ES2710607T3 - Biomaterial multidimensional y método para producir el mismo - Google Patents
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Abstract
Un biomaterial que tiene una estructura multidimensional y comprende tejido de las MSC diferenciadas y matriz ósea desmineralizada, en donde dicha matriz ósea desmineralizada se dispersa dentro del tejido de las MSC diferenciadas, y en donde dichas MSC diferenciadas son células madre derivadas de tejido adiposo.
Description
DESCRIPCION
Biomaterial multidimensional y metodo para producir el mismo
Campo de la invencion
Esta invencion se dirige al campo de las celulas madre mesenquimales y su diferenciacion para la produccion de tejidos o biomateriales o matrices multidimensionales. Los productos de la invencion pueden ser utiles en reumatologfa, en reconstruccion de tejidos y/o en cirugfa, especialmente en traumatologfa, cirugfa ortopedica, plastica y maxilofacial. Especialmente, los productos de la invencion pueden ser utiles en la reparacion o el reemplazo de huesos o cartflagos. Antecedentes de la invencion
La ingeniena de tejidos es un campo en crecimiento donde se desarrollan nuevos materiales para la implantacion en el cuerpo. Un area importante implica los materiales de injerto oseo para reemplazar areas de hueso perdidas debido a traumas o enfermedades (como, por ejemplo, reseccion de tumores). Tradicionalmente, el material de injerto puede extraerse del hueso del individuo que recibe el material de injerto. Sin embargo, esto requiere una cirugfa adicional y una recuperacion adicional. Ademas, el hueso puede extraerse de otros, o incluso de cadaveres, pero esto introduce problemas de biocompatibilidad, asf como tambien el riesgo de transferir enfermedades.
La solicitud de patente internacional WO02/062357 describe un dispositivo que tiene caractensticas similares a los tejidos para el tratamiento del tejido enfermo o danado. El documento US2005/002910 describe un metodo de cultivo de una matriz extracelular capaz de formar hueso al proporcionar celulas formadoras de hueso en un biorreactor. Se han realizado investigaciones en el campo de la diferenciacion de celulas madre para la produccion de tejidos. Por ejemplo, el documento WO2007/103442 describe una composicion que comprende un andamio de seda y una celula madre adulta, en donde dicha celula madre adulta es una celula madre derivada de tejido adiposo.
Problema tecnico
Sin embargo, la produccion de tejidos multidimensionales para su uso en injerto oseo o refuerzo oseo o reconstruccion osea permanece como un problema tecnico real. El mismo problema permanece tambien en la reconstruccion de cartflagos, o para el alivio de los defectos de cartflago.
Por lo tanto, existe aun la necesidad en la tecnica de materiales de ingeniena de tejidos que sean biocompatibles completamente y que proporcionen caractensticas mecanicas apropiadas para las aplicaciones designadas.
Breve descripcion de la invencion
Esta invencion se refiere a un biomaterial osteoinductivo humano natural que tiene una estructura multidimensional y que comprende tejido de celulas madre mesenquimales diferenciadas (m Sc , por sus siglas en ingles) y matriz osea desmineralizada (DBM, por sus siglas en ingles), en donde dicha matriz osea desmineralizada se dispersa dentro del tejido de las MSC diferenciadas, y en donde dichas MSC son celulas madre derivadas de tejido adiposo.
La MSC usada para fabricar el tejido de MSC diferenciadas puede ser de origen humano o animal.
Las MSC se han aislado del tejido adiposo, y se denominan en la presente descripcion como celulas madre mesenquimales de tejido adiposo (AMSC, por sus siglas en ingles).
Preferentemente, las MSC incluidas en el biomaterial de la invencion son celulas madre derivadas de tejido adiposo de pase tardfo.
El biomaterial de la invencion se destina para implantarse en un cuerpo humano o animal. El biomaterial implantado puede ser de origen autologo o alogenico. El biomaterial de la invencion puede implantarse en un area de hueso o de cartflago. El biomaterial de la invencion puede implantarse en areas irregulares del cuerpo humano o animal.
El biomaterial de la invencion es biocompatible.
Tfpicamente, el biomaterial de la invencion es homogeneo, lo que significa que la estructura y/o la constitucion del biomaterial son similares a lo largo de todo el tejido. Tfpicamente, el biomaterial de la invencion tiene las caractensticas mecanicas y de manejo convenientes requeridas para la implantacion en el area de la enfermedad nativa. De acuerdo con una modalidad particular, el biomaterial de la invencion puede agarrarse con un instrumento quirurgico sin romperse. En una modalidad de la invencion, el biomaterial no incluye ningun agente de cohesion o agente aglutinante.
De acuerdo con una modalidad preferida, el biomaterial de acuerdo con la invencion es tridimensional (3D). En esta modalidad, el biomaterial de la invencion puede formar una pelfcula gruesa que tiene un grosor de al menos 1 mm. El
tamano del biomaterial puede ajustarse segun sea conveniente para el uso. En otra modalidad, el biomaterial forma un andamio: por lo tanto, el biomaterial de la invencion no necesita el uso de ningun andamio sintetico adicional.
De acuerdo con otra modalidad, el biomaterial de la invencion puede formar una pelfcula delgada de menos de 1 mm. En esta modalidad, el biomaterial se considera bidimensional.
De acuerdo con una primera modalidad, el biomaterial de la invencion tiene las mismas propiedades que un hueso real con propiedades de mineralizacion y expresion de osteocalcina, es decir, comprende celulas oseas y un tejido interconectivo. De acuerdo con una modalidad particular, el biomaterial de la invencion comprende celulas oseas (tambien llamadas celulas similares a osteocitos) y colageno, preferentemente colageno calcificado y mineralizado, una matriz osea, y un recubrimiento mineral sobre las celulas oseas, cuyo recubrimiento es de cristales fosfocalcicos organizados. Tfpicamente, el biomaterial de la invencion tiene una porosidad cercana a la del hueso natural.
De acuerdo con una segunda modalidad, el biomaterial de la invencion tiene las mismas propiedades que un cartflago real, es decir, comprende condrocitos, una matriz extracelular que comprende colageno y proteoglicanos.
Las propiedades de recolonizacion del biomaterial de la invencion pueden depender del entorno donde se implanta el biomaterial: el biomaterial de la invencion puede ser recolonizable cuando se coloca en un entorno oseo, y puede ser no recolonizable cuando se coloca en un entorno no oseo.
El biomaterial de la invencion es de manera que la diferenciacion de las celulas del biomaterial ha alcanzado un punto final, y el fenotipo del biomaterial permanecera inalterado cuando se implante. El implante de la invencion puede ser multicapa, es decir, comprende al menos dos capas de biomaterial, posiblemente suturadas o fijadas una a la otra por cualquier medio adecuado, tal como, por ejemplo, un adhesivo quirurgico o cualquier medio de fijacion adecuado. En una modalidad, el biomaterial de la invencion incluye una matriz osea desmineralizada en forma de partfculas que tienen un diametro medio de 50-2.500 pm. En una modalidad, las partfculas tienen un diametro medio de 50-125 pm. En una modalidad, las partfculas tienen un diametro medio de 125-200 pm. En una modalidad, las partfculas tienen un diametro medio de 500 a 1.000 pm. Tfpicamente, la matriz osea desmineralizada se obtiene a partirde donantes de menos de 40 anos de edad. De acuerdo con una modalidad, la tasa de desmineralizacion de la matriz osea es del 90-99 %, preferentemente del 95-98 %, y aun con mayor preferencia aproximadamente del 97 %. Esta tasa de desmineralizacion resulta ventajosamente de un proceso que usa HCl 0,6 N durante tres horas. De acuerdo con una modalidad espedfica, la matriz osea desmineralizada se esteriliza.
De acuerdo con una modalidad particular, la matriz osea desmineralizada se proporciona por el University Tissue Bank (Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruselas, Belgica).
Esta invencion se refiere, ademas, a un metodo para producir un biomaterial multidimensional que comprende incubar las MSC en medio osteoblastico y/o condrogenico durante 15-25 dfas y despues anadir matriz osea desmineralizada en dicho medio y mantener la incubacion durante un penodo adicional de 15-30 dfas, preferentemente 15-25 dfas, con mayor preferencia 20 dfas; durante el penodo adicional, se reemplaza preferentemente el medio cada 2 dfas sin eliminar la matriz osea desmineralizada.
La incubacion de las MSC antes de anadir la matriz osea desmineralizada es una etapa clave del metodo de la invencion. Dicha etapa es necesaria para permitir la diferenciacion de las MSC en celulas condrogenicas y/o celulas osteoblasticas. Ademas, esta etapa es necesaria para obtener una estructura 3D similar al hueso.
De acuerdo con una modalidad preferida, las MSC son celulas madre mesenquimales de tejido adiposo de pase tardfo.
De acuerdo con una modalidad, se anaden de 1 a 20 mg de matriz osea desmineralizada por ml de medio. De acuerdo con una modalidad preferida, se anaden de 1 a 10 mg de matriz osea desmineralizada por ml de medio.
Con la maxima preferencia, se anaden 5 a 10 mg de matriz osea desmineralizada por ml de medio. Dicha cantidad de matriz osea desmineralizada es la concentracion optima para proporcionar una estructura 3D del biomaterial similar al hueso.
De acuerdo con una modalidad, todos los medios estan libres de protemas animales.
De acuerdo con una segunda modalidad, el medio de diferenciacion contiene suero humano. Ventajosamente, el medio de diferenciacion no contiene ningun suero animal, preferentemente no contiene otro suero que el suero humano.
La invencion se refiere, ademas, a un biomaterial multidimensional obtenible mediante el metodo de acuerdo con la invencion. El biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion se destina a implantarse en un cuerpo humano o animal. El biomaterial implantado puede ser de origen autologo o alogenico. El biomaterial de la invencion puede implantarse en un area de hueso o de cartflago. Este biomaterial puede implantarse en areas irregulares del cuerpo humano o animal.
El biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion es biocompatible.
Este biomaterial es homogeneo, lo que significa que la estructura y/o constitucion del biomaterial son similares a lo largo de todo el tejido. Preferentemente, este biomaterial tiene las caractensticas mecanicas y de manejo convenientes requeridas para la implantacion en el area de la enfermedad nativa. Tfpicamente, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion puede agarrarse con un instrumento quirurgico sin romperse.
En una modalidad de la invencion, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion no incluye ningun agente de cohesion o agente aglutinante.
En otra modalidad, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion es tridimensional. En esta modalidad, el biomaterial puede formar una pelfcula gruesa que tiene un grosor de al menos 1 mm. El tamano del biomaterial puede ajustarse segun sea conveniente para el uso. En otra modalidad, el biomaterial forma un andamio: por lo tanto, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion no necesita el uso de ningun andamio sintetico adicional.
En aun otra modalidad, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion puede formar una pelfcula delgada de menos de 1 mm. En esta modalidad, el biomaterial es bidimensional.
De acuerdo con una primera modalidad, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion tiene las mismas propiedades que un hueso real con respecto a la propiedad de mineralizacion y la expresion de osteocalcina, es decir, comprende celulas oseas y un tejido interconectivo. En una modalidad, este biomaterial comprende celulas oseas (tambien llamadas celulas similares a osteocitos) y colageno, preferentemente colageno mineralizado y calcificado, una matriz osea, y un recubrimiento mineral sobre las celulas oseas, cuyo recubrimiento es de cristales fosfocalcicos organizados. Tfpicamente, el biomaterial tiene una porosidad cercana a la del hueso natural.
De acuerdo con una segunda modalidad, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion tiene las mismas propiedades que un cartflago real, es decir, comprende condrocitos, una matriz extracelular que comprende colageno y proteoglicanos.
El biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion es de manera que la diferenciacion de las celulas del biomaterial ha alcanzado un punto final, y el fenotipo del biomaterial permanecera inalterado cuando se implante. El implante de la invencion puede ser multicapa, es decir, comprende al menos dos capas de biomaterial, posiblemente suturadas o fijadas una a la otra por cualquier medio adecuado, tal como, por ejemplo, un adhesivo quirurgico o cualquier medio de fijacion adecuado.
En una modalidad, el biomaterial obtenible mediante el metodo de la invencion incluye una matriz osea desmineralizada en forma de partfculas que tienen un diametro medio de 50-2.500 pm. En una modalidad, las partfculas tienen un diametro medio de 50-125 pm. En una modalidad, las partfculas tienen un diametro medio de 125-200 pm. En una modalidad, las partfculas tienen un diametro medio de 500 a 1.000 pm. Tfpicamente, la matriz osea desmineralizada se obtiene a partir de donantes de menos de 40 anos de edad. De acuerdo con una modalidad, la tasa de desmineralizacion de la matriz osea es del 90-99 %, preferentemente del 95-98 %, y aun con mayor preferencia aproximadamente del 97 %. Esta tasa de desmineralizacion resulta ventajosamente de un proceso que usa HCl 0,6 N durante tres horas. De acuerdo con una modalidad preferida, la matriz osea desmineralizada se esteriliza.
Tfpicamente, la matriz osea desmineralizada se proporciona por el University Tissue Bank (Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruselas, Belgica).
La invencion se refiere a cualquier uso del biomaterial de la invencion, como un dispositivo medico o incluido en un dispositivo medico, o en una composicion farmaceutica.
La descripcion se refiere, ademas, a un kit que comprende un dispositivo medico que comprende el biomaterial de la invencion, y un medio de fijacion adecuado, tal como, por ejemplo, un adhesivo quirurgico, o un adhesivo para tejidos, o cualquier composicion adhesiva que sea biocompatible, no toxica para uso quirurgico, y posiblemente bioabsorbible y, en particular para unir tejidos biologicos entre sf o a un biomaterial implantado.
La invencion se refiere, ademas, a un kit que comprende el biomaterial de la invencion, y un medio de fijacion adecuado, tal como por ejemplo un adhesivo quirurgico, un adhesivo para tejidos, o cualquier composicion adhesiva que sea biocompatible, no toxica para uso quirurgico, y posiblemente bioabsorbible y, en particular, para unir tejidos biologicos entre sf o a un biomaterial implantado.
En otro aspecto, la invencion se refiere al biomaterial de acuerdo con la invencion para su uso en un metodo para aliviar o tratar un defecto oseo o de cartflago.
Esta invencion se refiere, ademas, a un metodo para aliviar o tratar un defecto oseo o de cartflago en un marnffero, dicho metodo comprende administrar a dicho marnffero que tiene un defecto oseo o de cartflago una cantidad eficaz terapeuticamente de un biomaterial como se describe en la presente.
El biomaterial se usa en una cantidad eficaz terapeuticamente para aliviar o tratar un defecto oseo o de cartflago en un mairnfero.
Un ejemplo no limitante de defecto oseo o de cartflago es la fractura osea, fragilidad de nacimiento, perdida de la densidad mineral osea, artritis, osteoporosis, osteomalacia, osteopenia, cancer de hueso, enfermedad de Paget, lesiones escleroticas, trastornos infiltrativos del hueso y la perdida osea metabolica.
La invencion se refiere, ademas, al uso del biomaterial en ortopedia, especialmente en cirug^a plastica o maxilofacial. Ademas, el biomaterial de la invencion puede usarse en reumatologfa.
La invencion se refiere, ademas, a un metodo para usar el biomaterial de la invencion para respaldar o corregir anomalfas congenitas o adquiridas de las articulaciones, huesos craneo-faciales-maxilares, procedimientos de ortodoncia, reemplazo oseo u oseo articular posterior a una cirugfa, traumatismo u otras anomalfas congenitas o adquiridas, y para respaldar otros implantes musculoesqueleticos, particularmente implantes artificiales y sinteticos.
La descripcion se refiere al biomaterial de la invencion para su uso para rellenar una cavidad osea dentro del cuerpo humano o animal.
La descripcion se refiere al biomaterial de la invencion para su uso en cirugfa reconstructiva o estetica. El biomaterial de la invencion puede ser autologo o alogenico. Puede usarse en injertos de tejidos.
La descripcion se refiere, ademas, a un metodo para rellenar una cavidad dentro del cuerpo humano o animal, dicho metodo comprende la etapa de administrar el biomaterial de la invencion.
El biomaterial de la invencion puede usarse como un implante alogenico o como un implante autologo.
El biomaterial tambien es ventajoso ya que no es inmunogenico y tiene un efecto inmunomodulador: sorprendentemente, en el biomaterial de la invencion, las propiedades inmunomoduladoras de las MSC no diferenciadas se mantienen, lo que resulta en que la implantacion del biomaterial de la invencion dentro del cuerpo humano o animal no resulta en ninguna reaccion inflamatoria: por el contrario, la presencia del biomaterial alivia la inflamacion en el sitio de la implantacion.
El biomaterial de la invencion es, por lo tanto, especialmente adecuado para su uso en el tratamiento de la artritis, especialmente de la artritis inflamatoria, como una alternativa a los productos farmaceuticos antiinflamatorios o como un medio para reducir la cantidad de productos farmaceuticos antiinflamatorios necesarios en un paciente que padece las consecuencias de dicha inflamacion.
El biomaterial de la invencion es ventajoso, ademas, para estimular la angiogenesis. De hecho, las MSC del biomaterial liberan el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en ingles) el cual estimula el crecimiento de nuevos vasos sangumeos. Dicho aspecto de la invencion es altamente prometedor ya que proporciona condiciones optimas para la formacion de hueso o de cartflago.
Definiciones
En el significado de esta invencion, el termino "tejido" se refiere a una coleccion de celulas interconectadas que realizan una funcion similar dentro de un tejido humano nativo.
En el significado de esta invencion, el termino "celulas madre mesenquimales" o MSC, son celulas madre multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad detipos de celulas.
"Adiposo" se refiere a cualquier tejido graso. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo marron, amarillo o blanco. Preferentemente, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutaneo. El tejido adiposo incluye adipocitos y estroma. El tejido adiposo puede encontrarse en todo el cuerpo de un animal. Por ejemplo, en los mamfferos, el tejido adiposo esta presente en el omento, la medula osea, el espacio subcutaneo, las almohadillas grasas (por ejemplo, las almohadillas grasas escapulares o infrapatelares), y alrededor de la mayona de los organos. Las celulas obtenidas a partir de tejido adiposo pueden comprender un cultivo celular primario o una lmea celular progenitora. El tejido adiposo puede ser de cualquier organismo que tenga tejido graso.
El termino "celula derivada de tejido adiposo" se refiere a una celula que se origina a partir de tejido adiposo. La poblacion celular inicial aislada a partir de tejido adiposo es una poblacion celular heterogenea, lo cual incluye, pero no se limita a, celulas de la fraccion vascular estromal (SVF, por sus siglas en ingles).
Como se usa en la presente, el termino "celulas madre mesenquimales de tejido adiposo" (AMSC) se refiere a las celulas estromales que se originan a partir de tejido adiposo, las que pueden servir como precursoras de una variedad de tipos de celulas diferentes tales como, pero no se limitan a, adipocitos, osteocitos, y condrocitos.
Como se usa en la presente, el termino "celulas madre mesenquimales de tejido adiposo de pase tardm" se refiere a una celula que presenta una caractenstica menos inmunogenica en comparacion con una celula de pase temprano. La inmunogenicidad de una celula estromal derivada de tejido adiposo se corresponde con el numero de pases. Preferentemente, la celula se ha pasado hasta al menos el cuarto pase, con mayor preferencia, la celula se ha pasado hasta al menos el sexto pase, y con la maxima preferencia, la celula se ha pasado hasta al menos el octavo pase.
Como se usa en la presente descripcion, "biocompatible" se refiere a cualquier material que, cuando se implanta en un mairnfero, no provoca una respuesta adversa en el mairnfero. Un material biocompatible, cuando se introduce en un individuo, no es toxico ni perjudicial para ese individuo, ni induce el rechazo inmunologico del material en el mairnfero.
Como se usa en la presente, "autologo" se refiere a un material biologico derivado del mismo individuo en el que posteriormente el material se introducira nuevamente.
Como se usa en la presente, "alogenico" se refiere a un material biologico derivado de un individuo diferente geneticamente de la misma especie que el individuo en el que se introducira el material.
Como se usa en la presente, un "injerto" se refiere a una celula, tejido u organo que se implanta en un individuo, tfpicamente para reemplazar, corregir o de cualquier otra manera superar un defecto. El tejido u organo puede consistir en celulas que se originan del mismo individuo; este injerto se refiere en la presente descripcion mediante los terminos intercambiables siguientes: "autoinjerto", "trasplante autologo", "implante autologo" e "injerto autologo". Un injerto que comprende celulas de un individuo diferente geneticamente de la misma especie se refiere en la presente descripcion mediante los terminos intercambiables siguientes: "aloinjerto", "trasplante alogenico", "implante alogenico" e "injerto alogenico". Un injerto de un individuo a su gemelo identico se refiere en la presente descripcion como un "isoinjerto", un "trasplante singenico", un "implante singenico" o un "injerto singenico". Un "xenoinjerto", "trasplante xenogenico" o "implante xenogenico" se refiere a un injerto de un individuo a otro de una especie diferente.
Como se usa en la presente, los terminos "injerto de tejido" y "reconstruccion de tejido" se refieren ambos a la implantacion de un injerto en un individuo para tratar o aliviar un defecto del tejido, tal como, por ejemplo, un defecto oseo o un defecto de cartflago.
Como se usa en la presente, "aliviar" una enfermedad, defecto, trastorno o condicion significa reducir la gravedad de uno o mas smtomas de la enfermedad, defecto, trastorno o condicion.
Como se usa en la presente, "tratar" significa reducir la frecuencia con la que un paciente experimenta los smtomas de una enfermedad, defecto, trastorno o condicion adversa, y similares.
Como se usa en la presente, una "cantidad eficaz terapeuticamente" es la cantidad de una composicion de la invencion suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al individuo al que se administra la composicion.
Como se usa en la presente, "defecto oseo" se refiere al hueso que esta roto, fracturado, le faltan porciones o esta danado de cualquier otra manera. Dicho dano puede deberse a una anomalfa congenita, enfermedad, tratamiento de la enfermedad, traumatismo o infeccion osea, y puede ser agudo o cronico. Por ejemplo, la perdida osea puede producirse como resultado de la reseccion de un tumor, lo que resulta de esta forma en un defecto oseo. Los ejemplos no limitantes de defectos oseos incluyen: fracturas oseas, deformacion osea/espinal, osteosarcoma, mieloma, displasia osea, escoliosis, osteoporosis, osteomalacia, raquitismo, osteitis fibrosa, displasia fibrosa, distrofia osea renal, y enfermedad de Paget del hueso.
Como se usa en la presente, "defecto de cartMago" se refiere al tejido cartilaginoso que falta, se reduce en cantidad o se dana de cualquier otra manera. Un defecto del tejido cartilaginoso puede resultar de una anomalfa congenita, una enfermedad, un tratamiento de la enfermedad o un traumatismo, y puede ser agudo o cronico (osteoartritis).
Como se usa en la presente, el termino "medio osteoblastico y/o condrogenico" pretende referirse a un medio de cultivo que promueve el crecimiento y la diferenciacion de celulas osteoblasticas y/o condrogenicas.
Ventajosamente, la osteogenesis se induce al suplementar un medio estandar con suero humano o animal (preferentemente suero fetal de ternera o bovino (FCS, FBS, por sus siglas en ingles)), dexametasona, ascorbato de sodio, fosfato dihidrogeno de sodio, penicilina, y estreptomicina. Las celulas se mantienen en cultivo osteogenico con reemplazo de medio cada 2 dfas.
En una modalidad preferida, el medio osteoblastico es un medio estandar, preferentemente DMEM, suplementado con suero humano al l0 % v/v, 1 pM de dexametasona, 50 pg/ml de ascorbato de sodio, 36 mg/ml de fosfato dihidrogeno de sodio, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina.
La condrogenesis se induce ventajosamente al suplementar un medio estandar con suero humano o animal (preferentemente suero fetal de ternera o bovino (FCS, FBS)), dexametasona, TGF-B3, L-prolina, ascorbato de sodio,
fosfato dihidrogeno de sodio, piruvato de sodio, ITS (Insulina-Transferrina-Selenio, por ejemplo, a partir de polvo liofilizado de suplemento de medio insulina-transferrina-selenito de sodio disponible de Sigma), penicilina, y estreptomicina.
Un medio condrogenico preferido es un medio estandar, preferentemente DMEM, suplementado con suero humano al 10 % v/v, 1 |jM de dexametasona, 10 ng de TGF-B3, 40 jg/m l de L-prolina, 50 jg/m l de ascorbato de sodio, 36 mg/ml de fosfato dihidrogeno de sodio, 100 jg/m l de piruvato de sodio, 100 jl/m l de ITS (Insulina-Transferrina-Selenio, por ejemplo, polvo liofilizado de suplemento de medio insulina-transferrina-selenito de sodio disponible de Sigma), 100 U/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina.
Los medios estandar adecuados tanto para los medios osteogenicos y condrogenicos incluyen, pero no se limitan a, DMEM, EMEM, RPMI y GMEM, y el DMEM es el medio estandar preferido.
Como se usa en la presente, "andamio" se refiere a una estructura, lo que incluye en la forma de, pero no se limita a, pelfculas (por ejemplo, una forma con dos dimensiones sustancialmente mayores que la tercera dimension), cintas, cuerdas, laminas, discos planos, cilindros, esferas, formas amorfas de 3 dimensiones, etcetera.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra la diferenciacion de AMSC humanas en medio osteogenico suplementado con suero humano y DBM. Se encontro una estructura de capas multiples (A) con retraccion del tejido y tejido interconectado (B) mediante la tincion con tincion tricromica de Masson (C).
La Figura 2 muestra la diferenciacion de las AMSC en medio condrogenico sin (A, B) y con (C, D, E) DBM. Se desarrollo una estructura monocapa (A) con celulas confluentes en medio condrogenico sin DBM (B). Por el contrario, una estructura multicapa (C) obtenida mediante retraccion del tejido celular (D) estaba compuesta por una matriz similar a condrogenica tenida con azul Alcian (E y rectangulo con tincion de Giemsa).
La Figura 3 muestra la diferenciacion de las AMSC humanas en medio osteogenico sin (A, B, C) y con (D, E, F) DBM. Se desarrollo una estructura monocapa (A) formada por nodulos oseos individuales (tincion de rojo Alizarina, B) y tejido de colageno intranodular (C) en medio osteogenico sin DBM. Por el contrario, retraccion del tejido celular (D) con tejido interconectivo (E) formado por colageno mineralizado (F, tincion de Von Kossa en negro: rectangulo izquierdo) con celulas que expresan osteocalcina (F, rectangulo derecho).
La Figura 4 muestra la viabilidad de las BM-MSC y AMSC despues de 60 dfas posteriores a la implantacion en los musculos paravertebrales de ratas desnudas. Las celulas madre mesenquimales se detectaron mediante inmunohistoqmmica para la protema verde fluorescente (GFP, por sus siglas en ingles) y anticuerpo de osteocalcina. En el caso de la implantacion de solo hueso, no se encontro expresion de GFP y osteocalcina en las celulas tenidas. En el caso de injertos compuestos conformados por "MSC - injerto de hueso humano", se detectaron celulas positivas a GFP y osteocalcina.
La Figura 5 muestra el desarrollo de estructuras multidimensionales para las AMSC incubadas en medio osteogenico (A C) y condrogenico (E-F) suplementado con DBM. Retraccion del tejido (A, D), interconexion de la DBM (B, E) y expresion de protemas osteocalcina (C) y proteoglicanos (F).
La Figura 6 muestra el potencial angiogenico de las AMSC frente a las BM-MSC. Se encontro potencial in vitro mediante la incubacion de ambas celulas a concentraciones diferentes de oxfgeno (0,1,3, 5 y 21 % de O2 ). Las AMSC demostraron, en cada concentracion de O2 , una liberacion mayor significativamente de VEGF que las BM-MSC.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Preparacion del biomaterial multidimensional de acuerdo con la invencion.
Fuente de animales para las AMSC en el modelo preclmico
Se usaron cerdos transgenicos fluorescentes verdes como donantes para medula osea y celulas madre de adipocitos (Brunetti y otros, Cloning Stem Cells, 2008 Dic;10(4):409-19). Los animales se alojaron de acuerdo con las directrices del Ministerio de Agricultura de Belgica y de Cuidado Animal. Todos los procedimientos se aprobaron por el Comite de Etica local para el Cuidado Animal de la universidad catolica de Louvain.
Fuente para las AMSC de origen animal
La colagenasa (0,075 g) se reconstituye en solucion salina equilibrada de Hank (con iones de calcio) y se almacena a 2 8 °C antes de la digestion. Los tejidos grasos (una media de 15 g) se lavaron tres veces con NaCl al 0,009 % y se cortaron en una placa Petri para eliminar los vasos y el tejido conectivo fibroso. La grasa se pesa antes de la digestion y se transfiere a un tubo Falcon de 50 ml que contiene la enzima. El tejido se coloca en un bano de agua con agitacion a 37
°C con agitacion continua durante 60 minutes. Despues de la digestion, la colagenasa se inactiva en DMEM (500 ml) suplementado con 50 ml de suero humano, L-glutamina (5 ml) y 5 ml de antibioticos (penicilina/estreptomicina). El tejido recolectado se centrifuga durante 10 min a 1.500 rpm a temperatura ambiente (20-25 °C). El sobrenadante, que contiene adipocitos maduros, se aspira. El sedimento se suspende nuevamente en 20 ml de medio de proliferacion (MP) compuesto de DMEM suplementado con 10 % de suero humano y antibioticos (100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) y se filtra a traves de un tamiz de malla de 500 pm. El tejido recolectado (despues de la filtracion) se centrifuga durante 10 min a 1.500 rpm a temperatura ambiente (20-25 °C) y el sedimento se resuspende en el MP y se identifica como las celulas de la fraccion vascular estromal (SVF). Este pase inicial de las celulas primarias se refirio como pase 0 (P0). Despues de 24-48 horas de incubacion a 37 °C en CO2 al 5 %, los cultivos se lavaron con PBS y se mantuvieron en el MP hasta P4 (pase cuatro) y despues se diferenciaron en medio espedfico (ver mas abajo).
Fuente para las AMSC de origen humano
El tejido graso humano (pequenas piezas de tejido graso subcutaneo, 1-2 g, n=4) se elimino durante la cirugfa de rutina (cirugfa abdominal y ortopedica), y se conservo en una solucion fisiologica fna a 4 °C hasta el laboratorio para su procesamiento. La digestion de grasa humana se proceso como se describio anteriormente para el procesamiento de tejido graso de cerdo. Despues de la digestion, las AMSC humanas se cultivaron en MP y se diferenciaron en medio espedfico (ver mas abajo la composicion exacta) suplementado con (i) suero fetal bovino (10 % v/v) o (ii) suero humano (10 % v/v).
Se observo que las AMSC se diferenciaron tanto en el medio de diferenciacion que contema FBS como en el medio de diferenciacion que contema suero humano.
Fuente de matriz osea desmineralizada
La matriz osea desmineralizada humana se proporciono por el University Tissue Bank (Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruselas, Belgica), y se produjo a partir de donantes humanos de multiples organos. La diafisis de hueso femoral o tibial se corta y se pulveriza en partteulas inferiores a 1.000 pm para el tratamiento de desmineralizacion (ver mas abajo).
La DBM humana se realiza mediante la trituracion de huesos corticales de donantes humanos seleccionados. En primer lugar, el tejido oseo humano se desgrasa con un bano de acetona (99 %) durante toda la noche y despues se lava en agua desmineralizada durante 2 horas. La descalcificacion se realiza por inmersion en HCl 0,6 N durante 3 horas (20 ml de solucion por gramo de hueso) en agitacion a temperatura ambiente. Despues, el polvo de hueso desmineralizado se enjuaga con agua desmineralizada durante 2 horas y se controla el pH. Si el pH es demasiado acido, el DBM se tampona con solucion fosfato 0,1 M en agitacion. Finalmente, la DBM se seca y se pesa. La DBM se esteriliza con 25 kGray por irradiacion Gamma a temperatura de congelacion.
Caracterizacion y diferenciacion de celulas madre
Adipogenesis
Los cultivos confluentes de las AMSC se indujeron a sufrir adipogenesis mediante el reemplazo del MP con medio de induccion de adipocitos compuesto por Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM, por sus siglas en ingles) suplementado con suero humano al 20 %, L-glutamina (5 ml), insulina bovina (5 pg/ml), indometacina (50 pM), 3-isobutil-1-metil-xantina (IBMX, 0,5 mM), dexametasona (1 pM) y penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 pg/ml (Mauney JR, Biomaterials 2005, vol 26: 6167). Las celulas se mantuvieron en cultivo adipogenico con reemplazo de medio cada 2 dfas. Los cultivos se enjuagaron con PBS y se fijaron en solucion de formalina y se determino la diferenciacion en adipocitos mediante la tincion de lfpidos neutros con rojo aceite.
Osteogenesis
Los cultivos confluentes de las AMSC se indujeron a sufrir osteogenesis mediante el uso de un medio osteogenico obtenido al suplementar DMEM con suero humano (10 % v/v), dexametasona (1 pM), ascorbato de sodio (50 pg/ml), fosfato dihidrogeno de sodio (36 mg/ml), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) (ver Fig. 3-A, B, C). Las celulas se mantuvieron en cultivo osteogenico con reemplazo de medio cada 2 dfas. Los cultivos se enjuagaron con PBS y se fijaron en etanol al 70 % y se determino la diferenciacion osteogenica mediante la tincion para fosfato de calcio con rojo Alizarina. Ademas, se realizaron una inmunohistoqmmica para la osteocalcina y la tincion de Von Kossa para confirmar el fenotipo "oseo" (ver Fig. 4).
Condrogenesis
Los cultivos confluentes de las AMSC se indujeron a sufrir condrogenesis mediante el uso de un medio condrogenico obtenido al suplementar DMEM con suero humano (10 % v/v), dexametasona (1 pM), TGF-B3 (10 ng), L-prolina (40 pg/ml), ascorbato de sodio (50 pg/ml), fosfato dihidrogeno de sodio (36 mg/ml), piruvato de sodio (100 pg/ml), ITS (Insulina-Transferrina-Selenio, por ejemplo, a partir de polvo liofilizado de suplemento de medio insulina-transferrinaselenito de sodio disponible de Sigma) (100 pg/ml), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) (Taipaleenmaki H,
Experimental Cell Research 2008 vol 314: 2400). Las celulas se mantuvieron en cultivo condrogenico con reemplazo de medio cada 2 dfas.
Impacto de los medios de diferenciacion (osteogenico y condrogenico) en el cultivo de las AMSC.
Celulas y condiciones de cultivo.
Las AMSC se cultivaron en medio de proliferacion (MP) y se mantuvieron a 37 °C (95 % de aire y 5 % de CO2) hasta aproximadamente el 85-90 % de confluencia. El medio se cambio cada 2 dfas. Para suspender las celulas para el ensayo de citotoxicidad, las celulas se separaron del matraz de cultivo con una mezcla de tripsina-EDTA al 0,25 % durante 10 minutos a 37 °C y se resuspendieron en el medio de cultivo. Las celulas se sembraron en microplacas de 96 pocillos para el ensayo de MTS (bromuro de 3-[4,5dimetiltiazol-2il]-5-[3-carboximetoxifenil]-2-[4-sulfofenil]-2H-tetrazolio) a una densidad de 1 x 104 celulas/pocillo. Estas se cultivaron cerca de la confluencia a las 96 horas a 37 °C antes de la exposicion a diferentes medios de prueba: (i) MP, (ii) medio osteogenico, y (iii) medio condrogenico durante 5 dfas.
Ensayo de MTS. Despues de 24 horas de contacto extracto-celula, se anadieron directamente 20 pl de "Cell titer 96® AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay" (Promega, Madison, WI) a cada pocillo, los cuales conteman 100 pl de medio de extracto. Las celulas se incubaron durante 3 horas a 37 °C. La absorbancia se midio a 492 nm mediante el uso de un espectrofotometro de placa de microtitulacion (Multiskan Ex, Labsystems, Bruselas, Belgica). La longitud de onda de referencia fue 690 nm. Se estimo la diferencia de densidad optica OD = OD492 nm-OD690 nm.
Se observo que la diferenciacion se produjo solo cuando se usaron medios de diferenciacion espedficos.
Desarrollo de estructura multidimensional
Despues de 15-20 dfas de incubacion de las AMSC (subcultivo de pase 4) en un medio espedfico (osteogenico o condrogenico), la matriz osea desmineralizada (DBM) se suplemento con medio osteogenico y condrogenico, lo que resulto en una estructura multidimensional (1 mg de DBM/ml de medio diferenciado) por un penodo adicional de 20 dfas. El medio se reemplaza cada 2 dfas sin eliminar la DBM.
Al final de la diferenciacion, los cultivos se enjuagaron con PBS y se fijaron en solucion de formalina para la caracterizacion osea y condrogenica mediante histologfa para las tinciones de osteocalcina, azul Alcian y Giemsa (Fig. 2-C, D, E, Fig. 3 D, E, F).
Los sedimentos celulares se fijaron en paraformaldetndo al 4 % durante toda la noche. Las secciones seriadas (5 pm de grosor) se montaron en laminas portaobjetos de vidrio con agua desmineralizada, se secaron durante 12 horas a 37 °C y se procesaron por deteccion inmunoclasica o histoqmmica. La actividad de la peroxidasa endogena se bloqueo mediante la colocacion de las secciones en peroxido de hidrogeno (H2O2 al 0,3 %) durante 30 min. Despues de lavar en solucion salinatamponada con Tris-Triton (TBS-0,05 M, 0,05 %, pH=7,4), las laminas portaobjetos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con suero normal de cabra (1:10; BIOSYS, Boussens, Francia) y durante toda la noche con un anticuerpo primario para la tincion de osteocalcina (anticuerpo monoclonal de raton anti-osteocalcina; ABCAM, Cambridge, Reino Unido) a una dilucion de 1:100. Despues de lavar con Tris-TBS, las laminas portaobjetos se incubaron durante 1 hora con anti-IgG de raton secundaria para la deteccion de inmunoperoxidasa.
La estructura de colageno se estudio mediante tincion tricromica de Masson en cada muestra para todos los tipos de celulas diferenciadas/no diferenciadas. Las celulas fibroblasticas incubadas en medios de proliferacion y diferenciacion (osteogenico, condrogenico y adipogenico) sirvieron como control negativo.
Los condrocitos secretores de proteoglicanos se tineron con tinciones de azul Alcian y Giemsa.
Las AMSC se tineron con cantidades saturadas de anticuerpo monoclonal CD90 conjugado con ficoeritrina (PE, por sus siglas en ingles). Al menos 15.000 eventos se analizaron por citometna de flujo (FACScan, BD Biosciences) con el software Cellquest.
En los medios de diferenciacion tanto osteogenico como condrogenico, la DBM suplementada indujo el desarrollo de una estructura tridimensional mediante una construccion celular, smtesis de colageno y reagrupamiento de partfculas de matriz osea desmineralizada (ver Fig. 5 A-E). Microscopicamente, la expresion de osteocalcina y la secrecion de proteoglicanos se revelaron en condiciones osteogenicas (Fig. 5C) y condrogenicas (Fig. 5F), respectivamente.
Implantacion in vivo y analisis histologico
Se sembraron las AMSC de cerdos-GFP con diferenciacion osteoblastica en una matriz osea humana tratada/descelularizada (Dufrane D., EurCell Mater, vol 1: 52, 2001) proporcionada por el University Tissue Bank (Hospital clmico universitario Saint-Luc, Bruselas, Belgica). El injerto compuesto se implanto por via subcutanea en la region paravertebral de ratas desnudas (2 implantes/receptor y n=10) (machos, 6-8 semanas de edad). Despues de 60 dfas, los animales se sacrificaron y los implantes se explantaron para el procesamiento por inmunohistoqmmica. Los implantes se descalcificaron en HCl, se procesaron y se incluyeron en parafina y se seccionaron (5 pm). Despues se realizaron la
tincion tricromica de Masson y la inmunohistoqmmica para osteocalcina y "Protema Verde Fluorescente" (anticuerpo monoclonal).
Ejemplo 2
Potencial de injerto multidimensional similar al hueso a partir de celulas madre mesenquimales de tejido adiposo
Materiales y metodos
Aislamientos de AMSC de cerdo y humano
Para el proposito de esos experimentos, los aislamientos de AMSC de cerdo y humano se llevaron a cabo como se describio en el ejemplo 1.
Potencial angiogenico de las AMSC
In vitro
Para evaluar in vitro las capacidades proangiogenicas de las celulas madre en condiciones normoxicas e hipoxicas, las MSC de medula osea y las MSC de tejido adiposo porcinas se colocaron en camaras de hipoxia durante 24, 48 y 72 horas a 0,1, 3, 5 y 21 % de O2 y la liberacion de VEGF se cuantifico mediante pruebas ELISA.
Optimizacion de la estructura multidimensional con matriz osea desmineralizada
Se indujo a las AMSC a sufrir osteogenesis mediante suplementacion del MP con suero fetal bovino (FBS, por sus siglas en ingles, 10 % v/v), dexametasona (1 j M), ascorbato de sodio (50 jg/ml), fosfato dihidrogeno de sodio y penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 jg/ml. Las celulas se mantuvieron en cultivo osteogenico con reemplazo de medio cada 2 dfas (Post y otros, Bone 2008, 43,1; 32-39, Qu y otros, In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2007; 43; 95-100). Los cultivos se enjuagaron con PBS y se fijaron en etanol al 70 % y se determino la diferenciacion osteogenica mediante la tincion para fosfato de calcio con rojo Alizarina. Ademas, se realizo inmunohistoqmmica para la osteocalcina y la tincion de Von Kossa para confirmar el fenotipo "oseo".
Se realizo una estructura multidimensional con AMSC con incubacion conjunta en presencia de "matriz osea desmineralizada (DBM)" suministrada por el University Tissue Bank (Hospital clmico universitario St-Luc, Bruselas, Belgica). La produccion de matriz osea desmineralizada se describe en el ejemplo 1.
Matriz
La eficacia de la DBM se evalua mediante: (i) la medicion de la concentracion de calcio residual despues del proceso de desmineralizacion (>97 % de reduccion [del calcio]) y (ii) el potencial osteogenico in vivo (en ratas desnudas) a 1 mes posterior a la implantacion.
Despues de una incubacion de las AMSC (subcultivo de pase 4) en medio osteoblastico durante una media de 15-18 dfas, se anade una concentracion diferente (0/1/5/10 y 20 mg/ml) de DBM en el medio de diferenciacion espedfico. El medio se reemplaza cada 2 dfas sin eliminar la DBM. El grado de estructura 3D, la estructura celular, la expresion de osteocalcina y la tincion de Von Kossa (para la deposicion de calcio) se evaluan para seleccionar la concentracion de DBM adecuada para la estructura 3D similar al hueso.
Procedimiento de implantacion y seguimiento de la estructura multidimensional con matriz osea desmineralizada y AMSC
Las AMSC obtenidas a partir de los cultivos osteogenicos (en el pase 4) con una concentracion de DBM optima (para la estructura multidimensional) se recolectaron para la implantacion.
Se usaron como receptores ratas desnudas (Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, Massachusetts, EE.UU.). Las celulas se implantaron en los musculos paraespinales. Se realizo una incision longitudinal centrada en la columna vertebral y se diseccionaron los tejidos subcutaneos para exponer la fascia. Se implantaron directamente estructuras multidimensionales (University Tissue Bank, Universite Catholique de Louvain, Bruselas, Belgica) en la musculatura paravertebral. El control se aseguro mediante la implantacion de solo hueso esponjoso liofilizado en los musculos paraespinales contralaterales de la misma rata. La fascia se cerro mediante el uso de sutura no reabsorbible para permitir la recuperacion facil del sitio de implantacion. Los animales se sacrificaron y la explantacion se realizo en el dfa 30 despues del trasplante mediante una inyeccion intracardiaca de T61 (Intervet Int. GmbH-D, Alemania) con anestesia general. Despues se recolectaron los implantes y se procesaron para histologfa y tomograffa microcomputarizada.
Cerdo receptor. Los injertos se prueban en dos modelos quirurgicos diferentes. Los inventores analizaron (i) su capacidad de formar puentes en un defecto de hueso cortical femoral y (ii) su potencial de fusion en una fusion intersomatica lumbar anterior (ALIF, por sus siglas en ingles).
(i) El modelo de defecto oseo cortical se conoce bien en cirugfa ortopedica experimental y en nuestro laboratorio, principalmente a traves del trabajo del profesor C. Delloye. Los cerdos se usan en modelos similares donde se crea un
defecto oseo diafisiario segmentario en un hueso largo y despues se rellena con material de injerto o se deja vado. En nuestro experimento, se operan ambos femures del cerdo. Se produce un defecto oseo cortical de 1,5 cm y se estabiliza mediante una placa de compresion de bloqueo de titanio estandar de 4,5 mm. Un defecto femoral se deja vado y el injerto de AMSC se implanta en la pierna contralateral.
(ii) El modelo ALIF esta bien establecido en la cirugfa experimental porcina. Nuestra tecnica consiste en un procedimiento ALIF de cuatro niveles mediante un enfoque posterolateral. La fusion se obtiene por medio de una caja intersomatica de polietil etil cetona (PEEK, por sus siglas en ingles). Se abre el disco intervertebral se abre y se remueve el nucleo pulposo, el cartflago se escarna para exponer el hueso subcondral, y despues se inserta la caja de PEEK. Estas cajas se disenan vadas, pero pueden rellenarse con diversos materiales experimentales. En este caso, cada nivel recibira un tejido de injerto diferente, mediante la creacion de cuatro grupos diferentes: una caja se deja vada como control negativo, una caja se rellena con hueso esponjoso irradiado liofilizado (como se realiza a menudo en el campo clmico), una caja contiene injerto de hueso esponjoso autologo (considerado como el estandar de oro en el procedimiento de fusion y, por lo tanto, nuestro control positivo), y la ultima caja tiene el injerto de AMSC. Los animales se sacrificaron y la explantacion se realizo en la semana 7 despues del trasplante por medio de una inyeccion intracardiaca de T61 (Intervet Int. GmbH-D, Alemania) con anestesia general. Despues se recolectaron los implantes y se procesaron para histologfa y tomograffa computarizada.
Seguimiento
Ratas desnudas:
Los implantes explantados se descalcificaron en HCl, se procesaron, se incluyeron en parafina y se seccionaron (5 pm). Para la tincion histologica se usaron las tinciones de coloracion estandar de Hemalumbre Eosina, Tricromica Verde de Masson, Osteocalcina y Von Kossa. La tincion de osteocalcina se obtuvo por medio de un anticuerpo monoclonal (OC4-30, Abcam, Cambrige) revelado por el anticuerpo monoclonal Envision Rsystem (Dako, Dinamarca). La microestructura de los implantes recolectados se analizo mediante el uso de una pQCT (Maquina de tomograffa computarizada cuantitativa periferica, modelo XCT Research SA, Stratec, Pforzheim, Alemania). Ladensidad osea cortical y total se midio en multiples laminas portaobjetos de cada implante. La cuantificacion de la neoangiogenesis in vivo se realizo mediante la cuantificacion de los vasos recien formados despues de la tincion de von Willebrandt (ver arriba).
Cerdos:
Los cerdos se alojan individualmente con acceso libre a comida y agua. Se proporcionan cuidado postoperatorio y analgesia mediante protocolos estandar para el cuidado de animales experimentales. En el modelo de autoinjerto, el seguimiento biologico consistira en la evaluacion de la inflamacion por medio de muestras de sangre.
El seguimiento radiologico nos permite comparar la formacion del hueso in vivo mediante exploracion por tomograffa computarizada (CT, por sus siglas en ingles) en las semanas 1, 5 y 7 despues de la implantacion. La resolucion alta y las reconstrucciones multiplanares de las exploraciones clmicas por Ct son tan precisas que los inventores pueden analizar el contenido de las cajas de PEEK in vivo, lo que permite, por lo tanto, la evaluacion del proceso de fusion.
El mismo procedimiento se usa en los femures, con toda la informacion recopilada atraves de una exploracion de barrido. Se obtiene aun una mejor resolucion despues de la eutanasia mediante el procesamiento de los injertos explantados a traves de una micro-CT. Se progresa en investigaciones histologicas e inmunohistoqmmicas sobre injertos explantados para evaluar la formacion de hueso nuevo y la revascularizacion del injerto (factor de crecimiento endotelial vascular, CD51, factor de von Willebrand), consolidacion (osteocalcina), y mineralizacion (Von Kossa) en comparacion con las capacidades naturales de fusion y de formacion de puentes corticales.
El proceso de descalcificacion permite estudios histologicos e inmunohistoqmmicos del material injertado. La histologfa, histomorfometna, y microrradiograffa requieren mantener el tejido calcificado; por lo tanto, el procesamiento sin descalcificacion tambien es obligatorio.
Estadfstica
La significacion estadfstica de las diferencias entre los grupos se evaluo mediante un analisis de varianza de una via con una prueba post hoc de Bonferroni. Las pruebas estadfsticas se llevaron a cabo con el programa Systat version 8.0. Las diferencias se consideraron significativas cuando p < 0,05.
Resultados
Prueba de concepto para estructura multidimensional con concentracion de DBM
optima: estructura similar al huesoin vitro
Con vistas a evitar un soporte biologico para el trasplante de celulas AMSC, se desarrollo una estructura multidimensional en combinacion con DBM. Se requiere una matriz osea desmineralizada (con un diametro medio de 700 pm) con una capacidad in vivo para promover la diferenciacion osteogenica en ratas desnudas (se requiere control de calidad antes del uso en contacto con las AMSC), para lograr una remodelacion celular in vitro en incubacion conjunta con las AMSC.
En ambos medios de diferenciacion osteogenica, la DBM suplementada indujo el desarrollo de una estructura tridimensional mediante una construccion celular, smtesis de colageno y reagrupamiento de partfculas de DBM en comparacion con las AMSC solas sin DBM. Para optimizar el desarrollo de la estructura multidimensional, se probaron dosis graduales de DBM. Se encontro que las concentraciones extremas (mas de 20 mg/ml) no se adaptaron. La concentracion de 1 mg/ml no desarrollo una estructura 3D optima para el manejo del injerto con vistas a la aplicacion quirurgica. Por el contrario, se encontro que las concentraciones de 5 y 10 mg/ml desarrollaron una retraccion tisular optima para la eliminacion del injerto y la aplicacion quirurgica. Microscopicamente, se revelo la expresion de osteocalcina y el proceso de mineralizacion (tincion de Von Kossa) con estas ultimas concentraciones de DBM. Se requiere una media de 20 ± 3 dfas de incubacion conjunta con DBM para obtener una estructura tridimensional con las AMSC en condiciones osteogenicas.
Prueba de concepto para estructura multidimensional con concentracion de DBM optima:
osteogenesis in vivo
Ratas desnudas
Despues de los 30 dfas posteriores a la implantacion en ratas desnudas, las AMSC solas sin DBM no indujeron la formacion de una estructura nueva similar al hueso. Solo los nodulos oseos pequenos (positivos a osteocalcina) tenidos por la tincion de Von Kossa se distribuyeron escasamente en la musculatura de las ratas desnudas. Por el contrario, la implantacion de la estructura multidimensional se realizo facilmente con una buena localizacion del sitio de implantacion. Despues de 30 dfas posteriores a la implantacion, se encontro una estructura compacta/fuerte similar al hueso en el musculo con un tejido conectivo denso microscopicamente dentro de la partfcula de DBM. Se encontro una estructura similar al hueso con tejido conectivo con tincion de osteocalcina y proceso de mineralizacion.
Cerdos receptores
Despues de 5 semanas posteriores a la implantacion, en cerdo, no se encontro consolidacion espontanea en el defecto femoral oseo (sin tratamiento) como se revelo en la exploracion con CT. Fue facil incorporar la estructura multidimensional en el defecto oseo sin ningun andamio. Este ultimo injerto mejora significativamente la consolidacion osea en el penodo temprano posterior a la implantacion (5 semanas despues del trasplante) con una estructura similar al hueso que forma puente en el defecto oseo cortical nativo.
Prueba de concepto para la estructura multidimensional con una concentracion de DBM optima:
angiogenesis in vivo
Para evaluar in vitro las capacidades proangiogenicas de las celulas madre en condiciones normoxicas e hipoxicas, se colocaron las MSC de medula osea y las MSC de tejido adiposo preclmicas porcinas en camaras de hipoxia durante 24, 48 y 72 horas a 0,1, 3, 5 y 21 % de O2 y se cuantifico la liberacion de VEGF por ELISA. Las BM-MSC liberaron mas VEGF en hipoxia que en condiciones normoxicas y mantuvieron esta secrecion en el tiempo con niveles mas altos de VEGF a las 48 y 72 horas que a las 24 horas (p<0,05). Por el contrario, la liberacion de VEGF por las AMSC fue similar en las diferentes condiciones de cultivo, pero se liberaron niveles de VEGF mas altos significativamente por las AMSC que por las BM-MSC (11.274 ± 679 vs. 2.364 ± 94 pg/ml, respectivamente; p<0,05) (Fig. 6). Estos resultados se confirmaron in vivo despues del trasplante de BM-MSC y AMSC. Se encontro una angiogenesis mas alta significativamente en el caso del trasplante de AMSC osteogenicas en comparacion con las BM-MSC (p<0,05).
Claims (15)
1. Un biomaterial que tiene una estructura multidimensional y comprende tejido de las MSC diferenciadas y matriz osea desmineralizada, en donde dicha matriz osea desmineralizada se dispersa dentro del tejido de las MSC diferenciadas, y en donde dichas MSC diferenciadas son celulas madre derivadas de tejido adiposo.
2. El biomaterial de conformidad con la reivindicacion 1, en donde las MSC usadas para conformar el tejido de MSC diferenciadas son de origen humano o animal.
3. El biomaterial de conformidad con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde las MSC son celulas madre derivadas de tejido adiposo de pase tardfo.
4. El biomaterial de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el cual es tridimensional.
5. El biomaterial de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la matriz osea desmineralizada esta en forma de partfculas que tienen un diametro medio de 50-2.500 pm.
6. Un implante que comprende un biomaterial de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Un metodo para producir un biomaterial multidimensional de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende incubar las MSC en medio osteoblastico y/o condrogenico durante 15-25 dfas y despues anadir matriz osea desmineralizada en dichos medios y mantener la incubacion durante un penodo adicional de 15-30 dfas.
8. El metodo de conformidad con la reivindicacion 7, en donde el medio osteoblastico es un medio estandar que se suplementa con suero humano, dexametasona, ascorbato de sodio, fosfato dihidrogeno de sodio, penicilina, y estreptomicina.
9. El metodo de conformidad con la reivindicacion 7, en donde el medio condrogenico es un medio estandar que se suplementa con suero humano, dexametasona, TGF-B3, L-prolina, ascorbato de sodio, fosfato dihidrogeno de sodio, piruvato de sodio, Insulina-Transferrina-Selenio, penicilina, y estreptomicina.
10. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde la matriz osea desmineralizada se anade en el medio en una cantidad de 5 a 10 mg/ml.
11. Un biomaterial multidimensional obtenible mediante el metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 7-10.
12. Un dispositivo medico que comprende el biomaterial de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 5 y 11.
13. Un kit que comprende el biomaterial de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 11, y un medio de fijacion adecuado.
14. Un biomaterial de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 11 para su uso en un metodo para aliviar o tratar un defecto oseo o de cartflago.
15. El biomaterial de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 11, para su uso en un metodo para respaldar o corregir anomalfas congenitas o adquiridas de las articulaciones, huesos craneofaciales-maxilares, procedimientos de ortodoncia, reemplazo oseo articular o del hueso despues de una cirugfa, trauma u otras anormalidades congenitas o adquiridas, o para respaldar otros implantes musculoesqueleticos, particularmente implantes artificiales y sinteticos.
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