JPH08505701A - 触媒性非酵素ポリペプチドおよび蛋白質の選別方法 - Google Patents
触媒性非酵素ポリペプチドおよび蛋白質の選別方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、基質Sの生成物Pへの変換に係わり、非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質を選別または検出する方法を提供し、この方法は潜在的に触媒性を有する試料を支持体上に固定されている基質Sと接触させ、得られる固定されている生成物Pを、好ましくは免疫検定法により検出する方法である。この方法は好ましくは、ハイブリドーマ上清をアシル転移反応、例えば加水分解またはアミノ分解、縮合反応およびエナンチオマーの分割を触媒する、触媒性モノクローナル抗体に係わり選別するために使用される。
Description
【発明の詳細な説明】
触媒性非酵素ポリペプチドおよび蛋白質の選別方法発明の分野および背景
本発明は、ハイブリドーマ上清(supernatant)またはその他の潜
在的触媒源を触媒活性に係わり直接選別することに関するものであり、さらに特
に触媒性抗体を包含する非酵素触媒性ポリペプチドおよび蛋白質を選別または検
出する方法に関するものである。
バイオテクノロジイの重要な目標の一つに、いずれか所望の化学反応に係わる
触媒を生成する能力がある。これには、化学、生物学および医学における多くの
広範囲に及ぶ用途がある。この目標に対する多くの研究がなされており、これに
は現存する酵素の特定部位修飾、新規酵素の微生物誘発、全合成ペプチドおよび
合成有機物質が包含される。一般に、触媒作用に関して注目され、照準が当てら
れているが、これらの経路の中で、「特別に仕立てられた」(“tailor
made”)、信頼でき、一般に適用できる技術を提供したものはない。
触媒性抗体を、速度増大および反復性と組み合わせて、予めデザインされてい
る基質に対して特別に仕立てることはできるが、これは従来開示されているよう
な(1−3)、最も注目される酵素模擬体を導いた。触媒性抗体はハプテン、代
表的には触媒作用を受けた反応の遷移状態(TS)の安定合成類縁体に対して誘
発される。免疫感作後に生じる全作品は、ハイブリドーマとして永遠性が与えら
れる(4)。これらは次いで、このハプテンに結合するモノクローナル抗体を産
生するクローンを選択する選別に付される。これらのハイブリドーマの培養上清
を、抗体触媒性に係わり直接選別することは従来では不可能であった。これは、
比較的高いバックグランド反応、抗体の一般に低い触媒効率および同一反応を触
媒する夾雑酵素によるものである(5)。従って、触媒活性を検出するためには
、大量の(通常、腹水からの)精製モノクローナル抗体が必要である。ハプテン
に結合する数ダースの抗体の中で、若干のみが触媒性であり、場合によっては、
これらの中で触媒性のものはない。従って、これらの非効率的であって、かつま
た
労力を消費する方法の代わりに、迅速で、直接的な選別方法を使用する必要があ
ることが広く認識されている(2、3、6−8)。新規な非ハイブリドーマ法、
例えばファージの組み合わせ可変領域クローニングなどの方法がまた、抗体の発
現に使用されていた(9、10)。しかしながら、すでに知られているように、
これらの方法を触媒性抗体を得るために引き続いて使用するには、適当な選別が
必要である。最近になって、Gong等は(28)、大量の抗体ライブラリイに
対する発色団検出法を提案した。しかしながら、この手段は加水分解反応に制限
され、かつまた強力な背景シグナルを生じる遊離エステル基を包含する。証明さ
れているように(5)、この欠点はこのような手段の実用を制限する。
触媒性抗体を誘発させる手段として数種の変法があり、この総合的技術には次
の技術がある:触媒作用を受けさせようとする反応を、そこに包含されるものと
信じられるメカニズムの観点から分析する;この方法は触媒作用を受けさせよう
とする反応に対して安定化させなければならないものを解明する必要がある。代
表的には、この安定化させなければならないものは、反応体から生成物までの反
応経路に沿って存在し、孤立していない一時的状態(遷移状態または高エネルギ
ー中間体)にある。次いで、この一時的状態の立体電子構造を偽装する、1種ま
たは2種以上の化学物質をデザインし、合成する。これらの物質を次いで、ハプ
テンとして使用して、モノクローナル抗体(MABs)を誘発させ、かなりの数
(1000またはそれ以上)の生成ハイブリドーマのそれぞれについて各種の試
験を行い、さらに研究すべきかを確かめる。この初期選別方法には一般に、ハプ
テン(または遷移状態類縁体、TSA)に最も堅固に結合するMABsに対する
ELISA検定法が包含される。これらの選別されたハイブリドーマ培養物を次
いで、増殖させ、大量の抗体を産生させて、これらの抗体のどれが所望の反応を
触媒することができるかを測定する。かなりの対照が存在するが、見出だされる
触媒作用に責任がある付随触媒(例えば酵素夾雑物)が存在していないことを確
実にする必要がある。上記したように、この手段またはその変法によって、比較
的多数(30以上)の特定の化学反応を触媒する触媒性モノクローナル抗体(c
atMABs)が提供された(1−3)。
上記から明らかなように、習得または学ばなければならない多くの技術および
プロトコールに加えて、充分なcatMABsの生成には、二つの基本的問題が
ある:すなわち1)使用されるハプテンのデザインおよび合成;2)引き続いて
研究される細胞を選択するための、ハイブリドーマ上清の初期選別。
クローンの選別に慣用の手段、すなわち免疫感作ハプテンに対する堅固な結合
は、この結合が遷移状態の合成類縁体を結合するMABsにのみ選択が制限され
、反応経路に従って存在する真の遷移状態に対するものではないことから、固有
の欠点を有する。また、免疫系の疑わしい変化を解明し、TSAに対して貧弱な
結合を示すが、優れた触媒でありうるMABsを得ることはできない。さらにま
た、慣用の手段は、非常に時間がかかり、かつまたエネルギーおよび材料を消費
する。すなわち、多くのハイブリドーマをそれぞれ増殖させなければならず、か
つまた多くの生成する抗体を精製し、初期選別からの下流収穫物を試験しなけれ
ばならない。初期ハイブリドーマ上清段階で、触媒性に係わり直接選別できたな
らば、はるかに有効で、かつまた有用であるものと、長年認識されてきた。良好
なcatMABsを迅速に、かつまた効率的に提供することは、格別に広範囲の
細分化を伴う突破口であることは確かなことである。
我々は、本発明に従いこの問題を解決し、触媒作用方法に係わる簡単で、効率
のよい、効果的な直接選別方法を開発した。本発明の要旨
抗体媒介触媒作用に係わるハイブリドーマ上清の直接選別に包含される独特の
問題(5)を分析することによって、我々は必須要素として、固定されている「
固相」基質、例えば微量滴定板に固定されている基質‐蛋白質接合体(conj
ugate)を包含する検定法を導いた。かなりの「固相」基質の生成物への抗
体‐触媒変換に引き続いて、この生成物を免疫検定法、例えば結合性抗‐生成物
P抗体を使用するELISAにより検出する。
本発明に従い、基質Sの生成物Pへの変換に適する非酵素触媒性ポリペプチド
または蛋白質の選別または検出方法が提供され、この方法は、
i 上記基質Sを支持体に固定し;
ii 潜在的に触媒性のポリペプチドまたは蛋白質を含有する試料を、この固
定した基質と接触させ、これにより支持体に固定したままで、基質Sを生成物P
に完全に、または部分的に変換し;
iiiこの固定されている生成物Pを当該生成物Pに対して特異性の抗体によ
り検出し;次いで
iv 生成物P‐結合した抗体分子を検出する;
ことからなり、ここで生成物Pは対照反応におけるよりも有意に早い速度および
多い量で生成され、これによって当該選別試料中における当該触媒性ポリペプチ
ドまたは蛋白質の存在が示唆される方法である。
本発明の方法によって選別または検出することができる非酵素触媒性ポリペプ
チドまたは蛋白質には、これらに制限されないものとして、天然のおよび遺伝子
工学により合成された抗体、その断片または一本鎖抗体、および合成ポリペプチ
ドまたはアミノ酸ポリマーが包含される。好適態様において、この触媒性蛋白質
はモノクローナル抗体、好ましくは触媒された反応の遷移状態の安定な合成類縁
体であるハプテンに対して誘発されたモノクローナル抗体であり、そして直接選
別はハイブリドーマ上清で行われる。もう一つの態様においては、組み合わせポ
リペプチドライブラリイが触媒機能性ポリペプチドに係わり選別される。
触媒作用を受けさせようとする反応の例には、すべてのアシル転移反応、例え
ばペプチド結合の開裂およびその他の開裂反応などのような加水分解またはアミ
ノ分解;縮合反応、例えばアミド形成およびディールス‐アルダー(Diels
‐Alder)反応;異性化;1種のエナンチオマーまたはジアステレオマーの
選択的反応によるエナンチオマーの分割;ホスフェートの加水分解、例えばトリ
ホスフェートおよびジホスフェートのモノホスフェートへの加水分解;などがあ
る。図面の説明
図1は、結合した抗体分子の検出に、ELISAを採用する、本発明の方法を
図式で示すものである。
図2は、基質、1a−g、2および5、それらの加水分解生成物、酸3、およ
びハプテン、4の化学構造を示すものである。これらの基質はいずれも、担体蛋
白質(BSAまたはKLH)に、そのカルボキシル基を介して結合されている;
本明細書において、この蛋白質接合体は、例えば1a‐BSAで示されている。
図3A−Bは、ハプテン結合性抗体に係わる(パネルA)および触媒活性に係
わる(パネルB)、1枚の微量滴定板(96ハイブリッドクローン、これはそれ
ぞれ、棒で示されている)の選別結果を示している。ハプテン結合(A)は、4
‐BSA(1μg/ml)が塗布されている微量滴定板において、50μlのハ
イブリドーマ上清を使用して測定した。試験(B)はp‐ニトロベンジルエステ
ル基質、1a‐BSAを用いて行った(材料および方法の項参照)。最後の3本
の棒は対照である:L、リパーゼ(OD A690=1.0);トリス‐緩衝塩類
溶液(TBS)、pH8.3;およびS、0.1M炭酸ナトリウム。対照に優る
有意の生成物形成を示す、2種の触媒性抗体クローン、D2.3(図3Bではク
ローン3として示されている)およびD2.4(図3Bではクローン4として示
されている)を、この滴定板で同定した。
図4は、本発明の検定方法により測定されたD2.3のエステル分解(est
rolytic)活性の抑制パターンを示している。抗体D2.3(蛋白質A‐
精製調製物、TBS中の20nM、pH8.25)を下記の各種稀釈の下に、1
a‐BSAを塗布した微量滴定板でインキュベートした:中黒四角形、ホスホネ
ートハプテン4(4‐N‐ベンジルアミドとして);中白四角形、「短鎖」(s
hort)ハプテン(モノ‐p‐ニトロベンジルメチルホスホネート);中黒円
形、アミド基質2(2‐N‐メチルアミド);および中白円形、p‐ニトロベン
ジルアルコール。点線のシグナルの抑制がまた、添加された抗‐生成物抗体含有
ウサギ血清(触媒性抗体とのインキュベーションの後に適用)が生成物3(3‐
N‐メチルアミド)を含有している場合に見出だされた。
図5は、HPLCにより測定されたモノクローナル抗体D2.3(0.3μM
)(中黒円形)による非接合エステル基質1a(0.3mM)の加水分解を示し
ている。この活性は、ハプテン4(4‐N‐ベンジルアミド、1.0μM)(中
白円形)の存在の下に抑制される。(挿入部分)運動力学的パラメーターは、L
inneweaver‐Burk分析法により測定され、この測定はpH8.2
5において1aを用いて行われた(Ab0=0.3μM、1/S0は分/μMでm
M1および1/V0で与えられている)。
図6A−Bは、触媒性抗体D2.5による(中黒印)および対照として非触媒
性抗体の存在下における(DEI、中白印)、エステル1aの加水分解の速度を
示している。パネルAの測定は、1a‐BSAを塗布した微量滴定板において、
D2.5(〜7nM;●、▲)またはDEI(〜7nM;○、△)の培養上清を
用いる、catELISAにより行った;パネルBの測定は、1a、非接合(0
.3mM)、および抗体D2.5(3.5μM;●、▲)またはDEI(3.5
μM;○、△)の蛋白質A精製試料を用いてHPLCにより行った。抗体の上清
または精製抗体は事前に、50mM TBSに対して透析した;pH8.3(▲
、△)またはpH9.0(●、○)。
図7は、基質11および補基質(co‐substrates)10a−d、
それらの縮合から生成されるアミド生成物12、および遷移状態類縁体ハプテン
13、14および15の化学構造を示している。これらの物質はいずれも、その
カルボキシル基を介して担体蛋白質(BSAまたはKLH)に結合させた。この
蛋白質接合体は、本明細書において、例えば11‐BSAとして示されている。
図8は、プロリルグリシルのベンゾイル化、引き続くcatELISAの結果
を示している。微量滴定板を11‐BSA(中黒印;ハプテン濃度(Hd)=2
8、10μg/ml、一夜、4℃)、またはBSA(中白印)を塗布し、そして
40mM PBS、pH7.4中のBz‐ONSu(10d)を、種々の時点で
(0−60分)、添加した(1mM、●、○または0.1mM、▲、△)。この
板をPBS+0.04%Tween(PBS/T)により洗浄し、次いで抗‐1
2ウサギポリクローナル血清(PBS/T中で1:4000に稀釈)を添加した
。さらに洗浄し、次いでパーオキシダーゼ結合マウス抗ウサギ抗体(Jacks
on、PBS中で1:5000に稀釈)を添加し、その吸光を690nmで測定
した。
図9は、15‐KLHにより免疫感作されたマウスのポリクローナル血清抗体
の結合活性を示している(完全フロイントアジュバント(CFA)中でエマルジ
ョン化した50μg/マウス)。14日間の後に、ブースターを投与した(不完
全フロイントアジュバント(IFA)中の50μg/マウス)。10日後に採取
した血清をPBSにより稀釈し(1:500−1:10000)、次いで15‐
BSAに対する、●、12‐BSAに対する、▲、およびBSAに対する、□、
結合に係わり、ELISAにより試験した(接合体、PBS中の1μg/mlを
、塗布物として使用)。これらの結果は、最高力値を示した3匹のマウスから採
取された血清に係わるものである。15‐BSAに対する結合の競合的抑制が、
遊離の、非接合体15(15‐N‐グリシルメチルアミド)の存在の下に見出だ
された、5μM、〇、(および0.1mMで>95%抑制)。15‐BSAに対
する結合は、同様に生成物(12)の存在の下に抑制されたが、有意の小さい親
和性を依然として伴っていた(例えば、12、1:2500血清稀釈で、IC50
=2mM)。
図10は、13‐KLHにより免疫感作されたマウスのポリクローナル血清抗
体の結合活性を示している。4匹のBalb/cマウスを、13‐KLHにより
免疫感作した(CFA中でエマルジョン化した50μg/マウス)。14日間の
後に、ブースターを投与した(IFA中の50μg/マウス)。10日後に採取
した血清をPBSにより稀釈し(1:200−1:15000)、次いで13‐
BSAに対する、●、12‐BSAに対する、○、およびBSAに対する、□、
結合に係わり、ELISAにより検定した(接合体、PBS中の1μg/mlを
、塗布物として使用)。これらの結果は、最高力値を示した4匹のマウスから採
取された血清に係わるものである。好適態様の説明
本発明による非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の直接選別または検出方
法は、支持体、例えば微量滴定板に固定されている基質Sを包含する。
本発明により検出または選別される非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質は
、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、組換え抗体、抗体の断片、合成ポリペプチ
ドおよびアミノ酸ポリマーなどであることができる。この試験は特に、ハイブリ
ドーマ上清の触媒性モノクローナル抗体に係わる直接的選別、および組み合わせ
ライブラリイの直接的選別に有用である。この組み合わせライブラリイでは、官
能性ポリペプチド、例えば官能性Fvを、数百万の可能性の中から選択しなけれ
ばならない。
基質Sは、選別しようとする試料、例えば触媒作用を受けた反応S−−→Pの
遷移状態の安定な合成類縁体に相当し、蛋白質に接合されているハプテンにより
免疫感作された動物の細胞の融合により得られるハイブリドーマ上清中に存在す
る非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白質により、生成物Pに総体的にまたは部
分的に変換される。本発明に従い行われた一例では、この基質はp‐ニトロベン
ジルエステル1aであり、生成物はカルボン酸3であり、そして抗体は遷移状態
類縁体ハプテン4に対して誘発させる(図1)。
縮合反応では、1種のみの反応体を支持体に固定する。補酵素との反応を潜在
的に触媒性のポリペプチドまたは蛋白質を含有する試料により触媒させて、生成
物Pを導く。この生成物Pは当該支持体に固定されたままであり、特異性抗体に
より検出される。本発明に従い行われた一例では、BSA‐11に接合されてい
る固相アミン基質をエステル補基質10と反応させる。このアミン生成物12は
この支持体に固定されたままで残される。この場合の抗体は、遷移状態類縁体ハ
プテン13、14または15に対して誘発させる(図7)。
生成物Pの分子は支持体に固定されて残され、特異性抗‐生成物抗体を使用す
るいずれか適当な免疫検定法、例えばELISA、放射免疫検定法(RIA)、
化学ルミネッセンス免疫検定法(CIA)、蛍光免疫検定法により検出すること
ができる。
被験試料中の触媒性ポリペプチドまたは蛋白質の存在は、生成物Pが対照反応
のいずれよりも有意に早い速度および多い量で生成される場合の全部で確認され
る。この対照反応は、(a)固定された基質Sのみ;または(b)無関係蛋白質
/抗体の存在における固定された基質S;または(c)固定された基質S単独あ
るいは固定された基質Sと無関係蛋白質/抗体との組み合わせ(ただし、工程(
iii)の抗‐生成物P特異性抗体は除外される);を用いて行う。
図1には、生成物の検出にELISAを使用した場合の、本発明の方法が示さ
れている。先ず、支持体上に固定されている生成物分子を、抗‐生成物特異性抗
体、例えば生成物Pに対してウサギで誘発されたポリクローナル抗体により検出
し、次いでこの結合した抗体分子を、酵素標識付けした第二の抗体により検出す
る。我々は、ELISAを用いる検定法を、catELISAと名付けた。ca
tELISAを採用することによって、ホスホネートTS類縁体に対して誘発さ
れた、数千のハイブリドーマクローンを迅速に選別することができ、相当す
るp‐ニトロベンジルエステルの触媒作用をうけた開裂を検出することができた
。
本発明には、種々の抗体‐触媒加水分解およびその他の開裂反応ならびに会合
反応、およびまた縮合反応が包含される。従って、基質Sは、支持体蛋白質、例
えばウシ血清アルブミン(BSA)に、またはキーホールリンペットヘモシアニ
ン(KLH)に、酸またはアルコール残基を介して接合されている固定エステル
であることができる。生成する酸またはアルコール生成物Pはこの支持体に固定
されたまま残され、工程(iii)における検出は、この酸またはアルコール生
成物Pに対して特異性の抗体を用いて行い、またこの結合した特異性抗体は、工
程(iv)において、免疫検定法により検出される。
基質Sは、その酸またはアミン残基を介して支持体蛋白質に接合されているア
ミドであることもでき、ここで生成される酸またはアミド生成物Pは、この支持
体に結合されたままであり、工程(iii)における検出はこの酸またはアミド
生成物Pに対して特異性の抗体を用いて行われ、またこの結合した特異性抗体は
、工程(iv)において、免疫検定法により検出される。
基質Sはまた、1種のみのエナンチオマーまたはジアステレオマーであること
ができ、この場合には、選別された触媒性ポリペプチドまたは蛋白質は、当該化
合物の分割を触媒し、所望のエナンチオマーまたはジアステレオマーをもたらす
ことができる。
基質Sはまた、小型ペプチドに分解するポリペプチドであることができる。例
えば、これは分解され、無毒性分子に変換されるトキシンであることができる。
この場合には、トキシンを分解させる触媒性抗体は医薬として、例えば敗血症性
ショックの処置用の医薬として有用であることができる。
基質Sはまた、アミン、例えばそのカルボキシル残基を介して支持体蛋白質に
結合しているアミノ酸11であることができ、この場合の補基質はエステル10
であり、そして生成物Pは、この支持体に固定されて残される生成アミドである
。工程(iii)における検出はこのアミドに対して特異性の抗体を用いて行わ
れる。その他の会合反応および縮合反応もまた、本発明に包含される。
ここで説明する系は、中でも、種々の抗体が触媒するアシル‐転移、例えば加
水分解反応を試験するようにデザインされている。固定されているエステル1a
−g、アミド(例えば、2)またはイミド5の開裂は、固相に結合しているカル
ボン酸生成物3をもたらす(図2)。この基質接合体のいずれとも交差反応しな
い抗‐生成物3ポリクローナル抗体を、検出に使用する。
catELISAの実施可能性を最初に確認するために、我々は、エステル1
a−dおよびイミド5の酵素‐または塩基‐触媒による加水分解を研究した。こ
れらの基質BSA接合体を微量滴定板に塗布し、各種経過時間に係わり、温和な
塩基(炭酸ナトリウム、0.1M、pH10.9)または膵臓リパーゼにより処
理した。生成する酸生成物3の生成は、ウサギ抗‐3抗体を使用する慣用のEL
ISAおよび引き続くパーオキシダーゼ結合した抗‐ウサギ免疫グロブリン抗体
により測定した。アミド、例えば2によっては、シグナルは見出だされなかった
。このことは、この基質が塩基またはリパーゼ‐触媒加水分解に対して安定であ
ることを示している。予想されたように、イミド5は炭酸ナトリウムの存在の下
に加水分解されるが(メチルエステルの場合の90分に比較して、t1/2=45
分)、リパーゼによっては加水分解されない。種々の稀釈度のリパーゼの存在の
下におけるエステル1a−dの加水分解速度は、酵素濃度の増大にしたがい最高
に達した(図3)。これは、固相上に塗布されている非常に少量の基質(約10
−50pmol/くぼみ)によるものである。酵素‐および塩基‐触媒反応の運
動力学は、5%ほどの少ない基質の生成物への変換が測定できることを示してい
る。当該基質がこの酵素に対して最適からはほど遠いにもかかわらず、0.01
単位よりも少ないリパーゼの活性を、1a−dなどのエステル基質によってさえ
も容易に検出することができる。これらのおよび追加の実験は、catELIS
Aが敏感であり、かつまた選択性であり、ハイブリドーマ上清中の触媒性抗体の
直接選別に施用できることを示す。例 材料および方法 基質およびハプテンの調製
合成基質はいずれも、結晶化またはシリカカラムクロマトグラフイにより均一
(薄層クロマトグラフイおよびNMRにより判断)に精製した。構造は、NMR
および質量スペクトルにより確認した。充分の元素分析値を全結晶化合物に関し
て得た。エステル1a、1b、1eおよびアミド2(図2)は次の方法により製
造した:(i)相当するアルコールまたはアミンを、塩基の存在の下に(1b、
エタノール、ナトリウムエトキシド、還流;1aおよび1e、p‐ニトロベンジ
ルアルコールまたはo‐ニトロベンジルアルコール、1,8‐ジアザビシクロ[
5.4.0]‐ウンデカン(DBU);2、p‐ニトロベンジルアミン;Et3
N)、無水グルタル酸と反応させる;(ii)N,N´−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド(DCC)を使用して、t‐ブチルグリシネートとカプリングさせる
;次いで(iii)トリフルオロ酢酸(TFA)の存在の下に、そのt‐ブチル
エステルを分離する。メチルエステル1cは、N‐グルタリル‐O‐ベンジルグ
リシンを、ジアゾメタンによりエステル化することにより製造し、また2‐フル
オロエチルエステル1dは、チオニルクロライドの存在の下に、2‐フルオロエ
タノールによりエステル化することにより製造し、接触水素添加により、このベ
ンジルエステルを分離することによって、生成物を得た。イミド5は、無水グル
タル酸およびグリシンベンジルエステルを、無水酢酸の存在の下に加熱すること
によって製造した;このベンジルエステルを次いで接触水素添加により分離した
。基質は、それらのN‐ヒドロキシスクシンイミドエステルを経て、ウシ血清ア
ルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に接合
させた。
カルボン酸3(生成物)の蛋白質接合体を調製する場合には、相当するp‐ヨ
ウドフェニルエステル1fを合成した;無水グルタル酸にt−ブチルグリシネー
トを添加し、生成するモノ酸を次いで、DCCを用いてp‐ヨウドフェノールに
カプリングした。t‐ブチルエステルを分離した後に、生成する1fを、蛋白質
とカプリングし(そのN‐ヒドロキシスクシンイミドエステルを経る)、次いで
加水分解させて(0.1M Na2CO3、3時間)、カルボン酸3‐BSAおよ
び3‐KLHを生成させた。ホスホネート4の合成および接合は、参考文献12
に記載のとおりにして行った。
プロリルグリシンのBSA接合体(11‐BSA)は、次のとおりにして製造
した:(i)保護されているプロリルペプチド、Fmoc‐Pro‐Gly‐O
H、をNSuエステルを経てBSAに接合させる;(ii)6M尿素およびP
BSに対して充分に透析した後に、Fmoc(フルオレニルメトキシカルボニル
)保護をその場で、ピペリジン(1:3、THF:0.1M NaHCO3中の
5%)の存在の下に、この蛋白質上で分離した。ハプテン濃度(Hd)は、保護
基を分離する前に、この結合されているFmoc基の吸光値を測定することによ
って測定した(E300nm=5,300M-1cm-1)。分子BSAあたりで20−
30のプロリル‐グリシル残基を有する接合体を、catELISAに使用した
。
12‐BSAおよび12‐KLHは、Bz‐ProGly‐ONSu(Bu=
ベンゾイル;NSu=N‐ヒドロキシスクシンイミドエステル)(200μLD
MF中、10μmol)を、BSAまたはKLH(0.1M NaHCO3中の
それぞれ、10mgまたは5mg)と反応させることにより製造した。
catELISA:抗‐生成物3抗体は、カルボン酸生成物3のKLH接合体
を用いて、免疫感作したウサギにより製造した(ハプテン濃度=17/分子;1
00μg/ウサギ、完全フロイントアジュバント(CFA)中でエマルジョン形
成されたもの;次いで14日後の追加感作、不完全フロイントアジュバント(I
FA)中でエマルジョン形成されたもの)。24日後に採取した血清は、生成物
に対して高い結合親和性(3−BSA、ハプテン濃度=10、力値=1:500
0)および種々の基質接合体(1a−d、2および5‐BSA)と最小交差反応
性(1:5000の稀釈度で、<10%)を示した。catELISAの場合に
、微量滴定板(Nunc、Maxisorb)に1a‐BSA(ハプテン濃度=
15、1.0μg/ml、1時間)を塗布し、次いでBSA(1mg/ml、0
.5時間)によりブロックした。ハイブリドーマ上清(50μl)を、3時間イ
ンキュベートし、この板を次いでリン酸塩緩衝塩類溶液(PBS、10mMリン
酸ナトリウム、0.14M NaCl、pH7.4)+0.04%Tweenに
より洗浄した。ウサギ抗‐生成物3血清を次いで添加した(PBS+0.04%
Tweenで1:5000に稀釈、1時間)。洗浄し、パーオキシダーゼ結合マ
ウス抗‐ウサギ免疫グロブリン抗体(Jackson、Immuno Rese
arch、PBS中で1:5000に稀釈)とともにインキュベートし、基質、
2,2´‐アジノビス(3‐エチルベンズチアゾリンスルホン酸)(ATBS)
を添加し、次いでその吸光値を690nmで測定した。加水分解の
陽性対照として、塩基(0.1M炭酸ナトリウム、pH10.9)またはリパー
ゼ(ブタ膵液、粗製エキス、Sigma L‐3126、50μg/ml)を使
用した。
抗‐生成物12抗体は、ウサギを12‐KLHにより免疫感作し(100μg
/ウサギ、CFA中でエマルジョン形成)、次いで14日後に、追加免疫感作し
た(100μg/ウサギ、IFA中)。14日後に採取した血清は、12‐BS
Aに対する高い結合親和性を示し(力値>1:10000)、かつまた11‐B
SAとの交差反応性は示さなかった。
catELISAの場合に、微量滴定板に11‐BSAを塗布した(10−2
0μg/ml、一夜、4℃)。この板をPBS/Tにより2回、次いでPBSに
より洗浄した。該当上清、血清または緩衝液(40mMPBS、pH7.4)を
、ベンゾイルエステル、Bz‐OX(10a−d;0.01−5mM)の存在の
下に、各種時間(10分−24時間)にわたりインキュベートした。この板を次
いで、PBS/Tにより洗浄し、次いで抗‐12ウサギポリクローナル血清(P
BS/Tで1:4000に稀釈)を添加した。さらに洗浄し、パーオキシダーゼ
結合マウス抗‐ウサギ抗体(Jackson、PBSで1:5000に稀釈)と
ともにインキュベートした後に、基質(ATBS)を添加し、次いでその吸光値
を690nmで測定した。
catELISAによる上清の選別条件は、触媒が存在していない背景シグナ
ルが最低にされ、かつまた炭酸ナトリウムまたはリパーゼによる完全分解の後に
得られるシグナルが最大にされるように、最適化した。すなわち、基質のそれぞ
れに係わり板の塗布に、相違する濃度の接合体を使用した(0.1−5μg/m
l)。最高の結果は、10−20のハプテン濃度を有する基質‐BSA接合体で
得られた。
例1
ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体
Balb/cマウスを、ハプテン接合体4‐KLH(ハプテン濃度=16,C
FA中の50μg/マウス)により免疫感作した(足の裏に注射)(図2)。1
4日後に、ブースターを投与し(IFA中の50μg/マウス)、次いでさら
にNSOミエローマ細胞との融合(免疫感作から45日目)の4日前および3日
前の2回、ブースターを投与した(i.p.,50μg/マウス)。
基質接合体2‐KLHを用いて、短縮免疫感作計画を使用した(図2)(ハプ
テン濃度=16);3匹のBalb/cマウスおよび3匹のC57BLマウスを
免疫感作した(CFA中の50μg/マウス)。17日後に、IFA中のブース
ターを与え、3日後に、排液(draining)リンパ節細胞をNOSミエロ
ーマ細胞と融合した。
融合後の2週間の時点で、生成するハイブリッドクローンをcatELISA
により選別した。陽性クローンをBalb/cマウスで腹水として増殖させた。
この抗体をスタフィロコッカル(staphylococcal)蛋白質A(P
harmacia)アフィニティクロマトグラフイにより精製し、次いでトリス
‐緩衝塩類溶液[TBS;50mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノ‐メタン
/0.14M NaCl]、pH8.25または9.0に対して透析した。この
精製抗体の等質性をSDS‐PAGEにより判定した。これは、還元条件の下に
、コマシーブルー(Coomassie blue)染色によりH鎖およびL鎖
のみを認めた。融合、ハイブリドーマセルラインの増殖、免疫検定および腹水中
でのモノクローナル抗体の産生は、参考文献13および14に記載のとおりにし
て行った。
蛋白質A‐精製抗体の触媒活性は、等質溶液中のp‐ニトロベンジルアルコー
ルの発現および基質1aの消失を、検出および定量にHPLCを用いて測定する
ことにより測定した。ジメチルスルホキシド中の基質を、50mMTBS、pH
8.25または9.0中の抗体に添加した(最終有機溶剤<1%)。この反応混
合物の一定量を冷却し(アセトニトリル+0.1%TFA)、次いでHPLCに
より分析した(RP‐8、100×5カラム;27:73、水/アセトニトリル
+0.1%TFA;流速1.0ml/分;277nmにおける吸光により検出;
基質1aに係わる保有時間6.9分および生成物p‐ニトロベンジルアルコール
に係わる保有時間4.1分)。
抗体濃度(Abo)は、4(4‐N‐ベンジルアミドとして)による活性部位
滴定により測定した。エステル1aの加水分解の無触媒速度(Kuncat)は、初
期速度分析により決定し、ゼロ緩衝濃度に挿入して、pH8.25において2.
8×10-5/分である。o‐ニトロベンジルエステルおよびベンジルエステル(
それぞれ1eおよび1g;1mM)を用いる触媒性抗体の活性は、HPLCによ
り評価した。この精製抗体(0.3−5μM)の存在下における速度増大は見出
だされなかった。
触媒性抗体を発現させるために、初めにホスホネートハプテン4を使用した。
この使用は、ホスホノエステルがエステル加水分解の四面の負に帯電した(te
trahedral,negatively charged)TS/中間体を
偽装すること、およびまたエステル加水分解性抗体を誘発させることが証明され
ていることによる(1)。p‐ニトロベンジルホスホノエステル接合体、4‐K
LHにより免疫感作したマウスからのひ臓細胞を、ミエローマNSO細胞と融合
させ、生成する1570ハイブリッドクローン(この中の970はハプテン結合
性クローンであった)を、基質1aの加水分解を誘発させるそれらの能力に係わ
り、catELISAにより評価した(図2)。この初期ハイブリドーマ上清の
選別からの代表的データを図3に示す。この図から明らかなように、数ダースの
クローンがこのホスホネートハプテンに結合するが、catELISAでは2つ
のみが陽性を示した。同時に、エステル1aの開裂を触媒する9クローンが同定
された。
対照実験により、このハイブリドーマ上清の存在の下に見出だされたcatE
LISAシグナルは確かに、p‐ニトロベンジルエステル基質1aの抗体‐触媒
された加水分解によるものであるという、結論的証拠が得られた。p‐ニトロベ
ンジルエステル以外のエステル(図2において、1b−d)が基質(例えば、1
b上の抗体D2.3、図示されていない)として使用された場合には、選別され
たクローンの中で、catELISAにおいてシグナルを生じたものはなかった
。この触媒部位のアフィニテイパターン(図4)は、ハプテン4に対して誘発さ
れた抗体に係わり予想されたとおりである、すなわちハプテン4>「短い」(s
hort)ハプテン>アミド基質>p‐ニトロベンジルアルコール(生成物)で
あった。これらの抗体のハプテン‐BSA接合体に対する結合の抑制が、通常の
競合性抑制免疫検定法(CIEIA;類似の分析方法、参考文献13参照)
により測定された場合には、同一程度の親和性が見出だされた。これらの抗体の
触媒としての総合的品質の特徴である、生成物抑制、pH‐活性プロフィール、
基質特異性、およびその他の性質はいずれも、抗体を精製する前にcatEIL
SAにより適切に測定された(データは示されていない)。
腹水からの精製抗体を、遊離の非接合p‐ニトロベンジルエステル1aの加水
分解を触媒する、それらの能力に係わりHPLCにより評価した(図5)。この
結果は、catELISA選別を確認するものであった。
比較的低い速度増進を示すクローン(例えば、抗体クローンD2.1:Kcat
/Kuncat:約700、pH9.0)のELISAによる同定は、catELI
SAの感受性および選択性の下にある。このエステル基質の「背景」(すなわち
、無触媒)加水分解も、ハイブリドーマ上清中の酵素の存在も、干渉するものは
なかった。固相エステル、例えば1aは、可溶性の非接合エステルを加水分解す
る大部分のエステラーゼ(例えば、ブタ肝臓エステラーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ)の存在の下で安定であることが見出だされた;これらの酵素は、溶液
の状態の(すなわち、固相に固定されていない)、同一エステル基質の加水分解
を触媒する。さらにまた、エステラーゼを含有することが知られている他の生物
学的液体(例えば、ヒトおよびマウスの血清、マウスの腹水、バクテリア増殖培
地など)を、エステル‐BSA(および追加の基質)に対するcatELISA
により評価した。これらの場合の中で、緩衝液(例えば、PBS、pH7.4)
とともにインキュベートした後に見出だされるシグナルよりも大きい背景シグナ
ルが見出だされたものはなかった。すなわち、これらの培地に分泌された触媒性
抗体を、効果的に検出することができた。
触媒性抗体の検出に「固相」基質を使用することによって、二つの格別の利点
が得られる。すなわち、触媒性抗体は、蛋白質担持構造体を包含する基質に対し
て増大された親和性を有しており(すなわち、Km値は低い)、また比較的低い
基質濃度が疑似一次オーダー条件の維持を確実にする(Km>>So)。これら
の2種の因子は抗体媒介触媒作用の検出能力を直接的に増加させることを示唆し
ている(5)。背景、すなわち非触媒性抗体の存在の下での加水分解(△Punca t
またはV0uncat)以上である、エステル1aの抗体触媒加水分解
(△PcatまたはV0cat)により見出だされるシグナルは、catELISAに
より有意に増大される(図6)。
例えば、1a‐BSAを用いるcatELISAは、pH8.25および9.
0の両方において、抗体D2.5含有ハイブリドーマ上清を使用して、明らかに
有意のシグナルを示す(図6A、V0cat/V0uncat=50および80)。遊離の
非接合1aを使用する慣用の試験(蛋白質A精製試料および放出生成物の検出お
よび定量にHPLCを使用)により見出だされた速度増大は、使用抗体濃度がc
atELISAに使用された抗体濃度よりも少なくとも50倍多かったにもかか
わらず、一桁小さい(図6B、V0cat/V0uncatはpH8.25において〜1.
0であり、そしてpH9.0において〜2.5である)。この差異は固相1a‐
BSAの小さいKmおよびSoを反映し、またより高いELISA検出感度を反
映している。
従って、反応生成物の検出に使用される方法に無関係に、固相基質は抗体媒介
触媒作用の検出に好ましい。これらの実験で開示された免疫検定法に加えて、別
種の検出技術、例えば放射性物質で標識した生成物、蛍光、吸光などを使用する
ことによる、上清中に放出された可溶性生成物(前記例では、p‐ニトロベンジ
ルアルコール)の検出にも使用することができる。
もう1種の抗体D2.3も、真に効果的な酵素様触媒(図5;Kcat=7.3
5min -1,Km=0.28mM,ph8.25)の例である。この抗体は非活性化
エステル基質により有意の速度増大(Kcat/Kuncat=2.6×105)を示す
ばかりでなくまた、多回反復性(>1000)を示す。反復性(turnove
r)、すなわち反復して処理される基質に対する一個の結合部位の能力は多くの
場合に、触媒性抗体における数種の生成物抑制により制限されることが見出ださ
れている(例えば、参考文献15−20参照)。ニトロフェニル基の存在にもか
かわらず(15)、p‐ニトロベンジルアルコール生成物は、小さいが十分の親
和性をもって(Kd=52μM)、抗体D2.3に結合し、充分の反復性を示す
ことができる(図5)。D2.3はまた、その格別の基質特異性を有することを
特徴とするものであり、この特徴はp‐ニトロベンジルエステルばかりでなく(
すなわち、ベンジルまたはo‐ニトロベンジルエステル1gお
よび1eの場合には触媒作用は見出だされない)、また当該基質のアシル部分を
も認識する:p‐ニトロベンジルアセテートの場合のKcat/Km値は10秒-1M-1
より小さいものと推定されるのに対して、N‐(O‐ニトロベンジルグルタル
)グリシン(1a)の場合は、440である。従って、直接選別はハプテン結合
非触媒性クローンの手数の掛かる労力を節約することができるばかりでなく、ま
た選別される触媒性抗体の種類および品質を増加させるものでなければならない
。
例2
追加の融合体を、catELISAにより触媒活性に係わり選別した。相違す
る種のマウスを、4‐KLHにより、および2‐KLHにより免疫感作し、次い
で各エステル基質1a‐BSAおよびアミド基質、2‐BSAの加水分解に係わ
り選別した。免疫感作、融合、および選別はいずれも、例1および材料および方
法の項に記載のとおりにして行った。これらの実験の全部で得られた結果を表I
にまとめて示す。
catELISAにより同定された触媒として活性な抗体クローンを、例1の
とおりにして、腹水中で増殖させ、蛋白質Aカラムで精製した。生成物の検出お
よび定量にHPLCを使用して、エステル1a(可溶性)による通常の検定を行
い、catELISAにより得られた結果を確認した。
これらの結果は、下記の条件の下における、抗体媒介触媒活性に係わる迅速な
選別に係わるcatELISAの能力をさらに証明している:(i)抗体が非常
に低濃度で存在する、(ii)反応を触媒することができる酵素が存在する。
例3
catELISA手段は、平易であるばかりでなく、また一般的である、すな
わち反応および基質の種類に制限されない。この追加の例は、会合反応、2分子
反応を包含するエステルおよびアミンの縮合反応によるアミドの生成を、前記の
解離性の単一種分子反応であるエステルまたはアミドの加水分解の例と比較する
ものである。その他のアミノ酸のいずれのアシル化にも比較して、プロリンのア
シル化は抗体触媒に関して魅力的な標的である。これは、ペプチド合成を触媒す
ることが知られている酵素(例えば、サブチリシン、ケモトリプシン)がいずれ
も、プロリン基質に対しては不活性であるからである。
この検出系は固相基質、すなわちBSAに接合され、微量滴定板に固定されて
いるプロリルグリシル(11‐BSA)に基づいている;移動相に存在する、補
基質、すなわち安息香酸のエステル(10)を、被験抗体および緩衝液とともに
添加する(図7)。プロリンのアミノ基によるベンゾエートエステルの求核性置
換は、固定されているベンゾイル‐プロリルグリシル、12‐BSAの生成およ
び相当するアルコールの放出をもたらす。このプロリルグリシル基質(11‐B
SA)と、あるいはベンゾイルBSAと交差反応しない抗‐生成物12ポリクロ
ーナルウサギ抗体を検出に使用した。
このcatELISA系の実行可能性を証明するために、ベンゾイル‐NSu
(N‐ヒドロキシスクシンイミドエステル)(10d)による固相プロリルグリ
シル(11‐BSA)のその場でのアシル化を実験した。N‐ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルはアミンと高い反応性を有し、水性媒質中におけるペプチド合
成に慣用されている。固相ベンゾイル‐プロリルグリシル(12‐BSA)の生
成を、抗‐12ウサギポリクローナル抗体を使用して検出した(図8)。図示さ
れているように、見出だされたシグナルは経過時間および濃度に依存する。さら
にまた、N‐ヒドロキシスクシンイミドエステルは選択性ではない、すなわちこ
れらはプロリルアミノ基および当該反応に存在するその他のアミノ基、例えばB
SAのリジン残基のε‐アミノ基とも反応する。しかるに、catELISAに
よる検出は、プロリルグリシルのベンゾイル化に対して特異性であることが証
明された。ベンゾイル‐BSAの生成により見出だされるシグナルは実際には、
有意ではない(図8)。
N‐ヒドロキシスクシンイミドエステルと同様には反応性ではない、安息香酸
のその他のエステル、例えばメチル、トリフルオロまたはシアノエチル(それぞ
れ10a、bおよびc)は、さらに長期間のインキュベーション(例えば、5m
M、室温で24時間)の後でさえも、生成物、ベンゾイル‐プロリルグリシル(
12‐BSA)を生成しなかった。前記したとおりに、プロリルグリシル‐BS
Aのベンゾイル化を触媒する抗体を同定するためには、これらのエステルは、相
当する遷移状態類縁体に対して誘発された抗体の上清の存在の下に、添加されな
ければならない。
前記アミド化反応に係わる遷移状態類縁体をデザインし、合成し(図7)、次
いで担体蛋白質(BSAまたはKLH)に結合させた。Balb/cマウスを、
ハプテン13−15のKLH接合体により免疫感作させると、高く、特異性の結
合応答が得られた(図9および図10)。これらのマウスから採取されたリンパ
球をNSOミエローマ細胞と融合させることによって得られたハイブリッドクロ
ーンを、ハプテンに対する(すなわちハプテン‐BSA接合体に対する)結合に
係わり、およびまたメチルまたはシアノエチルベンゾエートの存在の下でのプロ
リルグリシルのアミド化の触媒作用に係わり選別した(それぞれ10aおよび1
0c;5mM、室温で24時間)。基質11のベンゾイル化を触媒して、アミド
生成物を生成させる陽性の抗体クローンを、例1に記載のとおりに、同定し、そ
の特徴を確認する。参考文献
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
// G01N 33/573 Z 8310−2J
(C12P 21/08
C12R 1:91)
(72)発明者 エシュハー,ゼリッグ
イスラエル国 76100 レホボト,ヘス
ストリート 18
(72)発明者 グリーン,バーナード エス.
イスラエル国 79233 クブトザット ヤ
ブネ(番地なし)
(72)発明者 タウフィック,ダン エス.
イスラエル国 96264 エルサレム,ハバ
ナイ ストリート 29
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.基質Sの生成物Pへの変換に適する非酵素触媒性ポリペプチドまたは蛋白 質の選別または検出方法であって、 i 上記基質Sを支持体に固定し; ii 潜在的に触媒性のポリペプチドまたは蛋白質を含有する試料を、この固 定した基質Sと接触させ、これにより支持体に固定されたままで、基質Sを生成 物Pに完全に、または部分的に変換し; iiiこの固定されている生成物P分子を当該生成物Pに対して特異性の抗体 により検出し;次いで iv 生成物P‐結合した抗体分子を検出する ことからなり、 ここで生成物Pは対照反応におけるよりも有意に早い速度および多い量で生 成され、これは選別された試料中における当該触媒性ポリペプチドまたは蛋白質 の存在を示唆している、上記方法。 2.選別または検出される非酵素触媒性蛋白質が、抗体、一本鎖抗体、抗体の 断片、あるいは合成ポリペプチドまたはアミノ酸ポリマーである、請求項1に記 載の方法。 3.ハイブリドーマ上清を、触媒性モノクローナル抗体に係わり直接選別する 、請求項1または2に記載の方法。 4.モノクローナル抗体を、触媒作用を受けた反応S−−→Pの遷移状態の安 定な合成類縁体に対して誘発させ、次いで触媒性モノクローナル抗体を、無意味 の抗体により行われる対照反応に比較して、有意に早い速度で生成物Pを生成さ せることにより検出する、請求項3に記載の方法。 5.組み合わせポリペプチドライブラリイを、触媒機能性ポリペプチドに係わ り直接選別する、請求項1に記載の方法。 6.基質Sを蛋白質に直接に結合させ、この基質S‐蛋白質接合体を微量滴定 板に固定する、請求項1−5のいずれか一項に記載の方法。 7.基質Sを、リンカーを介して蛋白質に結合させ、この基質‐リンカー‐蛋 白質接合体を微量滴定板に固定する、請求項1−5のいずれか一項に記載の方法 。 8.固定されているエステルSの加水分解を触媒する非酵素ポリペプチドまた は蛋白質を選別または検出する方法であって、生成する固定されている酸または アルコール生成物Pを、工程(iii)において抗‐P特異性抗体により検出し 、次いで工程(iv)において、この抗体分子を、免疫検定法により検出する、 請求項1−7のいずれか一項に記載の方法。 9.固定されているアミドSの開裂を触媒する非酵素ポリペプチドまたは蛋白 質を選別または検出する方法であって、生成する固定されているアミンまたは酸 生成物Pを、工程(iii)において、抗‐P特異性抗体により検出し、次いで 工程(iv)において、この抗体分子を、免疫検定法により検出する、請求項1 −7のいずれか一項に記載の方法。 10. (a)エナンチオマーまたはジアステレオマーの分割;(b)大型ペプ チドSの小型ペプチドSへの分解;および(c)トキシンの毒性が少ないか、ま たは無毒性の物質への分解;から選択される反応を触媒する非酵素ポリペプチド または蛋白質を選別または検出する、請求項1−7のいずれか一項に記載の方法 。 11. 固定されているアミンSおよびエステル補基質からのアミドの合成を触 媒する非酵素ポリペプチドまたは蛋白質を選別または検出する方法であって、生 成する固定されているアミド生成物Pを、工程(iii)において、抗‐P特異 性抗体により検出し、次いで工程(iv)において、この抗体分子を、免疫検定 法により検出する、請求項1−7のいずれか一項に記載の方法。 12. 抗‐生成物P特異性抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項1−1 1のいずれか一項に記載の方法。 13. 工程(iv)における生成物P‐結合抗体分子をELISAにより検出 する、請求項1−12のいずれか一項に記載の方法。
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