JPH07198717A - カルパインによって特異的に分解されたフォドリン蛋白分解産物１５０ｋの分解部位に特異的な抗体、その作製方法及び該抗体を用いたフォドリン蛋白分解産物１５０ｋの認識方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 カルパインによって特異的に分解されたフォ
ドリン蛋白分解産物１５０Ｋの空間的な情報が得られる
抗体、その作製方法及び該抗体を用いたフォドリン蛋白
分解産物１５０Ｋの認識方法を提供する。 【構成】 フォドリンαサブユニットの１５０Ｋ分解産
物のＮ末に対応するペプチド（ＧＭＭＰＲ）をペプチド
シーケンサーを用いて合成し、Ｃ末端に付加したシステ
インを介してＫＬＨと結合させた後、高速液体クロマト
グラフィーによって精製した。次いで、この抗原をウサ
ギ１羽当たり０．２５ｍｇ〜１ｍｇ、２〜３週間の間隔
で６回免疫し、最後の免疫から１週間の後採血し、抗原
ペプチドを固相化したアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いてポリクローナル抗体を精製した。一次的虚血
と灌流の後のスナネズミ脳を２０μｍに薄切し、上記ポ
リクローナル抗体と反応させ、さらに染色することによ
って、１５０Ｋを特異的に認識することができた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カルパインによって特
異的に分解されたフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの分
解部位に特異的な抗体、その作製方法及び該抗体を用い
たフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの認識方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】フォドリンは、脳に多量に存在する高分
子量の細胞骨格蛋白質で、脳の総蛋白質量の２％程度を
占める。フォドリンは、軸索輸送、神経分泌、記憶の物
質的痕跡づくりに重要な役割を果たしている。フォドリ
ンは、分子量２３０Ｋ（α）と２２０Ｋ（β）の２種の
サブユニットで構成され、自然状態でのフォドリンは、
分子量約９７０Ｋでα₂β₂の４量体である。

【０００３】フォドリンは、ほぼ同時に４つの研究室で
発見された。筑波大学渡辺良雄研究室に居た下岡は、脳
に存在し、アクトミオシンＡＴＰーａｓｅ活性を促進す
る高分子量のアクチン結合性蛋白質を見いだし、これを
ブラインアクチン結合性蛋白質（ｂｒａｉｎ ａｃｔｉ
ｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と名付けた。ま
た、レヴァイン（Ｌｅｖｉｎｅ）とウィラード（Ｗｉｌ
ｌａｒｄ）は、アクチン結合性蛋白で皮質細胞に局在す
る蛋白を見いだし、フォドリンと命名した。さらに、垣
内研究室及ディヴィス（Ｄａｖｉｅｓ）とクリー（Ｋｌ
ｅｅ）は、脳に存在する高分子量のカルモデュリン結合
性蛋白質を発見し、それぞれカルスペクチン及びカルモ
デュリン結合性蛋白Ｉと命名した。一方、フォドリン
は、赤血球裏打ち蛋白の一つのスペクトリンのアナログ
でもあることから、ブラインスペクトリン（ｂｒａｉｎ
ｓｐｅｃｔｒｉｎ）とも呼ばれる。この蛋白質の呼称
は、世界的にはまだ統一されていないのが現状である
が、本明細書においては、一貫してフォドリンと呼ぶ。

【０００４】一方、カルパインは、カルシウムによって
活性化される細胞内プロテアーゼである。カルパイン
は、分子量約８０Ｋと３０Ｋの２つのサブユニットから
なるヘテロダイマーであり、活性中心にシステインとヒ
スチジンを有するシステインプロテアーゼである。活性
中心のシステインは、通常は分子内に埋もれた形で存在
しており、Ｃａ⁺⁺濃度に依存して分子の表面に露出して
くる。即ち、カルパインの活性化には、Ｃａ⁺⁺の存在が
必要となる。

【０００５】カルパインの名称についても確定されてお
らず、別名カルシウム依存性中性プロテアーゼ（ｃａｌ
ｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒ
ｏｔｅａｓｅ、ＣＡＮＰ）とも呼ばれる他、ＣＤＳＰ
（ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｌｈｙｄ
ｒｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）や単にＣＤＰ（ｃａｌｃｉ
ｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅａｓｅ）と呼ば
れることがある。今日では、カルパインが最も一般的な
名称であると思われるので、本明細書においては、一貫
してカルパインと呼ぶ。

【０００６】数あるカルパインの基質蛋白のなかで、フ
ォドリンは脳の機能の生理学及び病理学に関して多くの
学者の興味を引き付けている。というのは、フォドリン
は、長期増強及び虚血後の変性の両方において、カルパ
インの触媒による蛋白分解を受けると記載された最初の
ものだったからである。フォドリンは、カルパインによ
って２３０Ｋαサブユニットが特異的に分解されて１５
０Ｋを産生することが明かとなっている。

【０００７】従来、この反応が進行する情報は、電気泳
動を用いて観察していた。即ち、試料をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）のような
電気泳動によって分子の大きさで分離し、分子量から蛋
白質の存在を推定していた。また、ウエスタンブロット
では、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後に、ゲ
ル中の蛋白質をニトロセルロースのような膜に転写し、
これに目的の蛋白質に対する抗体を一次抗体として反応
させ、さらにこの一次抗体に対する抗体と酵素の標識物
を二次抗体として反応させた後に、酵素反応によって酵
素基質を発色させることにより、分子量によって分けら
れた目的とする蛋白質だけを検出できる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ような電気泳動を用いる方法では、試料を溶液状態で電
気泳動にかけなければならず（組織中の蛋白であれば、
組織をホモゲナイズして抽出する）、組織内に目的とす
る蛋白質がどのように分布しているかといった空間的な
情報が得られなかった。従って、カルパインによるフォ
ドリンの分解過程において、どのステップが実際に、数
日に渡る複雑なカスケードの引き金になるのか、どのよ
うに他の因子と相互に関連しているのかについては未だ
明らかではなかった。このため、脳の機能の生理学及び
病理学を探索する医学分野においては、カルパインによ
り特異的に分解されるフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋ
の空間的な情報を得る手段が望まれていた。

【０００９】従って、本発明は、上記課題を解決し、カ
ルパインによって特異的に分解されたフォドリン蛋白分
解産物１５０Ｋの空間的な情報が得られる抗体、その作
製方法及び該抗体を用いたフォドリン蛋白分解産物１５
０Ｋの認識方法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段、作用及び効果】本第１発
明は、カルパインによって特異的に分解されたフォドリ
ン蛋白分解産物１５０Ｋの分解部位に特異的な抗体にあ
る。本第２発明は、上記抗体がポリクローナル抗体であ
って、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの分解部位であ
るＮ末端に対応するペプチドを合成し、該ペプチドにキ
ャリヤー蛋白質を結合させ、精製した後、これを生体内
に免疫してポリクローナル抗体を作製させ、該ポリクロ
ーナル抗体を採取し、精製することを特徴とする上記抗
体の作製方法にある。

【００１１】本第３発明は、上記抗体がモノクローナル
抗体であって、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの分解
部位であるＮ末端に対応するペプチドを合成し、該ペプ
チドにキャリヤー蛋白質を結合させ、精製した後、これ
を生体内に免疫してポリクローナル抗体を作製させ、上
記生体の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させてハイ
ブリドーマ細胞を製造し、該ハイブリドーマ細胞を培養
することによって産生させたモノクローナル抗体を採取
し、精製することを特徴とする上記抗体の作製方法にあ
る。

【００１２】本第４発明は、上記抗体を用いることを特
徴とするフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの認識方法に
ある。本発明者は、インタクトな蛋白から蛋白分解によ
って生じた分解物を特異的に区別できる抗体を発明し
た。即ち、本第１発明の抗体によれば、カルパインによ
って特異的に分解されたフォドリン蛋白分解産物１５０
Ｋの分解部位にのみ特異的であり、インタクトな２３０
Ｋαサブユニット及びゆっくりと産生されるβサブユニ
ットの１６０Ｋ分解産物とは全く反応しない。従来知ら
れている分子のＸＩドメインのＰＥＳＴ配列残基に対し
て反応する別の抗体では、インタクトな２３０Ｋと分解
された１５０Ｋの両者に反応する。

【００１３】尚、ＰＥＳＴ配列とは、カルモジュリン結
合蛋白質（フォドリンもそのひとつ）のなかで、プロリ
ン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸
（Ｄ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）に富んだ部分
で、カルモジュリンによって認識される部位を言う。カ
ルパインも同じ部位を認識すると思われる。ＰＥＳＴ部
位は、非常に疎水性であり、表面ループを形成しやす
く、カルパインにとって接近しやすい構造となってい
る。

【００１４】ここで、αサブユニットは、いくつかのド
メインからなっており、カルパインによる分解部位は、
ＸＩドメインにあり、ＸＩドメインからＸＩＩドメイン
のアミノ酸配列の一部を示せば、以下の通りである。

【００１５】

【数１】

【００１６】（但し、Ｑ：グルタミン、Ｅ：グルタミン
酸、Ｖ：バリン、Ｙ：チロジン、Ｇ：グリシン、Ｍ：メ
チオニン、Ｐ：プロリン、Ｒ：アルギニン、Ｄ：アスパ
ラギン酸、Ｔ：スレオニン、Ｓ：セリン、Ｋ：リジン、
Ａ：アラニン、Ｗ：トリプトファン、Ｌ：ロイシン、
Ｈ：ヒスチジン、Ｆ：フェニールアラニン、Ｎ：アスパ
ラギン、Ｉ：イソロイシン） このうち、カルパインによるフォドリンの分解部位は、
上記に米印で示したＹとＧの間である。

【００１７】このため、組織内において、カルパインに
より特異的に分解されたフォドリン蛋白分解産物１５０
Ｋの空間的な情報を得ることができる。抗体としては、
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を挙げるこ
とができる。

【００１８】ポリクローナル抗体は、本第２発明のよう
にして得ることができる。一方、モノクローナル抗体に
ついては、本第３発明のようにして得ることができる。
ここで、ペプチドは、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋ
の分解部位であるＮ末端に対応するアミノ酸配列、例え
ば、「ＧＭＭＰＲ」に従い、従来公知のペプチドシーケ
ンサーを用いて合成することができる。このポリクロー
ナル抗体の産生に用いられた抗原ペプチドは、５ｍｅｒ
と非常に小さなペプチドに対して設計されたものであ
り、蛋白分解産物のＮ末端の新しいアミノ酸グループは
エピトープに本質的な部分であることから、このポリク
ローナル抗体は、分解部位に対する高い特異性を持って
いる。

【００１９】本第２発明及び第３発明において用いられ
る抗原ペプチドは、分子量が小さく、これを動物に免疫
することによって抗体を作製させることができないハプ
テンである。このため、これにキャリヤー蛋白質、例え
ば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスカシガイヘモシ
アニン（ＫＬＨ）のような蛋白質と結合させて高分子と
して免疫する必要がある。

【００２０】抗原の精製方法としては、特に限定されな
いが、通常、クロマトグラフィーによって行う。免疫す
る生体としては、特に限定されないが、例えば、ウサ
ギ、ネズミ、ブタまたはニワトリ等が挙げられる。

【００２１】得られた抗体、即ち、ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体の精製方法としては、従来公
知のいずれの方法を用いてもよいが、通常、抗原ペプチ
ドを固相化したクロマトグラフィーによって行う。ま
た、第３発明において、細胞融合させる方法としては、
従来公知のいずれの方法も適用することができる。例え
ば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法［Ｎａｔ
ｕｒｅ、第２５６巻、４９５頁（１９７５年）参照］が
挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞の培養は、例
えば、イン・ビトロ（例えば、培地中）またはイン・ビ
ボ（例えば、生体の腹腔内）で行うことができる。

【００２２】本第４発明によれば、上記抗体がフォドリ
ン蛋白分解産物１５０Ｋの分解部位に特異的であること
から、上記抗体を用いることによって、インタクトなフ
ォドリンから分解されたフォドリン蛋白分解産物１５０
Ｋの空間的な分布を認識することができる。このため、
例えば、脳の海馬におけるフォドリン蛋白分解産物１５
０Ｋの分布を調べることができ、従って、カルパインに
よってフォドリンが分解されていく空間的な情報を得る
ことができる。従って、カルパインによるフォドリンの
分解過程において、どのステップが実際に、数日に渡る
複雑なカスケードの引き金になるのか、どのように他の
因子と相互に関連しているのかについて、解明の一因と
なる。

【００２３】

【実施例】以上説明した本発明の構成・作用を一層明ら
かにするために、以下に本発明の好適な実施例を説明す
る。 １．フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋ抗原の作製 フォドリンαサブユニットの１５０Ｋ分解産物のＮ末に
対応するペプチド（ＧＭＭＰＲ）をアプライドバイオシ
ステムズ社モデル４３０Ａペプチドシーケンサーを用い
てチェンジ アンド メイエンホファー（Ｃｈａｎｇ
ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）の方法［Ｃｈａｎｇ，
ｃ．ｄ．＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９７８）
Ｉｎｔ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，ｌ
１，２４６−２４９］に従い合成し、そのＣ末端にシス
テイン残基を付加し、レナー（Ｌｅｒｎｅｒ）ら［Ｌｅ
ｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．，Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，
Ｊ．Ｇ．，＆Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．（１９８１）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
７８，３４０３〜３４０７］の方法に従い、ｍ−マレイ
ミドベンゾイルーＮーヒドロキシスクシニミドを介して
ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）を結合させる。この
後、高速液体クロマトグラフィーによって精製した。

【００２４】但し、 Ｇ：グリシン Ｍ：メチオニン Ｐ：プロリン Ｒ：アルギニン ２．フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリクロ
ーナル抗体の作製 上記１で合成した免疫原をウサギ１羽当たり０．２５ｍ
ｇ〜１ｍｇ、２〜３週間の間隔で６回免疫した。初回及
び２回目の免疫にはそれぞれフロインドの完全アジュバ
ンド及び不完全アジュバンドを用いた。最後追加免疫の
後１週間で抗血清を得た。これを採血し、ポリクローナ
ル抗体のアフィニティー精製は、抗原ペプチドを固相化
したＴＳＫ ＡＦ−トレシル トーヨーピアール（ＴＳ
Ｋ ＡＦーｔｒｅｓｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０
Ｍを用いて行った。

【００２５】３．フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対
するモノクローナル抗体の作製 上記１で合成した免疫原をマウスに免疫した。このマウ
スの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞（骨髄腫細胞）
とをＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法［Ｎａｔ
ｕｒｅ、第２５６巻、４９５頁（１９７５年）参照］に
より細胞融合してマウス・ハイブリドーマ細胞を製造し
た。さらに、このハイブリドーマ細胞をイン・ビトロ
（培地中）またはイン・ビボ（マウスの腹腔内）で培養
することによってモノクローナル抗体を産生させた。こ
のモノクローナル抗体は、上記２と同様に精製した。

【００２６】４．スナネズミ前脳における虚血の誘導 体重５０ｇ〜７０ｇのメスのスナネズミは、虚血〜再灌
流の間エーテルで麻酔し、体温は３７℃に維持する。頸
部正中線を切開し、二つの通常の動脈瘤をクリップで咬
合する。１０分後にクリップを除き、再灌流する。各グ
ループ４匹を１５分、４時間、２４時間、３日、７日後
にコントロールと共に解体する。

【００２７】各時間において動物はペントバルビタール
（６０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）のオーバードーズによっ
て安楽死させ、４℃で上向大動脈を５ｍＭＥＤＴＡ、５
ｍＭメルカプトエタノール、２５０ｍＭシュクロース、
０．１ｍＭ ロイペプシン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を含
む２０ｍＭ トリスーＨＣｌバッファー（ｐＨ７．６）
５０ｍｌで灌流の後２％パラホルムアルデヒドで灌流す
る。

【００２８】灌流後の脳は取り除き、同じ固定液で２４
時間固定し、１０〜２０％シュクロースを含むＰＢＳに
２４時間浸す。 ５．μーカルパインの精製 ５ｋｇのウサギ骨格筋を３倍量のバッファーＡ［２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１０ｍＭ ２ーｎｅｒｃａｔｏｅｅｔｈａｎｏｌ］
を加えてホモゲナイズし、１２００ｇで１５分間遠心す
る。上清は、ガラスウールを用いて濾過し、脂肪分を除
く。

【００２９】この粗抽出物（１４．２リットル）にバッ
ファーＡで平衡化したＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｄ
ＥＡＥセルロースの商品名）２．３ｋｇを加える。この
懸濁液をときどきかき混ぜながら、２時間静置した後、
吸着されなかった分画をデカンテーションによって除
く。残った樹脂にバッファーＡを５リットル加え、懸濁
液を５×１３０ｃｍのカラムに詰める。２．６リットル
のバッファーＡで洗った後、吸着した蛋白質を０．０Ｍ
から０．６ＭまでのＮａＣｌの直線グラジエントをかけ
てバッファーＡで溶出する。ここでは、カルパインとカ
ルパイン阻害物質がＮａＣｌの０．１５Ｍ〜０．２５Ｍ
の位置に一緒に溶出されてくるため、この両者を集め、
０．３ＭのＮａＣｌを含むバッファーＡで平衡化された
フェニールセルロースＣＬ−４Ｂカラム（２．６×２５
ｃｍ）に添加する。カラムは、５０ｍｌの０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌ加バッファーＡで洗った後、バッファーＡで溶出
させる。ここにおいて、カルパインはカラムに吸着され
るが、阻害物質はカラムを素通りする。カルパインの分
画を集め、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ、１．０×４０
ｃｍ、ＤＥＡＥセルロースカラムの商品名）のカラムに
添加する。吸着した蛋白質は、０．０Ｍ〜０．３ＭのＮ
ａＣｌの直線的グラジエントで総量３００ｍｌのバッフ
ァーＡで溶出する。カルパインの活性分画を集め、Ｎａ
Ｃｌ濃度を０．３Ｍに調整した後、フェニールセファロ
ースカラム（１．０×２５ｃｍ）に添加し、０．３Ｍ
ＮａＣｌバッファーＡで洗浄する。ＮａＣｌ濃度を０．
３Ｍから０．０Ｍへ減少的に、エチレングリコールを０
％から５０％まで増加的に変化させながら、バッファー
Ａ２００ｍｌで溶出する。

【００３０】以上の４段階のクロマトグラフィーを経
て、カルパインは精製される。 ６．フォドリンの精製 フォドリンの精製は、以下の文献に従い、行った。 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７ ２４５８５〜２４５
９０（１９９２）；ＴａｋａｏｍｉＣ．Ｓａｉｄｏ，Ｍ
ａｓａｏ Ｓｈｉｂａｔａ，ＴａｄａｏｍｉＴａｋｅｎ
ａｗａ，Ｈｉｒｏｍｕ Ｍｕｒｏｆｕｓｉ及びＫｏｉｃ
ｈｉ Ｓｕｚｕｋｉ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ μーＣａｌｐａｉｎＡｃｔｉｏｎ ｂ
ｙ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｏｔｉｄｅｓ） ７．ＰＥＳＴ配列に対する抗体の合成 フォドリンＰＥＳＴ配列に対する抗体は、以下のような
合成ペプチドを用い、フォドリン分解産物に対する抗体
と同様に作製した。

【００３１】ＹＧＥＴＡＥＲＬＴＱＳＨＰＥＳＡＥＤＬ
ＱＥＫＣＴＥＬＣ 尚、ペプチドの合成は、上記「１．抗原の作製」と同様
に行った。 ８．免疫組織化学 一次的虚血と灌流の後のスナネズミ脳の染色は本質的に
次の通り行なった。即ち、固定した脳はクリオスタット
で２０μｍに薄切し、３％のノーマル ゴートセルム
（Ｎｏｒｍａｌ Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ）、０．３％Ｈ
₂Ｏ₂を含むＰＢＳで室温３０分間反応させた。次に、上
記のようにして得られたフォドリン蛋白分解産物１５０
Ｋに対するポリクローナル抗体あるいはＰＥＳＴ配列に
対する抗体で室温一晩反応、すすいだ後、ビオチン化ヤ
ギ抗ウサギＩｇＧ（ベクター社）で２時間、ＡＢＣーペ
ルオキシダーゼ錯体（ＡＢＣ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
ｃｏｍｐｌｅｘ）［ベクター社］で室温２時間反応、洗
浄後０．０１５％ジアミノベンチジンと０．００３％Ｈ
₂Ｏ₂を含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ
７．６）で発色させる。

【００３２】遅延神経死は、再灌流後３日及び７日後の
クレシル紫染色切片中のピラミダルニューロン（ｐｙｒ
ａｍｉｄａｌ ｎｅｕｒｏｎ）を数えることによって確
認する。 ９．ウエスタンブロット 上記免疫組織化学で用いたのと同様な組織、即ち、一次
的虚血と灌流の後のスナネズミ脳を用いて、ウエスタン
ブロットを行った。ウエスタンブロットは、トビン（Ｔ
ｏｗｂｉｎ）らの方法に従って行った。（Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６，４３５０〜
４３５４（１９７９）、ＴｏｗｂｉｎＨ、Ｓｔａｅｈｅ
ｉｎＴ、ＧｏｒｄｏｎＪ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔ
ｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒ
ｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｔｏ
ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｈｅｅｔｓ：ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ）参照］ １０．結果 （１）精製されたフォドリンのμーカルパインによる蛋
白分解 上記５で精製されたフォドリン（３６μｇ／ｍｌ）を試
験管内で、１００μＭロイペプシンの存在下あるいは非
存在下において、経時的に、上記４で精製されたμーカ
ルパイン（２．５μｇ／ｍｌ）の触媒によって蛋白分解
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって
分析した。

【００３３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１、図２及び
図３に示す。図１は、クマシーブリリアントブルー（Ｃ
ＢＢ）によるゲルの染色を示す。上の矢印は、分解され
ていない分子量約２３０Ｋの完全なフォドリンαサブユ
ニットを示す。一方、下の矢印は、αサブユニットに由
来する分子量約１５０Ｋの蛋白分解産物に相当する。時
間とともに、２３０Ｋが１５０Ｋに分解されいていく過
程がわかる。また、図１で２０分後において、１５０Ｋ
に反応するバンドは、システインプロテアーゼ阻害剤で
あるロイペプシン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）によって産生
が阻害されていることがわかる。尚、右端のレーンは、
分子量マーカーである。

【００３４】また、図２は、フォドリン蛋白分解産物１
５０Ｋに対するポリクローナル抗体を用いた免疫染色、
図３は、抗フォドリンαサブユニットＰＥＳＴ配列に対
する抗体を用いた免疫染色を示す。図２から明らかなよ
うに、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリク
ローナル抗体は、インタクトな２３０Ｋαサブユニット
には全然反応せず、μ−カルパインから生じた１５０Ｋ
に特異的に反応した。一方、図３から明らかなように、
ＰＥＳＴ配列に対する抗体は、インタクトな２３０Ｋと
分解された１５０Ｋの両者に反応し、特異的でないこと
がわかる。

【００３５】さらに、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋ
に対するポリクローナル抗体は、よりゆっくりと産生さ
れるβサブユニットの１６０Ｋ分解産物とも反応しなか
った［図１で△で示される位置］。 （２）スナネズミ脳の虚血前後でのウエスタンブロット
による分析 上記図２で示したように、スナネズミの全脳を可溶化し
てＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロットを
行った。

【００３６】結果を図４に示す。図４（Ａ）は、フォド
リン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリクローナル抗体
を用いて染色したもの、図４（Ｂ）は、１００μｇ／ｍ
ｌの抗原ペプチドの存在下で上記ポリクローナル抗体を
用いて染色したもの、図４（Ｃ）は、免疫前のＩｇＧを
用いて染色したもの、更に図４（Ｄ）は、ＰＥＳＴ配列
に対する抗体を用いて染色したものである。また、レー
ンＮは、正常の動物（スナナズミ）の脳を用いた場合、
レーンＩは、虚血後の動物の脳を用いた場合、またレー
ンＣは、コントロールとして、フォドリン蛋白分解産物
１５０Ｋを用いた場合を示す。尚、矢印は、分子量を、
△は、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋを示す。

【００３７】図４（Ａ）のレーンＩから、スナネズミ前
脳の一時的（１０分）な虚血処理と、再灌流は、フォド
リンのαサブユニットの１５０Ｋフラグメントを産生す
ることがわかる。このことはセバート（Ｓｅｕｂｅｒ
ｔ）らの報告を再確認するものである。

【００３８】図４（Ａ）のレーンＮから、フォドリン蛋
白分解産物１５０Ｋは正常の脳には存在しないことがわ
かり、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリク
ローナル抗体は、十分特異的でＢａｃｋの非特異的染色
を生じなかった。ここで、Ｂａｃｋの非特異染色とは、
二次抗体が組織に非特異的に吸着し、抗原部位以外の背
景を非特異的に染色することをいう。

【００３９】また、図４（Ｂ）及び図４（Ｃ）からわか
るように、抗原ペプチドの存在下での染色あるいは免疫
前のＩｇＧでの染色は、１５０Ｋのバンドの消失をもた
らした。さらに、図４（Ｄ）から、フォドリンＰＥＳＴ
配列に対する抗体を用いた染色の結果は、全フォドリン
の一部のみ（５％未満）が蛋白分解されて１５０Ｋ断片
を生じていることを示している（△印）。

【００４０】（３）虚血及び再灌流後の海馬におけるフ
ォドリン分解の免疫組織化学的観察 次に、空間的な情報を得るため、虚血後の脳の免疫組織
化学的観察を行ない、海馬におけるそのプロセスの特徴
的局在を見いだした。即ち、動物の前脳を１０分間の虚
血処理した後、免疫組織化学的に観察した。一次抗体に
は、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリクロ
ーナル抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で用いた。

【００４１】結果を図５、図６、図７及び図８に示す。
図５は、コントロールとしての虚血前の正常海馬切片、
図６は、虚血処理１５分後、図７は、虚血処理４時間
後、及び図８は、虚血処理２４時間後を示す。図５〜図
８は、一時的虚血の後における海馬のフォドリン分解が
おきていることを証明するものである。虚血に先立つ通
常の状態の下では図４のウエスタンブロットの結果にし
たがって、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポ
リクローナル抗体での染色はほとんど見られず［図４
（Ａ）］、このことは生理的条件下においては基本的に
フォドリンαサブユニット分子はインタクトな２３０Ｋ
として存在することを示している。

【００４２】また、図６から、フォドリンの蛋白分解に
対応する反応性は、貫通線維（ｐｅｒｆｏｒａｎｔ ｐ
ａｔｈ）［図６において矢印で示す］、網状ー分子層
（ｓｔｒａｔｕｍ−ｌａｃｕｎｏｓｕｍ−ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｅ）［図６において２重矢印で示す］、ＣＡ３セ
クターの上昇層（ｓｔｒａｔｕｍ ｏｒｉｅｎｓ）［図
６において▲で示す］、ＣＡ１の上昇層（ｓｔｒａｔｕ
ｍ ｏｒｉｅｎｓ）［図６において▲▲で示す］に対す
る分子層のような特異的な領域において、１５分以内に
極めて明白に現われた。

【００４３】もし、この重要な裏打ち蛋白としてのフォ
ドリンの蛋白分解による修飾が、指摘されているように
（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｌｙｎｃｈ
ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ，１９９０；Ｆｒｉｅｄｒｉｃ
ｈ，１９９０）、興奮性アミノ酸レセプターの幾何学的
変化あるいはシナプスの形態変化をもたらすとしたら、
ここで観察された変化は興奮性及び興奮伝達状態の見地
から、海馬のこれらの領域における劇的な交替をもたら
すかも知れない。

【００４４】（４）フォドリンＰＥＳＴ配列に対する抗
体及び免疫前のフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対す
るポリクローナル抗体を用いた海馬の免疫組織化学 次に、虚血前後の海馬のＰＥＳＴ配列に対する抗体を用
いた免疫染色を示す。図９は、虚血前の海馬をＰＥＳＴ
配列に対する抗体で染めたものである。図１０は、虚血
１５分後の海馬をＰＥＳＴ配列に対する抗体で染めたも
のである。また、図１１は、虚血１５分後の海馬をフォ
ドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリクローナル抗
体のコントロールとして、免疫前のＩｇＧで染めたもの
である。これらから、蛋白分解の基質としてのフォドリ
ンが、基本的に海馬の全領域に存在すること、及びウエ
スタンブロットの結果により、その分布が変化していな
いことを示す［図４（Ｄ）］。

【００４５】免疫前のＩｇＧあるいは抗原ペプチドと競
合するフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリク
ローナル抗体を用いることによって、虚血後の海馬のど
こにも染色が見られないことから、観察の特異性が確認
された［図１１］。 （５）結論 ４〜２４時間で徐々に消滅する１５分後の網状ー分子層
（ｓｔｒａｔｕｍ−ｌａｃｕｎｏｓｕｍーｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒｅ）分子あるいはＣＡ３の上昇層（ｓｔｒａｔｕ
ｍ ｏｒｉｅｎｓ）の免疫反応性［図７、図８］は、部
分分解産物の濃度がさらに下がり、新たにインタクトな
フォドリンに合成され、置き変わることを示している。

【００４６】これとは極めて対象的に、最初の数時間の
間、弱い反応しか示さなかったＣＡ１セクター全体は、
２４時間前後におけるフォドリンの分解を示す強い永続
的な反応を示し始める［図８］。この反応性は虚血処理
の７日後まで続いた。

【００４７】虚血によるＣＡ１細胞の蛋白合成能の選択
的で回復不能な変性について、分解されたフォドリン分
子がこれ以後新たに合成された分子に変わらないだろう
ことを示している。ＣＡ１における蛋白分解の後期相
と、分子層やＣＡ３における初期相との間のタイムラグ
は、病理学的情報伝達の複雑で重層的な出来事がこの期
間に含まれており、初期相は多分カスケードの引き金と
なる初期段階の一つであろうことを示している。

【００４８】主に観察される神経の変性は、ただ主とし
てＣＡ１セクターにおいて、虚血ショックの２〜３日後
にスタートするにすぎないので、我々は、この後期相の
蛋白分解反応が細胞死に含まれると考えるかも知れな
い。しかしながら、重要な、傷つきやすい神経であるＣ
Ａ１の錐体細胞は、この段階でのＣＡ１の他の領域に比
べて、分解フォドリンの弱い反応を示す。このことは、
神経の変性にとってこれに続く更なるステップが必要で
あることを示している。

【００４９】反応過程の局在が、時間的経過に伴ってド
ラスチックに変わることの発見は、虚血後のカルパイン
の活性化が単に１つの細胞内における出来事ではなく、
多様な細胞間相互作用を含む病理学的な情報伝達の一部
であることを示している。貫通線維及びＣＡ３からＣＡ
１にかけての領域から移動する虚血後のフォドリン分解
の輪郭におけるいくつかの変化は、海馬の長期増強にお
いて興奮の流れが伝えられる過程と部分的には似通った
ものとなっている。この類似性は、ダイナミックな虚血
後の病理学的過程が少なくとも一部において情報伝達に
関連した器官を記憶の獲得に必要な反応のカスケードと
分かちあっていることを示す。

【００５０】以上説明したように、上記実施例によれ
ば、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリクロ
ーナル抗体によって、脳の変性における空間的情報を得
ることができた。この抗体は、上記実施例に限らず、さ
らに種々の免疫組織化学的観察に用い、あるいは種々の
免疫組織化学的観察と組み合わせて、種々の解明に役立
つことができる。

【００５１】また、上記実施例では、フォドリン蛋白分
解産物１５０Ｋに対するポリクローナル抗体を用いて観
察した結果を示したが、フォドリン蛋白分解物１５０Ｋ
に対するモノクローナル抗体についても同様に生体の空
間的情報を得るのに有用であった。

【００５２】以上本発明の実施例について説明したが、
本発明はこうした実施例に何等限定されるものではな
く、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、種々なる
態様で実施し得ることは勿論である。

【図面の簡単な説明】

【図１】カルパインによってフォドリンを分解した状態
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、クマシーブリリ
アントブルー（ＣＢＢ）によるゲルの電気泳動を示す写
真である。

【図２】カルパインによってフォドリンを分解した状態
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、フォドリン蛋白
分解産物１５０Ｋに対するポリクローナル抗体を用いて
免疫染色した電気泳動を示す写真である。

【図３】カルパインによってフォドリンを分解した状態
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した、ＰＥＳＴ配列に
対する抗体を用いで免疫染色した電気泳動を示す写真で
ある。

【図４】スナネズミ脳の虚血前後でウエスタンブロット
により分析した電気泳動を示す写真であり、（Ａ）はフ
ォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポリクローナル
抗体を用いて染色したもの、（Ｂ）は１００μｇ／ｍｌ
の抗原ペプチドの存在下で上記ポリクローナル抗体を用
いて染色したもの、（Ｃ）は免疫前のＩｇＧを用いて染
色したもの、更に（Ｄ）はＰＥＳＴ配列に対する抗体を
用いて染色したものを示す。

【図５】虚血前の正常海馬切片におけるフォドリン蛋白
分解産物１５０Ｋに対するポリクローナル抗体により免
疫染色した生物の形態を示す写真である。

【図６】虚血処理１５分後におけるフォドリン分解の進
行過程を示すフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対する
ポリクローナル抗体により免疫染色した生物の形態を示
す写真である。

【図７】虚血処理４時間後におけるフォドリン分解の進
行過程を示すフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対する
ポリクローナル抗体により免疫染色した生物の形態を示
す写真である。

【図８】虚血処理２４時間後におけるフォドリン分解の
進行過程を示すフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対す
るポリクローナル抗体により免疫染色した生物の形態を
示す写真である。

【図９】ＰＥＳＴ配列に対する抗体を用いて虚血前の海
馬を免疫染色した生物の形態を示す写真である。

【図１０】ＰＥＳＴ配列に対する抗体を用いて虚血１５
分後の海馬を免疫染色した生物の形態を示す写真であ
る。

【図１１】フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋに対するポ
リクローナル抗体のコントロールとして、免疫前のＩｇ
Ｇを用いて虚血１５分後の海馬を免疫染色した生物の形
態を示す写真である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルパインによって特異的に分解された
   フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの分解部位に特異的な
   抗体。
2. 【請求項２】 上記抗体がポリクローナル抗体であっ
   て、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの分解部位である
   Ｎ末端に対応するペプチドを合成し、該ペプチドにキャ
   リヤー蛋白質を結合させ、精製した後、これを生体内に
   免疫してポリクローナル抗体を作製させ、該ポリクロー
   ナル抗体を採取し、精製することを特徴とする請求項１
   記載の抗体の作製方法。
3. 【請求項３】 上記抗体がモノクローナル抗体であっ
   て、フォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの分解部位である
   Ｎ末端に対応するペプチドを合成し、該ペプチドにキャ
   リヤー蛋白質を結合させ、精製した後、これを生体内に
   免疫してポリクローナル抗体を作製させ、上記生体の脾
   臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させてハイブリドーマ
   細胞を製造し、該ハイブリドーマ細胞を培養することに
   よって産生させたモノクローナル抗体を採取し、精製す
   ることを特徴とする請求項１記載の抗体の作製方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の抗体を用いることを特徴
   とするフォドリン蛋白分解産物１５０Ｋの認識方法。