JP3891542B2 - リン酸化部位に特異的な免疫学的反応体を生じさせる方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の背景】
蛋白質のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は幅広く多様な細胞過程（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の調節にとって重要である。セリン、トレオニンおよびチロシン残基のリン酸化による蛋白質活性の調節が高度に利用されている。また、蛋白質のヒスチジン、アルギニンおよびリジン残基も細胞過程でリン酸化を受けるが、そのような非常に不安定な修飾を研究するのは困難なことからその重要性は未知である。蛋白質のリン酸化状態の変化を検出して量化することはそれの機能的重要性の研究において大きな有用性を有する。
【０００２】
蛋白質のリン酸化状態を測定する標準的な方法は、典型的に、付加させるホスフェート部分に燐の放射性同位体（ホスフェートとして）を組み込んでおくことでその部分に前以て標識を付けておくことを伴う。そのようなリン酸化アッセイはいくつかの方法論的落とし穴に苦しんでおり、そのような落とし穴には、予め標識を付けておく実験で［³²Ｐ］Ｐｉを多い量で用いる必要があることに関連した健康の危険および処分問題、規定（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）物質を用いた作業の煩わしさ、そしてリン酸化を受けた部位が１つの蛋白質またはペプチド部分に数箇所存在する場合の部位特異性が不足していることが含まれる。このような欠点が存在する結果として、蛋白質のリン酸化状態を検出しようとする場合に免疫化学を基にした方法が普及してきている。免疫化学方法を用いた時に達成され得る感度および選択率が理由で、このような方法は魅力的な代替法である（Ｍａｔｓｕｉ 他．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４０：６４７−６５７（１９９８）；Ｃｏｎｒａｄ 他．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：１６７−１７３（１９９７））。
【０００３】
多様な細胞骨格蛋白質に特異的なリン酸化状態依存モノクローナル抗体が作り出されて特徴づけされた。このような抗体の単離は、リン酸化エピトープの特異的標的が主な目的ではない免疫プロトコルを用いて行われた。より最近になって、リン酸化部位上のエピトープを標的にする抗体が産出される機会を向上させる目的で小型の合成ホスホポリペプチドが用いられた（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ 他．，Ｇｅｎｅｓ および Ｄｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；Ｍａｔｓｕｉ 他．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．１４０：６４７−６５７（１９９８）；Ｃｈｅｎ 他．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２：Ａ５５０（１９８８）；Ｃｚｅｒｎｉｋ 他．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０１：２６４−２８３（１９９１））。このような方法は、より直接的ではあるが、それでもまだ、免疫時にポリペプチド抗原が急速に脱リン酸化を起こすことでホスホ特異的抗体の滴定量が少なくなると言った制限に苦しんでいる。このことは、特に、ホスホセリンおよびホスホトレオニン（これらは両方とも一般にホスホチロシンよりもかなり不安定である）を含有する抗原を用いた時に問題になる。
【０００４】
（発明の要約）
本発明は、特定のアミノ酸の所がリン酸化を受けているポリペプチドに特異的に反応する抗体を生じさせる方法を提供する。モノクローナルおよびポリクローナル両方の抗体を生じさせる方法を提供する。本方法は、リン酸化アミノ酸残基の擬態（ｍｉｍｅｔｉｃ）を組み込んでおいたポリペプチドを提供することを伴う。この擬態に天然にリン酸化を受けたアミノ酸にも存在する抗原決定基を持たせる。このポリペプチド抗原を標準的な方法で用いて天然のリン酸化ポリペプチドと交差反応して前記ポリペプチドの特異的リン酸化状態を特異的に認識するモノクローナルもしくはポリクローナルいずれかの抗体を生じさせる。
【０００５】
１つの態様において、前記擬態は非加水分解性結合を含有し、この結合を炭素原子と燐原子（ホスフェート基が有する）の間に存在させる。好適な態様における前記結合はＣＦ₂基である。このような結合基をホスホセリンに組み込むことで擬態Ｆ₂Ｐａｂを生じさせる。ｐ５３から誘導されるポリペプチド配列に存在するホスホセリンの代わりにＦ₂Ｐａｂを用いることで、ｐ５３の特異的リン酸化状態を認識する抗体を生じさせる。別の態様では、ＣＦ₂結合基をホスホトレオニンに組み込むことで擬態Ｆ₂Ｐｍｂを生じさせる。別の態様では、ＣＦ₂結合をホスホチロシンに組み込むことで擬態Ｆ₂Ｐｍｐを生じさせる。
【０００６】
（発明の詳細な記述）
本発明は、ある程度ではあるが、以前にホスファターゼ阻害剤として用いたホスホペプチド擬態（Ｂｕｒｋｅ 他．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１２９−１３４（１９９４）；Ｃｈｅｎ 他．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１６：９７６−９８４）が抗原性を示すことを見いだしたことを基にしている。より具体的には、ある擬態をポリペプチドに組み込んだ後、それを用いて、ある動物が免疫応答を示すようにする目的でそれを接種し、少なくともある程度ではあるが、前記擬態に存在する抗原決定基に対する抗体を引き出させる。本発明は、また、前記擬態に対して生じさせた抗体が天然のホスホペプチドと交差反応することを見いだしたことも基にしている。このような交差反応性は、擬態が天然のホスホペプチドの抗原決定基に非常に類似した抗原決定基を有することを示している［それが同じ隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）アミノ酸の前後関係（ｃｏｎｔｅｘｔ）で存在する場合］。そのような擬態ペプチド（ｍｉｍｅｔｉｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ）に対して生じさせた抗体は、天然のリン酸化ポリペプチドに対して、抗原性アミノ酸配列の元の燐蛋白質を免疫診断で同定する時の道具として働くに充分な結合活性および特異性を示す。このような見いだした事が基になって、前以て決めておいた蛋白質の特別なリン酸化状態を識別する免疫学的反応体を生じさせて単離する方法を提供する本発明がもたらされた。
【０００７】
本発明で用いるに適したホスホペプチド擬態の化学構造は、これを似させる天然のリン酸化残基に非常に類似していなければならずかつまた化学的に安定でなければならない（例えばホスファターゼによる脱リン酸化に対して耐性を示す必要がある）。これを、天然に存在する酸素橋渡しの代わりに非加水分解性結合がホスフェート部分に結合しているアミノ酸原子構造を含んで成る合成分子を用いて達成する。好適な態様では、ＣＦ₂基でアミノ酸とホスフェートを連結させる。自然にリン酸化を受ける数種のアミノ酸の擬態をそのようなアプローチで生じさせることができる。適切な炭素からホスフェート部分に至る所にＣＦ₂結合を位置させることでホスホセリン、ホスホトレオニンおよびホスホチロシンの擬態を生じさせる。好適な態様では、抗原性ポリペプチドに存在するホスホセリンの代わりに擬態分子であるＬ−２−アミノ−４−（ジエチルホスホノ）−４，４−ジフルオロブタン酸（Ｆ₂Ｐａｂ）［Ｏｔａｋａ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６：９２７−９３０（１９９５）］を用い、ホスホトレオニンの代わりにＬ−２−アミノ−４−ホスホノ−４，４−ジフルオロ−３−メチルブタン酸（Ｆ₂Ｐｍｂ）を用い、そしてホスホチロシンの代わりにＬ−２−アミノ−４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニン（Ｆ₂Ｐｍｐ）［Ａｋａｍａｔｓｕ他、Ｂｉｏｏｒｇ ＆ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５：１５７−１６３（１９９７）］を用いる（図１および図２）。代替態様では、天然のアミノ酸が有する酸素橋渡しをメチレン基に置き換える（図１および図２）。
【０００８】
Ｆ₂Ｐａｂの合成はＯｔａｋａ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３６：９２７−９３０（１９９５）に記述されている。Ｆ₂Ｐｍｐの合成はＳｍｙｔｈ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３５：５５１（１９９４）およびＡｋａｍａｔｓｕ他、Ｂｉｏｏｒｇ ＆ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５：１５７−１６３（１９９７）に記述されている。Ｆ₂Ｐｍｂの合成を、追加的メチル基を１つ持たせたバックボーン前駆体を用いてＦ₂Ｐａｂ合成に類似した方法で達成する。
【０００９】
前以て決めておいた燐蛋白質に特異的な免疫学的反応体を生じさせる時、適切な擬態をリン酸化残基を取り巻いている配列に相当する合成ペプチドに組み込む。この組み込み方法は公知であるか或は他の様式で本分野の技術者に利用可能である。ホスホ特異的抗体を生じさせる時に必要な配列の長さは、この試験で用いる個々の燐蛋白質に依存し得る。必要な特異性を生じさせるには一般にホスホ残基に隣接する３または４個の残基に相当する配列を存在させることで充分である。１つの態様におけるポリペプチド抗原は、そのような配列に適切な擬態が組み込まれている縦列繰り返し（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）を含んで成る。抗原のプロセシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）および掲示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）が容易に起こるようにする目的で繰り返し配列の間にスペーサーであるアミノ酸を組み込むことも可能である。本分野の技術者は化学合成を用いた常規実験を適用することを通してそのようなポリペプチドを生じさせることができるであろう。以下に示す例示セクションに詳述するように、以下に挙げるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示すアミノ酸配列を伴うポリペプチド抗原を用いて、セリン１５の所がリン酸化を受けているｐ５３を認識するポリクローナル抗体を生じさせることができる。ｐ５３が有する他の天然セリンのリン酸化部位に相当する数種のホスホペプチドを用いて成功裏にホスホ特異的抗体を生じさせた［Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）］。例示セクションに示す実験は、またＦ₂Ｐａｂが天然ホスホセリンの代わりに組み込まれているポリペプチド抗原を本発明の方法で用いることでもホスホ特異的抗原を生じさせることができることを示している。そのようなポリペプチド抗原を以下に挙げ、これらをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−１０で示す。
【００１０】
【表１】

【００１１】
このような擬態含有ポリペプチドにさらなる修飾を受けさせることで天然の産物により類似させるか或は別法として抗原性を助長することも可能である。そのような修飾には、これらに限定するものでないが、酵素による修飾、化学的保護または脱保護、変性および化学結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）が含まれる。好適な態様では、前記ポリペプチドを担体蛋白質であるキーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンに結合させる。他の担体蛋白質を置換で用いることも可能であり、そのような担体蛋白質には、例えばウシの血清アルブミン、オボアルブミンおよびツベルクリンの精製蛋白誘導体が含まれる。化学結合は例えば二官能反応体などを用いて達成可能である。
【００１２】
前記ポリペプチド抗原を生じさせて、それに適切な修飾を受けさせた後、これを用いて、これをある動物に免疫応答を引き出すような条件下で接種する。この免疫応答の産物を単離して、燐蛋白質にしかないもの以外の抗原決定基に交差反応を示す成分に関して選別する。このような成分を単離して、これを前記ポリペプチド抗原配列の元の蛋白質の特別なリン酸化状態を識別する反応体として用いる。
【００１３】
そのような免疫学的反応体を生じさせる時に用いる動物の免疫化を一般的には一連の好機接種（ｆｉｍｅｄ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ）として実施する。好適な態様では、天然のホスホペプチド複合体を１回以上の最終的接種（増強）で用いる。この段階は、リン酸化されていないペプチドに反応性を示す抗体の合成を過度に刺激（脱リン酸化を受けたペプチドが抗体合成を刺激する結果としてもたらされる）することなく最も有用な抗体を産出するＢ細胞の数を多くすることを意図した段階である。このような増強を通常技術に従って実施し、そして実験でそれを更に最適にすることができる。
【００１４】
本発明の１つの面は、ポリペプチドの中に組み込んでおいたホスホペプチド擬態を抗原として用いて前以て決めておいたアミノ酸残基の所がリン酸化を受けている蛋白質もしくはポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を生じさせて単離する方法である。通常の技術（例えば、Ｈａｒｌｏｗ および Ｌａｎｅ（Ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）参照））を用い、この上に記述した如く調製した免疫原を用いてある動物に免疫性を与えることを通して、ポリクローナル抗体を調製する。簡単に述べると、そのようにして免疫性を与えた動物を前記免疫原に反応性を示す抗体が産出される条件下に維持する。所望の抗体滴定量に到達した時点で前記動物から血液を集める。当該抗体を含有する血清を他の血液成分から分離する。別法として、前記免疫性を与えた動物から抗体含有腹水液を誘発させて単離する。場合により、そのようなポリクローナル抗体を含有する血清または腹水液を個々の種類の抗体（例えばＩｇＧまたはＩｇＭ）が入っている画分に更に分離することも可能である。
【００１５】
用いるペプチド抗原はリン酸化されている蛋白質およびリン酸化されていない蛋白質の両方に共通した抗原決定基を含有することから、本方法で生じさせた血清は、通常は、燐蛋白質に特異的に結合する抗体の集合を含有することに加えてまたリン酸化状態に依存しないで結合する抗体の集合も含有する。通常技術（Ｃｚｅｒｎｉｋ 他．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０１：２６４−２８３（１９９１））を用いて、そのような望まれない結合活性を抗血清から排出させるか或は除去してもよい。必要ならば、抗原決定基を用いたアフィニティー（ａｆｆｉｎｉｔｙ）精製（例えばアフィニティークロマトグラフィーによる）で前記血清から単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を精製してもよいか、或は逆に、他の抗体活性の全部を前記血清から除去してもよい。
【００１６】
本発明の別の面は、ポリペプチドの中に組み込んでおいたホスホペプチド擬態を抗原として用いて前以て決めておいた燐蛋白質エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を生じさせて単離する方法である。この上に記述した抗原を通常技術［例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編集）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））を参照］で用いて、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生じさせる。好適な態様では、ａ）抗体を分泌しないマウスミエローマまたはハイブリドーマとｂ）抗体を分泌するマウス脾臓細胞を融合させることで生じさせたマウスハイブリドーマ（擬態含有ポリペプチド抗原を用いて免疫性を与えたマウスから得た）を用いてホスホ特異的モノクローナル抗体を生じさせる。
【００１７】
典型的には、数匹のマウスに抗原の１回目の注射を受けさせた後に数回の追加免疫注射を受けさせることを通してそれらに免疫性を与えた。この免疫手順中または手順後に、前記マウスから採取した血清にスクリーニングを受けさせることで実質的な免疫応答を開始したマウスを識別した。選択したマウスの脾臓細胞を得て融合（ｆｕｓｉｏｎｓ）を実施する。適切な融合技術には、例えばＳｅｎｄａｉのウイルス技術（Ｋｏｈｌｅｒ および Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）またはポリエチレングリコール方法（Ｋｅｎｎｅｔ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ−Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｋｅｎｎｅｔ，Ｍｃｋｅｒｎ および Ｂｅｃｈｔｏｌ編集，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８０））が含まれる。
【００１８】
次に、結果として生じたハイブリドーマを前記抗原に特異的な抗体の産生に関して選別する。数種のアッセイを用いて選別を行うことができ、ホスホ擬態ポリペプチド抗原または天然にリン酸化を受けたポリペプチド抗原を用いて前記アッセイを行うことができる。適切な選別技術は固相ラジオイムノアッセイである。適切な抗原を不溶なマトリックスに結合させることを通して固相を調製する。免疫吸着剤をハイブリドーマの培養上澄み液に接触させる。インキュベーションをある期間行った後、固相を上澄み液から分離し、次に、それを、マウス免疫グロブリンに対する標識を付けておいた抗体に接触させる。標識が前記免疫吸着剤と結合することは抗原に反応し得るハイブリドーマ産物が存在することを示している。
【００１９】
抗体を産生するハイブリドーマをマウスの腹腔内に注射して妥当な時間が経過した後に前記マウスから腹水液を収穫することを通して、モノクローナル抗体を多量に生産することができる。次に、このモノクローナル抗体を前記液から単離する。別法として、前記ハイブリドーマをインビトロで培養しそして分泌されたモノクローナル抗体を培地から直接単離することで抗体を生産することも可能である。
【００２０】
この上に記述した本発明の方法を用いて、既知であるか或は疑わしい蛋白質リン酸化状態に特異的な免疫学的反応体を生じさせることができる。当該抗体が既知リン酸化状態に特異的な時には、この抗体をいろいろな条件下で用いて蛋白質のリン酸化を緊密に監視することができる（例えば細胞サイクル、ホルモン刺激またはストレス）。別法として、天然に存在する疑わしいリン酸化状態に対するホスホ特異的抗体を生じさせる。このような免疫学的反応体を用いて疑わしいリン酸化状態が生理学的に存在することを立証または排除することができる。
【００２１】
以下に示す例示セクションに示す結果は、この上に記述した本発明の方法を用いると結果として、また、隣接するアミノ酸配列から独立して特別なホスホ残基（ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｉｄｕｅ）に結合する抗体の単離を行うことも可能であることを示している。そのような抗体が産生される時、モノクローナルまたはポリクローナルいずれかの抗体として生じる。このような抗体は、隣接するアミノ酸配列から大きく独立して、特別なホスホ残基に対して結合を示す。このような抗体を識別することは可能であり、そして必要ならば、それらが初期の抗原に関係のないポリペプチド配列のホスホ残基に結合する能力を用いて、それらの精製を行うことができる。このような抗体は価値ある研究道具を提供するものである。このような抗体の１つの使用は免疫を基にしたキナーゼアッセイにおける使用であり、これは幅広い範囲の蛋白質に適用可能である。
【００２２】
単に常規実験を適用することを通して本発明の教示をこの上に記述した系以外の系が産生するホスホ特異的抗体の単離に適用することも可能であることを本分野の技術者は認識するであろう。そのような１つの例は、擬態含有抗原を用いて結合活性を示す抗体の組み合わせライブラリーを選別する例である。本開示にそのような用途および関連した用途を包含させることを意図する。
【００２３】
例示
ポリクローナル抗体の生成
高度免疫血清を一連のポリペプチド結合カラムに通すことで前記血清からセリン１５の所がリン酸化を受けているｐ５３に特異的な抗体をアフィニティー精製した。前記血清を最初にｐ５３の残基１１−２２のポリペプチド（セリン１５の所がリン酸化を受けている）を入れておいたカラムに通すことでｐ５３に特異的な抗体を豊富にした。結合した抗体を溶離させた後、リン酸化を受けていないｐ５３ポリペプチドを入れておいたカラムに通すことで、ホスホセリンに特異的でない抗体を取り除いた。このフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を保持して特徴付けた。
【００２４】
結果として得た抗血清の結合特異性をポリペプチドｐ５３（１−３９）、ｐ５３（１−３９）１５Ｐおよびｐ５３（２５−６３）３７Ｐを用いた酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。両方のリン酸化ポリペプチドに対する特異的な結合を１：３２０未満の抗体希釈度で検出し（図３）たが、全ての濃度でｐ５３（１−３９）１５Ｐに対する結合の方が多かった。リン酸化を受けていないポリペプチドに対する結合は全ての濃度で有意でなかった。前記抗血清がｐ５３（２５−６３）３７Ｐポリペプチドに交差反応性を示すことで非特異的ホスホセリン抗体が存在することが示された。
【００２５】
このような非特異的ホスホセリン抗体を前記抗血清から除去する目的で、この抗血清をｐ５３（Ａｃ−３２−４３（３７Ｐ）Ｃｙｓ）のカラムに通した。結果として結合しなかったフロースルーにこの上に示した試験と同様な試験を受けさせることで、これはセリン１５の所がリン酸化を受けているｐ５３に非常に特異的であることを確認した（図４）。蛋白質キナーゼＤＮＡ−ＰＫを用いてセリン１５の所に酵素によるリン酸化を受けさせておいたｐ５３およびリン酸化を受けていないｐ５３を用いたイムノブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）分析を用いて、ｐ５３のセリン１５に関する反応性および特異性を立証した。
【００２６】
天然にリン酸化を受けたポリペプチドを特異的に認識する抗体がホスホセリンの代替であるＦ₂Ｐａｂを伴うペプチド抗原から生じることは、Ｆ₂Ｐａｂがこれを抗原として用いた時に有効なホスホセリン擬態として機能することを立証している。重要なことは、そのような結果は、また、特異的抗体の産生において、前記Ｆ₂Ｐａｂを組み込んでおいたペプチドを抗原として用いた時にこれがＢリンパ球の誘発のために要求される必要な抗原プロセシングおよび掲示を行うことも示している。この上に示した結果は、抗原に組み込んでおいたＦ₂Ｐａｂを用いてあるペプチド内の特別なリン酸化部位を特異的に認識する抗体およびまた一般的にホスホセリンをより幅広く認識する抗体を生じさせることができることを示している。
【００２７】
ここに記述したＦ₂Ｐａｂ擬態を用いてホスホセリンに特異的なポリクローナル抗体を成功裏に生じさせることができたことは、他の様式の標準的な方法を用いることでもまたＦ₂Ｐａｂを含有させたポリペプチドを用いてマウスまたは他の動物に免疫性を与えることができ、その結果としてＢリンパ球の刺激およびクローン増殖（ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を生じさせることができることで、天然にリン酸化を受けた残基、ポリペプチドまたは蛋白質に特異的な抗体を生じさせることができるであろうことを示している。そのようなＢリンパ球を単離してハイブリドーマの生成で用いることで燐蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を生じさせることができる。
【００２８】
発明の方法
免疫血清の生成
抗原として用いたポリペプチドをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示す。このポリペプチドは１５個の残基で構成されていて、その配列はｐ５３のアミノ酸残基１３−１９の７アミノ酸配列に相当し、この配列が２回繰り返して存在し、セリン１５の代わりにホスホセリン擬態であるＦ₂Ｐａｂを含有しており、このポリペプチドは、前記ｐ５３のアミノ酸配列に加えて追加的にカルボキシ末端のシステイン残基を有する。このポリペプチドの化学的合成を、ｔ−Ｂｏｃ化学を用い、Ｂｏｃ−Ｆ₂Ｐａｂ（Ｅｔ２）−ＯＨをｔ−Ｂｏｃ化学を用いた手操作で結合させる以外はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成装置を製造業者の推奨に従って用いて行った。このペプチド鎖の組み立てを標準的方法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇ．Ｇｒａｎｔ（編集），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））で行った。２段階脱保護方法（Ｏｔａｋａ 他．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：９２７−９３０（１９９５））を用いて、前記ペプチドを樹脂から開裂させた後に側鎖保護基の除去を実施した。Ｖｙｄａｃ Ｃ−８カラムを用いた高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルを用いることで前記ペプチドを精製した。
【００２９】
このポリペプチドをキーホールリンペットホモシアニン（ＫＬＨ）にカルボキシ末端のシステイン残基を通して結合させた。結果として得たＫＬＨ−Ｆ₂Ｐａｂ−ペプチド接合体を用いて標準的な手順でラビットに免疫性を与えた。簡単に述べると、アジュバントと混合しておいた前記ペプチド接合体をラビットに０日目、７日目および１４日目に５００μｇづつ皮下注射した。１回目の注射で完全フロイントアジュバントを用いそして追加的注射では不完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ）アジュバントを用いた。２１日目に血液を集めた。２１日後では免疫化と血液採取を５週間に渡って週毎に繰り返した。
【００３０】
アフィニティークロマトグラフィー用ポリペプチドの生成
ヒトｐ５３配列の残基１１から２２に相当する１３アミノ酸で構成されていて追加的にカルボキシ末端のシステイン残基を有するポリペプチドを、リン酸化を受けていないポリペプチド：（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２Ｃｙｓ））としてか或はセリン１５の所がリン酸化を受けているポリペプチド：（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２（１５Ｐ）Ｃｙｓ））として、標準的な方法で化学的に合成した。ヒトｐ５３配列の残基３２から４３に相当していてカルボキシ末端のセリン残基が付加しているポリペプチドをセリン３７の所がリン酸化を受けているポリペプチド：（ｐ５３（Ａｃ−３２−４３（３７Ｐ）Ｃｙｓ））として合成した。
【００３１】
ペプチドの合成を、Ａｌｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成装置（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたＦｍｏｃ化学（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇ．Ｇｒａｎｔ（編集），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））による固相方法で行った。ホスホセリン残基をＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚＩ）ＯＨ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｗａｋａｍｉｙａ 他．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：１０９９−１１０２（１９９４））として組み込んだ。試薬Ｋ（ＴＦＡ：フェノール：チオアニソール：Ｈ₂Ｏ：ＥＤＴ＝８２．５：５：５：５：２．５）を室温で３時間用いることで、前記ペプチドを前記樹脂から開裂させた後に側鎖保護基の除去を実施した（Ｋｉｎｇ 他．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３６：２５５−２６６（１９９０））このペプチドの精製をＶｙｄａｃ Ｃ−８カラム（Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を用いたＨＰＬＣ（０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルを使用）またはｐＨに安定なＶｙｄａｃ Ｃ−８カラム（Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を用いたＨＰＬＣ（０．２％ヘキサフルオロアセトン−ＮＨ₄ＯＨ、ｐＨ７．０／アセトニトリルを使用）（１−３９ペプチドの場合）を用いて行った。Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ ＳＳＱ ７０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いたエレクトロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）イオン化質量分光測定で前記ペプチドの質量を実証した。
【００３２】
ポリペプチド結合カラムの生成
ポリペプチド（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２Ｃｙｓ），（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２（１５Ｐ）Ｃｙｓ）），および（ｐ５３（Ａｃ−３２−４３（３７Ｐ）Ｃｙｓ））をＳｕｌｆｏｌｉｎｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に製造業者が提供した指示に従って結合させた。結果として得たＳｕｌｆｏｌｉｎｋ複合体を用いて３本のカラムを生じさせたが、それらの各々にポリペプチド−Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ複合体の中の１つを充填した。
【００３３】
アフィニティー精製
高度免疫ラビット血清を一連のペプチド結合カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけることで、セリン１５の所がリン酸化を受けているｐ５３に特異的な抗体を精製した。前記血清を最初に（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２（１５Ｐ）Ｃｙｓ））カラムに通した。洗浄後、吸着された抗体をＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＩｇＧ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で溶離させた後、直ちに１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．５）を添加することで中和した。溶離液を（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２Ｃｙｓ））カラムに通すことで、リン酸化を受けていないｐ５３に結合した抗体を除去した。結合しなかったフロースルーを集めた後、（ｐ５３ Ａｃ−３２−４３）（３７Ｐ）Ｃｙｓ）カラムに通すことで、ポリペプチド内に位置する場所に関係なくホスホセリンに結合する抗体をそれから除去した。
【００３４】
抗体分析
アフィニティー精製を受けさせた抗体調合物の特徴づけを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ そして Ｅｎｇｖａｌｌ 他．，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８：８７１−８７５（１９７１）に記述されている如きＥＬＩＳＡアッセイにより、ポリペプチドｐ５３（１−３９），ｐ５３（１−３９）１５Ｐ，またはｐ５３（１−３９）３７Ｐに対する結合に関して行った。この示したポリペプチドを炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６（１リットル当たりＮａ₂ＣＯ₃が１．５９ｇでＮａＨＣＯ₃が２．９３ｇで、ｐＨをＨＣｌで調整しておいた）で１μｇ／ｍｌになるように希釈することで、プレートを前記ポリペプチドで覆った後、５０または１００ｎｇ（５０または１００μｌ）を４℃で一晩または室温で約３時間インキュベートした。次に、前記ペプチド溶液を除去した後、プレートをＰＢＳ中１％のＢＳＡと一緒にして室温で１時間インキュベートすることで、阻止を行った（ｂｌｏｃｋｅｄ）。ポリペプチドで覆ったウエルを１／１０から１／１０００の範囲の抗体希釈度でインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ラビットＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートした後にＨＲＰ基質ＡＢＴＳ［２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加することで、結合した抗体を検出した。前記ＡＢＴＳがＨＲＰで酸化されると緑色の産物が生じ、これを用いて抗体の存在を識別した。前記ポリペプチドで覆ったプレートに結合したラビットＩｇＧの量を、この混合物の光学密度を４０５ｎｍの所で測定（ＯＤ₄₀₅）することで決定した。結果を個別のＥＬＩＳＡアッセイおよびスポットブロット（「ウエスタン」ブロット）で立証した。
【００３５】
前記ＥＬＩＳＡ分析で用いたポリペプチドはこの上に記述した如きＦｍｏｃ化学で合成したポリペプチドであった。フラグメント縮合方法（Ｓａｋａｍｏｔｏ 他．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４８：４２９−４４２（１９９６））を用いて、より長いペプチドを合成した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１に、ホスホセリンの類似物およびホスホトレオニンの類似物を示す。
【図２】 図２に、ホスホチロシンの類似物を示す。
【図３】 図３は、リン酸化を受けていないペプチドと交差反応する抗体を除去する目的で（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２）Ｃｙｓ）カラムに通した後にアフィニティー精製を受けさせたｐＡｂＦ１５抗体を用いたＥＬＩＳＡで得たデータの図式図である。
【図４】 図４は、セリン３７の所がリン酸化を受けているｐ５３と交差反応する抗体を除去する目的で（ｐ５３（Ａｃ−３２−４３）（３７Ｐ）Ｃｙｓ）カラムに通した後にアフィニティー精製を受けさせたｐＡｂＦ１５抗体を用いたＥＬＩＳＡで得たデータの図式図である。

Claims (24)

1. 特定のアミノ酸残基の所がリン酸化を受けているポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を単離する方法であって、
   ａ）前記特定のアミノ酸残基の擬態を含んで成る合成ポリペプチドを準備し、ここで該擬態はホスフェート部分が非加水分解性である結合を介して結合したアミノ酸構造を含み、この合成ポリペプチドを生理学的に受け入れられる担体に入れて調合し、
   ｂ）段階ａ）の前記合成ポリペプチドを用いて動物（ヒトを除く）に免疫性を与え、
   ｃ）段階ｂ）で免疫性を与えた動物（ヒトを除く）から血清または腹水液を集めて調製し、
   ｄ）前記リン酸化ポリペプチドに特異的な抗体の存在に関して選別を行い、そして
   ｅ）必要ならば、前記リン酸化ポリペプチドに特異的な抗体を通常方法で更に豊富にする、
   ことを含んで成る方法。
2. 適切なアミノ酸配列で構成されている天然のホスホペプチド複合体を追加免疫剤として用いて前記動物（ヒトを除く）にさらなる免疫性を与える請求項１記載の方法。
3. 段階ａ）の合成ポリペプチドに修飾を段階ｂ）の免疫化に先立って受けさせる請求項１記載の方法。
4. 前記修飾を前記合成ポリペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよびツベルクリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）から成る群から選択される担体蛋白質に任意の二官能反応体を用いて結合させることを通して行う請求項３記載の方法。
5. 前記擬態が炭素原子からホスフェート基に至る所に非加水分解性結合を含有する請求項１記載の方法。
6. 前記非加水分解性結合がＣＦ_２基を含んで成る請求項５記載の方法。
7. Ｌ−２−アミノ−４−（ジエチルホスホノ）−４，４−ジフルオロブタン酸がホスホセリンの擬態である請求項６記載の方法。
8. Ｌ−２−アミノ−４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニンがホスホチロシンの擬態である請求項６記載の方法。
9. Ｌ−２−アミノ−４−ホスホノ−４，４−ジフルオロ−３−メチルブタン酸がホスホトレオニンの擬態である請求項６記載の方法。
10. 段階ａ）の合成ポリペプチドがｐ５３のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する請求項１記載の方法。
11. 前記合成ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記した通りである請求項１０記載の方法。
12. 前記合成ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３、４、５、６、７、８、９および１０から成る群から選択される請求項１０記載の方法。
13. 特定のアミノ酸残基の所がリン酸化を受けているポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を単離する方法であって、
    ａ）前記特定のアミノ酸残基の擬態を含んで成る合成ポリペプチドを準備し、ここで該擬態はホスフェート部分が非加水分解性である結合を介して結合したアミノ酸構造を含み、この合成ポリペプチドを生理学的に受け入れられる担体に入れて調合し、
    ｂ）段階ａ）の前記合成ポリペプチドを用いて動物（ヒトを除く）に免疫性を与え、
    ｃ）段階ｂ）の動物（ヒトを除く）からＢ細胞を集め、
    ｄ）段階ｃ）の前記Ｂ細胞をミエローマ細胞に融合させることでハイブリドーマを生じさせ、
    ｅ）段階ｄ）のハイブリドーマをリン酸化ポリペプチドに特異的な抗体の産生に関して選別し、そして
    ｆ）段階ｅ）で同定したハイブリドーマを単離して増殖させ、
    ｇ）段階ｆ）で単離したハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を単離する、
    ことを含んで成る方法。
14. 適切なアミノ酸配列で構成されている天然のホスホペプチド複合体を追加免疫剤として用いて前記動物（ヒトを除く）にさらなる免疫性を与える請求項１３記載の方法。
15. 段階ａ）の合成ポリペプチドに修飾を段階ｂ）の免疫化に先立って受けさせる請求項１３記載の方法。
16. 前記修飾を前記合成ポリペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよびツベルクリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）から成る群から選択される担体蛋白質に任意の二官能反応体を用いて結合させることを通して行う請求項１５記載の方法。
17. 前記擬態が炭素原子からホスフェート基に至る所に非加水分解性結合を含有する請求項１３記載の方法。
18. 前記非加水分解性結合がＣＦ_２基を含んで成る請求項１７記載の方法。
19. Ｌ−２−アミノ−４−（ジエチルホスホノ）−４，４−ジフルオロブタン酸がホスホセリンの擬態である請求項１８記載の方法。
20. Ｌ−２−アミノ−４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニンがホスホチロシンの擬態である請求項１８記載の方法。
21. Ｌ−２−アミノ−４−ホスホノ−４，４−ジフルオロ−３−メチルブタン酸がホスホトレオニンの擬態である請求項１８記載の方法。
22. 段階ａ）の合成ポリペプチドがｐ５３のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する請求項１３記載の方法。
23. 前記合成ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に明記した通りである請求項２２記載の方法。
24. 前記合成ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３、４、５、６、７、８、９および１０から成る群から選択される請求項２２記載の方法。

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