JP2003517451A

JP2003517451A - リン酸化部位に特異的な免疫学的反応体を生じさせる方法

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Publication number: JP2003517451A
Application number: JP2000594838A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン，カール・ダブリユー; アペラ，エツトレ; サカグチ，カズヤス
Original assignee: ブルツクヘブン・サイエンス・アソシエイツ・エルエルシー
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2003-05-27
Anticipated expiration: 2020-01-25
Also published as: HUP0105309A2; NO20013636L; DE60027542D1; EP1147137B9; ATE324382T1; EP1147137B1; US6309863B1; EP1147137A4; JP3891542B2; AU3582800A; NO20013636D0; CA2360511C; AU767969B2; NZ512868A; UA73109C2; EP1147137A1; HUP0105309A3; BR0008977A; IL144471A0; CA2360511A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、リン酸化部位に特異的な免疫学的反応体を生じさせる方法を提供する。より具体的には、リン酸化を受けたアミノ酸の代わりにホスホペプチド擬態をポリペプチドの中に組み込む。このポリペプチドを標準的な方法で抗原として用いることで天然にリン酸化を受けたポリペプチドと交差反応するモノクローナルもしくはポリクローナルいずれかの抗体を生じさせる。このホスホペプチド擬態は、好適には、加水分解を起こさない結合をアミノ酸の適切な炭素原子からホスフェート基に至る部分に含む。好適な結合はＣＦ₂基である。このような結合を用いてホスホセリンの擬態であるＦ₂Ｐａｂを生じさせて、これをｐ５３から誘導したポリペプチド配列の中に組み込むことで、ｐ５３の特定リン酸化状態を認識する抗体を生じさせる。ＣＦ₂基結合を用いて、また、ホスホトレオニンの擬態であるＦ₂Ｐｍｂも作成しかつホスホチロシンの擬態であるＦ₂Ｐｍｐも作成して、それらの抗体も生じさせる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

蛋白質のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）は幅広く多様な細胞過
程（ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の調節にとって重要である。セリ
ン、トレオニンおよびチロシン残基のリン酸化による蛋白質活性の調節が高度に
利用されている。また、蛋白質のヒスチジン、アルギニンおよびリジン残基も細
胞過程でリン酸化を受けるが、そのような非常に不安定な修飾を研究するのは困
難なことからその重要性は未知である。蛋白質のリン酸化状態の変化を検出して
量化することはそれの機能的重要性の研究において大きな有用性を有する。

【０００２】蛋白質のリン酸化状態を測定する標準的な方法は、典型的に、付加させるホス
フェート部分に燐の放射性同位体（ホスフェートとして）を組み込んでおくこと
でその部分に前以て標識を付けておくことを伴う。そのようなリン酸化アッセイ
はいくつかの方法論的落とし穴に苦しんでおり、そのような落とし穴には、予め
標識を付けておく実験で［³²Ｐ］Ｐｉを多い量で用いる必要があることに関連し
た健康の危険および処分問題、規定（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）物質を用いた作業の
煩わしさ、そしてリン酸化を受けた部位が１つの蛋白質またはペプチド部分に数
箇所存在する場合の部位特異性が不足していることが含まれる。このような欠点
が存在する結果として、蛋白質のリン酸化状態を検出しようとする場合に免疫化
学を基にした方法が普及してきている。免疫化学方法を用いた時に達成され得る
感度および選択率が理由で、このような方法は魅力的な代替法である（Ｍａｔｓ
ｕｉ他．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４０：６４７−６５７（１９９８）；Ｃ
ｏｎｒａｄ他．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１６：１６７−１７３（１９９７））
。

【０００３】多様な細胞骨格蛋白質に特異的なリン酸化状態依存モノクローナル抗体が作り
出されて特徴づけされた。このような抗体の単離は、リン酸化エピトープの特異
的標的が主な目的ではない免疫プロトコルを用いて行われた。より最近になって
、リン酸化部位上のエピトープを標的にする抗体が産出される機会を向上させる
目的で小型の合成ホスホポリペプチドが用いられた（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他．
，ＧｅｎｅｓおよびＤｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；Ｍａ
ｔｓｕｉ他．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏ．１４０：６４７−６５７（１９９８）
；Ｃｈｅｎ他．，ＦＡＳＥＢＪ．２：Ａ５５０（１９８８）；Ｃｚｅｒｎｉ
ｋ他．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２０１：２６４−２
８３（１９９１））。このような方法は、より直接的ではあるが、それでもまだ
、免疫時にポリペプチド抗原が急速に脱リン酸化を起こすことでホスホ特異的抗
体の滴定量が少なくなると言った制限に苦しんでいる。このことは、特に、ホス
ホセリンおよびホスホトレオニン（これらは両方とも一般にホスホチロシンより
もかなり不安定である）を含有する抗原を用いた時に問題になる。

【０００４】（発明の要約）本発明は、特定のアミノ酸の所がリン酸化を受けているポリペプチドに特異的
に反応する抗体を生じさせる方法を提供する。モノクローナルおよびポリクロー
ナル両方の抗体を生じさせる方法を提供する。本方法は、リン酸化アミノ酸残基
の擬態（ｍｉｍｅｔｉｃ）を組み込んでおいたポリペプチドを提供することを伴
う。この擬態に天然にリン酸化を受けたアミノ酸にも存在する抗原決定基を持た
せる。このポリペプチド抗原を標準的な方法で用いて天然のリン酸化ポリペプチ
ドと交差反応して前記ポリペプチドの特異的リン酸化状態を特異的に認識するモ
ノクローナルもしくはポリクローナルいずれかの抗体を生じさせる。

【０００５】１つの態様において、前記擬態は非加水分解性結合を含有し、この結合を炭素
原子と燐原子（ホスフェート基が有する）の間に存在させる。好適な態様におけ
る前記結合はＣＦ₂基である。このような結合基をホスホセリンに組み込むこと
で擬態Ｆ₂Ｐａｂを生じさせる。ｐ５３から誘導されるポリペプチド配列に存在
するホスホセリンの代わりにＦ₂Ｐａｂを用いることで、ｐ５３の特異的リン酸
化状態を認識する抗体を生じさせる。別の態様では、ＣＦ₂結合基をホスホトレ
オニンに組み込むことで擬態Ｆ₂Ｐｍｂを生じさせる。別の態様では、ＣＦ₂結合
をホスホチロシンに組み込むことで擬態Ｆ₂Ｐｍｐを生じさせる。

【０００６】（発明の詳細な記述）本発明は、ある程度ではあるが、以前にホスファターゼ阻害剤として用いたホ
スホペプチド擬態（Ｂｕｒｋｅ他．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１２９−１３４（１９９４）；Ｃｈｅｎ他．，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１６：９７６−９８
４）が抗原性を示すことを見いだしたことを基にしている。より具体的には、あ
る擬態をポリペプチドに組み込んだ後、それを用いて、ある動物が免疫応答を示
すようにする目的でそれを接種し、少なくともある程度ではあるが、前記擬態に
存在する抗原決定基に対する抗体を引き出させる。本発明は、また、前記擬態に
対して生じさせた抗体が天然のホスホペプチドと交差反応することを見いだした
ことも基にしている。このような交差反応性は、擬態が天然のホスホペプチドの
抗原決定基に非常に類似した抗原決定基を有することを示している［それが同じ
隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）アミノ酸の前後関係（ｃｏｎｔｅｘｔ）で存在す
る場合］。そのような擬態ペプチド（ｍｉｍｅｔｉｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ）に対し
て生じさせた抗体は、天然のリン酸化ポリペプチドに対して、抗原性アミノ酸配
列の元の燐蛋白質を免疫診断で同定する時の道具として働くに充分な結合活性お
よび特異性を示す。このような見いだした事が基になって、前以て決めておいた
蛋白質の特別なリン酸化状態を識別する免疫学的反応体を生じさせて単離する方
法を提供する本発明がもたらされた。

【０００７】本発明で用いるに適したホスホペプチド擬態の化学構造は、これを似させる天
然のリン酸化残基に非常に類似していなければならずかつまた化学的に安定でな
ければならない（例えばホスファターゼによる脱リン酸化に対して耐性を示す必
要がある）。これを、天然に存在する酸素橋渡しの代わりに非加水分解性結合が
ホスフェート部分に結合しているアミノ酸原子構造を含んで成る合成分子を用い
て達成する。好適な態様では、ＣＦ₂基でアミノ酸とホスフェートを連結させる
。自然にリン酸化を受ける数種のアミノ酸の擬態をそのようなアプローチで生じ
させることができる。適切な炭素からホスフェート部分に至る所にＣＦ₂結合を
位置させることでホスホセリン、ホスホトレオニンおよびホスホチロシンの擬態
を生じさせる。好適な態様では、抗原性ポリペプチドに存在するホスホセリンの
代わりに擬態分子であるＬ−２−アミノ−４−（ジエチルホスホノ）−４，４−
ジフルオロブタン酸（Ｆ₂Ｐａｂ）［Ｏｔａｋａ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ３６：９２７−９３０（１９９５）］を用い、ホスホトレオニ
ンの代わりにＬ−２−アミノ−４−ホスホノ−４，４−ジフルオロ−３−メチル
ブタン酸（Ｆ₂Ｐｍｂ）を用い、そしてホスホチロシンの代わりにＬ−２−アミ
ノ−４−ホスホノ（ジフルオロメチル）フェニルアラニン（Ｆ₂Ｐｍｐ）［Ａｋ
ａｍａｔｓｕ他、Ｂｉｏｏｒｇ＆ＭｅｄＣｈｅｍ．５：１５７−１６３（
１９９７）］を用いる（図１および図２）。代替態様では、天然のアミノ酸が有
する酸素橋渡しをメチレン基に置き換える（図１および図２）。

【０００８】Ｆ₂Ｐａｂの合成はＯｔａｋａ他、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３
６：９２７−９３０（１９９５）に記述されている。Ｆ₂Ｐｍｐの合成はＳｍｙ
ｔｈ他、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３５：５５１（１９９４）およ
びＡｋａｍａｔｓｕ他、Ｂｉｏｏｒｇ＆ＭｅｄＣｈｅｍ．５：１５７−１
６３（１９９７）に記述されている。Ｆ₂Ｐｍｂの合成を、追加的メチル基を１
つ持たせたバックボーン前駆体を用いてＦ₂Ｐａｂ合成に類似した方法で達成す
る。

【０００９】前以て決めておいた燐蛋白質に特異的な免疫学的反応体を生じさせる時、適切
な擬態をリン酸化残基を取り巻いている配列に相当する合成ペプチドに組み込む
。この組み込み方法は公知であるか或は他の様式で本分野の技術者に利用可能で
ある。ホスホ特異的抗体を生じさせる時に必要な配列の長さは、この試験で用い
る個々の燐蛋白質に依存し得る。必要な特異性を生じさせるには一般にホスホ残
基に隣接する３または４個の残基に相当する配列を存在させることで充分である
。１つの態様におけるポリペプチド抗原は、そのような配列に適切な擬態が組み
込まれている縦列繰り返し（ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ）を含んで成る。抗原
のプロセシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）および掲示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）が容易に起こるようにする目的で繰り返し配列の間にスペーサーであるアミ
ノ酸を組み込むことも可能である。本分野の技術者は化学合成を用いた常規実験
を適用することを通してそのようなポリペプチドを生じさせることができるであ
ろう。以下に示す例示セクションに詳述するように、以下に挙げるＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１で示すアミノ酸配列を伴うポリペプチド抗原を用いて、セリン１５の
所がリン酸化を受けているｐ５３を認識するポリクローナル抗体を生じさせるこ
とができる。ｐ５３が有する他の天然セリンのリン酸化部位に相当する数種のホ
スホペプチドを用いて成功裏にホスホ特異的抗体を生じさせた［Ｓａｋａｇｕｃ
ｈｉ他、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）
］。例示セクションに示す実験は、またＦ₂Ｐａｂが天然ホスホセリンの代わり
に組み込まれているポリペプチド抗原を本発明の方法で用いることでもホスホ特
異的抗原を生じさせることができることを示している。そのようなポリペプチド
抗原を以下に挙げ、これらをＳＥＱＩＤＮＯ：２−１０で示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】このような擬態含有ポリペプチドにさらなる修飾を受けさせることで天然の産
物により類似させるか或は別法として抗原性を助長することも可能である。その
ような修飾には、これらに限定するものでないが、酵素による修飾、化学的保護
または脱保護、変性および化学結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）が含まれる。好適な態
様では、前記ポリペプチドを担体蛋白質であるキーホールリンペット（ｋｅｙｈ
ｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンに結合させる。他の担体蛋白質を置換で用
いることも可能であり、そのような担体蛋白質には、例えばウシの血清アルブミ
ン、オボアルブミンおよびツベルクリンの精製蛋白誘導体が含まれる。化学結合
は例えば二官能反応体などを用いて達成可能である。

【００１２】前記ポリペプチド抗原を生じさせて、それに適切な修飾を受けさせた後、これ
を用いて、これをある動物に免疫応答を引き出すような条件下で接種する。この
免疫応答の産物を単離して、燐蛋白質にしかないもの以外の抗原決定基に交差反
応を示す成分に関して選別する。このような成分を単離して、これを前記ポリペ
プチド抗原配列の元の蛋白質の特別なリン酸化状態を識別する反応体として用い
る。

【００１３】そのような免疫学的反応体を生じさせる時に用いる動物の免疫化を一般的には
一連の好機接種（ｆｉｍｅｄｓｅｒｉｅｓｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ
）として実施する。好適な態様では、天然のホスホペプチド複合体を１回以上の
最終的接種（増強）で用いる。この段階は、リン酸化されていないペプチドに反
応性を示す抗体の合成を過度に刺激（脱リン酸化を受けたペプチドが抗体合成を
刺激する結果としてもたらされる）することなく最も有用な抗体を産出するＢ細
胞の数を多くすることを意図した段階である。このような増強を通常技術に従っ
て実施し、そして実験でそれを更に最適にすることができる。

【００１４】本発明の１つの面は、ポリペプチドの中に組み込んでおいたホスホペプチド擬
態を抗原として用いて前以て決めておいたアミノ酸残基の所がリン酸化を受けて
いる蛋白質もしくはポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を生じ
させて単離する方法である。通常の技術（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａ
ｎｅ（Ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）参照））を
用い、この上に記述した如く調製した免疫原を用いてある動物に免疫性を与える
ことを通して、ポリクローナル抗体を調製する。簡単に述べると、そのようにし
て免疫性を与えた動物を前記免疫原に反応性を示す抗体が産出される条件下に維
持する。所望の抗体滴定量に到達した時点で前記動物から血液を集める。当該抗
体を含有する血清を他の血液成分から分離する。別法として、前記免疫性を与え
た動物から抗体含有腹水液を誘発させて単離する。場合により、そのようなポリ
クローナル抗体を含有する血清または腹水液を個々の種類の抗体（例えばＩｇＧ
またはＩｇＭ）が入っている画分に更に分離することも可能である。

【００１５】用いるペプチド抗原はリン酸化されている蛋白質およびリン酸化されていない
蛋白質の両方に共通した抗原決定基を含有することから、本方法で生じさせた血
清は、通常は、燐蛋白質に特異的に結合する抗体の集合を含有することに加えて
またリン酸化状態に依存しないで結合する抗体の集合も含有する。通常技術（Ｃ
ｚｅｒｎｉｋ他．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２０１：
２６４−２８３（１９９１））を用いて、そのような望まれない結合活性を抗血
清から排出させるか或は除去してもよい。必要ならば、抗原決定基を用いたアフ
ィニティー（ａｆｆｉｎｉｔｙ）精製（例えばアフィニティークロマトグラフィ
ーによる）で前記血清から単一特異的（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を精製
してもよいか、或は逆に、他の抗体活性の全部を前記血清から除去してもよい。

【００１６】本発明の別の面は、ポリペプチドの中に組み込んでおいたホスホペプチド擬態
を抗原として用いて前以て決めておいた燐蛋白質エピトープに特異的に結合する
モノクローナル抗体を生じさせて単離する方法である。この上に記述した抗原を
通常技術［例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編集）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ（１９８８））を参照］で用いて、モノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマを生じさせる。好適な態様では、ａ）抗体を分泌しないマウスミ
エローマまたはハイブリドーマとｂ）抗体を分泌するマウス脾臓細胞を融合させ
ることで生じさせたマウスハイブリドーマ（擬態含有ポリペプチド抗原を用いて
免疫性を与えたマウスから得た）を用いてホスホ特異的モノクローナル抗体を生
じさせる。

【００１７】典型的には、数匹のマウスに抗原の１回目の注射を受けさせた後に数回の追加
免疫注射を受けさせることを通してそれらに免疫性を与えた。この免疫手順中ま
たは手順後に、前記マウスから採取した血清にスクリーニングを受けさせること
で実質的な免疫応答を開始したマウスを識別した。選択したマウスの脾臓細胞を
得て融合（ｆｕｓｉｏｎｓ）を実施する。適切な融合技術には、例えばＳｅｎｄ
ａｉのウイルス技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５）またはポリエチレングリコール方法（Ｋｅｎｎｅ
ｔ，“ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ−
ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓ
ｉｓ”Ｋｅｎｎｅｔ，ＭｃｋｅｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ編集，Ｐｌｅｎｕ
ｍＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８０））が含まれる。

【００１８】次に、結果として生じたハイブリドーマを前記抗原に特異的な抗体の産生に関
して選別する。数種のアッセイを用いて選別を行うことができ、ホスホ擬態ポリ
ペプチド抗原または天然にリン酸化を受けたポリペプチド抗原を用いて前記アッ
セイを行うことができる。適切な選別技術は固相ラジオイムノアッセイである。
適切な抗原を不溶なマトリックスに結合させることを通して固相を調製する。免
疫吸着剤をハイブリドーマの培養上澄み液に接触させる。インキュベーションを
ある期間行った後、固相を上澄み液から分離し、次に、それを、マウス免疫グロ
ブリンに対する標識を付けておいた抗体に接触させる。標識が前記免疫吸着剤と
結合することは抗原に反応し得るハイブリドーマ産物が存在することを示してい
る。

【００１９】抗体を産生するハイブリドーマをマウスの腹腔内に注射して妥当な時間が経過
した後に前記マウスから腹水液を収穫することを通して、モノクローナル抗体を
多量に生産することができる。次に、このモノクローナル抗体を前記液から単離
する。別法として、前記ハイブリドーマをインビトロで培養しそして分泌された
モノクローナル抗体を培地から直接単離することで抗体を生産することも可能で
ある。

【００２０】この上に記述した本発明の方法を用いて、既知であるか或は疑わしい蛋白質リ
ン酸化状態に特異的な免疫学的反応体を生じさせることができる。当該抗体が既
知リン酸化状態に特異的な時には、この抗体をいろいろな条件下で用いて蛋白質
のリン酸化を緊密に監視することができる（例えば細胞サイクル、ホルモン刺激
またはストレス）。別法として、天然に存在する疑わしいリン酸化状態に対する
ホスホ特異的抗体を生じさせる。このような免疫学的反応体を用いて疑わしいリ
ン酸化状態が生理学的に存在することを立証または排除することができる。

【００２１】以下に示す例示セクションに示す結果は、この上に記述した本発明の方法を用
いると結果として、また、隣接するアミノ酸配列から独立して特別なホスホ残基
（ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｉｄｕｅ）に結合する抗体の単離を行うことも可能であ
ることを示している。そのような抗体が産生される時、モノクローナルまたはポ
リクローナルいずれかの抗体として生じる。このような抗体は、隣接するアミノ
酸配列から大きく独立して、特別なホスホ残基に対して結合を示す。このような
抗体を識別することは可能であり、そして必要ならば、それらが初期の抗原に関
係のないポリペプチド配列のホスホ残基に結合する能力を用いて、それらの精製
を行うことができる。このような抗体は価値ある研究道具を提供するものである
。このような抗体の１つの使用は免疫を基にしたキナーゼアッセイにおける使用
であり、これは幅広い範囲の蛋白質に適用可能である。

【００２２】単に常規実験を適用することを通して本発明の教示をこの上に記述した系以外
の系が産生するホスホ特異的抗体の単離に適用することも可能であることを本分
野の技術者は認識するであろう。そのような１つの例は、擬態含有抗原を用いて
結合活性を示す抗体の組み合わせライブラリーを選別する例である。本開示にそ
のような用途および関連した用途を包含させることを意図する。

【００２３】例示ポリクローナル抗体の生成高度免疫血清を一連のポリペプチド結合カラムに通すことで前記血清からセリ
ン１５の所がリン酸化を受けているｐ５３に特異的な抗体をアフィニティー精製
した。前記血清を最初にｐ５３の残基１１−２２のポリペプチド（セリン１５の
所がリン酸化を受けている）を入れておいたカラムに通すことでｐ５３に特異的
な抗体を豊富にした。結合した抗体を溶離させた後、リン酸化を受けていないｐ
５３ポリペプチドを入れておいたカラムに通すことで、ホスホセリンに特異的で
ない抗体を取り除いた。このフロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を保持
して特徴付けた。

【００２４】結果として得た抗血清の結合特異性をポリペプチドｐ５３（１−３９）、ｐ５
３（１−３９）１５Ｐおよびｐ５３（２５−６３）３７Ｐを用いた酵素結合イム
ノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。両方のリン酸化ポリペプチドに
対する特異的な結合を１：３２０未満の抗体希釈度で検出し（図３）たが、全て
の濃度でｐ５３（１−３９）１５Ｐに対する結合の方が多かった。リン酸化を受
けていないポリペプチドに対する結合は全ての濃度で有意でなかった。前記抗血
清がｐ５３（２５−６３）３７Ｐポリペプチドに交差反応性を示すことで非特異
的ホスホセリン抗体が存在することが示された。

【００２５】このような非特異的ホスホセリン抗体を前記抗血清から除去する目的で、この
抗血清をｐ５３（Ａｃ−３２−４３（３７Ｐ）Ｃｙｓ）のカラムに通した。結果
として結合しなかったフロースルーにこの上に示した試験と同様な試験を受けさ
せることで、これはセリン１５の所がリン酸化を受けているｐ５３に非常に特異
的であることを確認した（図４）。蛋白質キナーゼＤＮＡ−ＰＫを用いてセリン
１５の所に酵素によるリン酸化を受けさせておいたｐ５３およびリン酸化を受け
ていないｐ５３を用いたイムノブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）分析を用いて
、ｐ５３のセリン１５に関する反応性および特異性を立証した。

【００２６】天然にリン酸化を受けたポリペプチドを特異的に認識する抗体がホスホセリン
の代替であるＦ₂Ｐａｂを伴うペプチド抗原から生じることは、Ｆ₂Ｐａｂがこれ
を抗原として用いた時に有効なホスホセリン擬態として機能することを立証して
いる。重要なことは、そのような結果は、また、特異的抗体の産生において、前
記Ｆ₂Ｐａｂを組み込んでおいたペプチドを抗原として用いた時にこれがＢリン
パ球の誘発のために要求される必要な抗原プロセシングおよび掲示を行うことも
示している。この上に示した結果は、抗原に組み込んでおいたＦ₂Ｐａｂを用い
てあるペプチド内の特別なリン酸化部位を特異的に認識する抗体およびまた一般
的にホスホセリンをより幅広く認識する抗体を生じさせることができることを示
している。

【００２７】ここに記述したＦ₂Ｐａｂ擬態を用いてホスホセリンに特異的なポリクローナ
ル抗体を成功裏に生じさせることができたことは、他の様式の標準的な方法を用
いることでもまたＦ₂Ｐａｂを含有させたポリペプチドを用いてマウスまたは他
の動物に免疫性を与えることができ、その結果としてＢリンパ球の刺激およびク
ローン増殖（ｃｌｏｎａｌｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を生じさせることができるこ
とで、天然にリン酸化を受けた残基、ポリペプチドまたは蛋白質に特異的な抗体
を生じさせることができるであろうことを示している。そのようなＢリンパ球を
単離してハイブリドーマの生成で用いることで燐蛋白質に特異的なモノクローナ
ル抗体を生じさせることができる。

【００２８】発明の方法免疫血清の生成抗原として用いたポリペプチドをＳＥＱＩＤＮＯ：１で示す。このポリペ
プチドは１５個の残基で構成されていて、その配列はｐ５３のアミノ酸残基１３
−１９の７アミノ酸配列に相当し、この配列が２回繰り返して存在し、セリン１
５の代わりにホスホセリン擬態であるＦ₂Ｐａｂを含有しており、このポリペプ
チドは、前記ｐ５３のアミノ酸配列に加えて追加的にカルボキシ末端のシステイ
ン残基を有する。このポリペプチドの化学的合成を、ｔ−Ｂｏｃ化学を用い、Ｂ
ｏｃ−Ｆ₂Ｐａｂ（Ｅｔ２）−ＯＨをｔ−Ｂｏｃ化学を用いた手操作で結合させ
る以外はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａペプチド合成装置を
製造業者の推奨に従って用いて行った。このペプチド鎖の組み立てを標準的方法
（ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇ．Ｇｒａｎｔ（編集），Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２））で行った。２段
階脱保護方法（Ｏｔａｋａ他．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３６：
９２７−９３０（１９９５））を用いて、前記ペプチドを樹脂から開裂させた後
に側鎖保護基の除去を実施した。ＶｙｄａｃＣ−８カラムを用いた高圧液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルを用い
ることで前記ペプチドを精製した。

【００２９】このポリペプチドをキーホールリンペットホモシアニン（ＫＬＨ）にカルボキ
シ末端のシステイン残基を通して結合させた。結果として得たＫＬＨ−Ｆ₂Ｐａ
ｂ−ペプチド接合体を用いて標準的な手順でラビットに免疫性を与えた。簡単に
述べると、アジュバントと混合しておいた前記ペプチド接合体をラビットに０日
目、７日目および１４日目に５００μｇづつ皮下注射した。１回目の注射で完全
フロイントアジュバントを用いそして追加的注射では不完全フロイント（Ｆｒｅ
ｕｎｄ'ｓ）アジュバントを用いた。２１日目に血液を集めた。２１日後では免
疫化と血液採取を５週間に渡って週毎に繰り返した。

【００３０】アフィニティークロマトグラフィー用ポリペプチドの生成ヒトｐ５３配列の残基１１から２２に相当する１３アミノ酸で構成されていて
追加的にカルボキシ末端のシステイン残基を有するポリペプチドを、リン酸化を
受けていないポリペプチド：（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２Ｃｙｓ））としてか或
はセリン１５の所がリン酸化を受けているポリペプチド：（ｐ５３（Ａｃ−１１
−２２（１５Ｐ）Ｃｙｓ））として、標準的な方法で化学的に合成した。ヒトｐ
５３配列の残基３２から４３に相当していてカルボキシ末端のセリン残基が付加
しているポリペプチドをセリン３７の所がリン酸化を受けているポリペプチド：
（ｐ５３（Ａｃ−３２−４３（３７Ｐ）Ｃｙｓ））として合成した。

【００３１】ペプチドの合成を、ＡｌｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａペプチド
合成装置（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いたＦｍｏｃ化学（ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇ．Ｇｒａｎｔ（編集），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ＆Ｃｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２））による固相方法で行った。ホス
ホセリン残基をＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚＩ）ＯＨ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂ
ｉｏｃｈｅｍ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｗａｋａｍｉｙａ他．，Ｃｈｅ
ｍ．Ｌｅｔｔ．６：１０９９−１１０２（１９９４））として組み込んだ。試薬
Ｋ（ＴＦＡ：フェノール：チオアニソール：Ｈ₂Ｏ：ＥＤＴ＝８２．５：５：５
：５：２．５）を室温で３時間用いることで、前記ペプチドを前記樹脂から開裂
させた後に側鎖保護基の除去を実施した（Ｋｉｎｇ他．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ
ｔ．ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．３６：２５５−２６６（１９９０））このペプチ
ドの精製をＶｙｄａｃＣ−８カラム（Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を用いたＨＰ
ＬＣ（０．０５％ＴＦＡ／水−アセトニトリルを使用）またはｐＨに安定なＶｙ
ｄａｃＣ−８カラム（Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を用いたＨＰＬＣ（０．２％
ヘキサフルオロアセトン−ＮＨ₄ＯＨ、ｐＨ７．０／アセトニトリルを使用）（
１−３９ペプチドの場合）を用いて行った。ＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴＳＳＱ
７０００（ＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を用いたエ
レクトロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）イオン化質量分光測定で前記ペ
プチドの質量を実証した。

【００３２】ポリペプチド結合カラムの生成ポリペプチド（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２Ｃｙｓ），（ｐ５３（Ａｃ−１１−
２２（１５Ｐ）Ｃｙｓ）），および（ｐ５３（Ａｃ−３２−４３（３７Ｐ）Ｃｙ
ｓ））をＳｕｌｆｏｌｉｎｋ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）に製
造業者が提供した指示に従って結合させた。結果として得たＳｕｌｆｏｌｉｎｋ
複合体を用いて３本のカラムを生じさせたが、それらの各々にポリペプチド−Ｓ
ｕｌｆｏｌｉｎｋ複合体の中の１つを充填した。

【００３３】アフィニティー精製高度免疫ラビット血清を一連のペプチド結合カラムを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーにかけることで、セリン１５の所がリン酸化を受けているｐ５
３に特異的な抗体を精製した。前記血清を最初に（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２（
１５Ｐ）Ｃｙｓ））カラムに通した。洗浄後、吸着された抗体をＩｍｍｕｎｏＰ
ｕｒｅＩｇＧＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏ．）で溶離させた後、直ちに１ＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．５）を
添加することで中和した。溶離液を（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２Ｃｙｓ））カラ
ムに通すことで、リン酸化を受けていないｐ５３に結合した抗体を除去した。結
合しなかったフロースルーを集めた後、（ｐ５３Ａｃ−３２−４３）（３７Ｐ
）Ｃｙｓ）カラムに通すことで、ポリペプチド内に位置する場所に関係なくホス
ホセリンに結合する抗体をそれから除去した。

【００３４】抗体分析アフィニティー精製を受けさせた抗体調合物の特徴づけを、ＰｉｅｒｃｅＣ
ｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｃａｌＬｉｂｒａｒｙそしてＥｎｇｖａｌ
ｌ他．，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８：８７１−８７５（１９７１）
に記述されている如きＥＬＩＳＡアッセイにより、ポリペプチドｐ５３（１−３
９），ｐ５３（１−３９）１５Ｐ，またはｐ５３（１−３９）３７Ｐに対する結
合に関して行った。この示したポリペプチドを炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ９．６（１リットル当たりＮａ₂ＣＯ₃が１．５９ｇでＮａＨＣＯ₃が２．９
３ｇで、ｐＨをＨＣｌで調整しておいた）で１μｇ／ｍｌになるように希釈する
ことで、プレートを前記ポリペプチドで覆った後、５０または１００ｎｇ（５０
または１００μｌ）を４℃で一晩または室温で約３時間インキュベートした。次
に、前記ペプチド溶液を除去した後、プレートをＰＢＳ中１％のＢＳＡと一緒に
して室温で１時間インキュベートすることで、阻止を行った（ｂｌｏｃｋｅｄ）
。ポリペプチドで覆ったウエルを１／１０から１／１０００の範囲の抗体希釈度
でインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ラビット
ＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートした後にＨＲＰ基質ＡＢＴＳ［２，２’−ア
ジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］を添加することで
、結合した抗体を検出した。前記ＡＢＴＳがＨＲＰで酸化されると緑色の産物が
生じ、これを用いて抗体の存在を識別した。前記ポリペプチドで覆ったプレート
に結合したラビットＩｇＧの量を、この混合物の光学密度を４０５ｎｍの所で測
定（ＯＤ₄₀₅）することで決定した。結果を個別のＥＬＩＳＡアッセイおよびス
ポットブロット（「ウエスタン」ブロット）で立証した。

【００３５】前記ＥＬＩＳＡ分析で用いたポリペプチドはこの上に記述した如きＦｍｏｃ化
学で合成したポリペプチドであった。フラグメント縮合方法（Ｓａｋａｍｏｔｏ
他．，Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．４８：４２９
−４４２（１９９６））を用いて、より長いペプチドを合成した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１に、ホスホセリンの類似物およびホスホトレオニンの類似物を示す。

【図２】図２に、ホスホチロシンの類似物を示す。

【図３】図３は、リン酸化を受けていないペプチドと交差反応する抗体を除去する目的
で（ｐ５３（Ａｃ−１１−２２）Ｃｙｓ）カラムに通した後にアフィニティー精
製を受けさせたｐＡｂＦ１５抗体を用いたＥＬＩＳＡで得たデータの図式図であ
る。

【図４】図４は、セリン３７の所がリン酸化を受けているｐ５３と交差反応する抗体を
除去する目的で（ｐ５３（Ａｃ−３２−４３）（３７Ｐ）Ｃｙｓ）カラムに通し
た後にアフィニティー精製を受けさせたｐＡｂＦ１５抗体を用いたＥＬＩＳＡで
得たデータの図式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者サカグチ，カズヤスアメリカ合衆国メリーランド州20892モンゴメリー・コングレツシヨナルレインナンバー619 263 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA13 4H045 AA10 AA11 AA20 BA17 BA42 BA50 CA40 DA75 DA76 DA86 EA50 FA34 FA44 FA52 FA71 FA72 GA25 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定のアミノ酸の所がリン酸化を受けているポリペプチドに
特異的に結合するポリクローナル抗体を単離する方法であって、ａ）生理学的に受け入れられる担体に入っているリン酸化アミノ酸残基の擬態を
含有するポリペプチドを準備し、ｂ）段階ａ）の組成物を用いて動物に免疫性を与え、ｃ）段階ｂ）で免疫性を与えた動物から血清または腹水液を集めて調製し、ｄ）前記リン酸化ポリペプチドに特異的な抗体の存在に関して選別を行い、そし
てｅ）必要ならば、前記リン酸化ポリペプチドに特異的な抗体を通常方法で更に豊
富にする、ことを含んで成る方法。
【請求項２】前記ポリクローナル抗体と前記リン酸化ポリペプチドの結合
がリン酸化アミノ酸に隣接するアミノ酸配列に依存する請求項１記載の方法。
【請求項３】前記ポリクローナル抗体と前記リン酸化ポリペプチドの結合
がリン酸化アミノ酸に隣接する配列に依存しない請求項１記載の方法。
【請求項４】前記リン酸化ポリペプチドに特異的な抗体をアフィニティー
精製で更に豊富にする請求項１記載の方法。
【請求項５】前記リン酸化ポリペプチドに特異的な抗体をこれと一緒に混
ざり合っている望まれない結合活性を示す抗体を減少させることで更に豊富にす
る請求項１記載の方法。
【請求項６】適切なアミノ酸配列で構成されている天然のホスホペプチド
複合体を追加免疫剤として用いて前記動物にさらなる免疫性を与える請求項１記
載の方法。
【請求項７】段階ａ）のポリペプチドに場合により修飾を段階ｂ）の免疫
化に先立って受けさせる請求項１記載の方法。
【請求項８】前記修飾を前記ポリペプチドをキーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＬＨ）、ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよびツ
ベルクリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）から成る群から選択される担体蛋白質に
任意の二官能反応体を用いて結合させることを通して行う請求項７記載の方法。
【請求項９】前記特定のアミノ酸をセリン、トレオニンおよびチロシンか
ら成る群から選択する請求項１記載の方法。
【請求項１０】前記擬態が炭素原子からホスフェート基に至る所に非加水
分解性結合を含有する請求項１記載の方法。
【請求項１１】前記非加水分解性結合がＣＦ₂基を含んで成る請求項１０
記載の方法。
【請求項１２】Ｆ₂Ｐａｂがホスホセリンの擬態である請求項１１記載の
方法。
【請求項１３】Ｆ₂Ｐｍｐがホスホチロシンの擬態である請求項１１記載
の方法。
【請求項１４】Ｆ₂Ｐｍｂがホスホトレオニンの擬態である請求項１１記
載の方法。
【請求項１５】段階ａ）のポリペプチドがｐ５３に由来するものである請
求項１記載の方法。
【請求項１６】前記ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：１に明記した通
りである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】前記ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：２、３、４、５
、６、７、８、９および１０から成る群から選択される請求項１５記載の方法。
【請求項１８】特定のアミノ酸残基の所がリン酸化を受けているポリペプ
チドに特異的に結合するモノクローナル抗体を単離する方法であって、ａ）生理学的に受け入れられる担体に入っている特定のリン酸化アミノ酸の擬態
を含有するポリペプチドを準備し、ｂ）段階ａ）の組成物を用いて動物に免疫性を与え、ｃ）段階ｂ）の動物からＢ細胞を集め、ｄ）段階ｃ）で集めたＢ細胞をメラノーマ細胞に融合させることでハイブリドー
マを生じさせ、ｅ）段階ｄ）のハイブリドーマをリン酸化ポリペプチドに特異的な抗体の産生に
関して選別し、そしてｆ）段階ｅ）で識別したハイブリドーマを単離して増殖させる、ことを含んで成る方法。
【請求項１９】前記モノクローナル抗体と前記リン酸化ポリペプチドの結
合がリン酸化アミノ酸に隣接するアミノ酸配列に依存する請求項１８記載の方法
。
【請求項２０】前記モノクローナル抗体と前記リン酸化ポリペプチドの結
合がリン酸化アミノ酸に隣接する配列に依存しない請求項１８記載の方法。
【請求項２１】適切なアミノ酸配列で構成されている天然のホスホペプチ
ド複合体を追加免疫剤として用いて前記動物にさらなる免疫性を与える請求項１
８記載の方法。
【請求項２２】段階ａ）のポリペプチドに修飾を段階ｂ）の免疫化に先立
って受けさせる請求項１８記載の方法。
【請求項２３】前記修飾を前記ポリペプチドをキーホールリンペットヘモ
シアニン（ＫＬＨ）、ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよび
ツベルクリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）から成る群から選択される担体蛋白質
に任意の二官能反応体を用いて結合させることを通して行う請求項２２記載の方
法。
【請求項２４】前記特定のアミノ酸残基をセリン、トレオニンおよびチロ
シンから成る群から選択する請求項１８記載の方法。
【請求項２５】前記擬態が炭素原子からホスフェート基に至る所に非加水
分解性結合を含有する請求項１８記載の方法。
【請求項２６】前記非加水分解性結合がＣＦ₂基を含んで成る請求項２５
記載の方法。
【請求項２７】Ｆ₂Ｐａｂがホスホセリンの擬態である請求項２６記載の
方法。
【請求項２８】Ｆ₂Ｐｍｐがホスホチロシンの擬態である請求項２６記載
の方法。
【請求項２９】Ｆ₂Ｐｍｂがホスホトレオニンの擬態である請求項２６記
載の方法。
【請求項３０】段階ａ）のポリペプチドがｐ５３に由来するものである請
求項１８記載の方法。
【請求項３１】前記ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：１に明記した通
りである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】前記ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：２、３、４、５
、６、７、８、９および１０から成る群から選択される請求項３０記載の方法。