JPH08503157A - 生体吸収性移植片の製造に、成長因子のための支持体として、多孔性の炭酸カルシウムに基づく物質を使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生きている動物有機体、特に脊椎動物中に置かれるべき生体吸収性移植片の製造に、少なくとも１種の成長因子のための支持体として、炭酸カルシウムに基づく多孔性物質を使用する方法。骨誘導因子の場合、移植片は骨充填材でああり得るか、または自家移植片として使用するための骨組織を生成するところの結合組織中に置かれ得る。骨誘導でない成長因子の場合、移植片は、イン ビ ボで細胞を成長させるのに使用され得る。例えば、その中に（特に遺伝子の組込みによって）変性された自己細胞が導入された中空の移植片を使用することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】生体吸収性移植片の製造に、成長因子のための支持体とし て、多孔性の炭酸カルシウムに基づく物質を使用する方法 本発明の主題は、生きている有機体に適合されるべく意図された生体吸収性移 植片の製造に、成長因子のための支持体として、炭酸カルシウムに基づく物質を 使用することにある。 そのような物質は、特に骨形成移植片として使用され得る。 骨手術はしばしば、そのような移植（graft）に、骨移植片（bone graft or i mplant）を構成する人工的代替物を適合させることを必要とすることは知られて いる。 同種移植を行うことは、公衆衛生という明らかな理由のために、ある種の重症 のウィルス性の病気または異例の伝染性因子すなわち「プリオン（prions）」に よって引き起こされる病気の伝染という危険の故に、反対がある。 この観点から、自家移植を行うのがより満足できるが、移植片を取ることは罹 患という重大な危険に至る、例えばクリストファー ジェー．ダミエン（Christ opher J.Damien）およびジェー．ラッセル パーソンズ（J.Russel l Parsons） の、ジャーナル オブ アプライド バイオマテリアルズ（Journal of Applied Biomaterials）、第２巻、187-208頁（1991年）を見よ。 これらの理由から、生体親和性物質、例えばトリカルシウムホスフェート、ヒ ドロキシアパタイト、石膏（plaster）、サンゴ、ポリ（乳酸）および／または ポリ（グリコール酸）に基づくポリマーに基づく移植片を使用することが推奨さ れてきた。 これらの物質のいくつかは、炭酸カルシウムを含み、生体吸収性であり、吸収 される移植物質を犠牲にして、新たに形成された骨組織を徐々に形成させる；特 に欧州特許第0，022，724号参照。 移植片おけるある種の骨誘導因子（osteoinductive factor）の存在が骨の再 成長を促進することはさらに知られている。しかしながら今まで、専門家たちは 、骨誘導因子のための支持体として働くコラーゲンを移植片に添加することが必 要であると判断してきた；これに関連して、すでに先に引用したダミエンおよび ラッセル パーソンズによる文献およびフランス国特許出願第2，637，502号参 照。 多孔性の炭酸カルシウムに基づく物質例えばサンゴが、生体吸収性移植片の製 造において、骨誘導因子、およびより一般的に成長因子のための支持体として働 き得ること、および移植片が骨形成移植片として使用されるべく意図される場合 には、コラーゲンの存在は必要でも望ましくもないことがここで発見された。 したがって本発明の主題は、生きている動物の有機体、特にヒトを含む脊椎動 物に適合されるべく意図された生体吸収性移植片の製造において、少なくとも１ 種の成長因子 のための支持体として、多孔性の炭酸カルシウムに基づく物質を使用し、該支持 体は、該成長因子が骨誘導因子である場合にコラーゲンを含まないことにある。 成長因子が骨誘導因子であるときには、移植片は骨形成移植片として使用され 得る。もちろん、これらの移植片は、骨誘導因子の他に、他の成長因子を含み得 る。かくして得られる移植片は、新たに形成された組織のために徐々に吸収され 得る骨充填材として適合されるか、あるいは骨でない部位、例えば結合組織に移 植されることができ、そこでは、骨の自家移植材料として次いで使用され得る骨 組織を生じさせる。 炭酸カルシウム支持体が、骨誘導でない成長因子を装填している場合には、特 に、生きている細胞のイン ビボ（in vivo）での培養のための支持体として使 用され得る。使用する細胞および成長因子に依存して、適合の後、移植片は特に 、移植部位に新たに形成された組織を得るための支持体として使用され得る。こ の新たに形成された組織は、欠損器官部分（すい臓／腸の連絡、尿道、膀胱、心 膜等）のための代替物として使用され得る。 本発明の移植片はまた、遺伝子の欠損を治療するために、それ自体公知の方法 で遺伝子的に変性された（特に適当な遺伝子の組込みにより）細胞のためのイン ビボ での培養支持体として使用され得る。変性された細胞はまた、自己採取に より手に入れたものであってもよい。かくして得られた移植片は、治療の処置手 段として役立つ「オルガノイ ド（organoid）」を構成し、それを適合することは、欠損器官を埋め合せること を可能にし、特に遺伝子的な由来の、ある種の機能不全を治療することを可能に する。したがって、これは遺伝子治療を実行する新規な方法である。 例えば、ネジで取り付けられるかまたは押して取り付けられる栓（これもまた サンゴでできている）によって閉じることができる開口を備えた中空のサンゴ部 品が作られ得る。例えば、ヒトでの移植のために、これは、高さ２〜１0cm）外 径１〜３ｃｍおよび内径0.5〜２ｃｍを有する中空の円柱体であり得る。内壁は 、成長因子例えばTGFーベータが装填されたコラーゲンで含浸され得る。外壁は、 脈管形成因子（angiogenic factor）（ＦＧＦ）の溶液で含浸され得る。変性さ れた自己細胞（例えば線維芽細胞）は、固体支持体例えばコラーゲン繊維のネッ トワークまたはサンゴ粒上で、イン ビトロであらかじめ培養される。変性され た細胞の培養物は、支持体と共に移植片の中空部分に導入される。次いで、後者 は栓を用いて閉じられ、そして移植（例えば腹腔内）が行われる。移植された細 胞は、サンゴが吸収されるにつれてそれを置き換えて、結合組織によって囲まれ た脈管化された組織を作り上げるようになる。 移植片に導入された細胞は、分化の生じていない細胞であり得、その分化は、 内在性のまたは外来性のサイトカイン（cytokine）を用いて行われる。 成長因子のための支持体として使用できる、炭酸カルシウムに基づく物質は、 好ましくはアラゴナイト（aragonite） である。特に、サンゴ骨格でできたものが使用され得る。サンゴ骨格を使用す ることの利点の１つは、それが互いに連絡する孔を有することであり、これは、 血管新生化（neovascularization）ならびに、あらかじめその場で（in situ） 導入または補充された骨細胞または他の細胞による物質の侵略を促進する。 50〜500ミクロン、特に200 〜400ミクロンの孔径を有する物質を、支持体物質 として使用するのが好ましい。空隙率（porosity）、すなわち物質の総体積に比 べた孔体積の割合は一般に、20〜80％、例えば40〜60％である。 このタイプの物質は、特にジェネラ ポリテス（generaPorites）、アクロポ ラ（Acropora）、ゴニオポラ（Goniopora）、ロボフィリア（Lobophyllia）、シ ンフィリア（Simphyllia）およびミリポラ（Millipora）といったサンゴを用い ることにより得ることができる。 成長因子は、ある細胞に局所的に作用し、それらの増殖、移動および／または 分化に影響を及ぼす、あるいは他の成長因子の生産を刺激するところのポリペプ チドであることは知られている。 多くの成長因子が現在知られている。 例えば、骨誘導作用を有する成長因子が知られており、その作用は、特にイン ビトロ （in vitro）での種々の骨細胞の培養において研究されてきた。 その活性が骨媒質（osseous medium）に特異的である成長因子の中で、無機質 が減少した骨のある種の蛋白質、すな わちDBM（無機質減少骨マトリックス（DemineralizedBone Matrix））、および 特にBP（骨蛋白質（Bone Protein））またはBMP（骨形成蛋白質（Bone Morphoge netic Protein））と呼ばれる蛋白質を挙げることができ、これらは実際に多数 の構成成分を含み；ヒトにおいては、例えばオステオネクチン（osteonectin） およびオステオカルシン（osteocalcin）と呼ばれる構成成分が特に分離されて きた。別の活性蛋白質はオステオゲニン（osteogenin）である。 一般に骨細胞の成長を含む、細胞の成長に影響を及ぼす成長因子の中で、特に ソマトメジン（somatomedin）またはIGF（インシュリン様成長因子（Insulin-li ke Growth Factor））、PDGF（血小板由来成長因子（Platelet-Derived Growth Factor））、FGF （線維芽細胞成長因子（FibroblastGrowth Factor））、BDGF II（またはベータ-2-ミクログロブリン（β-2-microglobulin））、TGF （形質 転換成長因子（Transforming Growth Factor））、特にＴＧＦ-ベータ（またはb TGF）等が挙げられる。 成長因子の使用できる投与量は公知であるか、あるいは動物モデルにおいて慣 例の実験で決定され得る。数マイクログラムまたは数十マイクログラムの投与量 で、その作用が局所的である成長因子が、一般に使用される。 本発明はまた、成長因子を装填した多孔性の炭酸カルシウム支持体の製造に関 する。後者は、 ‐成長因子を含む溶液またはゲルを用いて含浸し、任意的に、次いで乾燥するこ とにより、 ‐陰性の表面電位を有するコーティング（ヘパリン、ヘパラン サルフェート、 デキストラン サルフェート、デルマタン サルフェート、キシラン サルフェ ート等）によって炭酸カルシウムと結合することによる、成長因子の溶液を用い たキャピラリーの作用によるフィルムの堆積により、組み込まれることができる 。 バインダー、特にゲルを形成しうるバインダーとの組合せの形で施与すること により、炭酸カルシウム支持体上への成長因子の固定および保持を容易にするこ とが可能である。そのようなバインダーは公知である。それらは、例えばコラー ゲンまたはセルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース 等である。これらの製品は、生体親和性である。それらは市販されていて、入手 可能である。バインダーとして、繊維素（fibrin）前駆体、例えばフィブリノー ゲン（fibrinogen）または生物的接着剤（寒冷沈降物）をまた使用することがで きる。 バインダーは、特に成長因子の固定および任意的にその徐々の放出を助長する 効果を有する。 バインダーは一般に、移植片が新たに形成された組織により再合体されるにつ れて、徐々に吸収される。 しかしながら、骨形成移植の場合には、バインダーとしてのコラーゲンの存在 は、新しい骨組織の創造を促進しないが、しかし遅らせる傾向があることが観察 された。 以下の実施例により本発明を説明する。実施例１ ： 出発物質として、直径6mmかつ厚さ2mmを有するサンゴ円盤（イノテブ（INOTEB ）製）を使用した。 蛋白質濃度1.52 mg/mlを有するウシBPを、骨誘導因子として使用した。 20マイクロリットルの体積において有効成分10、35、100マイクログラムを有す る投与量を得るように、BPを希釈した。各サンゴ円盤は、得られた溶液の１つの 20マイクロリットルで含浸した。溶液を孔に浸透させた後、円盤を急速に凍結し 、次いで凍結乾燥に供した。 かくして処理した円盤を用いて、ラットの腹部領域に皮下移植を行った。５匹 ずつ３群を用い、各群はそれぞれ、BP 10、35、100マイクログラムで含浸したサ ンゴ移植片を受けた。 27日後、カルセイン（calcein）から成るラベル剤20 mg/kgの投与量を、皮下 的にこれらの動物に投与した。28日目に移植片を取り出し、計量し、写真をとり 、かつメタノール中で固定した。試料を、組織学的実験のために、ポリ（メチル メタクリレート）で被覆した。試料を、薄片に切断し、試薬ラピッド ボーン ステイン（Rapid Bone Stain）およびファン ギーソンのピクローフクシン（Va n Gieson’s picro-fuchsin）を用いて染色した。切片は顕微鏡で検査した。 移植前および外移植後のサンゴ円盤の重量を以下の表１ に示す。ここでは、結果は、平均±標準偏差の形で表現されている。 群Ｉにおいては、顕微鏡での検査により、移植片中いたるところに、まだ未成 熟である骨および造血の骨髄の形成、ならびに表面での骨の形成が示された。骨 が形作られ、かつその物質による伝導が、骨の成長を許す。骨誘導（osteoinduc tion）および骨伝導（osteoconduction）の間が釣り合っている。 群IIにおいては、移植片中いたるところで鉱化が良好であり、新たに形成され た骨が成熟し、サンゴを覆っている。骨誘導が骨伝導より優勢であり、移植片の 周辺に骨がより多い。 群IIIにおいては、試料は、中心に造血の骨髄を有する成熟した骨の厚い外側 の端を有する。幾つかの場合、２〜３週間後に、軟骨および鉱化されている軟骨 が観察された。実施例２ ： 頭蓋の頂部から直径８mmの円盤を除去することにより、ウサギに穿孔術を行っ た。かくして得られた穴に、直径８mmのサンゴ円盤を施与した。このサンゴ円盤 は、先の実施例で述べたのと同様のやり方で、骨誘導因子（組換えヒトBMP-2） により（サンゴ１mgに対してBMP-2が0.5マイクログラムの比で）含浸された。手 術の日に、20mg/kgの割合で、カルセイン（calcein）を筋肉内に注入した。第２ ７日に、キシレノール オレンジ（xylenol orange）（90mg/kg）を筋肉内に注 入した。 これらの色素は、黄色およびオレンジ色の蛍光を、骨形成の輪郭を描いて与え る。 第２８日に、移植片を含む頭蓋の頂部を採取し、組織学的研究のために、色素 ギムザ‐パラゴン（Giemsa-Paragon）で染色された無機物減少していない切片に ついて、メチルメタクリレート中に封入した後、中性のホルムアルデヒド10％水 性溶液中で固定した。マイクロラジオグラフ（microradiograph）は、鉱化を証 明した。 この切片は、骨損傷の縁から始まりサンゴ円盤の端を越えて広がる骨形成を示 す。 BMP-2で含浸したサンゴの場合には、骨は円盤全体にわたって存在した。サン ゴの吸収は、BMP-2がないものより速かった。実施例３ ： 両側左右対称の頭蓋穿孔術を頭頂骨の高さで、ウサギに 行い、２つの直径10mmの円盤を除去した。 ５つの群のウサギを用いた：４つの試験群および１つの対照群。各試験群の個 体において、１方の側を処置した。 群１（記号ＭＦ）：１μｇのTGF-βを含有するメチルセルロースゲル50マイク ロリットルを、穴の１つに施与した。 群２（記号ＢＦ）：１μｇのTGF-βを１回添加した生物的接着剤100マイクロ リットルを、穴の１つに施与した。 群３（記号ＢＣＦ）：ＢＦ群に施与したのと同様の、ただしさらにイノテブ（ INOTEB）社からBIOCORAL 450の名称で市販されているポリテス（Porites）サン ゴ粒70mgを含有する混合物50マイクロリットルを施与した。 群４（記号ＢＣ）：群３と同様の混合物を、ただし成長因子なしで、施与した 。 骨構成の進展は、頭蓋のトモデンシトメトリーにより追跡した。穿孔の直径お よび面積はイメージアナライザーで測定した。１か月後に、研究した動物を犠牲 にした後、頭蓋の頂部を採取し、次いで組織形態計測（histomorphometory）お よび蛍光顕微鏡による組織分析のためにミクロトームを用いて調製した。骨形成 表面をラベルするために、犠牲にする10日前および３日前に、オキシテトラキノ ール２mlを注入した。 以下の観察が成された： 30日後、群ＢＣおよびＢＣＦは、類骨組織で瘢痕を完全に覆った。 他の群については、被覆は完全でなかった。処理した側 の直径は、対照の側の直径より小さい。対照の側の直径は、対照群で観察された 直径より小さい。 骨スパン体積（ＢＳＶ）は、組織形態計測で決定した。 ＢＣＦ群は、最も高いＢＳＶを有していて、ＢＣ群がその次であった。 サンゴで処理した群の動物の研究は、粒子は徐々に吸収されることを示す。サ ンゴは、これら粒子の間で骨スパンを急速に創造させる。 一般に、成長因子の添加は無機質成分再補充速度を増加させる。実施例４ ： １片のサンゴ（空隙率：50％）を、脈管形成成長因子（angiogenic growth fa ctor）（bFGF）を含むタイプＩのマウスコラーゲンゲルで被覆した。 放射性ヨウ素でラベルしたbFGFを用いることにより、放出試験によって、bFGF のサンゴ支持体への結合が非常に強いことを示すことが可能である。この結合は 、ヘパランまたはヘパリンの存在でさらに高められる。 かくして処理したサンゴ片は、マウスに皮下的に移植された。移植片の肉眼で の観察および組織学的観察を１年間行った。 数か月でサンゴは吸収された。それは、移植片と同じ大きさおよび同じ形の結 合組織で置き換えられた。３か月の終りに、強い血管新生およびサンゴ残留物の 隣にいかなる炎症性の細胞の存在もないことが観察された。低い密度の 間葉細胞により、結合組織が形成された。 他の実験では、コラーゲンを、カルボキシメチルセルロースまたはフィブリノ ーゲンで置き換えた。実施例５： 中空のサンゴの円柱体を作った。 レトロウィルスベクターを用いて、遺伝子を組込むことにより、遺伝子的に変 性した自己の線維芽細胞を含有するコラーゲン繊維のネットワークを、中空部分 に導入した。 ヘパリンを結合した、タイプＩのコラーゲン ゲルで、柱体の外側の壁をあら かじめ含浸した。このように前処理したサンゴを、脈管形成成長因子（bFGF）の 存在中で定温放置（incubate）した。最後に、柱体をサンゴの栓を用いて閉じ、 腹腔内移植を、25kgの大きさの犬に行った。 ４５日後、移植片を回収した。後者の血管新生は著しく、大きい内径を有する 脈管（vessel）を含んでいた。サンゴの吸収が始められた。変性した細胞は生存 能力があり、組込んだ遺伝子を発現した。 それらは、血管新生した組織に作り上げられた。 同様の実験を、ベータ‐グルクロニダーゼが欠損し、かつリソソーム滞留疾患 （lysosomal accumulation disease）を有するマウスに行った。ベータ‐グルク ロニダーゼをコードするヒトcDNAを、レトロウィルスベクターに組込み、次いで （自己の）マウス細胞を変性するために使用した。変性した細胞を、コラーゲン 繊維のネットワークに導入し、この全体を上記と同様のやり方で処理したサンゴ 円柱体に 導入した。かくして調製した移植片を欠損マウスの腸間膜に挿入した。 移植した変性細胞は、失われている酵素を分泌することができ、これは一般的 な循環中を通り、したがって、遺伝子欠陥の生理学的結果の緩解、特に、肝臓お よび牌蔵の障害の補正に至る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生きている動物有機体、特に脊椎動物に適合されるべく意図された生体吸収 性移植片の製造に、少なくとも１種の成長因子のための支持体として、多孔性の 炭酸カルシウムに基づく物質を使用する方法（但し、該成長因子が骨誘導因子で ある場合には、該支持体はコラーゲンを含まないこと）。 ２．前記炭酸カルシウムが、アラゴナイト、特にサンゴ骨格の形状である請求項 １記載の使用方法。 ３．前記成長因子が骨誘導因子である請求項１または２記載の使用方法。 ４．前記移植片が、骨充填材として適合されることを意図されている請求項３記 載の使用方法。 ５．前記移植片が、骨でない部位に適合されることを意図されている請求項３記 載の使用方法。 ６．前記成長因子が骨誘導でない因子である請求項１または２記載の使用方法。 ７．前記移植片が、イン ビボでの細胞培養を意図されている請求項６記載の使 用方法。 ８．前記細胞が、遺伝子的に変性された細胞、特に自己細胞である請求項７記載 の使用方法。 ９．前記細胞が、遺伝子欠陥の治療を意図した遺伝子の組込みによって変性され ている請求項８記載の使用方法。 10．前記移植片が、栓で閉じられることができる開口を備 えた中空片の形状である請求項７〜９のいずれか１項記載の使用方法。 11．少なくとも１種の成長因子が、前記中空片の内壁に含浸により堆積されてい る請求項10記載の使用方法。 12．培養されるべき細胞培養物が、移植片中空部分に導入され、次いで該中空部 分が、移植を行う前に栓を用いて閉じられる請求項10または11記載の使用方法。