JP5968492B2 - 多次元生体材料およびその製造方法 - Google Patents
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Description
しかし、骨移植または骨の補強あるいは骨の再建に使用される多次元組織の製造には、現実的な技術的問題が残されている。軟骨再建または軟骨欠損の軽減においても同じ問題が残されている。
本発明の意味において、「組織」という用語は、自然のヒト組織内で類似した機能を果たす相互に結合した細胞の集合体(collection)を指す。
前臨床モデルにおけるAMSCの動物源
骨髄および脂肪細胞幹細胞のドナーとして緑色蛍光遺伝子導入ブタを使用した(Brunetti D, Cloning Stem Ceils, eupb 2008)。ベルギー農業および動物管理省(Belgian Ministry of Agriculture and Animal Care)の指針に従って動物を収容した。全ての手順は、ルーヴァン・カトリック大学の地域動物実験倫理委員会によって認可されていた。
コラゲナーゼ(0.075g)をハンクス液(カルシウムイオンを含む)で再構成し、消化前に2〜8℃で保存する。脂肪組織(平均15g)を0.009%NaClで3回洗浄し、ペトリ皿の中で切断して、血管および線維結合組織を除去した。脂肪を消化前に計量し、酵素を含む50mlのファルコン管に移す。この組織を、60分間連続的に撹拌しながら37℃の振盪水浴に入れる。消化後、コラゲナーゼを、50mlのヒト血清、L−グルタミン(5ml)および5mlの抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)を添加したDMEM(500ml)で失活させる。回収した組織を、室温(20〜25℃)、1500rpmで10分間遠心分離する。成熟脂肪細胞を含む上澄みを吸引する。このペレットを、10%ヒト血清および抗生物質(100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン)を添加したDMEMからなる20mlの増殖培地(MP)に再懸濁し、500μmのメッシュスクリーンで濾過する。回収した組織(濾過後)を、室温(20〜25℃)、1500rpmで10分間遠心分離し、このペレットをMPに再懸濁し、間質血管画分(SVF)細胞として特定する。初代細胞の最初の継代を継代0(P0)と呼んだ。5%CO2中37℃で24〜48時間インキュベートした後、培養物をPBSで洗浄し、P4(第4継代)までMP中に維持した後、特異的培地(下記参照)で分化させた。
ヒト脂肪組織(皮下脂肪組織の小片、1〜2g、n=4)を、ルーチンな手術(腹部および整形外科手術)の間に取り出し、処理のために研究室に運ぶまで4℃の冷たい生理溶液に保存した。ブタ脂肪組織処理について上述したように、ヒトの脂肪の消化を行った。消化後、ヒトAMSCをMP中で培養し、(i)ウシ胎児血清(10%v/v)または(ii)ヒト血清(10%v/v)を添加した特異的培地(正確な組成については下記参照)中で分化させた。
ヒト脱灰骨基質は、大学組織バンク(ルーバン大学医学部付属病院、ベルギーのブリュッセル)から提供され、多臓器ヒトドナーから産生された。大腿骨または脛骨の骨幹を切断し、脱灰処理(下記参照)のために1000μm以下の粒子に粉砕する。
脂肪生成
AMSCのコンフルエントな培養物を、20%ヒト血清、L−グルタミン(5ml)、ウシのインスリン(5μg/ml)、インドメタシン(50μM)、3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX、0.5mM)、デキサメタゾン(1μM)、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)からなる脂肪細胞誘導培地でMPを置き換えて脂肪生成を引き起こすように誘導した(Mauney JR, Biomaterials 2005, vol 26: 6167)。2日ごとに培地を取り替えて、脂肪生成培養物中に細胞を維持した。培養物をPBSでリンスし、ホルマリン溶液で固定し、中性脂質をオイルレッドで染色して脂肪細胞分化を測定した。
AMSCのコンフルエントな培養物を、ヒト血清(10%v/v)、デキサメタゾン(1μM)、アスコルビン酸ナトリウム(50μg/ml)、ジヒドロリン酸ナトリウム(36mg/ml)、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)をDMEMに添加して得られる骨形成培地を用いて骨形成を引き起こすように誘導した(図3A、図3B、図3Cを参照)。2日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に細胞を維持した。培養物をPBSでリンスし、70%エタノールで固定し、リン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨形成分化を測定した。さらに、オステオカルシンの免疫組織化学法およびフォン・コッサ染色を行って「骨」の表現型を確認した(図4を参照)。
AMSCのコンフルエントな培養物を、ヒト血清(10%v/v)、デキサメタゾン(1μM)、TGF−B3(10ng)、L−プロリン(40μg/ml)、アスコルビン酸ナトリウム(50μg/ml)、ジヒドロリン酸ナトリウム(36mg/ml)、ピルビン酸ナトリウム(100μg/ml)、ITS(インスリン−トランスフェリン−セレン(例えば、Sigma社から入手可能なインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地添加用凍結乾燥粉末由来)(100μg/ml)、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)をDMEMに添加して得られる軟骨形成培地を用いて軟骨形成を引き起こすように誘導した(Taipaleenmaki H, Experimental Cell Research 2008 vol 314: 2400)。2日ごとに培地を取り替えて、軟骨形成培養物中に細胞を維持した。
細胞および培養条件
AMSCを増殖培地(MP)で増殖させ、約85〜90%コンフルエントになるまで37℃(95%空気および5%CO2)に維持した。培地を2日ごとに取り替えた。細胞毒性アッセイ用に細胞を懸濁するために、0.25%トリプシン−EDTA混合物を用いて37℃で10分間、培養フラスコから細胞を剥離し、培地に再懸濁した。細胞を、1×104細胞/ウェルの密度で、MTS(3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−5−[3−カルボキシメトキシフェニル]−2−[4−スルホフェニル]−2H−テトラゾリウムブロミド)のために、96ウェルマイクロプレートに播種した。それらを、異なる試験培地(i)MP、(ii)骨形成培地および(iii)軟骨形成培地に5日間曝露する前に、コンフルエントに近い状態まで37℃で96時間増殖させた。
抽出物と細胞の接触から24時間後、20μlの「Cell titer 96(登録商標)AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay」(Promega社、ウィスコンシン州マディソン)を、100μlの抽出物培地を含む各ウェルに直接添加した。細胞を37℃で3時間インキュベートした。マイクロタイタープレート分光光度計(Multiskan Ex、Labsystems社、ベルギーのブリュッセル)を用いて492nmで吸光度を測定した。参照波長は690nmであった。光学濃度差OD=OD492nm−OD690nmを試算した。
特異的培地(骨形成もしくは軟骨形成)におけるAMSC(第4継代)のインキュベーションを15〜20日間行った後に、骨形成および軟骨形成培地に脱灰骨基質(DBM)を添加することにより、さらなる20日の期間に多次元構造(分化培地1mlあたり1mgのDBM)が得られた。この培地を、DBMを除去せずに2日ごとに取り替える。
骨芽細胞の分化したGFP−ブタAMSCを、大学組織バンク(ルーバン大学医学部付属病院(University clinical hospital Saint−Luc)、ベルギーのブリュッセル)から提供されたヒトの処理済み/脱細胞化骨基質に播種した(Dufrane D, Eur Cell Mater, vol 1: 52, 2001)。複合移植片を、ヌードラット(1レシピエントにつき2つのインプラント、n=10)(雄、6〜8週齢)の傍脊椎領域に皮下移植した。60日後、動物を屠殺し、免疫組織化学的処理のためにインプラントを外植した。次いで、インプラントをHCLで脱灰し、処理し、パラフィンに包埋し、薄片(5μm)にした。次いで、オステオカルシンおよび「緑色蛍光タンパク質」(モノクローナル抗体)に対して、マッソン三色染色法および免疫組織化学的検査を行った。
材料および方法
ブタおよびヒトAMSCの単離
実験のために、実施例1に開示したように、ブタおよびヒトAMSCの単離を行った。
生体外
正常酸素圧および低酸素条件において生体外での幹細胞の血管新生促進能力を評価するために、ブタの骨髄MSCおよび脂肪MSCを、0.1、3、5および21%O2の低酸素室に24、48および72時間置き、VEGFの放出をELISA試験で定量化した。
AMSCを、ウシ胎児血清(FBS、10%v/v)、デキサメタゾン(1μM)、アスコルビン酸ナトリウム(50μg/ml)、ジヒドロリン酸ナトリウム、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンをMPに添加して骨形成を引き起こすように誘導した。2日ごとに培地を取り替えて、骨形成培養物中に細胞を維持した(Post et Al. Bone 2008, 43,1; 32−39, Qu et Al In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2007; 43; 95−100)。培養物をPBSでリンスし、70%エタノールで固定し、リン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色して骨形成分化を測定した。さらに、オステオカルシンの免疫組織化学法およびフォン・コッサ染色を行って「骨」の表現型を確認した。
DBMの効力を以下によって評価する:(i)脱灰プロセス後の残留カルシウム濃度の測定(97%超の[カルシウム]低下)、および(ii)移植から1ヵ月後の生体内での(ヌードラットにおける)骨生成の可能性。平均15〜18日間の骨芽細胞培地におけるAMSC(第4継代)のインキュベーション後に、異なる濃度(0/1/5/10および20mg/ml)のDBMを特異的分化培地に添加する。培地を、DBMを除去せずに2日ごとに取り替える。3次元構造の程度、細胞構造、オステオカルシン発現およびフォン・コッサ染色(カルシウム沈着のため)を評価して、3次元骨様構造にとって適当なDBM濃度を選択する。
(多次元構造にとって)最適なDBM濃度を有する骨形成培養物(第4継代)から得られたAMSCを移植のために回収した。
− ヌードラット(Charles River Laboratories International社、米国マサチューセッツ州ウィルミントン)をレシピエントとして使用した。細胞を傍脊柱筋に移植した。脊柱を中心とした縦切開を行い、皮下組織を切開して筋膜を露出させた。多次元構造を傍脊柱筋組織に直接移植した(大学組織バンク、ルーヴァン・カトリック大学、ベルギーのブリュッセル)。対照は、同じラットの反対側の傍脊柱筋に凍結乾燥した海綿骨を単独で移植して確保した。移植部位の早期回復を可能にするために、再吸収不可能な縫合糸を用いて筋膜を閉じた。動物を屠殺し、全身麻酔下でのT61心臓内注射(Intervet Int.社、ドイツ)による移植から30日後に外植を行った。次いで、インプラントを回収し、組織学およびマイクロコンピュータ断層撮影のために処理した。
− ブタのレシピエント。2つの異なる外科的モデルで移植片を試験する。本発明者らは(i)大腿皮質骨欠損部におけるそれらの架橋能力および(ii)腰椎前方固定術(ALIF)におけるそれらの融合性を分析する。
− (i)皮質骨欠損モデルは、実験的整形外科において、および主にC.Delloye教授の研究を通して本発明者らの研究室においてよく知られている。ブタを類似モデルに使用し、骨幹骨欠損部を長骨上に形成した後、そこに移植材料を充填するか空のままにする。本発明者らの実験では、ブタの両大腿部を手術する。1.5cmの皮質骨欠損部を形成し、標準的な4.5mmのチタン製ロッキング圧迫プレートによって安定させる。片方の大腿骨欠損部を空のままにし、反対側の脚にAMSC移植片を移植する。
− (ii)ブタの実験的外科手術においてALIFモデルが十分に確立されている。本発明者らの技術は、後側方到達法による4つのレベルのALIF法からなる。融合は、椎体間ポリエチルポリエチルケトン(PEEK)ケージによって得られる。椎間板を開き、髄核を除去し、軟骨を広げて軟骨下骨を露出させた後、PEEKケージを挿入する。これらのケージは空として設計するが、様々な実験材料を充填することができる。この場合、各レベルに異なる移植片組織を入れて、4つの異なる群を構成する。1つのケージは、陰性対照として空のままにし、1つのケージは、凍結乾燥した照射済み海綿骨を充填し(臨床分野で実施される場合が多い)、1つのケージは自家海綿骨移植片を含み(融合法における至適基準であるため、本発明者らの陽性対照とみなす)、最後のケージはAMSC移植片を有する。動物を屠殺し、全身麻酔下でのT61心臓内注射(Intervet Int.社、ドイツ)による移植から7週間後に外植を行った。次いで、インプラントを回収し、組織学およびコンピュータ断層撮影のために処理した。
ヌードラット:
外植したインプラントをHCLで脱灰し、処理し、パラフィンに包埋し、薄片にした(5μm)。組織学的染色のために、ヘマルン・エオシン(Hemalun Eosin)染色、マッソン緑色三色(Masson’s Green Trichrom)染色、オステオカルシンおよびフォン・コッサ染色による標準的な呈色反応を使用した。オステオカルシン染色は、Envision Rsystemモノクローナル抗体(Dako社、デンマーク)によって公開されたモノクローナル抗体(OC4−30、Abcam社、ケンブリッジ)によって得られた。回収したインプラントのミクロ構造を、pQCT(末梢骨用定量的コンピュータ断層装置、XCT Research SA型、Stratec社、ドイツのプフォルツハイム)を用いて分析した。皮質および総骨密度を、各インプラントの複数のスライドを用いて測定した。フォンヴィルブラント染色(von Willebrandt staining)(上記参照)後に、新しく形成された血管の定量化によって生体内での血管新生の定量化を行った。
食品および水を自由に摂取できる状態でブタを個々に収容する。術後処置および鎮痛は、実験動物管理のための標準的な実験計画書に従って行う。自家移植片モデルでは、生物学的追跡調査は、血液試料による炎症評価で構成される。
ボンフェローニのポストホックテストを含む一元配置分散分析法によって群間の差の統計的有意性を試験した。Systatバージョン8.0によって統計的検定を行った。差はp<0.05で有意であるとみなした。
最適なDBM濃度を有する多次元構造についての構想の証明:生体外での骨様構造
AMSC細胞移植の生物学的支持体を回避するために、多次元構造をDBMと組み合わせて発達させた。ヌードラットにおいて生体内で骨形成分化促進能力を有する脱灰骨基質(平均径700μm)(AMSCに接触させて用いる前に品質管理が必要とされる)は、AMSCとの共インキュベーションにおいて生体外細胞リモデリングを達成するために必要となる。
ヌードラット
ヌードラットにおける移植から30日後に、DBMを含まない単独のAMSCでは、新しい骨様構造の形成は誘導されなかった。フォン・コッサによって染色された小さい骨小節(オステオカルシン+)のみがヌードラット筋肉組織内にまばらに分散していた。対照的に、多次元構造の移植は、移植部位の良好な局在化によって容易に行われた。移植から30日後に、小型で強力な骨様構造が、DBM粒子内の顕微鏡的に高密度の結合組織を有する筋肉内に認められた。骨様構造は、オステオカルシン染色結合組織および無機化プロセスに認められた。
移植から5週間後に、ブタにおいて、CTスキャンによって示されるように、大腿骨の欠損部(処理なし)には自然発生の硬化が全く認められなかった。足場を全く使用せずに、骨欠損部に多次元構造を組み込むことは容易であった。この最新の移植は、自然の皮質骨欠損部を架橋する骨様構造によって、移植後の初期(移植から5週間後)に骨硬化を有意に向上させる。
正常酸素圧および低酸素条件において、生体外で幹細胞の血管新生促進能力を評価するために、前臨床ブタ骨髄MSCおよび脂肪MSCを、0.1、3、5および21%O2の低酸素室内に24、48および72時間置き、VEGFの放出をELISAで定量化した。BM−MSCは、正常酸素圧条件よりも低酸素条件においてより多くのVEGFを放出し、24時間よりも48および72時間(より高レベルのVEGFを有する時間)後に、この分泌を維持した(p<0.05)。対照的に、AMSCからのVEGFの放出は、複数の異なる培養条件において類似していたが、有意なより高レベルのVEGFは、BM−MSCよりもAMSCによって放出された(それぞれ2364±94pg/ml対11274±679、p<0.05)(図6)。
Claims (16)
- 多次元構造を有し、かつ分化したMSC組織および脱灰骨基質を含む生体材料であって、前記脱灰骨基質が前記分化したMSC組織内に分散されており、前記MSCが脂肪組織由来幹細胞である生体材料。
- 前記分化したMSC組織を製造するために使用される前記MSCはヒトまたは動物由来である、請求項1に記載の生体材料。
- 前記MSCは、継代培養後期の脂肪組織由来幹細胞である、請求項1または2に記載の生体材料。
- 3次元である請求項1〜3のいずれか1項に記載の生体材料。
- 無機質コーティングでコーティングされた骨細胞と、コラーゲンを含む相互結合組織とを含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生体材料。
- 軟骨細胞と、コラーゲンおよびプロテオグリカンを含む細胞外基質とを含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生体材料。
- 前記脱灰骨基質は、50〜2500μmの平均径を有する粒子の形態である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の生体材料。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の生体材料を含むインプラント。
- 骨芽細胞培地および/または軟骨形成培地でMSCを15〜25日間インキュベートし、次いで前記培地に脱灰骨基質を添加し、かつ15〜30日のさらなる期間にわたってインキュベーションを維持することを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多次元生体材料の製造方法。
- 前記骨芽細胞培地は、ヒト血清、デキサメタゾン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された標準的な培地である、請求項9に記載の方法。
- 前記軟骨形成培地は、ヒト血清、デキサメタゾン、TGF−B3、L−プロリン、アスコルビン酸ナトリウム、ジヒドロリン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、インスリン−トランスフェリン−セレン、ペニシリンおよびストレプトマイシンが添加された標準的な培地である、請求項9に記載の方法。
- 前記脱灰骨基質を5〜10mg/mlの量で前記培地に添加する、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の生体材料を含む医療機器。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の生体材料と、好適な固定手段とを含むキット。
- 骨もしくは軟骨欠損を軽減または治療する方法で使用される請求項1〜7のいずれか1項に記載の生体材料。
- 関節の先天的もしくは後天的な異常部分、頭蓋顔面上顎骨、歯科矯正処置部分、術後の骨もしくは関節骨の置換部分、外傷もしくは他の先天的もしくは後天的な異常部分を支持または矯正するため、または他の筋骨格インプラント、特に人工および合成インプラントを支持するための方法で使用される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の生体材料。
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