁶〜５×１０⁷個／ウェルで樹立する。次いで、週１度培地の半分を除去して新しい培地に代えて、細胞を５％ＣＯ₂含有空気を含む加湿インキュベーター内にて、３７℃でインキュベートする。このようにして調製した培養物により、脾臓細胞及び胎仔肝臓細胞から造血が生じ得る。更には、全ての種々の器官は、培養器官に由来する（アルカリ性及び酸性ホスファターゼのような様々な酵素の存在に対する染色や形態によって決定される）不均質細胞の集密層を生じる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）標準培地、（ｂ）血清アルブミン、（ｃ）トランスフェリン、（ｄ）脂質及び脂肪酸源、（ｅ）コレステロール、（ｆ）還元剤、（ｇ）ピルビン酸塩、（ｈ）ＤＮＡ及びＲＮＡ合成用ヌクレオシド、（ｉ）基質細胞、組織細胞又は器官細胞の増殖及び発生を刺激する少なくとも１種の成長因子、及び（ｊ）少なくとも１種の細胞外マトリックス材料を細胞の培養に効果的な量含んでおり、無血清又は低血清である細胞の長期増殖及び発生用培地。２．前記成長因子が、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子及びインシュリンからなる群の中から選択される請求項１に記載の培地。３．前記成長因子の各々を含んでいる請求項２に記載の培地。４．更にグルココルチコイドを含んでいる請求項１に記載の培地。５．前記グルココルチコイドがヒドロコーチゾンである請求項４に記載の培地。６．更に基質細胞を含んでいる請求項１に記載の培地。７．更にＣＳＦ−１活性阻害剤を含んでいる請求項１に記載の培地。８．前記培地中で培養すべき前記細胞がＣＳＦ−１を生成し得ない請求項１に記載の培地。９．前記培地中で培養すべき前記細胞がＢ６Ｃ３Ｆｅ−ａ／ａ−ｏｐ／ｏｐマウス株から得られる請求項８に記載の培地。１０．前記標準培地がＩｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地である請求項１に記載の培地。１１．前記血清アルブミン、トランスフェリン及び成長因子がヒト、マウス又はウシ起源である請求項１に記載の培地。１２．前記ヌクレオシドが、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、２ ’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジン又はチミジンの１種以上である請求項１に記載の培地。１３．前記細胞外分子が、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンからなる群の中から選択される請求項１に記載の培地。１４．前記細胞外マトリックス材料の各々が含まれる請求項１に記載の培地。１５．前記細胞が造血性又はリンパ生成性である請求項１に記載の培地。１６．前記細胞が哺乳動物器官又は組織に由来する請求項１に記載の培地。１７．前記細胞が、正常細胞、非不死化細胞又は細胞系である請求項１に記載の培地。１８．以下の成分：を指示した濃度で含んでいる請求項１に記載の培地。１９．請求項１に記載の培地で細胞を８〜２０週間培養することを包含する細胞の長期培養方法。２０．請求項１に記載の培地で細胞を２〜７週間培養することを包含する細胞の短期培養方法。