JPH08505405A

JPH08505405A - ウィルスのエアロゾールの調製方法

Info

Publication number: JPH08505405A
Application number: JP7512453A
Authority: JP
Inventors: クロードセネ; ディディエールラミィ
Original assignee: トランスジーンソシエテアノニム
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 1996-06-11
Anticipated expiration: 2023-07-02
Also published as: JP4110329B2; US6582694B2; CA2152505C; FR2711523A1; US5952220A; EP0680315A1; ES2152993T3; AU8063994A; DE69426596T2; CA2152505A1; EP0680315B1; US6344194B1; GR3035541T3; DK0680315T3; US20020106349A1; AU683954B2; DE69426596D1; PT680315E; FR2711523B1; WO1995011664A1

Abstract

(57)【要約】６〜１２ｇ／ｌの１価のカチオンの塩、または５０〜１００ｇ／ｌのヘキソースを含む水溶液中にウィルスを溶解することにより調製された希釈ウィルス懸濁液から、次に、０．５〜３．５バールのガス圧または２〜５ＭＨｚの超音波周波数を用いて噴霧化してウィルスのエアロゾールを調製する方法。得られるエアロゾール組成物も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ウィルスのエアロゾールの調製方法本発明は、ウィルスを含むエアロゾール（aerosol）の調製方法に関する。種々の物質、特に医薬物質のエアロゾール製剤は、非常に長い間、知られている。安定性および無視できる沈降率が、エアロゾールの必須の特徴をなす。他方、この理由の故に、粒子が互いに凝集したり、あるいは高い沈降率のような優れた有効性と相容れない特性を防止するために、構成成分の配合割合は、特に湿気および温度の程度のような異なる外界のパラメーターによる多数の特定の制約を満足させねばならず、他方で、その製剤は、吸収された有効成分が迅速に分解する傾向がある、空気の汚染物質に対する気道の防御（清浄化メカニズム）の効率に主として関連する多数の困難な事態を考慮に入れなければならない。特に、有効成分が、ウィルスから成る場合、ウィルス粒子の完全性（integrit y）が、肺上皮の細胞への感染および侵入に必要であり、それによりエアロゾールを得るための非常に特殊な条件を負荷することになる。一般的に言えば、エアロゾール化（aerolization）する間、ウィルスは、３つの主たる理由の結果、不活化され得る。先ず、感染力の消失が、噴霧化（nebulization）の過程（気道中への噴霧）の際にウィルスが被る障害の結果として生じ得、それはまた、脱水によりエアロゾール中で不活化され得、そして最後には、気道の全体を覆い非常に多数の（タンパク質分解およびその他の）酵素を有する粘液により示される潜在的に不利な環境中で分解され得る。ウィルス不活化は、エアロゾールを得るために特定の条件の噴霧化およびパッケージングを使用する本発明の方法を適用することにより制限され、適当な限度内に維持され得ることが示されている。さらに、この方法は、ウィルスを、肺、特に気管気管支の通路に、効果的に適切な量で、送り込むことを可能にする。従って、本発明の主題は、特に哺乳動物の気道を介して投与することを可能にする、ウィルスのエアロゾールを得るための方法であり、以下により特徴付けられる：（ａ）少なくとも６〜１２ｇ／ｌの１価のカチオンの塩または５０〜１００ｇ／ｌのヘキソースを含む水溶液中に、１０⁴〜１０¹³プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウィルスを含むウィルス懸濁液の希釈物に対応する、希釈ウィルス懸濁液を調製し；（ｂ）希釈ウィルス懸濁液を、０．５〜３．５バールの空気圧または２〜５ＭＨｚの超音波周波数を用いて噴霧化（nebulize）する。本発明に従う方法は、エアロゾールにより投与され得る非常に多数のウィルス、特に、ポックスウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノ関連性ウィルス、ライノウィルス、インフルエンザウィルスおよびアデノウィルスからなる群から選ばれるウィルスに適用可能である。本発明の論旨において、用語「ウィルス」は、自然界に見出されるような天然のウィルス、およびゲノムが、それが起源とする親ウィルスに対して改変を含む修飾されたウィルスの両方を表す。それは、それが由来する天然のウィルスに対して、その病原性の全てまたは一部を失った、弱毒化されたウィルスであることができる。そのゲノムは、インビボで、細胞培養中または生物中の、連続的な継代の過程で修飾される。用語「ウィルス」はまた、そのゲノムが、インビトロで遺伝子工学的技法により修飾された、組換えウィルスを指すこともできる。この修飾は、例えば、ウィルス複製に必須な少なくとも１つの遺伝子が不活化されるのを可能とし（ウィルスを複製に関して不完全なものにする）、および／または異種タンパク質（天然ウィルスにより通常コードされない）をコードするＤＮＡフラグメントが挿入されるのを可能にする。挿入は、ウィルスゲノムの適切な領域で起こり、異種ＤＮＡフラグメントの宿主細胞内での発現を可能にする。宿主細胞は、該ウィルスにより感染され得るあらゆる真核生物、有益にはヒトの細胞および好ましくは気管気管支の通路の上皮細胞から構成される。本発明の目的のために、異種ＤＮＡフラグメントは、真核生物に、または、それが中に挿入されるもの以外のウィルスに由来することができる。それは、当分野において慣用されているあらゆる技法、例えば、クローニング、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または化学合成により、単離され得る。それは、ゲノム型ＤＮＡ（天然遺伝子のイントロンのセットを全部または一部含む）、相補的ＤＮＡ型（ｃＤＮＡ；イントロンを欠く）またはミニ遺伝子、即ち、混合された型（少なくともイントロンを全部または一部を含む）のフラグメントであり得る。本発明により追求される目的に従って、異種ＤＮＡフラグメントは、その発現に必要とされるエレメントの制御下に、置かれ得る。「必要とされるエレメント」とは、該ＤＮＡフラグメントのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、またはｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を可能とする、エレメントのセットを表す。異種ＤＮＡフラグメントは、（ｉ）細胞内タンパク質、（ｉｉ）宿主細胞の表面に存在する膜タンパク質、または（ｉｉｉ）外界の培地に分泌されるタンパク質をコードすることができる。従って、それは、膜に向かって、または宿主細胞の外側にタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列を含むことができる。エアロゾールによる投与から恩恵を受けることが可能な多くの組換えウィルスは、当技術分野で記載されている。それらの構築および増殖は、当業者の能力の範囲内にある。例として、α１−アンチトリプシン（α１ＡＴ）をコードするヒト遺伝子がそのゲノムに挿入されているＡｄ−α−１ＡＴ（Rosenfeldら、1991 、Science、252、431-434）、およびＣＦＴＲ（英語では、嚢胞性線維症（Cysti c Fibrosis）の貫膜コンダクタンスレギュレ-ター）タンパク質をコードするヒト遺伝子がそのゲノムに挿入されているＡｄ−ＣＦＴＲ（Rosenfeldら、1992、C ell、68、143-155）が、言及され得る。本発明に従う方法は、希釈ウィルス懸濁液の調製物を含む。この希釈懸濁液は、少なくとも６〜１２ｇ／ｌの１価のカチオンの塩または５０〜１００ｇ／ｌのヘキソースを含む水溶液中に１０⁴〜１０¹³ｐｆｕのウィルスを含む、ウィルス懸濁液の希釈物に対応する。この工程では、希釈されるべき懸濁液は、一般に、必要に応じて、マグネシウム、カルシウムまたはマンガンのような２価のカチオンを含む緩衝培地に播かれたウィルスから構成される。このタイプの懸濁液も、貯蔵に使用できる。凍結形態での貯蔵のためには、該懸濁液は、少なくとも１０％の濃度のグリセロール、または約１Ｍの濃度のシュクロースのような安定剤を添加されるべきである。希釈されるべきウィルス粒子の懸濁液は、必要に応じて、他の物質、特にヒト血清アルブミン（HSA）、尿素、グルタミン酸ナトリウム、グリシンおよびイノシトールを含むことができる。本発明の方法に従うと、ウィルス懸濁液は、ウィルスを１０⁴〜１０¹³、有益には１０⁶〜１０¹²および好ましくは１０⁸〜１０¹¹ｐｆｕ含むことが必要であり；この懸濁液の活性は、特に使用されるウィルスに依存することがあり得る。希釈されるべきこの懸濁液は、次に、懸濁液／水溶液の体積比が、１：５〜１：２０、有益には１：１０〜１：２０、好ましくは１：１２〜１：１８、および特に好ましいものとして約１：１６に従うように、水溶液で希釈される。該水溶液は、好ましくは、１価のカチオンの塩、好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩、および特に好ましいものとして塩化カリウム、乳酸ナトリウムおよび／または塩化ナトリウムを６〜１２ｇ／ｌ含む。１価のカチオンの塩の濃度は、好ましくは６〜１０ｇ／ｌ、特に好ましいものとして約９ｇ／ｌである。水溶液が、ヘキソースを５０〜１００ｇ／ｌ、好ましくは約５０ｇ／ｌ含むとき、考えられるヘキソースは、特にグルコースおよびマンノースである。さらに、水溶液は、カルシウム塩、例えば塩化カルシウムのような他の化合物を含むことができる。このように希釈された懸濁液は、気道において、ウィルスがそこを通過可能なほどに十分な、特別の安定性を付与されたエアロゾールを製造するのを可能とする。当然、他の操作手順により、対応するウィルス懸濁液を得ることが可能である。希釈懸濁液の噴霧化は、ガス圧によるかまたは超音波により達成され得る。この噴霧化の条件も、本方法の実行の重要なパラメーターを構成する。本発明に従う方法の好ましい実施態様によれば、希釈懸濁液を、０．５〜３．５バール、特に好ましいものとして２〜３．５バールのガス圧にかける。あるいは、それを、２〜５ＭＨｚの、特に好ましくは約２〜３ＭＨｚの超音波周波数にかけても良い。ガス圧および超音波周波数も、噴霧器（nebulizer）により適用して良い。一般的に言えば、噴霧器は、エアロゾールの投与を可能にする装置である。噴霧器は、いかなるタイプのものでも良く、その構造は、当業者に公知であり、これらの装置は市販されている。使用される本方法が、ガス圧の適用を必要とするとき、空気または医療用酸素のような圧縮ガスの源または空気ポンプのいずれかに接続された、空気式タイプの噴霧器が、好適に使用される。希釈ウィルス懸濁液を超音波周波数で噴霧化に関しては、超音波タイプの噴霧器で、高い周波数で振動する水晶結晶板を取り付けたものを使用するのが好ましい。本発明に従う方法は、治療的目的を意図したエアロゾールの調製に特に最も十分に適しており、気道の気管気管支の通路の中に最適な量のウィルス粒子を送り込む。一般的に言えば、人間では、気道は、３つの異なる領域から構成される： − 鼻から気管の上端にまたがる上部（upper part）； − 気管の上端から終末の細気管支にまたがる気管気管支の通路；および − 細気管支から肺胞嚢にまたがる肺胞領域。本発明に従う方法を使用することにより治療されることが可能な疾病の中で、気管気管支の通路に影響を与える肺疾患、特に嚢胞線維症、肺気腫、ぜん息および肺癌が言及され得る。この論旨の中では、本発明に従う方法を遂行することにより送り込むのに有利であるウィルスは、好ましくは、そのゲノムが、特に肺疾患の進行を阻止するか遅らせる、またはそれが確立するのを防ぐことが可能な、異種タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを含むゲノムを有する組換えウィルスである。異種タンパク質の中で、以下のものが可能であるものとして言及され得る： − 細胞膜を介して、直接的または間接的にイオンを移送すること、より詳細には、塩素（Ｃｌ^-）またはナトリウム（Ｎａ⁺）イオンの移送に関係する、例えばＣＦＴＲタンパク質（Riordanら、Science、245、1066-1073）； − 肺の、特に炎症状態に存在するプロテアーゼの活性を減少させる、例えば天然のα１ＡＴ（Longら、1984、Biochemistry、23、4828-4837）または修飾された α１ＡＴ（Jallatら、1986、Protein Engineering、１、29-35）；および − 細胞性免疫を強化することにより腫瘍細胞の増殖をを阻害する、例えばインターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および腫瘍抑制活性を有することにより腫瘍細胞の増殖を阻害する、例えばタンパク質ｐ５３（Bakerら、1989、Science、244、217-221）またはＲｂ（Fr iendら、1986、Nature、323、643646)。このリストは、限定的なものではない。文献中に、肺組織の破壊に関する、それらの抗腫瘍効果または抑制効果について記載されている他のタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを使用して良い。最後に、本発明はまた、以下に従う方法：（ａ）希釈ウィルス懸濁液を少なくとも６〜１２ｇ／ｌの１価のカチオンの塩又は５０〜１００ｇ／ｌのヘキソースを含む水溶液中に１０⁴〜１０¹³ｐｆｕのウィルスを含むウィルス懸濁液の希釈物に対応するように調製する；（ｂ）希釈ウイルス懸濁液を、０．５〜３．５バールのガス圧または２〜５ＭＨｚの超音波周波数で噴霧化する、方法により調製されるエアロゾールを、気道の疾病、特に人間の肺疾患の、そのような治療を必要とする患者の鼻腔または口腔で、吸入により投与する方法にも関する。吸入は、１回の用量もしくは一定時間の間隔をおいて１又は数回繰り返す用量で、行うことができる。本発明は、以下の実施例により、より完全に説明される。実施例１１０％のグリセロールの存在下に貯蔵され、１価のカチオン溶液で希釈されたウィルス懸濁液由来のエアロゾールの調製ローゼンフェルト（Rosenfeld）ら（１９９２、上記）に記載されたようにして、ＣＦＴＲタンパク質（Ａｄ−ＣＦＴＲ）をコードするヒト遺伝子がゲノムに挿入された組換えアデノウィルスからウィルス懸濁液を調製する。簡単に言うと、それはアデノウィルス・タイプ５に由来し、該ウィルスのゲノムは、一方ではアデノウィルスの複製に必須であるトランス−活性化タンパク質（trans-activating protein）をコードするＥＩＡ遺伝子を欠き、他方では必須ではないＥ３遺伝子を欠いている。ＣＦＴＲ遺伝子は、ＥＩＡ遺伝子の代わりに挿入されている。Ａｄ−ＣＦＴＲは、ヒト胎児腎細胞株２９３（グラハム（Graham）ら、１９７７、Ｊ．Gen．Virol.，３６、５９ −７２）により増やされ、該細胞株はＥ１機能を構成的に発現する。この株は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ１５７３）で利用可能である。該２９３細胞は、供給者の推薦に従い培養される。培養中の細胞は、Ａｄ−ＣＦＴＲウィルスの最初のイノキュラム（inoculum）との融合の前に２〜１０倍の感染の多重度（ｍｏｉ）に従い感染される。それらは３７℃でインキュベートされ、細胞変性効果が観察されるとすぐに、通常は４〜１０日間の培養後であるが、ウィルスは以下のプロトコールに従い収穫される。細胞懸濁液は、低速で１０分間遠心分離される。細胞ペレットは、２％ウシ胎児血清を添加された約１０ｍｌのＧＭＥＭ培地（グラスゴー・モディファイド・イーグル・メディウム（Glasgow Modified Eagle Medium），Gibco BRL，Cergy- Pontoise）に再懸濁される。ウィルスは、エタノール−ドライアイス浴／３７℃ の水浴中の、数回の連続した凍結／解凍サイクルにより細胞から分離される。最後のサイクルに続き、細胞の破片を５〜１０分間の低速遠心分離により除去する。ウィルスは、各々１．４０及び１．２５ｇ／ｍｌの２つの密度層を有する塩化セシウム・グラジエントでの分別により遠心分離の上清から精製される。遠心分離は、室温で、100,000gで数時間行われる。ウィルスは、２つの層の界面に位置する白いバンドの形態で現れ、シリンジを用いて回収される。それらは、１．３３ｇ／ｍｌを含む溶液を用いて調製された、自然発生の塩化セシウム・グラジエント上で第２の精製に供される。ウィルスは、同様にシリンジでチューブを刺すことにより回収され、１／１０倍容量と等価のグリセロールを加える。塩化セシウムは、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４、１ｍＭＭｇＣｌ₂、及び１０％グリセロールを含む緩衝液に対する透析により除去される。かくして得られたウィルス懸濁液の力価は、カンテン中の滴定法または３０ｈに従い正確に測定される（Graham及びPrevec，1991，Methods in Molecular Bio logy，7，109-128，E．J．Murray編，The Human Press Inc．Clinton，NJ）。懸濁液は、各々５×１０⁹から５×１０¹⁰ｐｆｕを含むようにチューブ（Nunc又はN algene）中に１００μｌのアリコートに分配される。これらのチューブは、貯蔵ウィルス懸濁液を構成し、使用時まで−６０℃で保存される。使用時には、９ｇ／ｌ（Meram，Melun）を含む塩化ナトリウム溶液１．５ｍｌを、１００μｌのＡｄ−ＣＦＴＲ懸濁液（１０⁷、１０⁸又は１０⁹ｐｆｕの濃度）に加える。実施されたコントロールは、かくして得られた希釈ウィルス懸濁液の力価が室温で数時間安定であることを示す。加速安定性の研究も、３７℃で行われた。異なる濃度（１０⁹、１０⁷、１０⁵ ｐｆｕ／ｍｌ）へのウィルス懸濁液の上記塩化ナトリウム溶液中の希釈の後、各希釈液のサンプルを規則的な間隔（ｔ＝０ｈ、２ｈ、４ｈ及び２４ｈ）で採り、ウィルス感染性がカンテン又は３０ｈ技術で滴定される。希釈ウィルス懸濁液の３７℃での３時間以上の安定性が、特に高濃度（１０⁹及び１０⁷ｐｆｕ／ｍｌ）で観察される。エアロゾールは、希釈ウィルス懸濁液をoptineb 709噴霧器（Air Liquide，Pa ris）の貯蔵器中に配置することにより製造される。後者は、高圧で作動し、キャリヤーガスを選択できる空気式製造装置である。それは、圧縮空気の源に接続され、そして種々の圧力のメディカル・エアーが適用される。エアロゾール化試験は、膵嚢胞性繊維炎（cystic fibrosis）を患う患者に適用するための最適条件を評価するために行われる。特に、圧力（１〜３．５バール）及び呼吸速度の影響が検討される。後者は１分間当たりの呼吸数を定義し、装置のセッティングにより予め決められる。この意味で、位置７のセッティングは、子供の呼吸速度に相当し、位置９は大人の呼吸速度に相当する。エアロゾール化は、３工程（ウィルス懸濁液の希釈、次いで塩化ナトリウム希釈液でカップを２回リンスする）で行われる。optinebは、自己誘発性（self-tr iggering）にセットされ、トラップ又はコレクター、例えばコレクトロンＭＤ８（Sartorius，Palaiseau，FRANCE）に接続され、その末端に噴霧後にウィルス粒子を回収できるゼラチン濾過膜が固定される。この膜は次いで１０ｍＭトリス− 塩酸緩衝液、ｐＨ７．４、１ｍＭＭｇＣｌ₂、及び１０％グリセロール中３７ ℃で溶解され、回収されたウィルスの感染性が３０ｈ及びカンテン技術により滴定される。この測定は、患者の気道に入ることのできる活性なウィルス量を評価できる。異なる試験条件下で相対的に繰り返し、補足された感染性ウィルスはウィルスの最初の数の１５〜４０％を示す。幾分変異が観察されたが、最良の回収収率は高圧（３．５バール）で得られ、これは両方のセット位置での場合である。指針として、エアロゾール化により適用される医療用製品の回収率は通常約１０％である。これらの結果は、膵嚢胞性繊維炎を患う患者の治療に、Ａｄ−ＣＦＴＲ組換えアデノウィルスのエアロゾール化の用途を認識できる。実施例２１Ｍシュクロースの存在下に貯蔵され、１価のカチオン溶液で希釈された貯蔵されたウィルス懸濁液由来のエアロゾールの調製以下のバリアントを用いて実施例１を繰り返す：第２の塩化セシウム・グラジエント後のウィルスの回収後に、ウィルスは１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．４、１ｍＭＭｇＣｌ₂、及び１Ｍシュクロースに対して透析される。エアロゾール化試験は、３．５バールの圧力及び位置９のoptinebのセッティングで実施例１に記載したように行われる。２７％の活性なウィルス粒子の回収率が得られる。実施例３グルコース溶液で希釈されたウィルス懸濁液由来のエアロゾールの調製以下のバリアントを用いて実施例１を繰り返す：１００μｌのウィルス懸濁液を、１．５ｍｌの５０ｇ／ｌを含むグルコース溶液（Laboratoire Chaix du Marais Lavoisier，Paris）に加えることにより希釈ウィルス懸濁液を調製する。該希釈ウィルス懸濁液を３７℃で、希釈がグルコース溶液で行われる以外は実施例１で定義されたのと同じ条件下に加速安定性研究に供されると、ウィルス活性が２時間を越えて安定であることが観察される。実施例４超音波振とうによるエアロゾールの調製以下のバリアントを用いて実施例１を繰り返す：エアロゾールが、ＳＡＭＬＳ超音波噴霧器（System Assistance Medical，L eLedat，France）を用い、供給者の推薦に従い使用して製造される。実施例１に従い得られる希釈ウィルス懸濁液は、噴霧器のカップに導入され、２．４ＭＨｚの周波数で振動する水晶結晶板により生み出される超音波振動に供される。これらの条件下で、回収率は１０％のオーダーである。実施例５霊長類の前臨床試験これらの試験の目的は、組換えアデノウィルスのエアロゾール化がインビボでのＣＦＴＲ遺伝子の肺細胞への移動を許容することを確立し、治療の毒性を評価することにある。Ａ．方法該実験は、５匹のアカゲザル（Mecaca mulatta）（TN0 Center for Animal Re search，Rijswijk，Holland）を含む。選択された動物は、良好な健康状態で、体重５〜１０ｋｇである。それらは３つのグループに分けられた：グループ１は単一用量のＡｄ−ＣＦＴＲを第１のサルは高用量（7.5×10⁹pfu）、第２は低用量（1.5×10⁷pfu）投与される（Ｄ＝０）２匹のサルからなる。それらは、Ｄ＋１０で犠牲になる。グループ２は１０日間隔で（Ｄ＝０及びＤ＋１０）等しい用量のＡｄ−ＣＦＴＲ（各々7.5×10⁹pfu及び1.5×10⁷pfu）を２回投与される２匹のサルからなる。それらは、Ｄ＋１３で犠牲になる。コントロール群は、グループ２に適用されるプロトコール（Ｄ＋１３に犠牲になる前にＤ＝０及びＤ＋１０の連続２回投与）に従いコントロール液（１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．４、１ｍＭＭｇＣｌ₂、及び１０％グリセロール）で処置される１匹のサルを含む。上記濃度に調整された１００μｌのＡｄ−ＣＦＴＲ溶液（グループ１及び２）、または１００μｌのコントロール溶液（グループ３）が、９ｇ／ｌ含む塩化ナトリウム希釈溶液１．５ｍｌに加えられ、optineb装置のカップに配置される。噴霧化は、気管に導入され、噴霧器に接続されたたチューブを介して麻酔されたサルに行われる。操作条件は、以下の通りである：位置７のセッティング、医療用空気圧３．５バール及び２段階の噴霧化（希釈ウィルス溶液の投与、続く８００μｌの希釈液によるすすぎ）。Ｂ．ウィルスの伝播力の分析各々組換え又は野生株ウィルス粒子の存在を試験するために、各動物の糞便を規則的に集め、許容される２９３またはＨｅｐＧ２細胞上で培養する。約３及び７日の培養の後、そのような粒子が例えばアデノウィルス５カプシドタンパク質（Bio-Science 012070）を認識する抗体のような特異的なモノクローナル抗体を用いた間接免疫蛍光法（indirect immunofluorescence ）により検出される。これらの分析により、実験のすべてのサルで陰性であることが証明され、それは環境中へのウィルスの伝播のリスクが低いかゼロでさえあることを示している。Ｃ．インビボでのＣＦＴＲ遺伝子の転移の分析使用される方法論は、Boutらに記載される（1994、Hum．Gene Therapy，5，3- 10）。簡単に言うと、主要な臓器（肝臓、睾丸など）と同様に気管の全長にわたり分布する組織サンプルが犠牲になった動物から除去される。ＤＮＡが抽出されると、アデノウィルスの配列が、各々ＯＴＧ３０４２（配列番号１、ＣＦＴＲ配列とハイブリダイズする）及びＯＴＧ４３４７（配列番号２、アデノウィルス・タイプ５配列を認識する）であるＣＦＴＲ発現カセットおよびアデノウィルスベクターの接合部に位置するＡｄ−ＣＦＴＲに特異的なプライマーを用い、ＰＣＲにより試験される。３０回の増幅サイクルの終わりに、ＰＣＲ産物がアガロースゲル電気泳動により分離され、³²Ｐを用いたリン酸化により標識された特別なプローブ（配列番号３）とハイブリダイズされる前に、Hybond N+膜（Amersham）上に移動される。高ウィルス用量（7.5×10⁹pfu）で処理されたグループ１及び２のサルの気管及び肺中にのみ特異的なシグナルが得られる。試験された他のすべての臓器は陰性であることに注目することは興味深い。 1.5×10⁷pfuのウィルス用量を受けたサルのアデノウィルス配列の存在を検出するために、技術の感度を増加させる必要がある。この目的で、ＰＣＲの最初の３０サイクルの後、ＯＴＧ３０４２および内部プライマーＯＴＧ４９０８（配列番号：４）を用いてさらに３０サイクルを行う。ＰＣＲ産物は、次いで上記のように処理される。気管から除去されたサンプルの約半分にシグナルが得られる。従って、エアロゾールによる肺へのウィルス投与は用量依存的であるように思われる。当然に、ハイブリダイゼーションはコントロールのサルについては陰性である。全体として、これらの結果は、Ａｄ−ＣＦＴＲが標的器官、すなわち気管に含まれたままであることを示す。Ｄ．ＣＦＴＲ遺伝子のインビボでの発現ヒトＣＦＴＲ遺伝子の発現が、ＲＮＡの逆転写及び引き続くＰＣＲの技術により気管から除去されたサンプルについて検討される（ショルディナー（Shouldiner）ら、1993，in Methods in Molecular Biology，15 ，169-176，編：ホワイト，Human Press Inc，Totowa，NJ）。この技術は、高度に特異的であるという利点があり、ヒトＣＦＴＲをコードするｍＲＮＡの存在が視覚化できるであろう。ＲＮＡが通常の技術によりサンプルから単離される。１ μｇの全ＲＮＡが、MoMLV（Moloney Murine Leukemia Virus）逆転写酵素の存在下に、５’末端にユニーク同定配列（英語ではｔａｇと表現される）を有するプライマーを用いて逆転写される。より正確には、該プライマー（ＯＴＧ５９８７；配列番号：５）は、３０ヌクレオチドの同定配列及びポリアデニレーション・シグナルに相当し、Ａｄ−ＣＦＴＲの転写に始まるＣＦＴＲｍＲＮＡの再会合を許容する１７ヌクレオチドを包含する。ＰＣＲは次いで、最初の３０増幅サイクルの間、プライマーＯＴＧ５９８８（配列番号：６）及びＯＴＧ５９９９（配列番号：７ＯＴＧ５９８７の同定配列に相当する）を用い、さらに次の３０サイクルの間、ＯＴＧ５９８８およびＯＴＧ４７４１（配列番号：８）を用いて上記反応混合物について直接に実施される。増幅産物は上記のように分析される。ヒトＣＦＴＲｍＲＮＡが、7.5×10⁹pfuのウィルス用量を１又は２回投与したサルの肺小葉のサンプル中に検出される。一方、コントロールのサル又は低ウィルス用量を受けたサルから始まるサンプル中にはシグナルは検出されない。これらの結果は、適当な投与量のＡｄ−ＣＦＴＲの噴霧化は、肺細胞の機能的なＣＦＴＲ遺伝子を発現する結果となることを示し、特に遺伝子治療による膵嚢胞性繊維炎の治療の観点を勇気づけるものである。Ｅ．病理学一般的に言えば、Ａｄ−ＣＦＴＲの噴霧化は、サルの体重減少又は異常行動、あるいは血液学的又は生化学的血清パラメーターの有意な障害に関与しない。肺機能をより正確に評価するために、死後の組織病理学的分析が、ボウト（Bo ut）ら（１９９４、上記）に記載の方法論に従い、気管の異なる部分から除去された組織の切片について行われる。これらの切片は、肺上皮の炎症及び損傷の兆候を探す観点から検査される。結果は以下の通りである。すべてのサルについて、肺の構造は無傷であった。軽微な炎症発現及び落屑性の化成が観察されたが、それらはコントロールのサルにも存在するため、Ａｄ−ＣＦＴＲの投与とは無関係である。しかしながら、低度の追加の損傷（脈管周囲及び気管支周囲のリンパ球の浸潤及び間質性肺炎）が高ウィルス用量を受けた２匹のサルで見られたが、グループＩの動物（7.5×10⁹pfuの用量を１回噴霧化）とグループIIの動物（7.5×10⁹pfu の用量を２回噴霧化）の間で有意な相違は明らかでない。結論として、Ａｄ−ＣＦＴＲのエアロゾールによる投与は、処置されたすべての動物により十分に耐えられる。これらの研究は、Ａｄ−ＣＦＴＲ組換えウィルスが肺に含まれたままであり、体内に伝播しないことをチェックすることができる。肺損傷が、高ウィルス用量の投与に続き観察されるが、これらは重大な病状を導くことはないように見える。これらの前臨床試験により、ヒトの治療も可能であると結論付けることができる。実施例６膵嚢胞性繊維炎の治療法実施例１を、以下のバリアントを用いて繰り返す。エアロゾールが、Optineb 709の貯蔵所に実施例１の希釈ウィルス懸濁液を配置することにより製造され、後者は患者の呼吸速度により適当な位置（７または９）にセットされる。１００μｌが引き続く分析のためにサンプルとされた後、該装置は医療用空気の供給源と接続される。該装置のバッカルノズルが、膵嚢胞性繊維炎を患う患者の口内に配置され、３．５バールのガス圧力がかけられる（第１の噴霧化）。気管でのエアロゾールの噴霧化は、患者の吸気により引き起こされる。噴霧化は、呼気相の始まる前に中止し；それにより材料の損失と環境中へのエアロゾールの放出を避けることができる。各吸気で送り込まれるエアロゾールの用量は、患者の呼吸能力により調節される。３０〜４０サイクル／分の呼吸速度を持つ乳児には、１噴霧（puff）当たりの平均投与量は１．８μｌである。２０〜２５サイクル／分の呼吸速度を持つ子供には、各噴霧で３．２μｌの用量が投与される。最後に、平均１５〜２０サイクル／分の呼吸速度を持つ成人には、各噴霧で５μｌ量のエアロゾールが投与される。これらの基準によると、１６０のエアロゾールの噴霧が成人に送り込まれ、初期希釈ウィルス溶液の約半分に相当する量が噴霧できる。この第１シリーズの吸入の直後に９ｇ／ｌを含む塩化ナトリウム溶液９００μ ｌが、噴霧器の貯蔵所に加えられる。上記のように、３．５バールのガス圧力がかけられ、１６０の噴霧を含む第２シリーズの吸入が行われる。最後に、装置の貯蔵所に９ｇ／ｌを含む塩化ナトリウム溶液９００μｌのが導入された後、同一条件下に第３シリーズが行われる。配列表（１）一般情報：（i）特許出願人（A）名称：トランスジーンソシエテアノニム（B）通り：１１リュドゥモルシャイ（C）市：ストラスブール（E）国：フランス（F）郵便番号：６７０８２（G）電話番号：（33）88 27 91 00 （H）FAX番号：（33）88 22 58 07 （ii）発明の名称：ウィルスのエアロゾールの調製方法（iii）配列の数：８（iv）コンピューターリーダブルフォーム：（A）メディウムタイプ：テープ（B）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換性（C）オペレーティングシステム：PC-D0S/MS-DOS （D）ソフトウエア：Patentln Release ♯1.0 Version ♯1.25（EPO）（２）配列番号１の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：２３塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源（A）生物名：ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡ（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ３０４２（xi）配列：配列番号：１：（２）配列番号２の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：２１塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源（A）生物名：アデノウィルスタイプ５（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ４３４７（xi）配列：配列番号：２：（２）配列番号３の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：２４塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源（A）生物名：ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡ（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ４９０５（xi）配列：配列番号：３：（２）配列番号４の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：２４塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源（A）生物名：アデノウィルスタイプ５（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ４９０８（xi）配列：配列番号：４：（２）配列番号５の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：４７塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ５９８７（xi）配列：配列番号：５：（２）配列番号６の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：３０塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源（A）生物名：ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡ（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ５９８８（xi）配列：配列番号：６：（２）配列番号７の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：３０塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ５９９９（xi）配列：配列番号：７：（２）配列番号８の情報：（i）配列の特徴（A）長さ：２５塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源（A）生物名：アカゲザルマカクポリオーマウィルス（ＳＶ４０）（C）個体・単離クローン名：合成オリゴヌクレオチド（vii）直接の起源（B）クローン：ＯＴＧ４７４１（xi）配列：配列番号：８：

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）少なくとも６〜１２ｇ／ｌの１価のカチオンの塩または５０〜１００ｇ／ｌのヘキソースを含む水溶液中に１０⁴〜１０¹³ｐｆｕのウィルスを含むウィルス懸濁液の希釈物に対応する希釈ウィルス懸濁液を調製し；および（ｂ）該希釈ウィルス懸濁液を０．５〜３．５バールのガス圧または２〜５ＭＨｚの超音波周波数を用いて噴霧化することを特徴とする、特に哺乳動物の気道を介してその投与を可能にするウィルスのエアロゾールの製造方法。２．希釈ウィルス懸濁液を０．５〜３．５バールのガス圧で噴霧化することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．希釈ウィルス懸濁液を２〜３．５バールのガス圧で噴霧化することを特徴とする請求項１および２のいずれか１つに記載の方法。４．前記希釈ウィルス懸濁液を２〜５ＭＨｚの超音波周波数で噴霧化することを特徴とする請求項１に記載の方法。５．希釈ウィルス懸濁液を２〜３ＭＨｚの超音波周波数で噴霧化することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。６．ウィルス懸濁液がアデノ関連性ウィルスまたは組換えアデノウィルスの懸濁液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。７．前記希釈がウイルス懸濁液／水溶液の体積比が１：５〜１：２０に従うようになされることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。８．前記希釈がウイルス懸濁液／水溶液の体積比が１：１０〜１：２０に従うようになされることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記希釈がウイルス懸濁液／水溶液の体積比が１：１２〜１：１８に従うようになされることを特徴とする請求項７に記載の方法。１０．少なくとも１０⁴〜１０¹³ｐｆｕのウィルスを含むウィルス懸濁液を６〜１２ｇ／ｌの１価のカチオンの塩を含む水溶液中に希釈することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。１１．ウィルス懸濁液を塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群から選ばれた１価のカチオンの塩を６〜１２ｇ／ｌ含む水溶液中に希釈することを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．ウィルス懸濁液を約９ｇ／ｌの１価のカチオンの塩を含む水溶液中に希釈することを特徴とする請求項１０および１１のいずれか１つに記載の方法。１３．１０⁴〜１０¹³ｐｆｕのウィルスを含むウィルス懸濁液を５０〜１００ｇ／ｌのヘキソースを含む水溶液中に希釈することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。１４．グルコースおよびマンノースからなる群から選ばれたヘキソースを５０〜１００ｇ／ｌ含む水溶液中にウィルス懸濁液を希釈することを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．５０ｇ／ｌのグルコースを含む水溶液中にウィルス懸濁液を希釈することを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．ウィルス懸濁液が、そのゲノム中に該ウィルスの異種タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントが挿入された組換えウィルスの懸濁液であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。１７．ウィルス懸濁液が、そのゲノム中にＣＦＴＲタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントが挿入された組換えウィルスの懸濁液であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．ウィルス懸濁液が１０⁶〜１０¹²ｐｆｕのウィルスを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。１９．ウィルス懸濁液が１０⁸〜１０¹¹ｐｆｕのウィルスを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。２０．請求項１〜１９のいずれか１つに記載の方法を行うことにより得られるエアロゾール。２１．肺疾患の治療を意図した医療用製品（medicinal product）の調製のための請求項２０に記載のエアロゾールの使用。２２．嚢胞線維症、肺気腫、ぜん息または肺癌の治療を意図した医療用製品の調製のための請求項２１に記載のエアロゾールの使用。