JPH08505701A

JPH08505701A - 触媒性非酵素ポリペプチドおよび蛋白質の選別方法

Info

Publication number: JPH08505701A
Application number: JP6516316A
Authority: JP
Inventors: エシュハー，ゼリッグ; エス．グリーン，バーナード; エス．タウフィック，ダン
Original assignee: イエダリサーチアンドデベロツプメントカンパニーリミテツド; イシウムリサーチアンドデベロップメントカンパニーオブザヘブリューユニバーシティーオブイエルサレム
Priority date: 1993-01-13
Filing date: 1994-01-12
Publication date: 1996-06-18
Also published as: DE69427123D1; WO1994016332A1; DE69427123T2; IL104384A0; IL104384A; EP0688431B1; EP0688431A1; EP0688431A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、基質Ｓの生成物Ｐへの変換に係わり、非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質を選別または検出する方法を提供し、この方法は潜在的に触媒性を有する試料を支持体上に固定されている基質Ｓと接触させ、得られる固定されている生成物Ｐを、好ましくは免疫検定法により検出する方法である。この方法は好ましくは、ハイブリドーマ上清をアシル転移反応、例えば加水分解またはアミノ分解、縮合反応およびエナンチオマーの分割を触媒する、触媒性モノクローナル抗体に係わり選別するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】触媒性非酵素ポリペプチドおよび蛋白質の選別方法発明の分野および背景本発明は、ハイブリドーマ上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）またはその他の潜在的触媒源を触媒活性に係わり直接選別することに関するものであり、さらに特に触媒性抗体を包含する非酵素触媒性ポリペプチドおよび蛋白質を選別または検出する方法に関するものである。バイオテクノロジイの重要な目標の一つに、いずれか所望の化学反応に係わる触媒を生成する能力がある。これには、化学、生物学および医学における多くの広範囲に及ぶ用途がある。この目標に対する多くの研究がなされており、これには現存する酵素の特定部位修飾、新規酵素の微生物誘発、全合成ペプチドおよび合成有機物質が包含される。一般に、触媒作用に関して注目され、照準が当てられているが、これらの経路の中で、「特別に仕立てられた」（“ｔａｉｌｏｒｍａｄｅ”）、信頼でき、一般に適用できる技術を提供したものはない。触媒性抗体を、速度増大および反復性と組み合わせて、予めデザインされている基質に対して特別に仕立てることはできるが、これは従来開示されているような（１−３）、最も注目される酵素模擬体を導いた。触媒性抗体はハプテン、代表的には触媒作用を受けた反応の遷移状態（ＴＳ）の安定合成類縁体に対して誘発される。免疫感作後に生じる全作品は、ハイブリドーマとして永遠性が与えられる（４）。これらは次いで、このハプテンに結合するモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する選別に付される。これらのハイブリドーマの培養上清を、抗体触媒性に係わり直接選別することは従来では不可能であった。これは、比較的高いバックグランド反応、抗体の一般に低い触媒効率および同一反応を触媒する夾雑酵素によるものである（５）。従って、触媒活性を検出するためには、大量の（通常、腹水からの）精製モノクローナル抗体が必要である。ハプテンに結合する数ダースの抗体の中で、若干のみが触媒性であり、場合によっては、これらの中で触媒性のものはない。従って、これらの非効率的であって、かつまた労力を消費する方法の代わりに、迅速で、直接的な選別方法を使用する必要があることが広く認識されている（２、３、６−８）。新規な非ハイブリドーマ法、例えばファージの組み合わせ可変領域クローニングなどの方法がまた、抗体の発現に使用されていた（９、１０）。しかしながら、すでに知られているように、これらの方法を触媒性抗体を得るために引き続いて使用するには、適当な選別が必要である。最近になって、Ｇｏｎｇ等は（２８）、大量の抗体ライブラリイに対する発色団検出法を提案した。しかしながら、この手段は加水分解反応に制限され、かつまた強力な背景シグナルを生じる遊離エステル基を包含する。証明されているように（５）、この欠点はこのような手段の実用を制限する。触媒性抗体を誘発させる手段として数種の変法があり、この総合的技術には次の技術がある：触媒作用を受けさせようとする反応を、そこに包含されるものと信じられるメカニズムの観点から分析する；この方法は触媒作用を受けさせようとする反応に対して安定化させなければならないものを解明する必要がある。代表的には、この安定化させなければならないものは、反応体から生成物までの反応経路に沿って存在し、孤立していない一時的状態（遷移状態または高エネルギー中間体）にある。次いで、この一時的状態の立体電子構造を偽装する、１種または２種以上の化学物質をデザインし、合成する。これらの物質を次いで、ハプテンとして使用して、モノクローナル抗体（ＭＡＢｓ）を誘発させ、かなりの数（１０００またはそれ以上）の生成ハイブリドーマのそれぞれについて各種の試験を行い、さらに研究すべきかを確かめる。この初期選別方法には一般に、ハプテン（または遷移状態類縁体、ＴＳＡ）に最も堅固に結合するＭＡＢｓに対するＥＬＩＳＡ検定法が包含される。これらの選別されたハイブリドーマ培養物を次いで、増殖させ、大量の抗体を産生させて、これらの抗体のどれが所望の反応を触媒することができるかを測定する。かなりの対照が存在するが、見出だされる触媒作用に責任がある付随触媒（例えば酵素夾雑物）が存在していないことを確実にする必要がある。上記したように、この手段またはその変法によって、比較的多数（３０以上）の特定の化学反応を触媒する触媒性モノクローナル抗体（ｃａｔＭＡＢｓ）が提供された（１−３）。上記から明らかなように、習得または学ばなければならない多くの技術およびプロトコールに加えて、充分なｃａｔＭＡＢｓの生成には、二つの基本的問題がある：すなわち１）使用されるハプテンのデザインおよび合成；２）引き続いて研究される細胞を選択するための、ハイブリドーマ上清の初期選別。クローンの選別に慣用の手段、すなわち免疫感作ハプテンに対する堅固な結合は、この結合が遷移状態の合成類縁体を結合するＭＡＢｓにのみ選択が制限され、反応経路に従って存在する真の遷移状態に対するものではないことから、固有の欠点を有する。また、免疫系の疑わしい変化を解明し、ＴＳＡに対して貧弱な結合を示すが、優れた触媒でありうるＭＡＢｓを得ることはできない。さらにまた、慣用の手段は、非常に時間がかかり、かつまたエネルギーおよび材料を消費する。すなわち、多くのハイブリドーマをそれぞれ増殖させなければならず、かつまた多くの生成する抗体を精製し、初期選別からの下流収穫物を試験しなければならない。初期ハイブリドーマ上清段階で、触媒性に係わり直接選別できたならば、はるかに有効で、かつまた有用であるものと、長年認識されてきた。良好なｃａｔＭＡＢｓを迅速に、かつまた効率的に提供することは、格別に広範囲の細分化を伴う突破口であることは確かなことである。我々は、本発明に従いこの問題を解決し、触媒作用方法に係わる簡単で、効率のよい、効果的な直接選別方法を開発した。本発明の要旨抗体媒介触媒作用に係わるハイブリドーマ上清の直接選別に包含される独特の問題（５）を分析することによって、我々は必須要素として、固定されている「固相」基質、例えば微量滴定板に固定されている基質‐蛋白質接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を包含する検定法を導いた。かなりの「固相」基質の生成物への抗体‐触媒変換に引き続いて、この生成物を免疫検定法、例えば結合性抗‐生成物Ｐ抗体を使用するＥＬＩＳＡにより検出する。本発明に従い、基質Ｓの生成物Ｐへの変換に適する非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の選別または検出方法が提供され、この方法は、ｉ上記基質Ｓを支持体に固定し；ｉｉ潜在的に触媒性のポリペプチドまたは蛋白質を含有する試料を、この固定した基質と接触させ、これにより支持体に固定したままで、基質Ｓを生成物Ｐに完全に、または部分的に変換し；ｉｉｉこの固定されている生成物Ｐを当該生成物Ｐに対して特異性の抗体により検出し；次いでｉｖ生成物Ｐ‐結合した抗体分子を検出する；ことからなり、ここで生成物Ｐは対照反応におけるよりも有意に早い速度および多い量で生成され、これによって当該選別試料中における当該触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の存在が示唆される方法である。本発明の方法によって選別または検出することができる非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質には、これらに制限されないものとして、天然のおよび遺伝子工学により合成された抗体、その断片または一本鎖抗体、および合成ポリペプチドまたはアミノ酸ポリマーが包含される。好適態様において、この触媒性蛋白質はモノクローナル抗体、好ましくは触媒された反応の遷移状態の安定な合成類縁体であるハプテンに対して誘発されたモノクローナル抗体であり、そして直接選別はハイブリドーマ上清で行われる。もう一つの態様においては、組み合わせポリペプチドライブラリイが触媒機能性ポリペプチドに係わり選別される。触媒作用を受けさせようとする反応の例には、すべてのアシル転移反応、例えばペプチド結合の開裂およびその他の開裂反応などのような加水分解またはアミノ分解；縮合反応、例えばアミド形成およびディールス‐アルダー（Ｄｉｅｌｓ ‐Ａｌｄｅr）反応；異性化；１種のエナンチオマーまたはジアステレオマーの選択的反応によるエナンチオマーの分割；ホスフェートの加水分解、例えばトリホスフェートおよびジホスフェートのモノホスフェートへの加水分解；などがある。図面の説明図１は、結合した抗体分子の検出に、ＥＬＩＳＡを採用する、本発明の方法を図式で示すものである。図２は、基質、１ａ−ｇ、２および５、それらの加水分解生成物、酸３、およびハプテン、４の化学構造を示すものである。これらの基質はいずれも、担体蛋白質（ＢＳＡまたはＫＬＨ）に、そのカルボキシル基を介して結合されている；本明細書において、この蛋白質接合体は、例えば１ａ‐ＢＳＡで示されている。図３Ａ−Ｂは、ハプテン結合性抗体に係わる（パネルＡ）および触媒活性に係わる（パネルＢ）、１枚の微量滴定板（９６ハイブリッドクローン、これはそれぞれ、棒で示されている）の選別結果を示している。ハプテン結合（Ａ）は、４ ‐ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）が塗布されている微量滴定板において、５０μｌのハイブリドーマ上清を使用して測定した。試験（Ｂ）はｐ‐ニトロベンジルエステル基質、１ａ‐ＢＳＡを用いて行った（材料および方法の項参照）。最後の３本の棒は対照である：Ｌ、リパーゼ（ＯＤＡ₆₉₀＝１．０）；トリス‐緩衝塩類溶液（ＴＢＳ）、ｐＨ８．３；およびＳ、０．１Ｍ炭酸ナトリウム。対照に優る有意の生成物形成を示す、２種の触媒性抗体クローン、Ｄ２．３（図３Ｂではクローン３として示されている）およびＤ２．４（図３Ｂではクローン４として示されている）を、この滴定板で同定した。図４は、本発明の検定方法により測定されたＤ２．３のエステル分解（ｅｓｔｒｏｌｙｔｉｃ）活性の抑制パターンを示している。抗体Ｄ２．３（蛋白質Ａ‐ 精製調製物、ＴＢＳ中の２０ｎＭ、ｐＨ８．２５）を下記の各種稀釈の下に、１ａ‐ＢＳＡを塗布した微量滴定板でインキュベートした：中黒四角形、ホスホネートハプテン４（４‐Ｎ‐ベンジルアミドとして）；中白四角形、「短鎖」（s ｈｏｒt）ハプテン（モノ‐ｐ‐ニトロベンジルメチルホスホネート）；中黒円形、アミド基質２（２‐Ｎ‐メチルアミド）；および中白円形、ｐ‐ニトロベンジルアルコール。点線のシグナルの抑制がまた、添加された抗‐生成物抗体含有ウサギ血清（触媒性抗体とのインキュベーションの後に適用）が生成物３（３‐ Ｎ‐メチルアミド）を含有している場合に見出だされた。図５は、ＨＰＬＣにより測定されたモノクローナル抗体Ｄ２．３（０．３μＭ）（中黒円形）による非接合エステル基質１ａ（０．３ｍＭ）の加水分解を示している。この活性は、ハプテン４（４‐Ｎ‐ベンジルアミド、１．０μＭ）（中白円形）の存在の下に抑制される。（挿入部分）運動力学的パラメーターは、Ｌｉｎｎｅｗｅａｖｅｒ‐Ｂｕｒｋ分析法により測定され、この測定はｐＨ８．２５において１ａを用いて行われた（Ａｂ₀＝０．３μＭ、１／Ｓ₀は分／μＭでｍＭ¹および１／Ｖ₀で与えられている）。図６Ａ−Ｂは、触媒性抗体Ｄ２．５による（中黒印）および対照として非触媒性抗体の存在下における（ＤＥＩ、中白印）、エステル１ａの加水分解の速度を示している。パネルＡの測定は、１ａ‐ＢＳＡを塗布した微量滴定板において、Ｄ２．５（〜７ｎＭ；●、▲）またはＤＥＩ（〜７ｎＭ；○、△）の培養上清を用いる、ｃａｔＥＬＩＳＡにより行った；パネルＢの測定は、１ａ、非接合（０．３ｍＭ）、および抗体Ｄ２．５（３．５μＭ；●、▲）またはＤＥＩ（３．５ μＭ；○、△）の蛋白質Ａ精製試料を用いてＨＰＬＣにより行った。抗体の上清または精製抗体は事前に、５０ｍＭＴＢＳに対して透析した；ｐＨ８．３（▲ 、△）またはｐＨ９．０（●、○）。図７は、基質１１および補基質（ｃｏ‐ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）１０ａ−ｄ、それらの縮合から生成されるアミド生成物１２、および遷移状態類縁体ハプテン１３、１４および１５の化学構造を示している。これらの物質はいずれも、そのカルボキシル基を介して担体蛋白質（ＢＳＡまたはＫＬＨ）に結合させた。この蛋白質接合体は、本明細書において、例えば１１‐ＢＳＡとして示されている。図８は、プロリルグリシルのベンゾイル化、引き続くｃａｔＥＬＩＳＡの結果を示している。微量滴定板を１１‐ＢＳＡ（中黒印；ハプテン濃度（Ｈｄ）＝２８、１０μｇ／ｍｌ、一夜、４℃）、またはＢＳＡ（中白印）を塗布し、そして４０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＢｚ‐ＯＮＳｕ（１０ｄ）を、種々の時点で（０−６０分）、添加した（１ｍＭ、●、○または０．１ｍＭ、▲、△）。この板をＰＢＳ＋０．０４％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ／Ｔ）により洗浄し、次いで抗‐１２ウサギポリクローナル血清（ＰＢＳ／Ｔ中で１：４０００に稀釈）を添加した。さらに洗浄し、次いでパーオキシダーゼ結合マウス抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＰＢＳ中で１：５０００に稀釈）を添加し、その吸光を６９０ｎｍで測定した。図９は、１５‐ＫＬＨにより免疫感作されたマウスのポリクローナル血清抗体の結合活性を示している（完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中でエマルジョン化した５０μｇ／マウス）。１４日間の後に、ブースターを投与した（不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の５０μｇ／マウス）。１０日後に採取した血清をＰＢＳにより稀釈し（１：５００−１：１００００）、次いで１５‐ ＢＳＡに対する、●、１２‐ＢＳＡに対する、▲、およびＢＳＡに対する、□、結合に係わり、ＥＬＩＳＡにより試験した（接合体、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを、塗布物として使用）。これらの結果は、最高力値を示した３匹のマウスから採取された血清に係わるものである。１５‐ＢＳＡに対する結合の競合的抑制が、遊離の、非接合体１５（１５‐Ｎ‐グリシルメチルアミド）の存在の下に見出だされた、５μＭ、〇、（および０．１ｍＭで＞９５％抑制）。１５‐ＢＳＡに対する結合は、同様に生成物（１２）の存在の下に抑制されたが、有意の小さい親和性を依然として伴っていた（例えば、１２、１：２５００血清稀釈で、Ｉ_C50 ＝２ｍＭ）。図１０は、１３‐ＫＬＨにより免疫感作されたマウスのポリクローナル血清抗体の結合活性を示している。４匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、１３‐ＫＬＨにより免疫感作した（ＣＦＡ中でエマルジョン化した５０μｇ／マウス）。１４日間の後に、ブースターを投与した（ＩＦＡ中の５０μｇ／マウス）。１０日後に採取した血清をＰＢＳにより稀釈し（１：２００−１：１５０００）、次いで１３‐ ＢＳＡに対する、●、１２‐ＢＳＡに対する、○、およびＢＳＡに対する、□、結合に係わり、ＥＬＩＳＡにより検定した（接合体、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌを、塗布物として使用）。これらの結果は、最高力値を示した４匹のマウスから採取された血清に係わるものである。好適態様の説明本発明による非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の直接選別または検出方法は、支持体、例えば微量滴定板に固定されている基質Ｓを包含する。本発明により検出または選別される非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、組換え抗体、抗体の断片、合成ポリペプチドおよびアミノ酸ポリマーなどであることができる。この試験は特に、ハイブリドーマ上清の触媒性モノクローナル抗体に係わる直接的選別、および組み合わせライブラリイの直接的選別に有用である。この組み合わせライブラリイでは、官能性ポリペプチド、例えば官能性Ｆｖを、数百万の可能性の中から選択しなければならない。基質Ｓは、選別しようとする試料、例えば触媒作用を受けた反応Ｓ−−→Ｐの遷移状態の安定な合成類縁体に相当し、蛋白質に接合されているハプテンにより免疫感作された動物の細胞の融合により得られるハイブリドーマ上清中に存在する非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質により、生成物Ｐに総体的にまたは部分的に変換される。本発明に従い行われた一例では、この基質はｐ‐ニトロベンジルエステル１ａであり、生成物はカルボン酸３であり、そして抗体は遷移状態類縁体ハプテン４に対して誘発させる（図１）。縮合反応では、１種のみの反応体を支持体に固定する。補酵素との反応を潜在的に触媒性のポリペプチドまたは蛋白質を含有する試料により触媒させて、生成物Ｐを導く。この生成物Ｐは当該支持体に固定されたままであり、特異性抗体により検出される。本発明に従い行われた一例では、ＢＳＡ‐１１に接合されている固相アミン基質をエステル補基質１０と反応させる。このアミン生成物１２はこの支持体に固定されたままで残される。この場合の抗体は、遷移状態類縁体ハプテン１３、１４または１５に対して誘発させる（図７）。生成物Ｐの分子は支持体に固定されて残され、特異性抗‐生成物抗体を使用するいずれか適当な免疫検定法、例えばＥＬＩＳＡ、放射免疫検定法（ＲＩＡ）、化学ルミネッセンス免疫検定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫検定法により検出することができる。被験試料中の触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の存在は、生成物Ｐが対照反応のいずれよりも有意に早い速度および多い量で生成される場合の全部で確認される。この対照反応は、（ａ）固定された基質Ｓのみ；または（ｂ）無関係蛋白質／抗体の存在における固定された基質Ｓ；または（ｃ）固定された基質Ｓ単独あるいは固定された基質Ｓと無関係蛋白質／抗体との組み合わせ（ただし、工程（ｉｉｉ）の抗‐生成物Ｐ特異性抗体は除外される）；を用いて行う。図１には、生成物の検出にＥＬＩＳＡを使用した場合の、本発明の方法が示されている。先ず、支持体上に固定されている生成物分子を、抗‐生成物特異性抗体、例えば生成物Ｐに対してウサギで誘発されたポリクローナル抗体により検出し、次いでこの結合した抗体分子を、酵素標識付けした第二の抗体により検出する。我々は、ＥＬＩＳＡを用いる検定法を、ｃａｔＥＬＩＳＡと名付けた。ｃａｔＥＬＩＳＡを採用することによって、ホスホネートＴＳ類縁体に対して誘発された、数千のハイブリドーマクローンを迅速に選別することができ、相当するｐ‐ニトロベンジルエステルの触媒作用をうけた開裂を検出することができた。本発明には、種々の抗体‐触媒加水分解およびその他の開裂反応ならびに会合反応、およびまた縮合反応が包含される。従って、基質Ｓは、支持体蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に、酸またはアルコール残基を介して接合されている固定エステルであることができる。生成する酸またはアルコール生成物Ｐはこの支持体に固定されたまま残され、工程（ｉｉｉ）における検出は、この酸またはアルコール生成物Ｐに対して特異性の抗体を用いて行い、またこの結合した特異性抗体は、工程（ｉｖ）において、免疫検定法により検出される。基質Ｓは、その酸またはアミン残基を介して支持体蛋白質に接合されているアミドであることもでき、ここで生成される酸またはアミド生成物Ｐは、この支持体に結合されたままであり、工程（ｉｉｉ）における検出はこの酸またはアミド生成物Ｐに対して特異性の抗体を用いて行われ、またこの結合した特異性抗体は、工程（ｉｖ）において、免疫検定法により検出される。基質Ｓはまた、１種のみのエナンチオマーまたはジアステレオマーであることができ、この場合には、選別された触媒性ポリペプチドまたは蛋白質は、当該化合物の分割を触媒し、所望のエナンチオマーまたはジアステレオマーをもたらすことができる。基質Ｓはまた、小型ペプチドに分解するポリペプチドであることができる。例えば、これは分解され、無毒性分子に変換されるトキシンであることができる。この場合には、トキシンを分解させる触媒性抗体は医薬として、例えば敗血症性ショックの処置用の医薬として有用であることができる。基質Ｓはまた、アミン、例えばそのカルボキシル残基を介して支持体蛋白質に結合しているアミノ酸１１であることができ、この場合の補基質はエステル１０であり、そして生成物Ｐは、この支持体に固定されて残される生成アミドである。工程（ｉｉｉ）における検出はこのアミドに対して特異性の抗体を用いて行われる。その他の会合反応および縮合反応もまた、本発明に包含される。ここで説明する系は、中でも、種々の抗体が触媒するアシル‐転移、例えば加水分解反応を試験するようにデザインされている。固定されているエステル１ａ −ｇ、アミド（例えば、２）またはイミド５の開裂は、固相に結合しているカルボン酸生成物３をもたらす（図２）。この基質接合体のいずれとも交差反応しない抗‐生成物３ポリクローナル抗体を、検出に使用する。ｃａｔＥＬＩＳＡの実施可能性を最初に確認するために、我々は、エステル１ａ−ｄおよびイミド５の酵素‐または塩基‐触媒による加水分解を研究した。これらの基質ＢＳＡ接合体を微量滴定板に塗布し、各種経過時間に係わり、温和な塩基（炭酸ナトリウム、０．１Ｍ、ｐＨ１０．９）または膵臓リパーゼにより処理した。生成する酸生成物３の生成は、ウサギ抗‐３抗体を使用する慣用のＥＬＩＳＡおよび引き続くパーオキシダーゼ結合した抗‐ウサギ免疫グロブリン抗体により測定した。アミド、例えば２によっては、シグナルは見出だされなかった。このことは、この基質が塩基またはリパーゼ‐触媒加水分解に対して安定であることを示している。予想されたように、イミド５は炭酸ナトリウムの存在の下に加水分解されるが（メチルエステルの場合の９０分に比較して、ｔ_1/2＝４５分）、リパーゼによっては加水分解されない。種々の稀釈度のリパーゼの存在の下におけるエステル１ａ−ｄの加水分解速度は、酵素濃度の増大にしたがい最高に達した（図３）。これは、固相上に塗布されている非常に少量の基質（約１０ −５０ｐｍｏｌ／くぼみ）によるものである。酵素‐および塩基‐触媒反応の運動力学は、５％ほどの少ない基質の生成物への変換が測定できることを示している。当該基質がこの酵素に対して最適からはほど遠いにもかかわらず、０．０１単位よりも少ないリパーゼの活性を、１ａ−ｄなどのエステル基質によってさえも容易に検出することができる。これらのおよび追加の実験は、ｃａｔＥＬＩＳＡが敏感であり、かつまた選択性であり、ハイブリドーマ上清中の触媒性抗体の直接選別に施用できることを示す。例材料および方法基質およびハプテンの調製合成基質はいずれも、結晶化またはシリカカラムクロマトグラフイにより均一（薄層クロマトグラフイおよびＮＭＲにより判断）に精製した。構造は、ＮＭＲおよび質量スペクトルにより確認した。充分の元素分析値を全結晶化合物に関して得た。エステル１ａ、１ｂ、１ｅおよびアミド２（図２）は次の方法により製造した：（ｉ）相当するアルコールまたはアミンを、塩基の存在の下に（１ｂ、エタノール、ナトリウムエトキシド、還流；１ａおよび１ｅ、ｐ‐ニトロベンジルアルコールまたはｏ‐ニトロベンジルアルコール、１，８‐ジアザビシクロ［５．４．０］‐ウンデカン（ＤＢＵ）；２、ｐ‐ニトロベンジルアミン；Ｅｔ₃ Ｎ）、無水グルタル酸と反応させる；（ｉｉ）Ｎ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して、ｔ‐ブチルグリシネートとカプリングさせる；次いで（ｉｉｉ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在の下に、そのｔ‐ブチルエステルを分離する。メチルエステル１ｃは、Ｎ‐グルタリル‐Ｏ‐ベンジルグリシンを、ジアゾメタンによりエステル化することにより製造し、また２‐フルオロエチルエステル１ｄは、チオニルクロライドの存在の下に、２‐フルオロエタノールによりエステル化することにより製造し、接触水素添加により、このベンジルエステルを分離することによって、生成物を得た。イミド５は、無水グルタル酸およびグリシンベンジルエステルを、無水酢酸の存在の下に加熱することによって製造した；このベンジルエステルを次いで接触水素添加により分離した。基質は、それらのＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルを経て、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合させた。カルボン酸３（生成物）の蛋白質接合体を調製する場合には、相当するｐ‐ヨウドフェニルエステル１ｆを合成した；無水グルタル酸にｔ−ブチルグリシネートを添加し、生成するモノ酸を次いで、ＤＣＣを用いてｐ‐ヨウドフェノールにカプリングした。ｔ‐ブチルエステルを分離した後に、生成する１ｆを、蛋白質とカプリングし（そのＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルを経る）、次いで加水分解させて（０．１ＭＮａ₂ＣＯ₃、３時間）、カルボン酸３‐ＢＳＡおよび３‐ＫＬＨを生成させた。ホスホネート４の合成および接合は、参考文献１２に記載のとおりにして行った。プロリルグリシンのＢＳＡ接合体（１１‐ＢＳＡ）は、次のとおりにして製造した：（ｉ）保護されているプロリルペプチド、Ｆｍｏｃ‐Ｐｒｏ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ、をＮＳｕエステルを経てＢＳＡに接合させる；（ｉｉ）６Ｍ尿素およびＰＢＳに対して充分に透析した後に、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）保護をその場で、ピペリジン（１：３、ＴＨＦ：０．１ＭＮａＨＣＯ₃中の５％）の存在の下に、この蛋白質上で分離した。ハプテン濃度（Ｈｄ）は、保護基を分離する前に、この結合されているＦｍｏｃ基の吸光値を測定することによって測定した（Ｅ_300nm＝５，３００Ｍ^-1ｃｍ^-1）。分子ＢＳＡあたりで２０− ３０のプロリル‐グリシル残基を有する接合体を、ｃａｔＥＬＩＳＡに使用した。１２‐ＢＳＡおよび１２‐ＫＬＨは、Ｂｚ‐ＰｒｏＧｌｙ‐ＯＮＳｕ（Ｂｕ＝ベンゾイル；ＮＳｕ＝Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル）（２００μＬＤＭＦ中、１０μｍｏｌ）を、ＢＳＡまたはＫＬＨ（０．１ＭＮａＨＣＯ₃中のそれぞれ、１０ｍｇまたは５ｍｇ）と反応させることにより製造した。ｃａｔＥＬＩＳＡ：抗‐生成物３抗体は、カルボン酸生成物３のＫＬＨ接合体を用いて、免疫感作したウサギにより製造した（ハプテン濃度＝１７／分子；１００μｇ／ウサギ、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中でエマルジョン形成されたもの；次いで１４日後の追加感作、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中でエマルジョン形成されたもの）。２４日後に採取した血清は、生成物に対して高い結合親和性（３−ＢＳＡ、ハプテン濃度＝１０、力値＝１：５０００）および種々の基質接合体（１ａ−ｄ、２および５‐ＢＳＡ）と最小交差反応性（１：５０００の稀釈度で、＜１０％）を示した。ｃａｔＥＬＩＳＡの場合に、微量滴定板（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｂ）に１ａ‐ＢＳＡ（ハプテン濃度＝１５、１．０μｇ／ｍｌ、１時間）を塗布し、次いでＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ、０．５時間）によりブロックした。ハイブリドーマ上清（５０μｌ）を、３時間インキュベートし、この板を次いでリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１４ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）＋０．０４％Ｔｗｅｅｎにより洗浄した。ウサギ抗‐生成物３血清を次いで添加した（ＰＢＳ＋０．０４％Ｔｗｅｅnで１：５０００に稀釈、１時間）。洗浄し、パーオキシダーゼ結合マウス抗‐ウサギ免疫グロブリン抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＰＢＳ中で１：５０００に稀釈）とともにインキュベートし、基質、２，２´‐アジノビス（３‐エチルベンズチアゾリンスルホン酸）（ＡＴＢＳ）を添加し、次いでその吸光値を６９０ｎｍで測定した。加水分解の陽性対照として、塩基（０．１Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．９）またはリパーゼ（ブタ膵液、粗製エキス、ＳｉｇｍａＬ‐３１２６、５０μｇ／ｍｌ）を使用した。抗‐生成物１２抗体は、ウサギを１２‐ＫＬＨにより免疫感作し（１００μｇ／ウサギ、ＣＦＡ中でエマルジョン形成）、次いで１４日後に、追加免疫感作した（１００μｇ／ウサギ、ＩＦＡ中）。１４日後に採取した血清は、１２‐ＢＳＡに対する高い結合親和性を示し（力値＞１：１００００）、かつまた１１‐ＢＳＡとの交差反応性は示さなかった。ｃａｔＥＬＩＳＡの場合に、微量滴定板に１１‐ＢＳＡを塗布した（１０−２０μｇ／ｍｌ、一夜、４℃）。この板をＰＢＳ／Ｔにより２回、次いでＰＢＳにより洗浄した。該当上清、血清または緩衝液（４０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．４）を、ベンゾイルエステル、Ｂｚ‐ＯＸ（１０ａ−ｄ；０．０１−５ｍＭ）の存在の下に、各種時間（１０分−２４時間）にわたりインキュベートした。この板を次いで、ＰＢＳ／Ｔにより洗浄し、次いで抗‐１２ウサギポリクローナル血清（ＰＢＳ／Ｔで１：４０００に稀釈）を添加した。さらに洗浄し、パーオキシダーゼ結合マウス抗‐ウサギ抗体（Jａｃｋｓｏｎ、ＰＢＳで１：５０００に稀釈）とともにインキュベートした後に、基質（ＡＴＢＳ）を添加し、次いでその吸光値を６９０ｎｍで測定した。ｃａｔＥＬＩＳＡによる上清の選別条件は、触媒が存在していない背景シグナルが最低にされ、かつまた炭酸ナトリウムまたはリパーゼによる完全分解の後に得られるシグナルが最大にされるように、最適化した。すなわち、基質のそれぞれに係わり板の塗布に、相違する濃度の接合体を使用した（０．１−５μｇ／ｍｌ）。最高の結果は、１０−２０のハプテン濃度を有する基質‐ＢＳＡ接合体で得られた。例１ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ハプテン接合体４‐ＫＬＨ（ハプテン濃度＝１６，ＣＦＡ中の５０μｇ／マウス）により免疫感作した（足の裏に注射）（図２）。１４日後に、ブースターを投与し（ＩＦＡ中の５０μｇ／マウス）、次いでさらにＮＳＯミエローマ細胞との融合（免疫感作から４５日目）の４日前および３日前の２回、ブースターを投与した（ｉ．ｐ．，５０μｇ／マウス）。基質接合体２‐ＫＬＨを用いて、短縮免疫感作計画を使用した（図２）（ハプテン濃度＝１６）；３匹のＢａｌｂ／ｃマウスおよび３匹のＣ５７ＢＬマウスを免疫感作した（ＣＦＡ中の５０μｇ／マウス）。１７日後に、ＩＦＡ中のブースターを与え、３日後に、排液（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節細胞をＮＯＳミエローマ細胞と融合した。融合後の２週間の時点で、生成するハイブリッドクローンをｃａｔＥＬＩＳＡにより選別した。陽性クローンをＢａｌｂ／ｃマウスで腹水として増殖させた。この抗体をスタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）蛋白質Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフィニティクロマトグラフイにより精製し、次いでトリス ‐緩衝塩類溶液［ＴＢＳ；５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノ‐メタン／０．１４ＭＮａＣｌ］、ｐＨ８．２５または９．０に対して透析した。この精製抗体の等質性をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより判定した。これは、還元条件の下に、コマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）染色によりＨ鎖およびＬ鎖のみを認めた。融合、ハイブリドーマセルラインの増殖、免疫検定および腹水中でのモノクローナル抗体の産生は、参考文献１３および１４に記載のとおりにして行った。蛋白質Ａ‐精製抗体の触媒活性は、等質溶液中のｐ‐ニトロベンジルアルコールの発現および基質１ａの消失を、検出および定量にＨＰＬＣを用いて測定することにより測定した。ジメチルスルホキシド中の基質を、５０ｍＭＴＢＳ、ｐＨ８．２５または９．０中の抗体に添加した（最終有機溶剤＜１％）。この反応混合物の一定量を冷却し（アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）、次いでＨＰＬＣにより分析した（ＲＰ‐８、１００×５カラム；２７：７３、水／アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ；流速１．０ｍｌ／分；２７７ｎｍにおける吸光により検出；基質１ａに係わる保有時間６．９分および生成物ｐ‐ニトロベンジルアルコールに係わる保有時間４．１分）。抗体濃度（Ａｂｏ）は、４（４‐Ｎ‐ベンジルアミドとして）による活性部位滴定により測定した。エステル１ａの加水分解の無触媒速度（Ｋ_uncat）は、初期速度分析により決定し、ゼロ緩衝濃度に挿入して、ｐＨ８．２５において２．８×１０^-5／分である。ｏ‐ニトロベンジルエステルおよびベンジルエステル（それぞれ１ｅおよび１ｇ；１ｍＭ）を用いる触媒性抗体の活性は、ＨＰＬＣにより評価した。この精製抗体（０．３−５μＭ）の存在下における速度増大は見出だされなかった。触媒性抗体を発現させるために、初めにホスホネートハプテン４を使用した。この使用は、ホスホノエステルがエステル加水分解の四面の負に帯電した（ｔｅｔｒａｈｅｄｒａｌ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｈａｒｇｅｄ）ＴＳ／中間体を偽装すること、およびまたエステル加水分解性抗体を誘発させることが証明されていることによる（１）。ｐ‐ニトロベンジルホスホノエステル接合体、４‐ＫＬＨにより免疫感作したマウスからのひ臓細胞を、ミエローマＮＳＯ細胞と融合させ、生成する１５７０ハイブリッドクローン（この中の９７０はハプテン結合性クローンであった）を、基質１ａの加水分解を誘発させるそれらの能力に係わり、ｃａｔＥＬＩＳＡにより評価した（図２）。この初期ハイブリドーマ上清の選別からの代表的データを図３に示す。この図から明らかなように、数ダースのクローンがこのホスホネートハプテンに結合するが、ｃａｔＥＬＩＳＡでは２つのみが陽性を示した。同時に、エステル１ａの開裂を触媒する９クローンが同定された。対照実験により、このハイブリドーマ上清の存在の下に見出だされたｃａｔＥＬＩＳＡシグナルは確かに、ｐ‐ニトロベンジルエステル基質１ａの抗体‐触媒された加水分解によるものであるという、結論的証拠が得られた。ｐ‐ニトロベンジルエステル以外のエステル（図２において、１ｂ−ｄ）が基質（例えば、１ｂ上の抗体Ｄ２．３、図示されていない）として使用された場合には、選別されたクローンの中で、ｃａｔＥＬＩＳＡにおいてシグナルを生じたものはなかった。この触媒部位のアフィニテイパターン（図４）は、ハプテン４に対して誘発された抗体に係わり予想されたとおりである、すなわちハプテン４＞「短い」（ｓｈｏｒｔ）ハプテン＞アミド基質＞ｐ‐ニトロベンジルアルコール（生成物）であった。これらの抗体のハプテン‐ＢＳＡ接合体に対する結合の抑制が、通常の競合性抑制免疫検定法（ＣＩＥＩＡ；類似の分析方法、参考文献１３参照）により測定された場合には、同一程度の親和性が見出だされた。これらの抗体の触媒としての総合的品質の特徴である、生成物抑制、ｐＨ‐活性プロフィール、基質特異性、およびその他の性質はいずれも、抗体を精製する前にｃａｔＥＩＬＳＡにより適切に測定された（データは示されていない）。腹水からの精製抗体を、遊離の非接合ｐ‐ニトロベンジルエステル１ａの加水分解を触媒する、それらの能力に係わりＨＰＬＣにより評価した（図５）。この結果は、ｃａｔＥＬＩＳＡ選別を確認するものであった。比較的低い速度増進を示すクローン（例えば、抗体クローンＤ２．１：Ｋ_cat ／Ｋ_uncat：約７００、ｐＨ９．０）のＥＬＩＳＡによる同定は、ｃａｔＥＬＩＳＡの感受性および選択性の下にある。このエステル基質の「背景」（すなわち、無触媒）加水分解も、ハイブリドーマ上清中の酵素の存在も、干渉するものはなかった。固相エステル、例えば１ａは、可溶性の非接合エステルを加水分解する大部分のエステラーゼ（例えば、ブタ肝臓エステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ）の存在の下で安定であることが見出だされた；これらの酵素は、溶液の状態の（すなわち、固相に固定されていない）、同一エステル基質の加水分解を触媒する。さらにまた、エステラーゼを含有することが知られている他の生物学的液体（例えば、ヒトおよびマウスの血清、マウスの腹水、バクテリア増殖培地など）を、エステル‐ＢＳＡ（および追加の基質）に対するｃａｔＥＬＩＳＡにより評価した。これらの場合の中で、緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）とともにインキュベートした後に見出だされるシグナルよりも大きい背景シグナルが見出だされたものはなかった。すなわち、これらの培地に分泌された触媒性抗体を、効果的に検出することができた。触媒性抗体の検出に「固相」基質を使用することによって、二つの格別の利点が得られる。すなわち、触媒性抗体は、蛋白質担持構造体を包含する基質に対して増大された親和性を有しており（すなわち、Ｋｍ値は低い）、また比較的低い基質濃度が疑似一次オーダー条件の維持を確実にする（Ｋｍ＞＞Ｓｏ）。これらの２種の因子は抗体媒介触媒作用の検出能力を直接的に増加させることを示唆している（５）。背景、すなわち非触媒性抗体の存在の下での加水分解（△Ｐ_unca _t またはＶ_0uncat）以上である、エステル１ａの抗体触媒加水分解（△Ｐ_catまたはＶ_0cat）により見出だされるシグナルは、ｃａｔＥＬＩＳＡにより有意に増大される（図６）。例えば、１ａ‐ＢＳＡを用いるｃａｔＥＬＩＳＡは、ｐＨ８．２５および９．０の両方において、抗体Ｄ２．５含有ハイブリドーマ上清を使用して、明らかに有意のシグナルを示す（図６Ａ、Ｖ_0cat／Ｖ_0uncat＝５０および８０）。遊離の非接合１ａを使用する慣用の試験（蛋白質Ａ精製試料および放出生成物の検出および定量にＨＰＬＣを使用）により見出だされた速度増大は、使用抗体濃度がｃａｔＥＬＩＳＡに使用された抗体濃度よりも少なくとも５０倍多かったにもかかわらず、一桁小さい（図６Ｂ、Ｖ_0cat／Ｖ_0uncatはｐＨ８．２５において〜１．０であり、そしてｐＨ９．０において〜２．５である）。この差異は固相１ａ‐ ＢＳＡの小さいＫｍおよびＳｏを反映し、またより高いＥＬＩＳＡ検出感度を反映している。従って、反応生成物の検出に使用される方法に無関係に、固相基質は抗体媒介触媒作用の検出に好ましい。これらの実験で開示された免疫検定法に加えて、別種の検出技術、例えば放射性物質で標識した生成物、蛍光、吸光などを使用することによる、上清中に放出された可溶性生成物（前記例では、ｐ‐ニトロベンジルアルコール）の検出にも使用することができる。もう１種の抗体Ｄ２．３も、真に効果的な酵素様触媒（図５；Ｋ_cat＝７．３５_min ^-1，Ｋ_m＝０．２８ｍＭ，ｐｈ８．２５）の例である。この抗体は非活性化エステル基質により有意の速度増大（Ｋ_cat／Ｋ_uncat＝２．６×１０⁵）を示すばかりでなくまた、多回反復性（＞１０００）を示す。反復性（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）、すなわち反復して処理される基質に対する一個の結合部位の能力は多くの場合に、触媒性抗体における数種の生成物抑制により制限されることが見出だされている（例えば、参考文献１５−２０参照）。ニトロフェニル基の存在にもかかわらず（１５）、ｐ‐ニトロベンジルアルコール生成物は、小さいが十分の親和性をもって（Ｋｄ＝５２μＭ）、抗体Ｄ２．３に結合し、充分の反復性を示すことができる（図５）。Ｄ２．３はまた、その格別の基質特異性を有することを特徴とするものであり、この特徴はｐ‐ニトロベンジルエステルばかりでなく（すなわち、ベンジルまたはｏ‐ニトロベンジルエステル１ｇおよび１ｅの場合には触媒作用は見出だされない）、また当該基質のアシル部分をも認識する：ｐ‐ニトロベンジルアセテートの場合のＫ_cat／Ｋ_m値は１０秒^-1Ｍ^-1 より小さいものと推定されるのに対して、Ｎ‐（Ｏ‐ニトロベンジルグルタル）グリシン（１ａ）の場合は、４４０である。従って、直接選別はハプテン結合非触媒性クローンの手数の掛かる労力を節約することができるばかりでなく、また選別される触媒性抗体の種類および品質を増加させるものでなければならない。例２追加の融合体を、ｃａｔＥＬＩＳＡにより触媒活性に係わり選別した。相違する種のマウスを、４‐ＫＬＨにより、および２‐ＫＬＨにより免疫感作し、次いで各エステル基質１ａ‐ＢＳＡおよびアミド基質、２‐ＢＳＡの加水分解に係わり選別した。免疫感作、融合、および選別はいずれも、例１および材料および方法の項に記載のとおりにして行った。これらの実験の全部で得られた結果を表Ｉにまとめて示す。ｃａｔＥＬＩＳＡにより同定された触媒として活性な抗体クローンを、例１のとおりにして、腹水中で増殖させ、蛋白質Ａカラムで精製した。生成物の検出および定量にＨＰＬＣを使用して、エステル１ａ（可溶性）による通常の検定を行い、ｃａｔＥＬＩＳＡにより得られた結果を確認した。これらの結果は、下記の条件の下における、抗体媒介触媒活性に係わる迅速な選別に係わるｃａｔＥＬＩＳＡの能力をさらに証明している：（ｉ）抗体が非常に低濃度で存在する、（ｉｉ）反応を触媒することができる酵素が存在する。例３ｃａｔＥＬＩＳＡ手段は、平易であるばかりでなく、また一般的である、すなわち反応および基質の種類に制限されない。この追加の例は、会合反応、２分子反応を包含するエステルおよびアミンの縮合反応によるアミドの生成を、前記の解離性の単一種分子反応であるエステルまたはアミドの加水分解の例と比較するものである。その他のアミノ酸のいずれのアシル化にも比較して、プロリンのアシル化は抗体触媒に関して魅力的な標的である。これは、ペプチド合成を触媒することが知られている酵素（例えば、サブチリシン、ケモトリプシン）がいずれも、プロリン基質に対しては不活性であるからである。この検出系は固相基質、すなわちＢＳＡに接合され、微量滴定板に固定されているプロリルグリシル（１１‐ＢＳＡ）に基づいている；移動相に存在する、補基質、すなわち安息香酸のエステル（１０）を、被験抗体および緩衝液とともに添加する（図７）。プロリンのアミノ基によるベンゾエートエステルの求核性置換は、固定されているベンゾイル‐プロリルグリシル、１２‐ＢＳＡの生成および相当するアルコールの放出をもたらす。このプロリルグリシル基質（１１‐ＢＳＡ）と、あるいはベンゾイルＢＳＡと交差反応しない抗‐生成物１２ポリクローナルウサギ抗体を検出に使用した。このｃａｔＥＬＩＳＡ系の実行可能性を証明するために、ベンゾイル‐ＮＳｕ（Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル）（１０ｄ）による固相プロリルグリシル（１１‐ＢＳＡ）のその場でのアシル化を実験した。Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルはアミンと高い反応性を有し、水性媒質中におけるペプチド合成に慣用されている。固相ベンゾイル‐プロリルグリシル（１２‐ＢＳＡ）の生成を、抗‐１２ウサギポリクローナル抗体を使用して検出した（図８）。図示されているように、見出だされたシグナルは経過時間および濃度に依存する。さらにまた、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルは選択性ではない、すなわちこれらはプロリルアミノ基および当該反応に存在するその他のアミノ基、例えばＢＳＡのリジン残基のε‐アミノ基とも反応する。しかるに、ｃａｔＥＬＩＳＡによる検出は、プロリルグリシルのベンゾイル化に対して特異性であることが証明された。ベンゾイル‐ＢＳＡの生成により見出だされるシグナルは実際には、有意ではない（図８）。Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルと同様には反応性ではない、安息香酸のその他のエステル、例えばメチル、トリフルオロまたはシアノエチル（それぞれ１０ａ、ｂおよびｃ）は、さらに長期間のインキュベーション（例えば、５ｍＭ、室温で２４時間）の後でさえも、生成物、ベンゾイル‐プロリルグリシル（１２‐ＢＳＡ）を生成しなかった。前記したとおりに、プロリルグリシル‐ＢＳＡのベンゾイル化を触媒する抗体を同定するためには、これらのエステルは、相当する遷移状態類縁体に対して誘発された抗体の上清の存在の下に、添加されなければならない。前記アミド化反応に係わる遷移状態類縁体をデザインし、合成し（図７）、次いで担体蛋白質（ＢＳＡまたはＫＬＨ）に結合させた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ハプテン１３−１５のＫＬＨ接合体により免疫感作させると、高く、特異性の結合応答が得られた（図９および図１０）。これらのマウスから採取されたリンパ球をＮＳＯミエローマ細胞と融合させることによって得られたハイブリッドクローンを、ハプテンに対する（すなわちハプテン‐ＢＳＡ接合体に対する）結合に係わり、およびまたメチルまたはシアノエチルベンゾエートの存在の下でのプロリルグリシルのアミド化の触媒作用に係わり選別した（それぞれ１０ａおよび１０ｃ；５ｍＭ、室温で２４時間）。基質１１のベンゾイル化を触媒して、アミド生成物を生成させる陽性の抗体クローンを、例１に記載のとおりに、同定し、その特徴を確認する。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｚ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者エシュハー，ゼリッグイスラエル国 76100 レホボト，ヘスストリート 18 (72)発明者グリーン，バーナードエス. イスラエル国 79233 クブトザットヤブネ（番地なし) (72)発明者タウフィック，ダンエス. イスラエル国 96264 エルサレム，ハバナイストリート 29

Claims

【特許請求の範囲】１．基質Ｓの生成物Ｐへの変換に適する非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の選別または検出方法であって、ｉ上記基質Ｓを支持体に固定し；ｉｉ潜在的に触媒性のポリペプチドまたは蛋白質を含有する試料を、この固定した基質Ｓと接触させ、これにより支持体に固定されたままで、基質Ｓを生成物Ｐに完全に、または部分的に変換し；ｉｉｉこの固定されている生成物Ｐ分子を当該生成物Ｐに対して特異性の抗体により検出し；次いでｉｖ生成物Ｐ‐結合した抗体分子を検出することからなり、ここで生成物Ｐは対照反応におけるよりも有意に早い速度および多い量で生成され、これは選別された試料中における当該触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の存在を示唆している、上記方法。２．選別または検出される非酵素触媒性蛋白質が、抗体、一本鎖抗体、抗体の断片、あるいは合成ポリペプチドまたはアミノ酸ポリマーである、請求項１に記載の方法。３．ハイブリドーマ上清を、触媒性モノクローナル抗体に係わり直接選別する、請求項１または２に記載の方法。４．モノクローナル抗体を、触媒作用を受けた反応Ｓ−−→Ｐの遷移状態の安定な合成類縁体に対して誘発させ、次いで触媒性モノクローナル抗体を、無意味の抗体により行われる対照反応に比較して、有意に早い速度で生成物Ｐを生成させることにより検出する、請求項３に記載の方法。５．組み合わせポリペプチドライブラリイを、触媒機能性ポリペプチドに係わり直接選別する、請求項１に記載の方法。６．基質Ｓを蛋白質に直接に結合させ、この基質Ｓ‐蛋白質接合体を微量滴定板に固定する、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。７．基質Ｓを、リンカーを介して蛋白質に結合させ、この基質‐リンカー‐蛋白質接合体を微量滴定板に固定する、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。８．固定されているエステルＳの加水分解を触媒する非酵素ポリペプチドまたは蛋白質を選別または検出する方法であって、生成する固定されている酸またはアルコール生成物Ｐを、工程（ｉｉｉ）において抗‐Ｐ特異性抗体により検出し、次いで工程（ｉｖ）において、この抗体分子を、免疫検定法により検出する、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。９．固定されているアミドＳの開裂を触媒する非酵素ポリペプチドまたは蛋白質を選別または検出する方法であって、生成する固定されているアミンまたは酸生成物Ｐを、工程（ｉｉｉ）において、抗‐Ｐ特異性抗体により検出し、次いで工程（ｉｖ）において、この抗体分子を、免疫検定法により検出する、請求項１ −７のいずれか一項に記載の方法。 10．（ａ）エナンチオマーまたはジアステレオマーの分割；（ｂ）大型ペプチドＳの小型ペプチドＳへの分解；および（ｃ）トキシンの毒性が少ないか、または無毒性の物質への分解；から選択される反応を触媒する非酵素ポリペプチドまたは蛋白質を選別または検出する、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。 11．固定されているアミンＳおよびエステル補基質からのアミドの合成を触媒する非酵素ポリペプチドまたは蛋白質を選別または検出する方法であって、生成する固定されているアミド生成物Ｐを、工程（ｉｉｉ）において、抗‐Ｐ特異性抗体により検出し、次いで工程（ｉｖ）において、この抗体分子を、免疫検定法により検出する、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。 12．抗‐生成物Ｐ特異性抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１−１１のいずれか一項に記載の方法。 13．工程（ｉｖ）における生成物Ｐ‐結合抗体分子をＥＬＩＳＡにより検出する、請求項１−１２のいずれか一項に記載の方法。